cpm counts per minute (Zerfälle in der Minute)
Da Dalton
EMSA Electro mobility shift assay ETS Extern transkribierter Spacer
HPLC high performance liquid chromatography (Hochauflösungsflüssig-chromatographie)
ICAT Isotope-coded affinity tags
IgG Immunglobulin G
IP Immunpräzipitation
iTRAQ isobaric tag for relative and absolute quantitation = isobares Epitop zur relativen und absoluten Quantifizierung
ITS Intern transkribierter Spacer
kB Kilobase(n)
kD KiloDalton
MIDAS metal ion-dependent adhesion site
min Minute
pH negativer dekadischer Logarithmus der H+-Ionenkonzentration PMSF Phenylmethylsulfonylchlorid
rpL Protein der 60S – Untereinheit rpS Protein der 40S-Untereinheit
RT Raumtemperatur
S Sedimentationskoeffizient
SDS Natriumdodecylsulfat
sec Sekunde
S. cerevisiae Saccharomyces cerevisiae
SF Spodoptera frugiperda
SILAC Stable isotope labelling with amino acids in cell culture snoRNA kleine nukleoläre RNA
snoRNP kleines nukleoläres RNP SRP Signal recognition particle SSU kleine ribosomale Untereinheit
Strep Streptomycin
TAP tandem affinity purificaton
Taq Thermus aquaticus
TBE Tris-Borat-EDTA
TBP TATA–Bindeprotein
TCA Trichloressigsäure
TE Tris-EDTA
TEMED N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin TEV tobacco etch virus (Tabakmosaikvirus)
TOF time of flight
Tris Tris(hydroxymethyl) aminomethan
tRNA Transfer RNA
Trp Tryptophan
ts temperatursensitiv
U Unit
UAF upstream activating factor
UE upstream element
upm Umdrehungen pro Minute
Ura Uracil
UV Ultraviolettes Licht
ÜN über Nacht
Vgl. vergleiche
WB Westernblot
WT Wildtyp
z. B. zum Beispiel
μ Mikro-
Chemische Elemente und Verbindungen, physikalische Größen und Einheiten werden entsprechend den internationalen Richtlinien abgekürzt.
7 Zusammenfassung
Zur Synthese eukaryotischer Ribosomen werden mehr als 150 Ribosomen-biogenesefaktoren benötigt, die vorübergehend bei der Bildung neusynthetisierter Unter-einheiten mit präribosomalen Partikeln interagieren. Während der letzten Jahre konnten verschiedenste präribosomale Zwischenstufen identifiziert werden, die sich in ihrer Proteinzusammensetzung und ihrem jeweiligen (prä-) rRNA–Gehalt unterscheiden.
Bei diesem hoch dynamischen und komplexen Vorgang stellt sich grundsätzlich die Frage, in welcher Form die zahlreichen beschriebenen Ribosomenbiogenesefaktoren an präribosomale Partikel assoziieren. Dabei besteht die Möglichkeit der Bindung einzelner Proteine an unabhängigen Bindungsstellen der (prä-) rRNA, der sequenziellen Assoziation einzelner Proteine an bereits gebundene ribosomale Proteine und Biogenesefaktoren oder auch der Assoziation vorgeformter prä-rRNA unabhängiger Proteinmodule. Weiterhin ist bisher auch unklar, ob diese Proteine als Einzelproteine oder im Komplex mit anderen Faktoren im Laufe der Ribosomenreifung von präribosomalen Partikeln abdissoziieren.
In der vorliegenden Arbeit konnte eine systematische Methode etabliert werden, die es ermöglicht, die Existenz prä-rRNA freier Proteinkomplexe von Ribosomenbiogenesefaktoren im Modellorganismus S. cerevisiae in vivo zu analysieren. Dazu wurden die Biogenesefaktoren Noc1p, Nop7p, Rio2p, Enp1p, Rix1p und Arx1p in Abwesenheit von rRNA–Neusynthese affinitätsgereinigt. Die Zusammensetzung assoziierter, ohne prä-rRNA vorliegender Zusammenschlüsse wurde mittels semiquantitativer Massenspektrometrie mit dem jeweiligen Aufbau von präribosomalen Partikeln verglichen, die in Anwesenheit von rRNA–Synthese gereinigt wurden.
Im Zuge dieser Untersuchung konnten die Zusammensetzungen bereits beschriebener rRNA freier Proteinkomplexe bestätigt werden. Dabei handelt es sich um den Rix1p-Ipi1p-Ipi3p-Komplex, den Nop7p-Erb1p-Ytm1p-Komlex und das potentielle Dimer der beiden Proteine Noc1p und Noc2p. Weiterhin konnten in fast allen Fällen neue Komponenten dieser Komplexe identifiziert werden. So scheint Rrp5p, eine Komponente des SSU-Prozessoms, prä-rRNA unabhängig mit dem Noc1p-Noc2p-Komplex zu interagieren und die DEXD/H Box RNA-Helikase Drs1p Teil des Nop7p-Erb1p-Ytm1p-Komplexes zu sein. Diese Komplexe aus LSU-Biogenesefaktoren könnten vermutlich funktionelle Blöcke in der Bildung von prä-60S Partikeln darstellen.
Weiterhin scheint nach Abschalten der rRNA-Synthese in vivo ein Rio2p-Enp1p-Modul mit bis zu fünf weiteren Komponenten zu existieren. Dabei handelt es sich wahrscheinlich eher um einen Komplex, der im Laufe der Ribosomenreifung im Ganzen vom 40S Präribosom abdissoziiert und in Abwesenheit von rRNA-Synthese als reiner Proteinkomplex erhalten bleibt.
Bei dem hier gewählten Ansatz war es im Gegensatz zu vorangegangenen Analysen unwahrscheinlich, dass sich diese Proteinmodule durch ein Zerfallen präribosomaler Partikel ausgebildet hatten. Vielmehr lassen die vorliegenden Ergebnisse vermuten, dass sie in vivo unabhängig von ablaufender Ribosomenbiosynthese existieren und als funktionelle Einheiten mit präribosomalen Partikeln interagieren können oder im Laufe der Ribosomenreifung aus präribosomalen Partikeln als Proteinkomplexe freigesetzt werden.
Zusätzlich zu diesen prä-rRNA unabhängigen Proteinmodulen konnten mehrere Ribosomenbiogenesefaktoren identifiziert werden, die nicht nur an neusynthetisierte große ribosomale Untereinheiten gebunden vorliegen. Arx1p, Tif6p/eIF6, Nmd3p und möglicherweise zusätzlich Rei1p, Alb1p und Lsg1p scheinen auch Assoziation an reife 60S Untereinheiten zu zeigen, die möglicherweise durch Termination der Transkription aus Polysomen freigesetzt werden. Dies lässt vermuten, dass sie eine doppelte Funktion in der Biogenese der großen Untereinheit und deren Stabilität und Recycling während der Translation ausfüllen könnten.
Durch anschließende heterologe Expression der jeweiligen Komponenten der Proteinkomplexe in Insektenzellen konnten die prä-rRNA unabhängigen Interaktionen innerhalb der Noc1p-Noc2p-Rrp5p Proteinkomplexe bestätigt und genauer charakterisiert werden. Auch innerhalb des Rio2p-Enp1p-Moduls konnten direkte Wechselwirkungen identifiziert werden, die jedoch noch genauer untersucht werden müssen. Prinzipiell scheinen Proteinmodule von Ribosomenbiogenesefaktoren mit dieser Methode in der nötigen Menge und Reinheit für anschließende funktionelle und strukturelle Untersuchungen exprimiert und gereinigt werden zu können.
Anfängliche Bindungstests dieser in vitro rekonstituierten Proteinkomplexe an kurze definierte rRNA-Fragmente waren nicht erfolgreich. Somit konnte nicht ermittelt werden, ob und, wenn ja, an welcher Stelle die identifizierten Proteinmodule in der Hefezelle mit präribosomalen Partikeln als vorgeformte Komplexe interagieren können. Da in der Vergangenheit zumindest für Rrp5p bereits eine Bindung an definierte Abschnitte der prä-rRNA nachgewiesen werden konnte, müssen in diesem Zusammenhang gegebenenfalls die Bindungsbedingungen entsprechend angepasst werden.
Grundsätzlich konnten im Rahmen der vorliegenden Arbeit Grundlagen zu weiterführenden Analysen der Architektur von Proteinkomplexen von Ribosomenbiogenesefaktoren und zur Untersuchung deren in vitro Bindung an präribosomale Partikel geschaffen werden, um langfristig einen Einblick in die funktionelle Architektur präribosomaler Partikel zu gewinnen.