HS 2007 Xiangyang Zhang 1
Analytische Chemie
für Biologie Pharmazie Bewegungs- wissenschaften und Sport
Teil Chromatographische und Elektrophoretische Trennverfahren
Zusammenfassung
Überblick Trennmethoden
Beweblichkeit
in Einzelphase Gleichgewicht Beweblichkeit
1+ 2++1
2 m
S
Verteilung Adsorption/Desorption
Beruht auf
Unterschied in Gleichgewicht / Kinetische Eigenschaften
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Ein Chromatogramm
normierte Signalhöhe h
t
Mt
At
Bw
Aw
B ZeitB A
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Klassische Grundlage
!
K = [ ] A
S[ ] A
M!
v = L t
R!
u = L t
M!
k = K V
sV
M!
k = t
R" t
Mt
M= t
R't
M" = K
BK
A" = k
Bk
A" = (t
R')
B(t
R')
A!
N = N
eff" k + 1 k
#
$ % &
' (
2
= t
R')
#
$ % &
' (
2
" k + 1 k
#
$ % &
' (
!
2N = L H = t
R2"
2= 16 t
Rw
#
$ % &
' (
2
!
t
R'= t
R" t
MTrennfaktor / Selektivätsfaktor Retentionsfaktor / Kapazitätsfaktor Retentionszeit / Geschwindigkeit Verteilungskoeffizient
Auflösung
!
H = L 16
w t
R"
# $ %
&
'
2
Bodenzahl und Bodenhöhe
!
R = t
B" t
Aw
B+ w
A2
= 2(t
B" t
A) w
B+ w
AR = " # 1
"
$
% & ' ( ) * k
B1 + k
B* N
4
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Kinetischer Bodenhöhe
Minimaler H-Wert
Theoretische BodenhöheH
!
H = 2 " # d
p+ 2k
D# D
Mu + u # f (d
p2, d
c2)
D
M+ q # k # d
f2(1+ k)
2D
Soder 2t
d# k (1+ k)
2$
% & '
( )
optimale u
Minimum H1. Kapillarsäulen A = 0 2. Optimale u => minimum
von Terme B und C 3. Dünne L-Filmdicke
Gaschromatographie (GC)
Mobile Phase: He, N
2und H
2als Träger
Stationäre Phase: entweder feste Adsorbentien oder flüssige Film Analyten:
• ausreichenden Dampfdruck und
• stabil bei Arbeitstemperatur
• Kleine, neutral und nicht-zu polare Moleküle Gekoppelt:
• mit MS zur qualitativen Analysen (Strukturaufklärung)
• mit FID (und TCD, unselektiv) und ECD (Cl-), FPD (P-/S-) (selektiv) zur quantitativen Analysen
GC:
am häufigsten verwendete analytische Technik im Labor oder in
der Industrie; 30,000 Geräte pro Jahr (1 Mrd US$ pro Jahr)
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Flüssige SP in GC
Physikalisch adsorbiert auf poröse Kieselgur (diatomite) mit grossen Oberfläche Chemikalische Modifizierung von OH-gruppen durch organische Seitengruppen
Si CH3 CH3
O n
Si CH3 CH3
O n
Si Ph Ph
O m
Si CH3 CH3
O n
Si Ph
O
m CN
Si O
n O
O
COOH O O
OOC
n Polysiloxan
unpolar polar
mit Phenylgruppe mit Cyanogruppe
Ethyleneglycol Ethyleneglycol, Phenyl, und Ester-gruppen
Polare Flüssigkeitsfilm
k N
Säulenparameter
und Bedingung
Kapazität Geschwindigkeit
R
! ! !
L ! ! " !
" ! "
ID ! ! " "
! ! "
d
f! ! " ! "
" ! !
T ! ! !
" !
! ! opt
u ! ! ! opt
Optimierung zur GC
Polarität und Flimdicke der SP, u der MP, T und Säulenparameter
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HPLC: Apparatur, Typen und MP
300 – 400 bar LM 10 ml/min He/Ar
LM Behälter
Detektor
Vorsäule Pumpe
Injektorvalve LM Aufteilungsvalve
Trennsäule
!
Adsorptions-Chromatographie
!
Verteilungs-Chromatographie
! Umkehrphasen-Chromatographie
" Ionenaustausch-Chromatographie (IEC)
" Ionenpaaren-Chromatographie
" Grössenausschluss-Chromatographie (GPC)
#
Affinitäts-Chromatographie
#
Komplexierungschromatographie
#
Chirale Chromatographie Mobile Phase:
Reinheit, Siedepunkt, Preis, Inert, Korrosions-beständigkeit,
Toxizität, UV–Durchlässigkeit, Brechungsindex, Mischbarkeit, Puffer, Haltbarkeit
"
Viskosität
"
Elutionsstärke
"
Selektivität
Normalphase (NP) und Umkehrphase (RP)
Si O OH
O Si
Si
O OH
O Si O OH
OH
Si
Si O O
O Si
OH
OH OH single
silanol group
two silanol group
three silanol group
Si OH
Si R2
Cl R
R1
Modifikation:
Si R1
R2 R Si
O
NP: SiO2
, Al
2O
3und modifizierte
polare GruppenO Si R1
R2
CN O Si
R1
R2
NH2
O Si R1
R2
O OH
OH
RP: unpolare straight-chain hydrocarbons (C18
, C
12, C
8, C
6, C
4, C
3, C
2, C
1) und cyclohexyl, phenyl, alkylphenyl
O Si R1
R2 R
R = C1 – C18 O Si
R1
R2 O Si
R1
R2
O Si R1
R2
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HPLC: Ionenchromatographie
Ionenaustauschchromatographie: um ionische Verbindunen zu trennen
• SO3–H+ (Sulfonsäure): stark saurer Kationenaustauscher, pH 2 – 14
• COO–H+ (Carbonsäure): schwach saurer Kationenaustauscher, pH 8 – 14
• NR3+OH– (quaternäres Amin): stark basischer Anionenaustauscher, pH 0 – 10
• NR2 (tertiäres Amin): schwach basischer Anionenaustauscher, nur bei niedrigem, pH 0 – 6.
Ionenpaar: um die organische grösse Ionen zu trennen
ein Ionenpaarbildner (sogenanntes Gegenion) als Hilfskomponente wird der mobilen Phase zugesetzt, um neutral Ionenpaar zu bilden, dann kann man die Umkehrphasen-Säule benutzen.
$ das Anion der Heptansulfonsäure für kationische Proben
$ das Tetrabutylammoniumion (Phosphat) für anionische Proben
HPLC: Größenausschlusschromatographie
!
t
R" 1
log
10MW
CH3(CH2)nCOOH
SP: 5 nm – 0.1 mm Ausschluss-/Eindringen-grenze, Kein Wechselwirkung
Geeignet für 10% Unterschied in MW; Biopolymer, Polymer, Organische Moleküle
Mechanismus: Grösse / Mol RadiusAusschluss Eindringen
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Dünnschichtchromatographie (HP–TLC)
Normal Silica / Alumina TLC, HPTLC plates C18-50 (50% silanization) and C18-100 (100%
silanization) with fluorescent indicator
!
R
f= S
xS
fSelektivität und Trennleistung
Wahl des Laufmittels (Rein oder Gemisch)
für HPLC und Reaktionsablauf
Elektrophorese (EP): Apparatur
• L: 10-100 cm
• ID 10-100 !m Probenaufgabe (1-10 nl) durch
• Hydrostatische Injektion (Siphoneffekt)
• Druck/Vakuum Injektion (Druckdifferenz)
• Elektrokinetische Injektion (!EOF, !EP)
• UV – 10–6 mol/L
• Fluoreszenz – Attomol
• Kopplung an MS
On-column (durchsichtlich)
Fused silica mit Polyimidbeschichtung
bis 30 kV
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Grundlage zur Elektrophorese
!
!
N = µ " V
2 " D
!
µ = µ
EP+ µ
EOF!
µ
EO= " # $ 4 % # &
!
µ
EP= v
iE = z
i" e
06 # " $ " r = q
6 # " $ " r
Elektrophoretische Mobilität
Elektroosmotische Mobilität
– N +
Kapillare
Kathode
–
Stempelförmig elektrochemische Doppelschicht
Totalmobilität:
Elektrophoretische Trennverfahren
CE -Modu s Trennprinzip Anwendung CZE EP + EOF Anionen, Kationen und Neutral (1) CPE EP + EOF + SEC Ionen mit Grössenunterschied ITP EP + V-Grad + EOF Ionen mit Ladungsunterschied IEF EP + pH-Grad + EOF Aminosäuren mit pI-Unterschied
MEKC EP + EOF + Verteilung Anionen, Kationen und mehr Neutrale ( ! 2) CEC EOF + Verteilung + EP Polar/unpolar + geladene/ungeladene M
UV-Vis- und Fluoreszenz-, auch MS Detektoren können eingesetzt werden
"
keine oder geringe Bandenverbreiterung (flaches EOF Strömungsprofil)
"
keine feste stationäre Phase, extrem wenig Lösungsmittelverbrauch
"
nur kleine Probenmengen nötig schnelles Verfahren (10 - 20 Minuten)
"
hohe Trennleistung
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Zusammenfassung
GC LC EP
MP He, H2, N2 LM (elutionsmittel) Pufferlösung SP Film-df/Polarität NP, RP, IC, SEC, … –––––
Säule (Kapillar) ID, L, Kapizität ID, L, df (kompakt) ID, L
Parameters Flussrate (u), T Flussrate (u) pH, Spannung (V)
Gradient- T- Elutions-, (T-) pH-, V-
Prinzip G/L Verteilung L/L Verteilung EP und EOF Detektor FID (ECD) / MS UV, RI, ELSD / MS UV, Fl / MS
Anwendungen Klein, neutral, thermostabil, nicht-zu-polare
Alle (auch polare bei RP, Polymere bei SEC)
Ionische (auch Neutrale bei MEKC)
Aufgabe der Analytischen Chemie
Die Art (qualitativ) und Anzahl (quantitativ) der Atome allein (Elementanalytik) oder zusammen mit ihrer Anordnung oder Verbindung untereinander als Molekül (Molekülanalytik) im 3- dimensionalen Raum (Strukturanalytik), die alle die Eigenschaften
eines Stoffes bestimmen Was liegt vor?
Wieviel davon liegt vor?
Welche Anordnung oder Form liegt vor?
Wo befindet sich der Analyt?
Verteilungs- oder OberflächenanalyseQualitative Analyse
Quantitative Analyse
Strukturanalyse
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Trennstrategie
Qualitativ
Quantitativ
Strukturaufklärung Identifizierung mit Bekanntem Stoff
Kalibrieren Kopplung mit IR,
UV/Vis, NMR, MS Peakzuordnung Fragmentierung Spektrendatenbank
Retentionszeiten Retentionsindizes
Selektiv Detektor
mit externem Standard mit internem Standard
Standardaddition Mengenbestimmung
Analysenzweck
Frage- stellung
Probe- nahme
Probe- Vorbe- reitung
Aus-
wertung Statistik Report Messung
Probenaufbereitung
Feststoff
Aerosol
Emulsion
Suspension
Flüssigkeitstropfen feste Teilchen Gas
Flüssigkeit
(unlöslich Feststoff)
Homo- und Heterogenes Stoffgemisch
(2 unmischbar Flüssigkeiten)
LLE, SPE, SPM, SPME Extraktion
Batch-E Soxhlet-E Soxtec-E Ultraschall-E MAE, ASE SPE, SWE Adsorption
Filtration
GCHPLC EP
mit
MS NMR IR UVLöslich oder unlöslich
Aufkonzentrierung
Aufreinigung
Vortrennung und AnreicherungProbenarten
Messung
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Analytmoleküle
!
Analysenzweck: Qualitativ / Quantitativ
!
Kleine, neutral, und thermostabil => GC
!
Kleine, ionische => IC und EP
!
GC nicht-geeignet => HPLC
!
Thermoempfindlich
!
zu polar und zu hohe Siedpunkt (wenig flüchtig)
"
derivatisieren
!
Grosse Biopolymere: HPLC, EP und IC
!
Polymere: SEC
Auswahl einer Flüssig-chromatographie
$
Polarität
$
Löslichkeit
$
Ionenisch
$
Molekulare Masse
NP RP
Ausschluss
• Geeignet für Sehr polare und thermisch labile Substanzen
• Geeignet für Ionische Verbindungen, Biopolymere und Polymere
• Analytische, Präparative und Produktive
• Grosse Auswahl und Hohe Trennleistung Selektivität
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Optimierungsfaktoren
• System – Säule (stationäre Phase) und mobile Phase (Polarität)
• Analyteneigenschaften
• Operationsbedingungen (Fliessrate, Temperatur und LM-Gradientenelution)
!
" = K
BK
A!
k = K V
sV
M!
N = L H
!
H = A + B
u + C " u
SP und Analyten Ideal: k = 5 - 10 Analyten SP und MP Temperatur
Säulenlänge Bodenhöhe
stark beinflusst durch u, D, df und dp
!
R = " # 1
"
$
% & ' ( ) * k
21 + k
2* N 4
!
t
R= 16R
S2H
u " #
# $ 1
%
&
' (
) * " ( 1 + k
2)
3k
22Kurze Retentionszeit t
R’ genuge Auflösung R
idealer Peakform (schmal w
bund symmetrisch)
Derivatisierung
$ Online: Vor- (für höhe Trennleistung) und Nach- (mit UV/Fl Marker für selektive und empfindliche Detektion )
$ Offline: bei der GC für flüchtig und zu schwer
$ Schnell, sauber, Reagenzien mischbar mit MP, Produkte löslich in MP
-NH
2(Amine, Aminosäuren) 5-(N,N-Dimethylamino)- naphthalin-1-sulphonylchlorid 2,4-dinitrofluorbenzol
-OH (Alkohole) 3,5-Dinitrobenzochlorid Silylierungsreagenzien
-CHO (Aldehyde) 2,4-Dinitrophenylhydrazin (DNPH) -C(O)R (Ketone) 4-Hydroazino-7-nitrobenzofurazan -COOH (Säuren) 4-Brommethyl-7-methoxycoumarin
-SH (Thiole) Dansylaziridin
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Beispiel 1
Schlagen Sie eine Trennmethode vor, um
eine Gemisch von Nucleotid- monophosphaten, -diphosphaten, und -triphosphaten
wie CMP, AMP und GMP, CDP, UDP, ADP, GDP, CTP, UTP, ATP und GTP in ppm-Bereich qualitativ und quantitativ zu bestimmen.Trennsäule: IonPac AS4A Eluten:
Wasser (A) / 0.5 M NaH2PO4, pH 3.4 mit H3PO4 (B)
Gradient: linear, 3% B auf 100% B in 40 min Durchflussrate: 1.5 ml/min
Detektion: UV (254 nm) Injektionsvolumen: 50 !l
Übungen
Eine Gemisch von 42 physiologisch relevanten Aminosäuren in Konzentration (10 nmol)
Pser (1), Tau (2), PETA (3), Urea (4), Asp (5), HO-Pro (6), Thr (7), Ser (8), Asn (9), Glu (10), Gln (11), Sarc (12), AAAA (13), Pro (14), Gly (15), Ala (16), Citr (17), AABA (18), Val (19), Cys (20), Met (21), Cyst (22), Ile (23), Leu (24), Tyr (25), Phe (26), B-Ala (27), B-AIBA (28), Homocys (29), GABA (30), ETA (31), NH3 (32), HO-Lys (33), Orn (34), Lys (35), 1-Meth (36), His (37), 3-Meth (38), Trp (39), Anser (40), Carn (41) und Arg (42)
Sulfonierten Kationenaustauscher vom Typ BTC 2710.
T-Programm: 48 – 70°C (4-stufig) Eluten: Lithiumcitrat-Puffer 0.3 ml/min
Detektor: Photometrie
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Säuren
Sie haben die Aufgabe, die genannten Säuren quantitativ zu bestimmen. Die Kohlensäure H2CO3 stammt aus gelöstem CO2 und kann nicht als Schadstoff bezeichnet werden. Auf ihre Bestimmung kann notfalls verzichtet werden.
Säuren im Regenwasser: HCl HNO3 HNO2 H2SO4 H2SO3 H2CO3;
Oxalsäure HOOC–COOH; Malonsäure HOOC–CH2–COOH, Ameisensäure H–COOH Bernsteinsäure HOOC–CH2–CH2–COOH, Essigsäure CH3–COOH
a) Schlagen Sie eine Methode zur Trennung und Quantifizierung der Säuren vor! Welchen Detektor setzen Sie ein?
b) Ist eine Vorbehandlung des Regenwassers notwendig?
c) Können Sie alle aufgeführten Säuren in einem einzigen Analysengang quantifizieren?
FAME
Entwerfen Sie eine Methode, um die Fettsäureverteilung in einem Fett oder Öl quantitativ zu bestimmen. Nehmen Sie an, das Fett sei bereits aus dem Lebensmittel isoliert.
Ist eine Aufarbeitung oder Derivatisierung notwendig?
Welches Trennverfahren eignet sich?
Wie detektieren Sie die Fettsäuren?
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Aflatoxine sind eine Gruppe von etwa 20 Toxinen, die von Schimmelpilzen der Gattung Aspergillus gebildet werden. Vier der wichtigsten Aflatoxine: