Inhibin B ELISA DS Arbeitsanleitung

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Arbeitsanleitung

IBL International GmbH Flughafenstraße 52 a 22335 Hamburg

Tel. +49 (0) 40 53 28 91-0 Fax +49 (0) 40 53 28 91-11 IBL@tecan.com

www.tecan.com/ibl

Inhibin B ELISA

Das Inhibin B Gen II ELISA-Kit (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) enthält Materialien für die quantitative Messung von inhibin B

in menschlichem Serum und Lithium-Heparin-Plasma.

DS52021 96

Nur zur allgemeinen Veranschaulichung.

Den Assay nur mit der mitgelieferten Arbeitsanleitung durchzuführen.

2-8°C

Distributed by: IBL International GmbH

Flughafenstrasse 52a

22335 Hamburg, Germany

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PI-A81303–04 12 of 110

INHIBIN B GEN II ELISA

A81303

NUR ZUR VERWENDUNG DURCH FACHKRÄFTE, Das Inhibin B Gen II ELISA-Kit (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) enthält Materialien für die quantitative Messung von inhibin B in menschlichem Serum und Lithium-Heparin-Plasma.

Dieser Assay ist zur In-vitro-Diagnostik bestimmt.

ZUSAMMENFASSUNG

Inhibine sind heterodimere Polypeptid-Hormone. Sie unterdrücken selektiv die Ausschüttung des follikelstimulierenden Hormons (FSH) aus der Hypophyse und zeigen ebenfalls eine lokale, parakrine Wirkung auf die Gonaden.^1,2 Die vollständig ausgebildete Form des Inhibinmoleküls hat ein Molekulargewicht von ungefähr 32-36 kD und besteht aus zwei einzelnen Ketten (α und β), die durch Disulfidbrücken verbunden sind.

Es treten ebenfalls Formen mit einem höheren Molekulargewicht in der Follikelflüssigkeit und im Serum auf, die Vorstufen der α-Untereinheit enthalten. Zusätzlich gibt es freie Formen von α-Untereinheiten, die nicht an β-Untereinheiten gebunden sind und die keine inhibin-Bioaktivität aufweisen.^3,4,5,6

Inhibin B besteht aus einer α-Untereinheit und einer β-Untereinheit. Inhibin B wird von den Sertoli-Zellen in den Hoden des Mannes oder von den Granulosazellen in den Eierstöcken der Frau gebildet. Seine primäre Rolle scheint die Regulierung der Gametogenese mittels negativer Rückkopplung auf die Produktion von FSH zu sein. Aus etlichen veröffentlichten Berichten geht hervor, dass die Messung von inhibin B als endokriner Marker zur Überwachung der Gonadenfunktion bei Männern7,8,9,10,11,12 und Frauen13,14,15,16,17,18,19,20,21von Nutzen ist.

Der Inhibin B Gen II ELISA verwendet ein hoch spezifisches Antikörperpaar, das nur die funktionalen dimeren inhibin-B-Moleküle erkennt und die freien α-Untereinheiten in biologischen Flüssigkeiten nicht misst.²² Der aktuelle Assay erfordert keine Vorbehandlung der Probe mit Wasserstoffperoxid, bei der die beiden Methionine im Epitop zu Sulfoxid oxidiert werden, um eine vollständige Immunoreaktivität zu erhalten.

PRINZIP

Der Inhibin B Gen II ELISA ist ein enzymatisch verstärkter „Sandwich“-Assay in drei Schritten. Bei dem Assay werden Kalibratoren, Kontrollen und Proben in Mikrotitervertiefungen inkubiert, die mit einem Anti-aktivin B-Antikörper beschichtet sind.²² Nach der Inkubation und dem Waschen werden die Vertiefungen mit einem biotinylierten Detektionsantikörper gegen die Inhibin α-Untereinheit inkubiert. Nach einem zweiten Inkubations- und Waschschritt werden die Vertiefungen mit Streptavidin-markierter Meerrettichperoxidase (HRP) inkubiert. Nach einem dritten Inkubations- und Waschschritt werden die Vertiefungen mit Tetramethylbenzidin (TMB) als Substrat inkubiert.

Nach der Inkubation wird eine saure Stopplösung hinzugefügt. Der Grad der enzymatischen Umsetzung des Substrates wird als duale Wellenlängen-Absorptionsmessung bei 450 nm als primärem Testfilter und bei 630 nm als primärem Referenzfilter bestimmt. Die gemessene Absorption ist direkt proportional zur Konzentration des Inhibin B in den Proben. Mit Hilfe einer Reihe von Inhibin-B-Kalibratoren der zweiten Generation wird eine Kalibrierungskurve der Absorption gegenüber der Inhibin-Konzentration aufgezeichnet. Anhand dieser Kalibrierungskurve kann dann die Inhibin-B-Konzentration in den Proben berechnet werden.

WARNUNGEN UND VORSICHTSMASSNAHMEN

In-vitro-Diagnostikum.

Befolgen Sie die GLP-Regeln (GLP-Gute Laborpraxis).²³

Unter Verwendung des beschriebenen Verfahrens können Proben und aus Blut gewonnene Produkte routinemäßig mit minimalem Risiko bearbeitet werden. Dennoch müssen diese Produkte als potentiell infektiös gemäß den allgemein geltenden Vorsichtsmaßnahmen und GLP gehandhabt werden, unabhängig von ihrer Herkunft, Behandlung oder vorheriger Zertifizierung.²⁴ Zur Dekontamination ist ein geeignetes Desinfektionsmittel zu verwenden.

Materialien und Behälter gemäß den lokal geltenden Vorschriften und Richtlinien lagern und entsorgen

Achtung

Natriumazid als Konservierungsmittel kann in metallischen Abflussleitungen explosive Verbindungen eingehen. Siehe hierzu das Dokument „NIOSH Bulletin: Explosive Azide Hazard“ (Informationsblatt des US-amerikanischen Instituts für Sicherheit und Gesundheit am Arbeitsplatz: Explosive Säuren) (16.08.1976).

Um eine mögliche Akkumulation von Azidverbindungen zu vermeiden, die Abwasserrohre nach der Entsorgung des unverdünnten Reagenzes mit Wasser spülen. Natriumazid muss entsprechend den örtlichen behördlichen Vorschriften entsorgt werden.

GHS-GEFAHRSTOFFKLASSIFIZIERUNG

Assay Buffer/ Biotin Conjugate Diluent

ACHTUNG

H317 Kann allergische

Hautreaktionen verursachen.

H319 Verursacht schwere

Augenreizung.

P280 Schutzhandschuhe,

Schutzkleidung und Augenschutz/Gesichtsschutz tragen.

P333+P313 Bei Hautreizung oder -ausschlag: Ärztlichen Rat einholen/ärztliche Hilfe hinzuziehen.

P337+P313 Bei anhaltender Augenreizung: Ärztlichen Rat einholen/ärztliche Hilfe hinzuziehen.

P362+P364 Kontaminierten

Kleidungsstücke ausziehen und vor erneutem Tragen waschen.

Octylphenoxypoly (ethoxyethanol) 1 - 2%

Reaktionsmasse aus:

5-Chloro-2-Methyl-4-Isothiazolin -3-on [EC# 247-500-7] und 2-Methyl-4-Isothiazolin-3-on [EC# 220-239-6](3:1) <

0,05%

AB Biotin Conjugate Concentrate

GEFAHR

H317 Kann allergische

Hautreaktionen verursachen.

Augenschäden.

P305+P351+P338 BEI KONTAKT MIT DEN AUGEN: Einige Minuten lang behutsam mit Wasser spülen. Vorhandene Kontaktlinsen nach Möglichkeit entfernen.

Weiter spülen.

P310 Sofort

GIFTNOTRUFZENTRALE oder Arzt anrufen.

P333+P313 Bei Hautreizung oder -ausschlag: Ärztlichen Rat einholen/ärztliche Hilfe hinzuziehen.

P362+P364 Kontaminierten

Kleidungsstücke ausziehen und vor erneutem Tragen waschen.

Octylphenoxypoly (ethoxyethanol) 1 - 5%

(3)

Reaktionsmasse aus:

5-Chloro-2-Methyl-4-Isothiazolin -3-on [EC# 247-500-7] und 2-Methyl-4-Isothiazolin-3-on [EC# 220-239-6](3:1) <

0,05%

Streptavidin Conjugate RTU

GEFAHR

H226 Flüssigkeit und Dampf entzündbar.

H302 Gesundheitsschädlich bei Verschlucken.

H313 Kann bei Berührung mit der Haut gesundheitsschädlich sein.

H370 Schädigt die Organe.

P210 Von Hitze, heißen

Oberflächen und Funken fernhalten. Nicht rauchen.

P308+P311 BEI Exposition oder falls betroffen: Arzt anrufen.

P312 Bei Unwohlsein

GIFTINFORMATIONSZENTRUM oder Arzt anrufen.

Methanol 1 - 9%

Stopping Solution A GEFAHR

Verätzungen der Haut und schwere Augenschäden.

P301+P330+P331 BEI VERSCHLUCKEN:

Mund ausspülen. KEIN Erbrechen herbeiführen.

P303+P361+P353 BEI BERÜHRUNG MIT DER HAUT (oder dem Haar): Haut mit Wasser abwaschen.

P305+P351+P338 BEI KONTAKT MIT DEN AUGEN: Einige Minuten lang behutsam mit Wasser spülen. Vorhandene Kontaktlinsen nach Möglichkeit entfernen.

Weiter spülen.

P310 Sofort

GIFTNOTRUFZENTRALE oder Arzt anrufen.

Schwefelsäure 1 - 3%

Wash Solution (20X) GEFAHR

H360 Kann die Fruchtbarkeit beeinträchtigen oder das Kind im Mutterleib schädigen.

P201 Vor dem Gebrauch

besondere Anweisungen einholen.

P308+P313 BEI Exposition oder falls betroffen: Ärztlichen Rat einholen/ärztliche Hilfe hinzuziehen.

Borsäure 0,1 - 0,3%

di-Natriumtetraborat-Decahydrat 0,1 - 0,3%

Das Sicherheitsdatenblatt ist auf techdocs.beckmancoulter.com verfügbar.

PROBENENTNAHME, -BEHANDLUNG, -LAGERUNG UND VERDÜNNUNG

Die empfohlenen Proben sind Serum und Lithium-Heparin-Plasma.

Für die Handhabung, Verarbeitung und Lagerung von Blutproben beachten Sie die folgenden Empfehlungen:²⁵

– Bei der Entnahme sämtlicher Blutproben sind die routinemäßigen Vorsichtsmaßnahmen für die Venenpunktion einzuhalten.

– Serumproben vor dem Zentrifugieren vollständig gerinnen lassen.

– Röhrchen stets verschlossen halten.

– Innerhalb von zwei Stunden nach dem Zentrifugieren mindestens 500 μL der zellfreien Probe in ein Lagerröhrchen umfüllen. Röhrchen sofort dicht verschließen.

– Proben dicht verschlossen bei 2 bis 8ºC für höchstens 48 Stunden lagern.

– Wenn der Assay nicht innerhalb von 48 Stunden durchgeführt wird oder die Proben versendet werden, die Proben bei -20 °C einfrieren.

Beim Vorbereiten der Proben die folgenden Richtlinien beachten:

– Sicherstellen, dass Fibrin-Reste und Zellbestandteile vor der Analyse entfernt werden.

– Beachten Sie die Empfehlungen des

Blutentnahmeröhrchen-Herstellers im Hinblick auf das Zentrifugieren.

Jedes Labor sollte die Eignung seiner eigenen Blutentnahmeröhrchen und Serumtrennartikel ermitteln. Diese Artikel können von Hersteller zu Hersteller und mitunter auch von Los zu Los unterschiedlich ausfallen.

Wiederholtes Einfrieren und Auftauen von Proben vermeiden.

Lipämische, ikterische oder hämolytische Proben möglichst nicht zur Analyse heranziehen.

MITGELIEFERTE MATERIALIEN

Kit zur Bestimmung von Inhibin B: 96 mikrotitervertiefungen (Kat.-Nr.

#A81303)

Antikörper beschichtete Mikrotiterstreifen: Ein Streifenhalter

Mit 96 Polystyrol-Mikrotiter-Vertiefungen mit monoklonalen Maus-anti-Activin-B-Antikörper, der an der Innenwand jeder Vertiefung immobilisiert wird.

Bis zum Verfallsdatum bei 2 bis 8 °C in einem wiederverschließbaren Beutel mit Trockenmittel zum Schutz gegen Feuchtigkeit lagern.

Antikörper-Biotin Konjugat-Konzentrat: Ein Fläschchen von 0,4 mL Einer Lösung mit biotinyliertem Anti-Inhibin- α-Untereinheit-Antikörper in einem Puffer mit Protein (Maus), <0,5% ProClin* 300.

Bis zum Verfallsdatum bei 2 bis 8 °C lagern.

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PI-A81303–04 14 of 110 10–30 Minuten vor Gebrauch mit Inhibin B Gen II Biotin-Konjugat- Diluent verdünnen.

Streptavidin-Enzymkonjugat: Eine Flasche von 13 mL(gebrauchsfertig) Mit konjugiertem HRP in einem Puffer mit Protein (Fisch) und <10% Methanol.

Assay-Puffer: Eine Flasche von 8 mL

Mit einem Puffer mit bovinem Serumalbumin (BSA), Protein (bovin, Maus, Ziege), oberflächenaktivem Stoff und <0,5% ProClin 300.

Biotin-Konjugat-Diluent: Eine Flasche von 13 mL(gebrauchsfertig) Mit einem Puffer mit BSA, Protein (bovin, Maus, Ziege), oberflächenaktivem Stoff und <0,5% ProClin 300.

TMB Chromogen-Lösung: Eine Flasche mit 11 mL(gebrauchsfertig) Einer TMB-Lösung in Citratpuffer mit Wasserstoffperoxid.

Waschkonzentrat U (20X): Eine Flasche 50,0 mL Die Flasche enthält Boratpuffer mit TWEEN.**

Die konzentrierte Lösung muss vor Gebrauch verdünnt werden.

Bis zum Verfallsdatum bei 2 bis 8 °C oder Zimmertemperatur (18-25°C) lagern.

Stopplösung A: Eine Flasche mit 11 mL(gebrauchsfertig) Die Flasche enthält 0,2 M Schwefelsäure.

Bis zum Verfallsdatum bei 2 bis 8 °C oder Zimmertemperatur (18-25°C) lagern.

ERFORDERLICHE, JEDOCH NICHT MITGELIEFERTE MATERIALIEN

Zusätzlich zu der Standardlaborausstattung, werden die folgenden Materialien benötigt:

• Inhibin B Gen II Kalibratoren und Kontrollen A81304

• Mikrotiterplatten-Reader für Absorptionsmessung bei 450/405 nm und vorzugsweise für Doppelwellenlänge (Referenzfilter) bei 600 bis 630 nm

• Deionisiertes Wasser

• Präzisionspipette(n) für 10-1000 μL

• Orbitalschüttler für Mikrotiterplatten für 600–800 Umdrehungen pro Minute (U/Min)

• Mikrotiterplatten-Wascher

• Vortexmischer

• Saugfähige Unterlage zum Trocknen der Streifen

• Millimeterpapier zur manuellen Datenauswertung

Die Stopplösung (11 mL) kann separat bestellt werden (Nr. C24811).

Die TMB-Chromogenlösung (11 mL) kann separat bestellt werden (Nr.

DSL-10-9755-1).

DURCHFÜHRUNG

Verfahrenshinweise

• Für die erfolgreiche Nutzung des Inhibin B Gen II ELISA ist ein gründliches Verständnis dieser Packungsbeilage erforderlich.

• Der Kunde ist dafür verantwortlich, die Assays für die gegebene Verwendung zu validieren.

• Um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten, sind präzise Laborverfahren und genaues Befolgen der Packungsbeilage zwingend erforderlich.

• Jeder Assay muss eine Standardkurve enthalten.

• Alle Reagenzien vor Gebrauch auf Zimmertemperatur (18-25ºC) bringen.

• Reagenzien vor dem Gebrauch durch vorsichtiges Schwenken gründlich mischen.

• Keine Kitkomponenten verschiedener Chargen mischen.

• Keine Komponenten nach dem auf dem Etikett angegebenen Verfallsdatum verwenden.

• Unvollständiges Waschen verfälscht das Ergebnis und die Assay-Präzision.

• Um einen potentiellen Drift des Assays aufgrund unterschiedlicher Substrat-Inkubationszeiten zu vermeiden, sollte darauf geachtet werden, die Stopplösung in der gleichen Reihenfolge und mit der gleichen Geschwindigkeit in die Vertiefungen zu geben wie die TMB Chromogen-Lösung.

• Mikrobielle Kontamination der Reagenzien vermeiden. Dies gilt insbesondere für Konjugat und Puffer.

• Kontamination der TMB Chromogen-Lösung mit den Konjugaten vermeiden.

• Für die Reagenzien, Kalibratoren, Kontrollen und Proben jeweils eine saubere Einweg-Pipettenspitze verwenden.

• Zum Pipettieren von Schwefelsäure und TMB Chromogen-Lösung Pipetten mit Metallteilen vermeiden.

• Das als Marker verwendete Enzym wird durch Sauerstoff inaktiviert und reagiert hoch empfindlich auf mikrobielle Kontamination, Natriumazid, Hypochlorsäure und aromatische Chlorkohlenwasserstoffe, die in den Wasseraufbereitungsanlagen von Laboren häufig vorkommen.

• Deionisiertes Wasser verwenden.

• Reagenzien bei Lagerung und Inkubation nicht übermäßiger Wärme oder direktem Sonnenlicht aussetzen.

Reagenzienvorbereitung

1. Waschlösung: Ein Fläschchen Waschkonzentrat mit 950 mL destilliertem Wasser verdünnen und gründlich mischen. Die verdünnte Lösung kann in einer fest verschlossenen Flasche einen Monat lang bei 18–25 °C oder bis zum Verfallsdatum des Kits bei 2–8 °C aufbewahrt werden.

2. Inhibin B Gen II Antikörper-Biotin-Konjugat: Das Inhibin B Gen II Antikörper-Biotin-Konjugatkonzentrat sollte entsprechend der Anzahl der verwendeten Vertiefungen im Verhältnis 1 Teil auf 50 Teile Inhibin B Gen II Biotin-Konjugat-Diluent verdünnt werden. Für eine gesamte Platte genau 220 μL des Konzentrats in 11 mL Inhibin B Biotin-Konjugat-Diluent pipettieren.

HINWEIS: Das Antikörper-Biotin-Konjugatkonzentrat sollte 10–30 Minuten vor Gebrauch frisch verdünnt werden.

3. Mikrotitervertiefungen:Die Anzahl der für den Assay erforderlichen Vertiefungen bestimmen. Die übrigen, unbenutzten Vertiefungen sollten in wiederverschließbaren Beuteln zum Schutz gegen Feuchtigkeit aufbewahrt werden.

Testdurchführung

Alle Proben und Reagenzien Zimmertemperatur (18-25°C) erreichen lassen.

Reagenzien vor dem Gebrauch durch vorsichtiges Schwenken mischen.

Nach Rekonstituierung Reagenzien gründlich, aber ohne Schaumbildung mischen. Kalibratoren, Kontrollen und Proben sollten als Doppelbestimmung durchgeführt werden.

1. Die zu verwendenden Mikrotiterstreifen kennzeichnen.

2. 50 μL der Kalibratoren, Kontrollen und Proben in die entsprechenden Vertiefungen pipettieren.

3. In jede Vertiefung mit einer Multipipette 50 μL des Inhibin B Gen II Assay-Puffers hinzugeben.

4. Die Vertiefungen auf einem Orbitalschüttler für Mikrotiterplatten mit 600–800 U/Min für zwei Stunden bei Zimmertemperatur (18-25°C) inkubieren.

5. Während der letzten 10–30 Minuten der Inkubation die Inhibin B Gen II Antikörper-Biotin-Konjugatlösung vorbereiten, wie im Abschnitt

„Vorbereitung der Reagenzien“ dieser Packungsbeilage beschrieben ist.

6. Jede Vertiefung fünf Mal aspirieren und mit Waschlösung waschen.

Dies kann automatisch mit einem Mikrotiterplatten-Wascher oder manuell mit einer Präzisionspipette erfolgen. Platte dekantieren und auf einer saugfähigen Unterlage trocken klopfen.

HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, einen automatischen Mikroplatten- Wascher zu verwenden. Unvollständiges Waschen verfälscht die Assay-Präzision. Wenn kein Mikrotiterplatten-Wascher verfügbar ist, befolgen Sie diese Schritte, um die Platten manuell waschen:

.

(5)

(a) Flüssigkeit aus jeder Vertiefung vollständig absaugen und dekantieren .

(b) In jede Vertiefung mit einer Multipipette 350 μL der Waschlösung geben .

(c) Flüssigkeit erneut absaugen und dekantieren .

(d) Schritte (b) und (c) vier Mal wiederholen

7. In jede Vertiefung mit einer Multipipette 100 μL der Inhibin B Gen II Antikörper-Biotin–Konjugatlösung zugeben.

8. Vertiefungen inkubieren, bei 600–800 U/min eine Stunde lang bei Raumtemperatur (18–25 °C) mit einem Mikrotiterplatten-Orbitalschüttler schütteln.

9. Jede Vertiefung fünf Mal absaugen oder dekantieren und mit Waschlösung und einem automatischen Mikrotiterplatten-Wascher waschen. Platte dekantieren und auf einer saugfähigen Unterlage trocken klopfen.

10. In jede Vertiefung mit einer Multipipette 100 μL der Inhibin B Gen II Streptavidin-Enzymkonjugatlösung zugeben.

11. Die Vertiefungen auf einem Orbitalschüttler für Mikrotiterplatten mit 600-800 U/Min für 30 Minuten bei Zimmertemperatur (18-25°C) inkubieren.

12. Jede Vertiefung fünf Mal absaugen oder dekantieren und mit Waschlösung und einem automatischen Mikrotiterplatten-Wascher waschen. Platte dekantieren und auf einer saugfähigen Unterlage trocken klopfen.

13. In jede Vertiefung mit einer Multipipette 100 µL der TMB Chromogen-Lösung hinzugeben.

Nicht dem direkten Sonnenlicht aussetzen.

14. Die Vertiefungen auf einem Orbitalschüttler für Mikrotiterplatten mit 600–800 U/Min für 8 bis 12 Minuten bei Zimmertemperatur (18-25°C) inkubieren.

HINWEIS: Beachten Sie, dass sich die Farbe je nach tatsächlicher Zimmertemperatur schneller oder langsamer als in der angegebenen Inkubationszeit entwickeln kann. Die Inkubationszeit kann durch Beobachtung der Farbentwicklung optimiert werden.

15. In jede Vertiefung mit einer Präzisionspipette 100 μL der Stopperlösung zugeben.

16. Die Absorption der Lösung in den Vertiefungen innerhalb von 30 Minuten ablesen. Dafür einen Mikrotiterplattenleser verwenden, der auf 450 nm eingestellt ist.

HINWEIS:

1) Beim Messen der Absorption der Mikrotiterplatten-Vertiefung muss der Nullkalibrator als „Leerwert“ programmiert werden.

2) Wenn eine Wellenlängenkorrektur verfügbar ist, Instrument auf duale Wellenlängenmessung bei 450 nm mit einer Hintergrund-Wellenlängenkorrektur zwischen 600 und 630 nm einstellen.

ERGEBNISSE

1. Den Absorptionsmittelwert für jeden Kalibrator, jede Kontrolle oder jede Probe berechnen.

2. Mittlere Absorption des Kalibrators 0 (Leerwert) von der mittleren Absorption der Kalibratoren 1-6, Kontrollen und Proben abziehen.

Den Logarithmus der mittleren leerwertkorrigierten Absorptionswerte für die Kalibratoren 1-6 auf der Y-Achse gegen den Logarithmus der inhibin B-Konzentrationen in pg/mL auf der X-Achse unter Verwendung einer Kurvenanpassung einer kubischen Regression auftragen. Alternativ können die Daten ebenfalls logarithmisch gegeneinander aufgetragen werden und es kann eine lineare Kurvenanpassung verwendet werden.

3. Die inhibin B-Konzentration der Kontrollen und Proben kann anhand der Standardkurve bestimmt werden, indem deren mittlere Absorptionswerte mit den entsprechenden inhibin B-Konzentrationen verglichen werden.

4. Alle Proben, die dem höchsten Kalibrator liegen, sollten entsprechend mit pg/mL-Kalibrator 0 verdünnt und erneut analysiert werden.

5. Alle Proben mit einem gemessenen Wert unterhalb der Analyseempfindlichkeit sollten als solche ausgewiesen werden.

6. Den Wert bei Bedarf mit einem Verdünnungsfaktor multiplizieren.

HINWEIS: Wenn die Absorptionswerte die Grenzwerte des Plattenlesers überschreiten, ist eine zweite Messung bei 405 nm notwendig (Referenzfilter zwischen 600 und 630 nm, falls verfügbar).

In diesem Fall ist eine zweite Kalibrierungskurve wie oben zu erstellen, und zwar mit den Absorptionswerten aller Kalibratoren bei 405 nm.

Die Konzentrationen der Proben außerhalb des Messbereichs bei 450 nm werden dann von der neuen Kalibrierungskurve abgelesen.

Die Messungen bei 405 nm sollten die maßstabsgetreuen Messungen bei 450 nm nicht ersetzen.

Standardkurve

Kalibratoren Konz. (pg/mL) ABS B/Bmax (%)

0 0 0,046 (blank) -

1 10 0,035 1,10

2 31 0,117 3,68

3 101 0,436 13,7

4 259 0,941 29,6

5 560 1,929 60,7

6 1 177 3,179 100

ABS = Extinktion

(Beispiel einer Standardkurve, nicht zur Berechnung benutzen).

ERWARTETE WERTE

Jedes Labor sollte seine eigenen Referenzbereiche erstellen, um sicherzustellen, dass spezifische Populationen korrekt repräsentiert werden.

Serumproben wurden von Lieferanten erworben oder waren Aliquote früherer Untersuchungen, die in Gefrierschränken gelagert wurden. Diese Proben wurden mithilfe des Inhibin B Gen II-Kits vor Ort analysiert. Die erwarteten Bereiche für inhibin B wurden unter Verwendung einer 85-95%

nicht-parametrischen Auswertung mit Analyse-it*** für Microsoft Excel****

berechnet.

Proben Median Alter (Jahre)

Median in (pg/mL)

2,5–97,5 Perzentile in

(pg/mL) Männer, zufällig

(N=235)

35 166 25-325

Frauen, zufällig (N=95)

30 47 ND-341

Frauen, 3.

Zyklustag (N=106)

NA 75 ND-273

Postmenopausale Frauen (N=20)^†

74 ND ND-4

Jungen (N=15)^†† 11 93 4-352

Mädchen (N=15)^††

11 18 ND-83

ND = Nicht nachweisbar

†90% nicht-parametrisch

††85% nicht-parametrisch

QUALITÄTSKONTROLLE

• Jedes Labor sollte Mittelwerte und akzeptable Bereiche festlegen, um das richtige Leistungsverhalten sicherzustellen.

• Die Grenzwerte für Inhibin B Gen II ELISA-Kontrollen werden mit dem Inhibin B Gen II Calibrator and Control-Kit mitgeliefert.

• Eine vollständige Standardkurve und Kontrollen mit niedriger und hoher Konzentration sollte Bestandteil eines jeden Assays sein.

• Eine vollständige Standardkurve und Kontrollen mit niedriger und hoher Konzentration sollten Bestandteil eines jeden Assays sein.

• Die TMB Chromogen-Lösung sollte farblos bis zu sehr hell gelb sein.

Die Entwicklung einer blauen Farbe deutet auf Reagenzkontamination oder Instabilität hin.

• Materialien zur Qualitätskontrolle simulieren die Eigenschaften von Patientenproben und sind von grundlegender Bedeutung für die Überwachung der Systemleistung von immunochemischen Assays. Kitinterne Kontrollen oder andere handelsübliche Qualitätskontrollmaterialien sollten mindestens zwei Analytkonzentrationen abdecken. Ein häufigerer Einsatz von Kontrollen oder die Verwendung zusätzlicher Kontrollen bleiben dem Benutzer überlassen, basierend auf den GLP-Regeln oder Laborakkreditierungsanforderungen und geltenden Gesetzen.

Die Herstelleranweisungen für Rekonstituierung und Lagerung befolgen. Jedes Labor sollte Mittelwerte und akzeptable Bereiche festlegen, um das richtige Leistungsverhalten sicherzustellen.

Qualitätskontroll-Ergebnisse, die sich außerhalb der festgelegten

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PI-A81303–04 16 of 110 Bereiche bewegen, weisen möglicherweise auf ungültige Testergebnisse hin.

• Im Falle von Verpackungsschäden oder einer

Leistungbeeinträchtigung des Produkts, kontaktieren Sie bitte unseren technischen Dienst. E-mail: imunochem@beckman.com

SPEZIFISCHE LEISTUNGSMERKMALE

(Für mehr Details, siehe die Beilage “APPENDIX”).

Repräsentative Daten dienen nur der Veranschaulichung. Die in einzelnen Labors erzielten Leistungen können anders ausfallen.

Empfindlichkeit Nachweisgrenze:

Der Inhibin B ELISA-Assay hat eine Nachweisgrenze (LoD) von 2,91 pg/mL, getestet anhand eines auf CLSI EP17-A2 basierenden Protokolls.²⁶ Quantifizierungsgrenze:

Der Inhibin-B-ELISA-Assay hat eine Messbereichsgrenze (LoQ) von 7,24 pg/mL mit einer Interassay-Ungenauigkeit von ≤20% CV, getestet anhand eines auf CLSI EP17-A2 basierenden Protokolls.²⁶

Spezifität

Das im Assay verwendete, stark charakterisierte Antikörperpaar misst 100 % Inhibin B bei Menschen, Affen und Ratten. Die folgenden potenziellen Kreuzreaktanten (Inhibin A, Activin A, Activin B, Activin AB, AMH, FSH, LH und Follistatin 315) wurden in mindestens zweifacher physiologischer Konzentration zur Serum-Matrix hinzugefügt und analysiert. Jedwede Inhibin-B-Werte, die bei Vorhandensein eines jeden Kreuzreaktanten erfasst wurden, waren nicht nachweisbar.

Präzision Intra-Assay

Serumproben aus derselben Serie wurden 25-mal getestet. Der Variationskoeffizient betrug ≤5,6%.

Inter-assay

Serumproben wurden in 10 Ansätzen getestet. Der Variationskoeffizient war

≤6,6%.

Genauigkeit Verdünnungstest

Hoch konzentrierte Proben wurden mit Nullkalibrator verdünnt. Die erhaltene Wiederfindung befindet sich zwischen 92,9 % und 110 %.

Wiederfindungstest

Proben mit geringen Konzentrationen wurden mit bekannten Mengen von Inhibin B versetzt. Die ermittelten prozentualen Wiederfindungswerte lagen zwischen 94,5 % und 105 %.

Messbereich(von der Nachweisgrenze bis zum höchsten Kalibrator):

2,91 bis ungefähr 1.000 pg/mL.

EINSCHRÄNKUNGEN

• Die in diesem Kit gelieferten Reagenzien sind auf die Messung von Inhibin B Konzentrationen in Serum und Lithium-Heparin-Plasma optimiert.

• Bei der Verwendung von Antikörpern besteht die Möglichkeit einer Interferenz durch heterophile Antikörper in der Probe. In Proben von Personen, die regelmäßig mit Tieren in Kontakt waren oder die einer Immuntherapie oder einem diagnostischen Verfahren mit Immunoglobulinen oder Immunoglobulinfragmenten ausgesetzt waren, können Antikörper enthalten sein, z. B. humane Anti-Maus-Antikörper (HAMA), die eine Interferenz im Immunoassay verursachen. Zusätzlich dazu können andere heterophile Antikörper wie humane Anti-Ziegen-Antikörper in Proben vorhanden sein.^27,28

• Fläschchen nicht benutzen, die Anzeichen für eine mikrobielle Kontamination zeigen oder stark getrübt sind.

• Die Inhibin B Gen II ELISA-Ergebnisse sollten im Zusammenhang mit dem gesamten klinischen Bild des Patienten interpretiert werden, einschließlich: Symptome, klinische Vorgeschichte, Daten anderer Tests sowie andere relevante Informationen.

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APPENDIX

PERFORMANCE CHARACTERISTICS

Representative data are provided for illustration only. Performance obtained in individual laboratories may vary.

Interference

When potential interferents (hemoglobin, triglycerides, bilirubin and human serum albumin), were added at least at two times their physiological concentration, inhibin B concentrations were within ±10% of the control as represented in the following table.²⁹

Interferents Analyte conc.

Unspiked sample (pg/mL)

Spiked sample (pg/mL)

% Difference to reference

Hemoglobin 2 mg/mL 102.66 93.91 -8.5

Triglycerides 20 mg/mL 96.81 99.02 2.3

Bilirubin 0.6 mg/mL 91.40 97.06 6.2

Human serum albumin

60 mg/mL 97.63 103.90 6.4

Precision Intra-assay

Serum samples S1 S2 S3

Number of determinations 25 25 25

Mean value, (pg/mL) 82.72 235.7 1,146

C.V., % 2.91 4.71 5.61

Li-Hep plasma sample H1 H2 H3

Mean value, (pg/mL) 65.34 139.9 945.6

C.V., % 4.87 4.53 4.18

Inter-assay

Serum samples S1 S2 S3

Mean value (pg/mL) 24.36 354.4 1065

C.V., % 6.57 4.78 2.15

Li-Hep plasma sample H1 H2 H3

Mean value (pg/mL) 68.91 146.0 995.5

C.V., % 7.83 7.46 3.89

Accuracy Dilution test

Three serum and lithium-heparin plasma samples were diluted with 0 pg/mL Inhibin B calibrator and assayed.

Inhibin B (pg/mL) Serum

samples

Dilution

factor Measured Expected

Ratio (%) Measured/

Expected

S1 - 1,032 - -

1:2 552.4 515.8 107.1

1:4 284.2 257.9 110.2

1:8 140.4 128.9 108.9

1:16 66.17 64.47 102.6

S2 - 701.2 - -

1:2 344.4 350.6 98.24

1:4 176.6 175.3 100.8

1:8 88.79 87.66 101.3

1:16 42.39 43.83 96.72

S3 - 606.7 - -

1:2 300.8 303.4 99.15

1:4 145.9 151.7 96.20

1:8 74.57 75.84 98.32

1:16 35.24 37.92 92.93

Inhibin B (pg/mL) Li-Hep

plasma sample

Dilution

factor Measured Expected

Expected

H1 - 743.3 - -

1:2 359.1 371.7 96.63

1:4 188.6 185.8 101.5

1:8 93.85 92.91 101.0

1:16 47.77 46.46 102.8

H2 - 676.0 - -

1:2 312.6 338.0 92.49

1:4 159.9 169.0 94.62

1:8 85.21 84.50 100.8

1:16 42.82 42.25 101.4

H3 - 1158 - -

1:2 578.3 579.0 99.87

1:4 283.6 289.5 97.97

1:8 137.7 144.8 95.11

1:16 60.04 72.38 82.95

Recovery test

Known amount of Inhibin B was added to 5 serum or lithium-heparin plasma samples and assayed according to the procedure of the kit.

Serum samples

Endog.

conc.

(pg/mL)

Added conc.

(pg/mL)

Expected conc.

(pg/mL)

Measured conc.

(pg/mL)

Expected

S1 72.44 17.33 89.77 91.49 101.9

73.68 53.19 126.9 129.8 102.3

70.58 101.4 171.9 180.1 104.7

S2 45.82 12.32 58.13 59.43 102.2

46.37 37.68 84.05 83.87 99.78

44.96 73.06 118.0 123.9 105.0

S3 27.05 7.519 34.57 35.93 103.9

25.69 21.55 47.24 46.31 98.03

26.74 44.93 71.67 70.87 98.89

S4 63.97 21.31 85.28 86.27 101.2

65.36 65.09 130.5 127.7 97.92

62.84 108.8 171.7 166.9 97.24

S5 47.45 15.17 62.62 62.85 100.4

48.18 46.04 94.22 88.99 94.45

46.40 88.67 135.1 129.6 95.94

Li-Hep plasma sample

Endog.

conc.

(pg/mL)

Added conc.

(pg/mL)

Expected conc.

(pg/mL)

Measured conc.

(pg/mL)

Expected

H1 19.63 6.87 26.50 28.61 108.0

18.54 19.36 37.91 40.19 106.0

19.45 41.23 60.68 55.98 92.26

H2 25.50 7.52 33.02 33.43 101.2

23.95 21.10 45.06 46.78 103.8

25.23 45.67 70.89 66.64 94.00

H3 48.28 14.07 62.34 63.78 102.3

49.29 43.70 92.99 84.85 91.24

47.36 83.97 131.3 114.5 87.18

H4 60.11 17.59 77.70 79.46 102.3

61.71 54.92 116.6 117.8 101.0

59.13 97.44 156.6 141.3 90.25

H5 51.62 15.39 67.01 66.41 99.10

52.83 47.63 100.5 93.24 92.81

50.56 91.65 142.2 132.9 93.48

(8)

Method Comparison

The Inhibin B Gen II (A81303) has been compared to two commercially available assays (Oxford Bio-Innovation (OBI) and Diagnostics Systems Laboratories (DSL)) using 60 serum male and 60 serum female samples, ranging in age from 20–50 years. Linear regression analysis of the results yielded the following:

Regression using n = 120 serum samples:

Inhibin B Gen II = 1.03 (OBI) - 6.77 pg/mL (r = 0.99; P < 0.0001)

Inhibin B Gen II = 1.57 (DSL-10-84100) + 11.29 pg/mL (r = 0.97; P < 0.0001)

PI-A81303–04 108 of 110

(9)

TRADEMARKS

Beckman Coulter, the stylized logo, and the Beckman Coulter product and service marks mentioned herein are trademarks or registered trademarks of Beckman Coulter, Inc. in the United States and other countries.

*ProClin^TMis a trademark of The Dow Chemical Company (“Dow”) or an affiliated company of Dow.

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***Analyse-it is a trademark of Analyse-it Software, Ltd.

****Microsoft and Microsoft Excel are trademarks of Microsoft Corporation.

24 July 2019

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Chemistry, EP7-A2. November 2005. Clinical and Laboratory

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Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύμβολα

REF Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N.–Cat.: / Αριθμός - Κατ .:

LOT Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθμός - Παραγωγή : Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιμοποιείται από :

No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθμός εξετάσεων :

CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συμπύκνωμα LYO Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασμένο

IVD

In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In- Vitro Διάγνωση.

Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης .

Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell’uso. / Διαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση.

Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l’abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται μακριά από θερμότητα και άμεση επαφή με το φως του ηλίου.

Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους :

Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός : Caution! / Vorsicht! / Attention! / ¡Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή !

Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED.

Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben.

Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit.

Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS.

Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS.

Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT.

Για τα σύμβολα των συστατικών του κιτ συμβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ.

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