Ablauf der quantitativen massenspektrometrischen Analyse

Um nun einerseits die mit den zu untersuchenden Faktoren in Wildtypzellen spezifisch angereicherten Proteine zu identifizieren, und andererseits die Unterschiede in der Zusammensetzung gereinigter Komplexe in An– und Abwesenheit von neu synthetisierter prä-rRNA zu untersuchen, wurde die Methode der semiquantitativen Massenspektrometrie (qMS) mit dem iTRAQ–Reagenz (Ross et al., 2004)verwendet.

Diese Methode eignet sich für den quantitativen Vergleich der Zusammensetzung gereinigter Proteinproben, die nach einer in vitro Markierung gemischt und gemeinsam im verwendeten Massenspektrometer analysiert werden.

A

B

-10 -5 0 5 10 15 20 25 30 35 40

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140

min mAU

Abbildung 13: Schematische Darstellung der Probenvorbereitung zur anschließenden qMS-Analyse

(A) Es wurden Affinitätsreinigungen der jeweiligen Proteine mit IgG–Sepharose durchgeführt. Dabei wurden pro Analyse der Wildtypstamm ohne Epitopmarkierung und der jeweilige Wildtyp und rrn3-8 Mutantenstamm mit der TAP–Markierung am zu analysierenden Protein ( ) untersucht. Dabei wurden Proteine unspezifisch ( ), spezifisch rRNA–unabhängig ( ) bzw. spezifisch rRNA–abhängig ( ) kogereinigt. Die eluierten Proteine jeder Aufreinigung wurden in Lösung mit Trypsin verdaut und die daraus resultierenden Peptide separat in vitro mit verschiedenen iTRAQ–Reagenzien markiert ( ). Nach Kombination der drei Ansätze wurden die Peptide unter Verwendung einer Nano-Flow–

HPLC–Apparatur aufgetrennt, auf eine MALDI–Analyseplatte aufgetragen und im MALDI–TOF/TOF–

Massenspektrometer vermessen.

(B) Gezeigt ist ein typisches Spektrum der Auftrennung der tryptischen Peptide auf einer Umkehrphasen–Säule in der verwendeten Nano–Flow–HPLC–Apparatur (Dionex Ulimate 3000).

Aufgetragen ist die Absorption der Peptide bei 254 nm in Milli–Absorptionseinheiten (mAU) gegen die Laufzeit in Minuten (min).

Dazu wurden zunächst Affinitätsreinigungen über den ProteinA–Teil des TAP–Epitops der jeweiligen Proteine mit IgG–Sepharose durchgeführt. Dabei wurden für jede qMS-Analyse drei verschiedene Stämme untersucht: der Wildtypstamm ohne Epitopmarkierung sowie der jeweilige Wildtyp und rrn3-8 Hefestamm mit der TAP–Markierung am zu analysierenden Protein (Abbildung 13). Dabei wurden im epitopmarkierten Wildtyp-Stamm zusätzlich zum Köderprotein weitere Faktoren sowohl (prä-) rRNA unabhängig als auch (prä-) rRNA abhängig angereichert, während im epitopmarkierten rrn3-8 Stamm nach Abschalten der rRNA Neusynthese zusätzlich zum Köderprotein Faktoren nur (prä-) rRNA unabhängig kogereinigt wurden.

Die mit der TEV–Protease (tabaccho etch virus = Tabakmosaikvirus) eluierten Proteine jeder Aufreinigung wurden mit Methanol/Chloroform gefällt, an Cystein-Resten analysebedingt modifiziert und in Lösung mit Trypsin verdaut (4.2.6.11-4.2.6.14). Die daraus resultierenden Peptide wurden separat in vitro mit verschiedenen iTRAQ-Reagenzien markiert. Nach Vereinigung der drei Ansätze wurden die Peptide mittels Umkehrphasenchromatographie unter Verwendung einer Nano–Flow–HPLC–Apparatur aufgetrennt, die Fraktionen automatisch auf eine Analyseplatte aufgetragen und im MALDI–TOF/TOF–

Massenspektrometer (Matrix–unterstützte Laserdesorption/Ionisation- Time Of Flight) der Serie 4700 der Firma Applied Biosystems vermessen.

Das MS–Spektrum für jede Fraktion auf der MALDI–Analyseplatte wurde aufgenommen, wobei die darin enthaltenen Peptide nach Laserbeschuss ionisiert und in einem elektrischen Feld beschleunigt werden. Nach einer ihrem jeweiligen Masse/LadungsVerhältnis (m/z) entsprechenden Flugzeit erreichen die Peptide den Ionendetektor und zeigen somit ein Signal im aufgenommenen Spektrum (Abbildung 14). Da bei MALDI-Analysen jedes Peptid eine einfach positive Ladung trägt erfolgt diese Auftrennung nach dem Molekulargewicht der Peptide. Dabei stellt jedes Absorptionsmaximum eine Mischung aus Peptiden gleicher

Sequenz aber mit unterschiedlicher iTRAQ–Markierung - je nach durchgeführter Affinitätsreinigung - dar.

Abbildung 14: Schematische Darstellung der durchgeführten qMS–Analysen

Gezeigt ist ein typisches MS–Spektrum, bei dem jedes Signal eine Mischung aus Peptiden gleicher Sequenz aber mit den drei unterschiedlichen iTRAQ–Markierungen darstellt. Im MS/MS–Modus wurden ausgewählte Peptide durch Gaskollision fragmentiert, wobei sequenzspezifische Peptidfragmente entstanden. Anhand der gefundenen m/z–Verhältnisse konnte das jeweilige Protein durch Datenbanksuche identifiziert werden. Zusätzlich konnte im MS/MS–Modus die Freisetzung der iTRAQ-Reporterionen erreicht werden, die je nach Art der verwendeten Isotope als Signale bei 114, 115, 116 oder 117 Dalton erschienen und zur Quantifizierung der beobachteten Koreinigungen verwendet wurden.

Dabei traten drei verschiedene Möglichkeiten der Signalintensitäten auf. Waren bei allen drei Aufreinigungen die Signalintensitäten vergleichbar, wurde das entsprechende Protein als unspezifisch gebunden eingestuft ( ). Bei spezifisch gebundenen Proteinen mit geringer Signalintensität des Reporterions des Wildtyps ohne Tag konnten zwei verschiedene Zustände beobachtet werden: Beim Köderprotein ( ) und rRNA–unabhängig angereicherten Proteinen ( ) waren die Signalintensitäten der Reporterionen des Wildtyps RRN3 und der rrn3-8 Mutante vergleichbar, während bei rRNA–abhängig gereinigten Proteinen ( ) das Reporterionensignal der rrn3-8 Mutante deutlich geringere Intensität zeigte.

Zur Identifizierung der Peptide wurden die sechs höchsten Peptidsignale jedes Analysepunkts in einer Gaskollisionskammer weiter fragmentiert um die jeweiligen MS/MS–

Spektren zu erhalten. Durch Vergleich mit theoretischen Massen tryptischer Peptidfragmente ließ sich die jeweilige Peptidsequenz und somit das entsprechende Protein mittels MASCOT Datenbanksuche in einer Hefedatenbank zuordnen. Es wurden wenn nicht anders angegeben nur Proteine, die durch das verwendete GPS Explorer Programm mit wenigstens zwei eindeutigen Peptiden eines C. I. (Confidential Intervalls) > 95% zugeordnet werden konnten, in die Untersuchung mit einbezogen.

Zusätzlich zur Sequenzinformation konnte im MS/MS–Modus die Freisetzung der iTRAQ-Reporterionen erreicht werden, welche den jeweiligen Peptiden aus den einzelnen Affinitätsreinigungen zugeordnet werden konnten. Diese Reporter erschienen, je nach Art der zur Synthese des Reagenzes verwendeten Isotope, als Signale bei 114, 115, 116 oder 117 Dalton. Da ihre Signalintensitäten direkt proportional zu der Menge des jeweiligen markierten Peptids in dem analysierten Peptidgemisch sind, wurden sie zur Quantifizierung der beobachteten Koreinigungen verwendet.

Dabei konnten drei verschiedene Möglichkeiten der Verteilung der Signalintensitäten der Reporterionen beobachtet werden. Bei unspezifisch gebundenen Proteinen waren für alle drei verwendeten iTRAQ-Reporter die Signalintensitäten vergleichbar. Bei geringer Signalintensität des Reporterions des unmarkierten Wildtyps wurde das Protein als spezifisch gebunden eingestuft. Dabei traten zwei verschiedene Zustände auf: Beim Köderprotein und rRNA–unabhängig angereicherten Proteinen waren die Signalintensitäten der Reporterionen des RRN3 Wildtyps und der rrn3-8 Mutante vergleichbar, da die entsprechenden Proteine in beiden Affinitätsreinigungen angereichert werden konnten. Im Gegensatz dazu zeigte das Reporterionensignal der rrn3-8 Mutante bei rRNA–abhängig gereinigten Proteinen eine deutlich geringere Intensität, da diese Proteine unter den gewählten Bedingungen des Abschaltens der rRNA–Neusynthese in der rrn3-8 Mutante nicht kogereinigt werden konnten (Abbildung 14). Zur genauen Einordung der angereicherten Proteine wurden Verhältnisse der Signalintensitäten der Reporterionen berechnet und mit Microsoft Excel ausgewertet.

2.2.2 Bestimmung von durch Affinitätsreinigung spezifisch angereicherten