Aus dem Institut für Anatomie ΙΙ:
Experimentelle Morphologie
(Direktor: Prof. Dr. med. Udo Schumacher)
des Zentrums für Experimentelle Medizin
des Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf
Die Wirkung des Proteasomeninhibitors Bortezomib auf
humane Neuroblastomzellen in vitro und in vivo in einem Xenograftmodell
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin
der Medizinischen Fakultät der Universität Hamburg vorgelegt von
Christina Haane
aus Dorsten
Angenommen von der Medizinischen Fakultät der Universität Hamburg am: 01.12.2008
Veröffentlicht mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät der Universität Hamburg
Prüfungsausschuss, der Vorsitzende: Prof. Dr. U. Schumacher
Prüfungsausschuss: 2. Gutachter: Prof. Dr. H.-E. Laack
Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
Alu Arthrobacter luteus
bzw. beziehungsweise
ca. circa
CASY Cellcounter Analyser System
CLL Chronisch lymphatische Leukämie
CT Computertomographie °C Grad Celsius ddH2O double distilled H2O evtl. eventuell [18 F]FDG Fluordeoxyglukose [18F]FLT Fluorothymidin g Gramm
GPOH Gesellschaft für Pädiatrische Onkologie und
Hämatologie
h Stunde
HE Hämatoxylin-Eosin
HPLC High Performance Liquid Chromatography
INSS International Neuroblastoma Staging System
i.v. intravenous kg Kilogramm KG Körpergewicht KV Kilo Volt nm nanometer nM nano Mol Nr. Nummer n.s. nicht signifikant min Minuten MHz Megahertz MRT Magnetresonanztomographie µm micrometer * p < 0,05 ** p < 0,01 *** p < 0,001
PCR Polymerasekettenreaktion
PET Positronenemissionstomographie
s Sekunden
s.c. subcutan
scid Severe combined immune deficiency
SD Standard deviation
SEM Standard error of the mean
Tab. Tabelle
UKE Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf
Voxel Volumenenlement (dreidimensionales Pixel)
z.B. zum Beispiel
Inhaltsverzeichnis
1
1 Arbeitshypothese und Fragestellung 3
2 Einleitung 4
2.1 Das humane Neuroblastom 4
2.2 Bortezomib 8
3 Material und Methoden 10
3.1 Neuroblastomzelllinien 10
3.2 Bortezomib 10
3.3 Charakterisierung von Bortezomib in vitro 10
3.3.1 Zellproliferationsassay 10
3.3.1.1 Zellkultur 10
3.3.1.2 Detektion von Mykoplasmen in der Zellkultur 11
3.3.1.3 Zellzählung 12
3.3.1.4 Erstellen von Eichkurven 12
3.3.1.5 Zellproliferationsassay mit Zusatz von Bortezomib 13
3.4 Charakterisierung von Bortezomib in vivo 14
3.4.1 Versuchstiere 14
3.4.2 Behandlung der Tiere 15
3.4.3 Histologie 16
3.4.3.1 Primärtumoren 16
3.4.3.1.1 Lichtmikroskopie 16
3.4.3.1.2 Elektronenmikroskopie 17
3.4.3.2 Lungenmetastasierung 17
3.4.4 Disseminierte Tumorzellen im Blut 18
3.4.5 Imaging 19
3.4.5.2 Positronen-Emissions-Tomographie /
Computer Tomographie 20
3.5 Statistische Auswertung 22
4 Ergebnisse 23
4.1 Wirkung von Bortezomib in vitro 23
4.2 Wirkung von Bortezomib in vivo 28
4.2.1 Primärtumor 28
4.2.1.1 Lichtmikroskopie 29
4.2.1.2 Elektronenmikroskopie 33
4.2.2 Lungenmetastasierung 35
4.2.3 Disseminierte Tumorzellen im Blut 36
4.2.4 Imaging 39 4.2.4.1 MRT 39 4.2.4.2 PET-CT 43 5 Diskussion 47 6 Zusammenfassung 59 7 Literaturverzeichnis 60 Danksagung 67 Lebenslauf 68 Selbstständigkeitserklärung 69
1
Arbeitshypothese und Fragestellung
Bei Kindern mit der Diagnose Neuroblastom ist die Prognose häufig infaust, so dass ein großes Interesse für neue Therapieansätze besteht. Besonders bei dem großen Anteil der Patienten, die sich im Stadium IV befinden, ist die Aussicht auf Heilung äußerst gering. Bei Einsatz des Proteasomeninhibitors Bortezomib wurden bereits antiproliferative Wirkungen bei verschiedenen Tumorentitäten nachgewiesen. Daher war das Ziel der vorliegenden Arbeit folgende Fragen zu klären:
• Hat der Proteasomeninhibitor Bortezomib eine wachstumshemmende Wirkung auf die humanen Neuroblastomzelllinien in vitro?
• Hat das Medikament Bortezomib auch eine antiproliferative Wirkung in vivo, wenn humane Neuroblastomzellen in scid – Mäuse transplantiert werden? • Gibt es Unterschiede zwischen der behandelten Bortezomibgruppe und der
Kontrollgruppe in Hinblick auf Apoptosen und Mitosen der Primärtumoren, sowie der Anzahl der Spontanmetastasen in den Lungen und der Anzahl der freien Tumorzellen im Blut?
• Können die Imagingverfahren MRT und PET-CT die humanen Neuroblastome im scid -Mausmodell charakterisieren?
2
Einleitung
2.1 Das Neuroblastom
Das Neuroblastom ist mit 7 - 14% aller kindlichen Tumoren der häufigste extrakranielle solide Tumor des Kindesalters (Morgenstern et al., 2004). In Deutschland liegt die Zahl der Neuerkrankungen bei 120 - 130 Fällen pro Jahr. Die Inzidenz liegt bei circa 1,3 Erkrankungen auf 100.000 Kinder, die sich in einem Alter unter 15 Jahren befinden (Hero und Berthold, 2002; Schwab et al., 2003; Simon, 2005). Das Neuroblastom gehört zu den embryonalen Tumoren, die charakteristischerweise in 90% der Fälle in einem Alter von unter 5 Jahren diagnostiziert werden (Schwab et al., 2003). Das mittlere Lebensalter der Patienten liegt bei unter zwei Jahren und 35% der Kinder erkranken bereits in einem Alter von unter einem Jahr (Morgenstern et al., 2004).
Es handelt sich um eine maligne Erkrankung, die von primitiven sympathischen neuralen Vorläufern des Nervengewebes ausgeht (Brodeur, 2003). Histologisch findet man zwei verschiedene Zelltypen, die Neuroblast / Ganglienzelle und die Schwann-Zellen. Letztere sind vermutlich nicht neoplastisch, werden aber wahrscheinlich als Stromazelle von den Tumorzellen rekrutiert (Koletzko, 2003).
Aufgrund seiner Histogenese, kann das Neuroblastom überall dort auftreten, wo sympathisches Nervengewebe zu finden ist. In erster Linie entstehen Neuroblastome deshalb im Nebennierenmark. Die übrigen Lokalisationen verteilen sich, vom Retroperitonealraum ausgehend, in den paraspinalen Ganglien von Thorax, Abdomen oder Pelvis (Brodeur, 2003). Die Ausbreitung des Neuroblastoms erfolgt durch infiltratives Wachstum und durch lymphogene und hämatogene Metastasierung. Diese erfolgt zumeist in das Knochenmark, in Fernlymphknoten und in die Leber, seltener in die Haut, ins Gehirn und in die Lunge (Hero und Berthold, 2002; Simon, 2005). Das Stadium IV-S nimmt eine Sonderstellung ein. Hierbei ist das Erkrankungsalter auf das erste Lebensjahr begrenzt, es findet sich ein lokalisierter Primärtumor mit Metastasen, die sich definitionsgemäß allerdings nur im Knochenmark, in der Haut oder in der Leber befinden dürfen (Hero und Berthold, 2002).
Die betroffenen Kinder leiden sowohl unter Krankheitszeichen, die direkt auf den Tumor zurückzuführen sind, als auch unter so genannten Allgemeinsymptomen. Entsprechend der verschiedenen Ursprungsorte kann ein Neuroblastom durch unterschiedliche Symptome auffallen wie z. B. ein tastbarer Knoten im Bauchraum, Atembeschwerden, Husten und verdickte Halslymphknoten oder auch Anzeichen einer Querschnittslähmung durch
Vorwachsen des Tumors in Richtung Rückenmark. Als Allgemeinsymptome können Blässe, Gewichtsverlust, Fieber und Durchfall auftreten (Simon et al., 2004; Simon, 2005).
Der Verdacht auf das Vorliegen eines Neuroblastoms ergibt sich aus den typischen Beschwerden und dem Befund der körperlichen Untersuchung. Häufig wird ein Neuroblastom aber auch zufällig im Rahmen einer Routineuntersuchung entdeckt. Die Diagnosesicherung erfolgt durch weiterführende Untersuchungen: Blut- und Urinuntersuchung auf Katecholaminmetabolite, feingewebliche Beurteilung eines Biopsats, Röntgenuntersuchung des Brustkorbs, Ultraschalluntersuchung des Bauchraums, Computer- und Kernspintomographie und Szintigraphie.
Ein System zum Staging des Neuroblastoms stellt das INSS (=International Neuroblastoma Staging System) dar. Zusätzlich können verschiedene Parameter wie z.B. der Ferritin-Spiegel bestimmt werden, um die Staging Analyse zu vervollständigen.
Stadium Kriterien
I Lokalisierter Tumor mit makroskopisch kompletter Entfernung, repräsentative ipsi- und contralaterale Lymphknoten histologisch ohne Tumorbefall. Lediglich unmittelbar am Tumor adhärente, chirurgisch entfernte Lymphknoten dürfen positiv sein. Auch bilaterale Tumoren, die makroskopisch komplett exstirpiert werden können und keinen regionalen Lymphknotenbefall aufweisen
IIa Unilateraler Tumor mit makroskopisch inkompletter Resektion, ipsi- und contralaterale Lymphknoten histologisch negativ
IIb Tumor wie bei IIa, jedoch positive regionale ipsilaterale Lymphknoten
III Nichtresektabler unilateraler Tumor infiltriert über die Mittellinie mit oder ohne Lymphknotenbefall
oder
Nichtresektabler Mittellinientumor mit bilateraler Ausdehnung durch Infiltration oder Lymphknotenbefall (Das Überschreiten der Mittellinie ist definiert durch infiltratives Erreichen / Überschreiten der Wirbelkante der Gegenseite)
IV Tumoraussaat in Lymphknoten, Knochen, Knochenmark, Leber und andere Organe
IV-S Sonderform, nur bei Säuglingen im 1. Lebensjahr, lokalisierter Primärtumor wie bei Stadium I, IIa oder IIb, Tumoraussaat nur in Leber, Haut und/oder Knochenmark
Die Prognose ist abhängig von verschiedenen Kriterien, wobei das Alter ein ganz entscheidender prognostischer Faktor darstellt. Die angefügte Tabelle 2. verdeutlicht die vergleichsweise guten Heilungschancen bei Kindern unter 1 Jahr im Gegensatz zu Kindern, die bei Diagnosestellung älter als 1 Jahr sind.
Alter Stadium Anteil Neuroblastome in der Altersgruppe (%) 5-Jahresüberlebensrate (%) < 1 Jahr I-III 61 95 +/-1 IV 13 53 +/-6 IV-S 26 79 +/-4 > 1 Jahr I-III 45 76 +/-2 IV 55 20 +/-2
Tab. 2: Überlebenswahrscheinlichkeit beim Neuroblastom in Abhängigkeit von Alter und Stadium (GPOH- Gesellschaft für Pädiatrische Onkologie und Hämatologie, Koletzko, 2003). Dabei waren 615 Kinder < 1 Jahr und 1028 Kinder > 1 Jahr.
Das Tumorstadium, das vor allem auch durch das Ausmaß der Metastasierung bestimmt wird, ist ebenfalls für die prognostische Einschätzung wichtig. Weitere klinische Marker, die mit der Prognose des Neuroblastoms korrelieren, sind die Serummarker LDH und Ferritin. Zunehmende Bedeutung als Risikofaktoren erlangen die bereits oben beschriebenen molekulargenetischen Veränderungen. Der wichtigste relevante Marker ist die Amplifikation des MYC-N, die mit einer deutlich schlechteren Überlebensrate einhergeht (Hero und Berthold, 2002). Daneben gibt es weitere zahlreiche molekulare Marker (Status Chromosom 1p, 11q, 3p, Expression des Adhäsionsmolekül CD44, Telomeraseaktivität, Caspase 8 als mögliches Tumorsuppressorgen, etc.), die in der Zukunft zunehmend an Bedeutung erlangen könnten, deren klinische Wertigkeit zum Teil aber noch nicht endgültig geklärt werden konnte (Hero und Berthold, 2002; Schwab et al., 2003; Simon et al., 2004; Simon, 2005).
Die Behandlung des Tumors richtet sich nach den prognostischen Faktoren wie z. B. Stadium, Alter, molekulargenetische Marker (Interdisziplinäre Leitlinien 2004, Deutsche Krebsgesellschaft e.V., Frankfurt). Erst nach einem kompletten Staging kann die Operation als erste therapeutische Maßnahme empfohlen werden. In einem Ersteingriff geht es um Diagnosesicherung und Resektion des Tumors. Wenn histologisch und molekulargenetisch die Diagnose gesichert wurde, erfolgt die Einteilung in der Regel in 3 Behandlungsgruppen: Beobachtungs-, Standardrisiko- und Hochrisikogruppe. In Abhängigkeit von der Risikogruppe reichen die therapeutischen Interventionen von alleiniger Operation bis hin zur
Maximaltherapie (Interdisziplinäre Leitlinien: Deutsche Krebsgesellschaft e.V. Frankfurt, 2004).
Das Therapiekonzept Beobachtungsgruppe besteht nach der Operation aus regelmäßigen Kontrollen und eventuell einer leichten Chemotherapie. Die Patienten mit einem Standardrisiko bekommen nach der Operation eine Chemotherapie. Je nach Ansprechen im Therapieverlauf kann eine sekundäre Tumoroperation oder eine Strahlentherapie notwendig sein. Hingegen werden Patienten mit einem Hochrisiko - Neuroblastom sowohl primär operiert als auch adjuvant / palliativ mit Chemotherapie und Strahlentherapie behandelt. Je nach Ansprechen kann eine Second-Look-Operation erfolgen (Simon, 2005; Hero und Berthold, 2002).
Im Rahmen von Tumorstudien erhalten alle Patienten anschließend eine Hochdosischemotherapie mit autologer Stammzelltransplantation (Simon, 2005). In der Regel wird die Behandlung der Hochrisikogruppe durch weitere konsolidierende Therapieverfahren ergänzt, z. B. Immuntherapie mit Antikörpern. Morgenstern et al., (2004) und Brodeur et al., (2003) berichteten von einer biologischen Therapie mit cis-Retinsäure, welche gute Resultate nach autologer Stammzelltransplantation zeigte. Fang et al., (2006) berichteten von H+linked monocarboxylate transporter (MCT1 / SLC 16A1), die einen Erfolg versprechenden Einfluss auf das Tumorwachstum von Hochrisikopatienten haben sollen. Simon (2005) wies weiterhin auf neue Ansätze der Tumorvakzinierung mit dendritischen Zellen hin. All diese verschiedenen Therapieansätze sind Gegenstand aktueller klinischer Studien.
Die Behandlung von Patienten mit Neuroblastom im Stadium IV-S nimmt eine Sonderstellung ein, da Tumor und Metastasen oft spontan regredieren. Beim Auftreten von Lebermetastasen oder Bedrohung durch Tumormassen kann auch hier eine milde Chemotherapie erforderlich sein (Interdisziplinäre Leitlinien 2004, Deutsche Krebsgesellschaft, e.V. Frankfurt).
Diese Therapieansätze führen aber noch immer nicht zu einem durchschlagenden Erfolg in der Behandlung des Neuroblastoms. Insbesondere Hochrisikopatienten im Stadium IV haben eine Fünfjahresüblerlebensrate von 20 ± 2%. Die hohe Mortalität (je nach Stadium bis zu 80%) dieses kindlichen Tumors (Koletzko 2003, Berthold et al., 2005) macht die Dringlichkeit der Suche nach weiteren Therapieoptionen deutlich. Ein solcher neuer Ansatzpunkt besteht möglicherweise in der Beeinflussung der Tumorzellen durch den Proteasomeninhibitor Bortezomib (Velcade ®).
2.2 Bortezomib
Bortezomib ist das erste zugelassene Medikament aus der neuen Wirkstoffklasse der Proteasomeninhibitoren. Bortezomib hemmt spezifisch die Aktivität des ubiquitär vorkommenden 26S-Proteasoms in Säugetierzellen. Das Proteasom ist ein essentieller Enzymkomplex, welches Apoptose, Transkription, Zelladhäsion, Angiogenese, Antigenpräsentation und den Zellzyklus reguliert (Le Blanc, 2002). In vielfachen Studien wurde gezeigt, dass durch die Inhibition des Proteasoms die Tumorgröße verringert werden kann. Beispiele hierfür sind das maligne Myelom (Hidshima et al., 2001; Katayoun et al., 2004), das Mantelzelllymphom (Pham et al., 2003), das nichtkleinzellige Lungenkarzinom (Ling et al., 2003), das Ovarialkarzinom (Frankel et al., 2000), das Pankreaskarzinom (Shah et al., 2001; Bold et al., 2001), das Prostatakarzinom (Adams et al., 1999; Frankel et al., 2000) und bösartige Tumoren im Kopf – Halsbereich (Sunwoo et al. 2001, van Waes et al., 2005). Neueste Studien von Michaelis et al. (2006), Brignole et al. (2006) und Hamner et al. (2007) zeigten erstmals antiproliferative Wirkungen auf humane Neuroblastomzelllinien in vitro und in vivo. Zudem konnte in einer Phase Ι Studie bei pädiatrischen Patienten mit refraktären soliden Tumoren (inklusive 2 Patienten mit Neuroblastom) gezeigt werden, dass Bortezomib ein gut tolerables Medikament ist, welches nur eine geringe Toxizität aufweist (Blaney et al., 2004).
Der molekulare Mechanismus, mit dem Bortezomib die Apoptose der Tumorzellen induziert, ist weitestgehend unklar. Vermutet wird eine Veränderung der Balance zwischen pro- und antiapoptotischen Signalen (Adams, 2003). Ein Molekül, das eine zentrale Rolle in der Vermittlung vieler Effekte des Bortezomibs darstellt, ist der Transkriptionsfaktor NF-κB (Karin et al., 2002). NF-κB liegt normalerweise im Zytosol im Komplex mit dem Inhibitormolekül IκB vor. Durch zellulären Stress wird IκB durch die Proteasomen abgebaut, so dass es zur Aktivierung von NF-κB kommt. Durch Bortezomib kann die Elimination des IκB reduziert werden und folglich die Aktivität von NF-κB gehemmt werden. Beim Multiplen Myelom konnte weiter beobachtet werden, dass Bortezomib die IL-6 induzierten Wachstumsstimulationen durch Verminderung von gp 130 induziert. Dies wiederum führt zu einer vermehrten Aktivität von Caspase 3 und somit zu einer verstärkten Apoptoseaktivität (Ludwig, 2004).
Weitere Studien haben gezeigt, dass Tumorzellen empfindlicher gegenüber den Effekten des Bortezomibs sind als normale Zellen. Durch die Reversibilität der Proteasomeninhibition mit Bortezomib erholten sich periphere mononukleare Blutzellen sehr schnell. Tumorzellen hingegen waren dazu nicht in der Lage und gingen in Apoptose (Richardson, 2003). Testungen
des Medikamentes an normalen diploiden Zellen, wie z.B. humane Fibroblasten zeigten wiederholt keine Effekte (Brignole et al., 2006).
Abb. 1: Intrazelluläre Signalkaskade des Transkriptionsfaktor NF-κκκB (modifiziert nach Adams, 2003). Die κ Abbildung stellt den Zusammenhang zwischen NF-κB und seinem Inhibitor IκB dar. Weiterhin wird gezeigt, dass bei Einfluss von zellulärem Stress IκB durch Proteasomen abgebaut wird und NF-κB somit aktiv wird. Bortezomib greift in diesen Mechanismus ein und verhindert die Elimination von IκB.
3
Material und Methoden
3.1 Neuroblastomzelllinien
Es wurden sieben verschiedene humane Neuroblastomzelllinien (Kelly, LS, SH-SY5Y, SK-N-SH, IMR-32, LAN-1 und LAN-5) untersucht. Die Zelllinien Kelly, LAN-1, LAN-5, SK-N-SH und IMR-32 wurden uns freundlicherweise von Herrn Prof. Dr. Erttmann (Abteilung Pädiatrische Onkologie, Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf, Deutschland) zur Verfügung gestellt. Die Zelllinien LS und SH-SY5Y wurden uns freundlicherweise von Herrn Prof. Dr. Hildebrandt (Abteilung Zelluläre Chemie, Medizinische Hochschule Hannover, Deutschland) zur Verfügung gestellt.
3.2 Bortezomib (Velcade®)
Das Medikament Bortezomib wurde von der Firma Janssen Pharmaceutica N.V. (Beerse, Belgien) über die Apotheke des Universitätsklinikums bezogen und als steriles Pulver in einer Packungsgröße von 3,5 mg geliefert. Aus diesem Pulver wurde dann durch Zugabe von 3,5 ml PBS eine Stammlösung hergestellt, deren Konzentration 1 mg / ml betrug. Gelagert wurde die Stammlösung dann bei – 20° C im Gefrierschrank.
Bei jedem Versuch wurde diese Stammlösung erneut aufgetaut und in einer Verdünnungsreihe wurden die zu untersuchenden Konzentrationen hergestellt (siehe 3.3.1.5).
3.3. Charakterisierung von Bortezomib in vitro 3.3.1 Zellproliferationsassays
3.3.1.1 Zellkultur
Die Arbeiten mit den Zelllinien erfolgten unter einer Hera Safe Sicherheitswerkbank (Heraeus Instruments, Hanau, Deutschland) unter sterilen Bedingungen. In 50 ml Zellkulturfalschen (Nunclon®, Nunc, Roskilde, Dänemark) erfolgte die Kultivierung der Zelllinien unter Standardbedingungen (37° C, 100% Luftfeuchtigkeit, 5% CO2 / 95% Luft) in einem Hera Cell Brutschrank (Heraeus Instruments, Hanau, Deutschland). Als Nährmedium wurde RPMI Medium (Gibco/Life Technologies, Paisley, Scotland) verwendet, welches zusätzlich mit 10% hitzeinaktiviertem fetalen Kälberserum (FCS, Gibco®), 2 mM L-Glutamin (Gibco®), sowie 100
U / ml Penicillin und 100 µg / ml Streptomycin (Gibco®) versetzt wurde. Dieses Medium wird im Weiteren als Kulturmedium bezeichnet und wurde 2 – 3 mal pro Woche gewechselt. Wenn die Zellen konfluent gewachsen waren, wurden sie passagiert. Hierzu wurde das alte Kulturmedium abgesaugt, die Zellen wurden mit 5 ml PBS (Gibco® Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline, Invitrogen, Carlsbad, USA) gespült, anschließend für fünf Minuten mit je 5 ml Trypsin-EDTA (Gibco®) versetzt und darauf folgend bei 37° C und 5% CO2 5 Minuten inkubiert. Nach dem Ablösen der Zellen vom Flaschenboden, erfolgte die Zugabe von 5 ml Kulturmedium, um das Trypsin zu inaktivieren und so eine Schädigung der Zellen durch das Trypsin-EDTA zu verhindern. Abschließend wurden die abgelösten Zellen auf neue Zellkulturflaschen verteilt, die zuvor mit 15 ml Kulturmedium aufgefüllt waren, oder die Zellen wurden für die Zellproliferationsexperimente eingesetzt. Da für die Standardisierung und Reproduktion der Experimente eine hohe Zellzahl erforderlich war, wurden vor Beginn aller Experimente alle sieben Zelllinien über mehrere Wochen in Zellkulturflaschen vermehrt und ein Suspensionspool von jeder der sieben Zelllinien erstellt. Die Suspensionen wurden fünf Minuten bei 1500 U / min zentrifugiert und der Überstand abgesaugt. Die entstandenen Zellpellets wurden mit Gefriermedium (Cryo-safe Ir, c.c. pro GmbH, Neustadt, Deutschland) resuspendiert und in Einfrierröhrchen (Nunc Cryo Tube Vials, Nalge Nunc International Naperville, Roskilde, Dänemark) auf identische Aliquots von 1,5 ml verteilt. Über Nacht wurden die Aliquots auf - 80° C gekühlt und abschließend in flüssigem Stickstoff kryokonserviert. Für die weiteren beschriebenen Zellproliferationsexperimente wurden jeweils ein bis zwei Aliquots pro Zelllinie aufgetaut, auf Zellkulturflaschen verteilt und ca. drei bis vier Wochen kultiviert, bis eine ausreichende Zellzahl herangewachsen war, um die Versuche durchführen zu können.
3.3.1.2 Detektion von Mykoplasmen-Kontamination in der Zellkultur
Zur Überprüfung der Zellkultur auf Kontamination durch Mykoplasmen wurde das VenorGeM® Mykoplasmen-Detektionskit (Minerva Biolabs GmbH, Berlin, Deutschland) auf der Basis der Polymerase-Kettenreaktion eingesetzt. Der Test ist zum Nachweis der typischerweise als Kontamination in Zellkulturen auftretenden Mykoplasmenspezies geeignet und wurde entsprechend der Angaben des Herstellers durchgeführt. Bei keiner der Zelllinien konnte eine Kontamination durch Mykoplasmen nachgewiesen werden.
3.3.1.3 Zellzählung
Die Bestimmung der Zellzahl wurde mittels des CASY®-Cell Counter Analyser System (CASY®-Technology, Schärfe System GmbH, Reutlingen, Deutschland) durchgeführt. Dabei wurden vitale Zellen gezählt. Für die Messung wurden die Zellen in einer speziellen Elektrolytlösung (CASY®ton) suspendiert und anschließend durch eine Präzisionsmesspore gesaugt.
3.3.1.4 Erstellen von Eichkurven
In den folgenden Zellproliferationsassays wurde der Einfluss des Proteasomeninhibitors Bortezomib der Firma Janssen Pharmaceutica N.V., (Beerse, Belgien) mit Hilfe des XTT-Zellproliferationskit (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland) untersucht. Zur Erstellung der Eichreihen wurde für jede Zelllinie eine Verdünnungsreihe mit sieben (Kelly, LAN-1, LAN-5, SH-SY5Y, IMR-32, LS) bzw. zehn (SK-N-SH) verschiedenen Zellkonzentrationen erstellt. Jeweils 80 µl der Zellsuspensionen wurden in die Vertiefungen einer 96er Mikrotiterplatte (Greiner, Frickenhausen, Deutschland) pipettiert. Als Leerwert für den ELISA-Reader wurden 80 µl Kulturmedium verwendet. Jeder Ansatz wurde fünffach getestet. Die Platten wurden im Brutschrank für 24 Stunden unter Standardbedingungen präinkubiert. Dann wurden 20 µl PBS zu den Testansätzen gegeben, was der Menge der in den endgültigen Versuchen zugefügten Substanz Bortezomib gelöst in PBS entsprach. Anschließend wurden die Zellen für 48 Stunden im Brutschrank unter Standardbedingungen inkubiert. Zur Ermittlung der Zelldichte wurde 72 Stunden nach dem Aussäen der Cell Proliferation Kit II (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) benutzt. Dafür wurde XTT labeling reagent und electron coupling reagent in einer Konzentration von 50 : 1 gemischt, was einer XTT Endkonzentration von 0,3 mg / ml entspricht. Von dieser Konzentration wurden jeweils 50 µl in jede Vertiefung der Mikrotiterplatte gegeben und die Platten wurden zur weiteren Inkubation in den Brutschrank gestellt. Die Extinktion wurde nach 4, 6 und 24 Stunden bei 450 nm im ELISA Reader Dynatch MR3.13 (Dynex Technologies, Ashford, UK) gemessen. Für die Zelllinien Kelly, LAN-1, LAN- 5, IMR-32, LS und SK-N-SH stellten sich 6 Stunden und für SH-SY5Y 24 Stunden als eine optimale Inkubationszeit mit XTT heraus. Die Zellkonzentrationen, die nach 72 Stunden Wachstum im exponentiellen Bereich der Eichkurve lagen, wurden zum Aussäen der einzelnen Neuroblastomzellreihen angewandt. Die jeweiligen Zellzahlen / ml sind in der Tabelle 3 zusammengefasst.
Zelllinie Kelly LAN-1 LAN-5 LS SK-N-SH SH-SY5Y IMR-32 Zellzahl / ml 150.000 150.000 200.000 70.000 60.000 420.000 700.000
Tab. 3: Zellzahlen / ml der Neuroblastomzelllinien, die ein geeignetes Wachstum über die Versuchsdauer von 72 Stunden gezeigt haben.
Exemplarisch ist in Abbildung 2 der Eichkurvenverlauf der Neuroblastomzelllinie SH-SY5Y dargestellt. Hierbei ist die unterschiedliche Absorption des XTTs nach 4, 6 und 24 Stunden zu sehen.
SH-SY5Y
104 105 106 0 1 2 4h 6h 24h Zellen / ml A b s o rp ti o nAbb. 2: Eichkurve der Zelllinie SH-SY5Y. Dargestellt ist die unterschiedliche Absorption nach 4, 6 und 24 Stunden. Die optimale Absorption fand nach 24 Stunden statt, aus diesem Grund wurden alle weiteren Ergebnisse der anschließend durchgeführten Versuche der Zelllinie SH-SY5Y nach 24 h abgelesen.
3.3.1.5 Zellproliferationsassay mit Zusatz von Bortezomib (Velcade ®)
Auf den einzelnen Mikrotiterplatten wurde jeder Versuch in einem Fünffachansatz durchgeführt. Jeder Versuch wurde in mindestens vier unabhängigen Versuchen wiederholt, dieses Vorgehen galt für alle sieben Zelllinien, die mit Bortezomib getestet wurden. Zu Beginn wurden 80 µl Medium in die Vertiefungen als Leerwert für den Zellproliferationsassay pipettiert. Die restlichen Vertiefungen wurden jeweils mit 80 µl der erstellten optimalen Zellkonzentration gefüllt. Anschließend wurden die pipettierten Mikrotiterplatten für 24 Stunden im Brutschrank (unter Standardbedingungen) inkubiert, um ein ideales Anwachsen
der Zellen zu gewährleisten. Die Testlösungen wurden hergestellt, indem die Stammlösung von Bortezomib (1 mg / ml) mit PBS in einer Verdünnungsreihe (1:10) versetzt wurde. Insgesamt wurden sechs verschiedene Konzentrationen in einer Verdünnungsreihe von 100 µg / ml bis 0,001 µg / ml des Bortezomib hergestellt. 20 µl dieser Verdünnungen wurden dann jeweils zu den 80 µl Medium in die Vertiefungen gegeben. Dies entsprach dann einer Endkonzentration von 20 µg / ml bis 0,0002 µg / ml des Medikamentes. Die Mikrotiterplatte wurde nach Medikamentengabe für weitere 48 Stunden im Brutschrank (unter Standardbedingungen) inkubiert.
72 Stunden nach dem Aussäen der Zelllinien, wurde zur Auswertung der Cell Proliferation Kit II (XTT) (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) verwendet. Von dieser XTT-Lösung wurden anschließend 50 µl in jede Vertiefung der Mikrotiterplatte gegeben. Bei den Zelllinien Kelly, LAN-1, LAN-5, SK-N-SH, LS und IMR-32 wurden nach 6 Stunden und bei der Zelllinie SH-SY5Y nach 24 Stunden bei einer Testfilter-Wellenlänge von 490 nm und einer Referenzfilter-Wellenlänge von 630 nm die Messungen durchgeführt. Die Ergebnisse der Kontrolle dienten dann bei der Auswertung des Proliferationsassays als 100% Zellwachstum, zu denen die übrigen Werte in Relation gesetzt wurden.
3.4 Charakterisierung von Bortezomib in vivo
3.4.1 Severe combined immuno deficiency Mausmodell 3.4.1.1 Versuchstiere
Die Versuche wurden an männlichen und weiblichen severe combined immuno deficiency (scid) Mäusen der Firma Charles River durchgeführt. Die Tiere sind in der 48. Kalenderwoche 2005 geboren und waren zu Versuchsbeginn 15 Wochen alt. Die Tiere hatten im Mittel ein Gewicht von 25 g mit einer Standardabweichung von 3,2 g. Die Haltung erfolgte in Filter-Top Käfigen in Gruppen zu jeweils 5 Tieren bei einer Raumtemperatur von 19 – 21° C und unter Beibehaltung des normalen Tag-Nacht-Rhythmus (Dunkelphase von 19 – 7 Uhr). Die Tiere erhielten steriles Wasser und steriles Standard-Einstreufutter (sniff M-Z Alleindiät extrudiert, sniff Spezialdiäten GmbH, Soest, Deutschland) ad libitum und wurden mindestens 6 – 8 Tage vor Versuchsbeginn zur Akklimatisierung und Eingewöhnung im Tierstall des Universitätsklinikums Hamburg–Eppendorf (Haus Süderfeldstraße) gehalten. Der im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte Tierversuch wurde nach § 8 des Tierschutzgesetzes von 1998 der Bundesrepublik Deutschland unter der Versuchsnummer: 64 / 05 von der Behörde für Umwelt und Gesundheit in Hamburg genehmigt.
Während der Studie ist die scid-Maus Nr. 8.3 (Bortezomibgruppe) aus unbekannter Ursache verstorben. Es gab keine Anzeichen dafür, dass der Tumor oder die Behandlung mit Bortezomib Einfluss auf den Gesundheitszustand des Tieres genommen hatten.
3.4.2 Behandlung der Tiere
Für den Tierversuch wurde die Zelllinie SK-N-SH ausgewählt, da diese Zelllinie in bereits durchgeführten Tierversuchen unseres Institutes ein gutes Tumorwachstum und eine hohe Metastasierungsrate aufwies (Ursula Valentiner, unveröffentlicht).
Aus den in flüssigem Stickstoff gelagerten Zellpoolen wurden je zwei Aliquots der SK-N-SH Zellen aufgetaut, mindestens zwei Wochen lang kultiviert und anschließend hinsichtlich ihrer Vitalität geprüft. Nach Absaugen des Kulturmediums und zweifacher Spülung im eisgekühlten PBS wurden die Zellen mittels Trypsinierung gelöst und bei 1500 U / min fünf Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt. Die Zellpellets wurden mit jeweils 1 ml Kulturmedium resuspendiert und alle Zellen der jeweiligen Zelllinie wurden erneut gepoolt. Nach Herstellung einer 1 : 10 Verdünnung wurde die Zellzahl der Suspension durch das CASY®-Cell Counter Analyser System (CASY®-Technology, Schärfe System GmbH, Reutlingen, Deutschland) bestimmt. Die Suspension wurde dann wieder zentrifugiert und die Zellpellets wurden nach Absaugen des Überstandes mit Kulturmedium ohne FCS resuspendiert und die Zellzahl wurde auf 5 x 106 Zellen / ml eingestellt. Die Tiere wurden mit einem Narkosegemisch aus 20% O2 und 80% CO2 anästhesiert und danach wurden jedem Tier 1 x 106 Zellen gelöst in 200 µl Kulturmedium subkutan zwischen die Schulterblätter injiziert. Drei Tage nach der Tumorzellinjektion wurden die vorher in Kontrollgruppe und Bortezomibgruppe eingeteilten Tiere, zwei mal pro Woche mit dem gleichen Verhältnis an Narkosegemisch betäubt. Danach wurden den 20 Tieren der Behandlungsgruppe 0,2 ml der Medikamentenlösung (Bortezomib: 1 mg / ml) in die Schwanzvene gespritzt. Dies entspricht einer Menge von 1 mg / kg KG (Körpergewicht). Die 20 Mäuse der Kontrollgruppe erhielten 0,2 ml PBS intravenös verabreicht. Der Gesundheitszustand der Tiere wurde regelmäßig kontrolliert. Es konnte keine Veränderung der scid-Mäuse im Verlauf der Behandlung mit dem Medikament Bortezomib festgestellt werden. Nach 31 Tagen Behandlung (insgesamt 9 Injektionen) wurde bei den Tieren ein Imaging mittels MRT und PET-CT durchgeführt. Abschließend erfolgte eine Betäubung der scid-Mäuse mit einem Narkosegemisch (0,1 ml / 10 g Körpergewicht) bestehend aus Rompun-Ketanest (0,8 ml Rompun 2% (Bayer Leverkusen, Deutschland) und 1,2 ml Ketamin Gräub (100 mg / ml; Albrecht, Aulendorf, Deutschland) in 8
ml 0,9% NaCl). Die Tiere wurden nach Blutentnahme aus dem Augenplexus durch cervicale Dislokation getötet. Danach wurden die Primärtumoren und die Lungen herauspräpariert. Die Primärtumoren wurden gewogen und in beschriftete Gitterkörbchen überführt. Zur späteren Einbettung in Paraffin nach einem automatisierten Standardverfahren wurden sie vorerst für zwei Tage in 4% gepuffertem Formalin für 48 Stunden fixiert. Die Lungen wurden en bloc in gepuffertem, mit 0,1 mol Phosphatpuffer (zusammengesetzt aus Natriumdihydrogenphosphat und Dinatriumphosphat) angesetztem Formalin für 48 Stunden fixiert. Anschließend wurden sie unter einem Stereo-Mikroskop in 1 mm dicke Scheiben geschnitten. Die Schnittdicke wurde durch unter der Glasplatte liegendes Millimeterpapier kontrolliert. Die Lungenschnitte wurden zufällig über einen Objektträger verteilt, in 4% igem Ager eingelegt und mit einem Deckgläschen zusammengedrückt. Dieser Block wurde dann, wie zuvor beschrieben, in Paraffin eingebettet. Die verdichteten Agarblöcke waren somit für die Histologie vorbereitet.
3.4.3 Histologie 3.4.3.1 Primärtumor 3.4.3.1.1 Lichtmikroskopie
Von den in Paraffin eingebetteten Primärtumoren wurden mit einem Mikrotom (Mircrom, Techno Med GmbH, Bielefeld) 5 µm dicke Paraffinschnitte angefertigt. Diese wurden anschließend in ein Wärmebad überführt und auf einen beschichteten Objektträger (Histo Bond, Marienfeld, Deutschland) aufgenommen. Danach wurden die Schnitte für 24 Stunden im Wärmeschrank bei 37° C getrocknet und anschließend mit Hämatoxylin – Eosin (HE) gefärbt. Dieses wurde nach einem Standardprotokoll in einem Färbeautomaten (Varistain, Shandon, Frankfurt, Deutschland) durchgeführt. Daraufhin wurden die Objektträger eingedeckelt (Deckgläser: Engelbrecht, Edermüde, Deutschland; Eukitt Kleber: Kindler Freiburg, Deutschland). Von den Primärtumorblöcken wurden zusätzlich Schnitte für die Immunhistologie gewonnen.
Die HE gefärbten Schnitte der Primärtumoren wurden anschließend mittels Lichtmikroskopie auf die Anzahl ihrer Apoptosen und Mitosen untersucht. Hierzu wurde ein Okular mit Gitternetz benutzt, welches aus 10 mal 10 Kästchen bestand. Es wurden die vitalen Areale des Primärtumors bestimmt und anschließend eine Zählung von 100 Zellen vorgenommen, die in apoptotische Zellen, mitotische Zellen und normale Zellen eingeteilt wurden. Dieses wurde an vier weiteren Bereichen des vitalen Primärtumorgewebes durchgeführt, so dass
insgesamt 500 Zellen ausgewertet wurden. Insgesamt wurde diese Zellzählung drei Mal durchgeführt.
Zusätzlich wurde eine Bestimmung des Nekroseanteils mittels Lichtmikroskopie durchgeführt. Dieses wurde durch eine prozentuale Einschätzung des vitalen und nekrotischen Primärtumorgewebes durchgeführt.
3.4.3.1.2 Elektronenmikroskopie
Für die Elektronenmikroskopie wurden etwa 1 x 1 x 1 mm3 Gewebestücke von den Tumoren der scid-Mäuse in 3,5% Glutaraldehyd und in 0,1 Phosphatpuffer fixiert. Anschließend erfolgte eine Nachfixierung mit Osmiumtetroxid (1% Osmiumtetroxidin 0,1 M Phosphat-Saccarose-Puffer) für zwei Stunden und anschließend wurde das Gewebe in einer aufsteigenden Ethanolreihe (35% - 100%) dehydriert. Nach Spülung in Propylenoxid wurden die Gewebestücke in Glycidether (Serva, Heidelberg, Deutschland) eingebettet. Der Primärtumor wurde unter der Stereolupe aufgeblockt. Jetzt konnten 80 - 100 nm ultradünne Schnitte mit dem Sorvall Porter-Blum MT2-B ULTRA-MICROTOME (Norwalk, Connecticut, USA) von den Neuroblastomen angefertigt werden. Nach Kontrastierung mit 1% Uranylacetet und Bleicitrat wurden die Schnitte mit einem Philips CM100 Transmissions-Elektronenmikroskop untersucht.
3.4.3.2 Lungenmetastasierung
Die vorher eingebetteten Lungen wurden ebenfalls in 5 µm dicke Paraffinschnitte geschnitten. Die Lungen wurden komplett in Serie aufgeschnitten, wobei jeder zehnte Schnitt in ein Wärmebad überführt und auf einen beschichteten Objektträger (Histo Bond, Marienfeld, Deutschland) aufgenommen wurde. Von den Lungenblöcken wurden zusätzlich aus der Mitte heraus jeweils 2 mal 20 Schnitte für die Immunhistologie gewonnen. Nach 24 Stunden im Wärmeschrank bei 37° C waren die Schnitte getrocknet, so dass sie dann weiter HE gefärbt wurden. Dieses wurde nach einem Standardprotokoll in einem Färbeautomaten (Varistain, Shandon, Frankfurt, Deutschland) durchgeführt.
Die HE gefärbten Schnitte der Lungen wurden lichtmikroskopisch bei 100 facher Vergrößerung betrachtet und die Anzahl der Metastasen gezählt. Dabei wurde mäanderförmig über den Objektträger gefahren, um alle Flächen des Schnittes zu erfassen und gleichzeitig eine fehlerhafte Doppelzählung von Lungenmetastasen auszuschließen. Die Lungenmetastasen stellen sich in der HE-Färbung unter dem Lichtmikroskop deutlich
abgegrenzt zum umgebenden Lungengewebe (Parenchym und Stroma) dar. Die Schnitte wurden jeweils zweimal durchgemustert. Die Metastasen der 10 mittleren HE-gefärbten Serienschnitte wurden unter dem Lichtmikroskop ausgezählt. Die Anzahl der Lungenmetastasen der mittleren 10 Schnitte einer Lunge wurden addiert und ein Mittelwert für die Anzahl an Lungenmetastasen pro Schnitt gebildet. Dieser wurde mit der Gesamtzahl der Schnitte einer Lunge multipliziert. Anschließend wurden von dem so errechneten Wert 20% subtrahiert. Das so erhaltene Ergebnis gibt die Anzahl an Lungenmetastasen in der gesamten Lunge wieder (Jojovic und Schumacher, 2000).
3.4.4 Disseminierte Tumorzellen im Blut
Für die Untersuchung der Anzahl der freien Tumorzellen im Blut der scid-Mäuse wurde eine Real-time Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt. Dazu wurde das LightCycler-System. LightCycler 2.0 der Firma Roche (Mannheim, Deutschland) benutzt.
Zur DNA Extraktion aus dem Blut wurde das QIAampDNA Blood Mini Kit 250 (Qiagen, Hilden, Deutschland) verwendet. Die Herstellung des LightCycler Master Mixes (LightCycler Fast Start DNA Master Plus SYBR Green Ι Cat No. 03515885001, Roche, Mannheim, Deutschland) wurde nach Angaben des Herstellers zubereitet. Dieses QIAampDNA Blood Mini Kit 250 besteht aus dem Fluoreszenzfarbstoff SYBR Green Ι, einer Taq DNA Polymerase, einem Taq PCR Puffer, einer Nukleotidmixtur und 1 mmol MgCl2. Für eine Blutprobe wurde ein 8 µl Arbeitsmastermix hergestellt. Dieser beinhaltete 100 pmol des ALU-Primers forward (TGGCTCACGC CTGTAATCCC A) und 100 pmol des ALU-ALU-Primers reverse (GCCACTACGC CCGGCTAATT T) (freundlicherweise von Frau Dr. Nehmann zur Verfügung gestellt). Dazu wurde der LightCycler Master Mix und ddH2O gegeben.
Nachdem die Proben für 10 min bei 95° C erhitzt wurden, erfolgte die Denaturierung für 5 s. Anschließend erfolgte das Annealing für 5 s bei 67° C und danach die Elongation bei 72° C für 20 s. Nach diesem Zyklus wurde dann die Messung durchgeführt. Es wurden für jede Probe 45 Zyklen durchgeführt. Durch die mitlaufenden Eichkurvenproben bestehend aus sieben Proben von 106 Tumorzellen bis zu 100 Tumorzellen, konnte anschließend der Rückschluss auf die Anzahl der freien Tumorzellen der scid-Mäuse im Blut hergestellt werden. Zusätzlich liefen immer zwei Negativproben bestehend aus H2O und scid-Kontroll-DNA mit, um sicherzustellen, dass die Messungen ordnungsgemäß abgelaufen waren.
Nach der PCR wurde eine Schmelzkurvenanlayse durchgeführt, anhand derer die Spezifität der Produkte bestimmt wurde. Jede DNA-Probe wurde mindestens drei Mal analysiert. Die Datenverarbeitung erfolgte mit der gerätespezifischen LightCycler™ Software 3.5 (Roche, Mannheim, Deutschland).
3.4.5 Imaging
3.4.5.1 Magnetresonanztomographie
Vier Wochen nach der Inokulation der humanen Neuroblastomzellen wurde bei acht scid-Mäusen ein Imaging mittels der Magnetresonanztomografie (MRT) durchgeführt. Dabei stammten jeweils vier scid-Mäuse aus der Kontrollgruppe und vier Tiere aus der Bortezomibgruppe. Für die Untersuchungen wurden die scid-Mäuse gewogen und mit einem Gemisch aus Rompun-Ketanest anästhesiert (0,8 ml Rompun 2% (Bayer Leverkusen, Deutschland) und 1,2 ml Ketamin Gräub (100 mg / ml; Albrecht, Aulendorf, Deutschland) in 8 ml 0,9% NaCl). Es wurden 0,1 ml / 10 g Mauskörpergewicht verabreicht. Nach Erreichen der Narkosetiefe, wurden die scid-Mäuse auf einer speziellen Kunststofftrage fixiert und diese dann in der MRT-Kleintierspule gelagert.
Die MRT-Untersuchungen erfolgten mit einem 3-Tesla-Ganzkörpergraphen (Intera Philips, Best, Niederlande). Es wurde eine splenoidförmige Kleintierspule mit einem Innendurchmesser von 7 cm als Empfangsspule verwendet (Philips Forschungslabor, Hamburg). Zur Übersicht wurden T1 gewichtete Gradientenechosequenzen in drei Ebenen angefertigt (Survey). Anschließend erfolgte die Akquisition hochauflösender T1 gewichteter Gradientenecho- und T2 gewichteter Turbo-Spinecho-Sequenzen in sagittaler, coronaler und axialer Schichtführung. Es wurden die folgenden Sequenzparameter verwendet: (T1 Gewichtung) TR 424 ms, TE 4,9 ms, Flip 45°; FOV 90 mm, Matrix 400 x 400, Schichtdicke 1 mm, Schichtabstand 0,1 mm, Zeit 5:57,9 min; (T2 Gewichtung) TR 3438,4 ms; TE 90 ms; Flip 90°; FOV 90 mm; Matrix 400 x 400; Schichtdicke 0.6 mm; Schichtabstand 0,06 mm, Zeit 6:04,5 min. Die gesamte Untersuchungszeit pro Maus betrug circa 30 Minuten.
Abb. 3: MRT (Tesla-Ganzkörpergraphen) mit Kleintierspule und spezieller Auflage zur Mauslagerung. Das Foto wurde freundlicherweise von Herrn Dr. med. Kersten Peldschus zur Verfügung gestellt.
Die Auswertung der Bilddaten zur Bestimmung der Tumorgrößen erfolgte durch Mitarbeiter der Forschungsgruppe VOXEL-MAN (Institut für Mathematik und Datenverarbeitung in der Medizin, UKE, Hamburg). Es wurde ein halbautomatisches Segmentationsverfahren basierend auf der interaktiven Festlegung von Schwellenwertbereichen (verschiedene Grauabstufungen des Tumors) und der anschließenden, automatischen Erfassung zusammenhängender Volumenelemente (Voxel) im Bereich der Tumore angewandt. Die korrespondierenden Tumorvolumina wurden jeweils aus der Anzahl der segmentierten Voxel und deren räumlichen Abmessungen berechnet.
3.4.5.2 Positronen-Emissions-Tomographie / Computer Tomographie
Weiterhin wurde ein Imaging mittels Positronen-Emissions-Tomographie (PET) / Computer-Tomographie (CT) bei 36 Versuchstieren durchgeführt. Die scid-Mäuse wurden in zwei Gruppen eingeteilt. Jede Gruppe bestand aus scid-Mäusen der Behandlungsgruppe und der Kontrollgruppe. Als Tracer wurden [18F]FDG und [18F]FLT (ABX Advanced Biochemical Compounds, Radeberg, Deutschland) benutzt. Diese wurden dann in jeweils 18 Mäuse appliziert. Je 13 MBq von [18F]FDG und [18F]FLT wurden über die Schwanzvene jeder scid-Maus verabreicht. Nach 60 min wurden die Tiere durch intraperitoneale Injektion bestehend aus einem Gemisch aus Rompun-Ketanest (0,8 ml Rompun 2% (Bayer Leverkusen,
Deutschland) und 1,2 ml Ketamin Gräub (100 mg / ml; Albrecht, Aulendorf, Deutschland) in 8 ml 0,9% NaCl) betäubt. Wie auch schon bei vorherigen Betäubungen wurden 0,1 ml / 10 g Mauskörpergewicht gespritzt. Nach Erreichen der Narkosetiefe wurden die Tiere auf einem Gerüst platziert und in das PET-CT gefahren. Dynamische PET Aufnahmen wurden für 45 min unter Verwendung eines konventionellen Vollringes, Ganzkörper PET durchgeführt (Gemini GXL 10 PET/CT System, Philips Medical Systems, Deutschland).
Abb. 4: Untersuchung der scid-Mäuse im PET-CT mit Tierreck. Hierbei ist es möglich 18 Tiere zeitgleich zu untersuchen. Das Foto wurde freundlicherweise von Herrn Dr. med. Kersten Peldschus zur Verfügung gestellt.
Nach der Durchführung der Untersuchung wurde zunächst durch die CT - Aufnahmen die anatomische Zuordnung der Strukturen im PET ermöglicht. Anschließend wurden die Bilder visuell beurteilt und die Stärke der Anreicherung von den radioaktiven Substanzen [18F]FDG und [18F]FLT beurteilt (freundlicherweise erfolgte dieses durch die Abteilung für Nuklearmedizin des UKE). Die visuelle Interpretation wurde wie folgt festgelegt: War keine Anreicherung erkennbar, wurde dieses mit 0 betitelt. Mit 1 wurde ein stärkeres Signal als das Hintergrundrauschen angegeben. Mit 2 wurde eine Aufnahme der radioaktiven Substanz betitelt, die stärker war als die des Referenzorgans Leber für [18F]FLT oder die des Referenzorgans Gehirn für [18F]FDG.
3.5 Statistische Auswertung
Die Ergebnisse der XTT-Tests sind als Mittelwert ± SD von mindestens vier unabhängigen Versuchen dargestellt. Die Absorption der unbehandelten Kontrollzellen wurde dabei einer Zellzahl von 100 % gleichgesetzt, die Absorption der behandelten Zellen entsprach dem prozentualen Anteil der Kontrolle. Mittels des t-Tests (ungepaart) konnte dann für alle oben genannten Untersuchungen ermittelt werden, ab welcher Konzentration des Bortezomibs eine signifikante Hemmung im Vergleich zum Kontrollwert vorhanden war.
Primärtumorgewicht, Anzahl an Apoptosen, Mitosen und nekrotischen Arealen in den Primärtumoren, sowie die Anzahl an disseminierten Tumorzellen im Blut von Kontroll- und Bortezomibgruppe wurden verglichen, um auch hier die Wirkung von Bortezomib auf das Neuroblastomzellwachstum in vivo zu untersuchen.
Die Ergebnisse der in vivo Versuche wurden auf ganze Zahlen auf- bzw. abgerundet.
Für alle statistischen Berechnungen und Graphen wurde die Software Graph Pad Prism (Graph Pad TM, San Diego, USA) verwendet, wobei p-Werte <0,05 als statistisch signifikant bewertet wurden.
4
Ergebnisse
4.1 Wirkung von Bortezomib in vitro
Die Wirkung von Bortezomib wurde an humanen Neuroblastomzellen untersucht. Dafür wurde der Effekt einzelner Konzentrationen von Bortezomib auf die Zelllinien Kelly, SK-N-SH, SH-SY5Y, LAN-1, LAN-5, IMR-32 und LS getestet. Wenn eine bestimmte Konzentration von Bortezomib nur bei drei oder weniger Zelllinien eine Wirkung zeigte, wurden statistisch signifikante Effekte von weniger als 20% als biologisch nicht relevant eingestuft (Valentiner et al., 2005). Bortezomib verursachte eine dosisabhängige Wachstumsinhibierung bei allen untersuchten Neuroblastomzelllinien. Die IC50 Werte der sieben Zelllinien reichten von 1,9 ng / ml (SH-SY5Y) zu 8,4 ng / ml (LAN-1).
Bei der Zelllinie LS kam es bei einer Konzentration des Bortzomibs von 0,0002 µg / ml und 0,002 µg / ml zu keinerlei Veränderung der Zellproliferation. Erst ab einer Konzentration von 0,02 µg / ml Bortezomiblösung kam es zu einem massiven Abfall der Zellzahl auf 6,9% (p<0,001) der Kontrolle. Bei einer Konzentration von 2 µg / ml und 20 µg / ml wurde die Proliferation auf 1,5% der Kontrolle gesenkt.
10-4 10-3 10-2 10-1 100 101 102 0 25 50 75 100 125 Bortezomib [µg/ml] Z e ll za h l [% ]
Abb. 5: Hemmende Wirkung von Bortezomib auf die humane Neuroblastomzelllinie LS. Dargestellt sind Mittelwert ± SEM (n = 20) für die jeweilige Konzentration.
Bei der Zelllinie Kelly setzte die inhibitorische Wirkung ebenfalls erst bei einer Konzentration von 0,02 µg / ml Bortezomib ein. Die Zellzahl erreichte nur noch 7,8% (p<0,001) des
Kontrollwertes. Bei einer Konzentration von 20 µg / ml und 2 µg / ml wurde die Proliferation auf 5% der Kontrolle gehemmt.
10-4 10-3 10-2 10-1 100 101 102 0 25 50 75 100 125 Bortezomib [µg/ml] Z e ll za h l [% ]
Abb. 6: Hemmende Wirkung von Bortezomib auf die humane Neuroblastomzelllinie Kelly. Dargestellt sind Mittelwert ± SEM (n = 20) für die jeweilige Konzentration.
Bei der Zelllinie SK-N-SH konnten ähnliche Werte wie bei den Zelllinien LS und Kelly erzielt werden. Hier lag die Zellzahl bei den Konzentrationen von 0,02 µg / ml bis 20 µg / ml Bortezomib bei ca. 9% (p<0,001). Bei einer Konzentration von 0,002 µg / ml kam es lediglich zu einem leichten Abfall auf 96% (p< 0,05) des Kontrollwachstums.
10-4 10-3 10-2 10-1 100 101 102 0 25 50 75 100 125 Bortezomib [µg/ml] Z e ll za h l [% ]
Abb. 7: Hemmende Wirkung von Bortezomib auf die humane Neuroblastomzelllinie SK-N-SH. Dargestellt sind Mittelwert ± SEM (n = 20) für die jeweiligen Konzentrationen.
Bei der Zelllinie SH-SY5Y zeigte sich bereits ab einer Konzentration des Bortezomibs von 0,002 µg / ml ein massiver Abfall auf 39% (p<0,001) des Kontrollwachstums. Hier lag die
stärkste Inhibition bei einer Konzentration von 0,02 µg / ml. Hierbei konnte die Proliferation auf 2,5% der Kontrolle (p<0,001) gehemmt werden.
10-4 10-3 10-2 10-1 100 101 102 0 50 100 150 Bortezomib [µg/ml] Z e ll za h l [% ]
Abb. 8: Hemmende Wirkung von Bortezomib auf die humane Neuroblastomzelllinie SH-SY5Y. Dargestellt sind Mittelwert ± SEM (n = 20)
Bei der Zelllinie IMR-32 zeigte sich eine statistisch signifikante Änderung der Zellzahl ab 0,02 µg / ml Bortezomib (p<0,001). Hierbei wurde die Proliferation auf 23% des Kontrollwertes gehemmt. Wie bei der Zelllinie SH-SY5Y lag auch hier die stärkste Proliferationshemmung (16,4% der Kontrolle, p<0,001) bei einer Bortezomibkonzentration von 0,2 µg / ml.
10-4 10-3 10-2 10-1 100 101 102 0 25 50 75 100 125 Bortezomib [µg/ml] Z e ll za h l [% ]
Abb. 9: Hemmende Wirkung von Bortezomib auf die humane Neuroblastomzelllinie IMR-32. Dargestellt sind Mittelwert ± SEM (n = 20) für die jeweiligen Konzentrationen.
Eine signifikante Hemmung konnte auch bei der Zelllinie LAN-1 erreicht werden. Wieder kam es bei einer Konzentration von 0,002 µg / ml Bortezomib nur zu einer leichten Hemmung auf 93% (p<0,05) des Kontrollwachstums. Jedoch konnte dann ein kontinuierlicher Abfall der Proliferation auf 30% (p<0,001) bei einer Konzentration von 0,02 µg / ml bis hin zu einer Hemmung auf 5% (p<0,001) des Kontrollwertes bei einer Konzentration von 2 µg / ml Bortezomib beobachtet werden.
10-4 10-3 10-2 10-1 100 101 102 0 25 50 75 100 125 Bortezomib [µg/ml] Z e ll za h l [% ]
Abb. 10 Hemmende Wirkung von Bortezomib auf die humane Neuroblastomzelllinie LAN-1. Dargestellt sind Mittelwert ± SEM (n = 20) für die jeweilige Konzentration.
Bei der Zelllinie LAN-5 konnten ähnliche Ergebnisse erzielt werden wie bei LAN-1. Hier wurde ebenfalls bei einer Konzentration von 0,002 µg / ml Bortezomib die Proliferation auf 87% (p<0,01) nur leicht gesenkt. Eine deutliche Hemmung wurde bei einer Konzentration von 0,02 µg / ml auf 27% (p<0,001) des Kontrollwachstums erzielt. Durch die höheren Konzentrationen konnte dann eine ausgeprägte Wachstumshemmung bei 20 µg / ml Bortezomib auf 3% der Kontrolle (p<0,001) erzielt werden.
10-4 10-3 10-2 10-1 100 101 102 0 25 50 75 100 125 Bortezomib [µg/ml] Z e ll za h l [% ]
Abb. 11: Hemmende Wirkung von Bortezomib auf die humane Neuroblastomzelllinie LAN-5. Dargestellt sind Mittelwert ± SEM (n = 20) für die jeweiligen Konzentrationen.
Bei allen Zelllinien bis auf SK-N-SH traten deutliche Schwankungen der einzelnen Ergebnisse innerhalb der Versuche, insbesondere bei einer Bortezomibkonzentration von 0,002 µg / ml, auf.
Substanz Lebende Zellen (% von der Kontrolle)
SH-SY5Y SK-N-SH IMR-32 LAN-5 LAN-1 LS Kelly Bortezomib 0.0002 µg / ml 0.002 µg / ml 0.02 µg / ml 0.2 µg / ml 2 µg / ml 20 µg / ml IC50 (µg / ml) 112 *** 39 *** 2 *** 3 *** 8 *** 11 *** 0.0019 103 n.s. 97 n.s. 9 *** 9 *** 10 *** 9 *** 0.0034 102 n.s. 94 * 23 *** 16 *** 19 *** 20 *** 0.0056 104 * 87 ** 28 *** 16 *** 7 *** 3 *** 0.0074 103 n.s. 93 * 31 *** 23 *** 10 *** 5 *** 0.0084 104 n.s. 101 n.s. 7 *** 3 *** 1 *** 2 *** 0.0078 102 n.s. 100 n.s. 8 *** 5 *** 5 *** 5 *** 0.0064
Tab. 4: Effekte von Bortezomib auf die sieben getesteten Neuroblastomzelllinien. Die Zahlen repräsentieren die Anzahl von lebenden Zellen im Vergleich zur Kontrolle. Der IC50 gibt die Konzentration an, bei
der die Hälfte der Gesamtwirkung erreicht wurde. Die statistische Analyse wurde mittels des Student´s t-test (ungepaart) durchgeführt. n.s.= nicht signifikant.* p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001.
4.2. Wirkung von Bortezomib in vivo
Um die Wirkung von Bortezomib in vivo zu untersuchen, wurden 40 scid-Mäuse mit humanen SK-N-SH Neuroblastomzellen beimpft. Diese Zelllinie wurde verwendet, da sie bereits bei durchgeführten Tierversuchen unseres Institutes ein gutes Tumorwachstum und eine hohe Metastasierungsrate aufwies (Ursula Valentiner, unveröffentlicht). Weiterhin wurde die Zellproliferation dieser Zelllinie in vitro durch Bortezomib inhibiert.
Die Tiere wurden in 2 Gruppen eingeteilt, die eine Gruppe erhielt den Proteasomeninhibitor Bortezomib (Konzentration 1 mg / kg KG) und die Kontrollgruppe erhielt PBS. Am Ende der Versuchszeit von vier Wochen wurden acht Tiere (vier Tiere aus jeder Gruppe) mittels MRT und 36 scid-Mäuse (jeweils 18 aus jeder Gruppe) mittels PET / CT untersucht. Zudem wurden die entnommenen Primärtumore und Organe durch histologische Färbungen und das Blut der Tiere mit Hilfe der Real-time PCR untersucht.
4.2.1 Primärtumor
Nach der Tötung der scid-Mäuse wurden die Primärtumoren entnommen und gewogen. Es konnte kein signifikanter Unterschied des Primärtumorgewichtes (p<0,84) zwischen Kontrollgruppe (0,29 g) und der mit Bortezomib behandelten Gruppe (0,26 g) festgestellt werden (Abb. 12).
Abb. 12: Tumorgewicht der mit PBS behandelten Kontrollgruppe und der mit Bortezomib behandelten Gruppe. Gezeigt ist der Mittelwert ± SEM.
Kontrolle Bortezomib 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 T u m o rg e w ic h t [g ]
4.2.1.1 Lichtmikroskopie
Die Neuroblastomzellen des Primärtumores präsentierten sich als eher runde, undifferenzierte Zellen und waren dicht gepackt. Einzig in der Zellperipherie waren die Zellen lockerer gepackt. Die Primärtumoren enthielten wenig Stroma; in ihrem Zentrum waren ausgeprägte eosinophile nekrotische Areale zu erkennen. Weiterhin wiesen die malignen Zellen eine zum Kern hin verschobene Kern-Plasma-Relation auf und zeigten atypische polymorphe und polyzyklische Zellkerne, prominente Nukleoli und Mitosen. In der HE Färbung wurden die apoptotischen Zellen durch dunkel gefärbte und kondensierte Chromosomen dargestellt. Mitosen zeigten sich durch mitotische Figuren von kondensierten Chromosomen.
In der vorliegenden Arbeit wurde bei den entnommenen Primärtumoren die Prozentzahl der Apoptosen und der Mitosen bestimmt. Sowohl die Anzahl der Apoptosen als auch die Anzahl der Mitosen wiesen einen hochsignifikanten Unterschied zwischen der Kontrollgruppe und der mit Bortezomib behandelten Gruppe auf. In der Kontrollgruppe befanden sich 5% der Zellen in Apoptose, während sich in der Behandlungsgruppe 10% der gezählten Zellen in Apoptose befanden (p<0,001). Die Mitoserate der Kontrollgruppe betrug im Mittel 6,5% und die der Bortezomibgruppe 5% (p<0,001). In den folgenden Abbildungen (Abb.13 – 16) sind die histologischen Präparate und die dazugehörigen Ergebnisse der Anzahl an Apoptosen und Mitosen graphisch dargestellt. Der Anteil an Nekrose im Primärtumor und das histologische Präparat eines Kontrollgruppentieres sind in Abb. 17 und 18 dargestellt.
Abb. 13: Primärtumorareal einer behandelten scid-Maus mit hohem Apoptoseanteil (HE Färbung). Mit sind einige Apoptosen gekennzeichnet.
Abb. 14: Anzahl der Apoptosen in den Primärtumoren der Kontrollgruppe und der Bortezomibgruppe. Gezeigt ist der Mittelwert ± SEM (n=15). Durch die Bortezomibbehandlung kam es zu einer statistisch signifikanten Steigerung der Apoptose in den Primärtumoren (p< 0,001).
Kontrolle Bortezomib 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5
***
A n z a h l d e r A p o p to s e nAbb. 15: Primärtumorareal mit Mitosen (HE Färbung). Mit sind einige Mitosen gekennzeichnet.
Abb. 16: Anzahl der Mitosen in den Primärtumoren der Kontrollgruppe und der mit Bortezomib behandelten Gruppe. Gezeigt ist der Mittelwert ± SEM (n=15). Durch die Behandlung mit dem Medikament Bortezomib kam es zu einer Herabsetzung der Mitosenanzahl in den Tumoren (p< 0,001).
Kontrolle Bortezomib 0 1 2 3 4 5 6 7
***
M it o s e A n za h lDarüber hinaus wurde der Nekroseanteil der entnommenen Primärtumore bestimmt. Hierbei zeigte sich kein signifikanter Unterschied in den Nekrosebezirken zwischen der mit Bortezomib behandelten Gruppe und der Kontrollgruppe.
Abb. 17: Übersichtsaufnahme eines Primärtumores mit hohem Nekroseanteil (HE Färbung). Das Nekroseareal ist durch gekennzeichnet.
Abb. 18: Prozentuale Abschätzung des Nekroseanteils der Primärtumoren der Kontrollgruppe versus Bortezomibgruppe. Dargestellt ist der Mittelwert ± SEM (n=15). Es konnte kein signifikanter Unterschied des Nekroseanteiles zwischen den beiden Gruppen festgestellt werden.
Kontrolle Bortezomib 0 10 20 30 40 50 60 70 N e k ro s e a n te il [ % ]
4.2.1.2 Elektronenmikroskopie
Die Neuroblastomzellen wuchsen im Randbereich des Tumors invasiv in Blutgefäße und Muskulatur (Abb. 19). Dabei drängten sie sich zwischen die Skelettmuskelzellen und proliferierten in diesen Zwischenräumen. Teilweise dellten die Tumorzellen die Skelettmuskelfasern lokal ein.
Abb. 19: Infiltration des Neuroblastoms in die Skelettmuskulatur. Man erkennt, dass die Tumorzellen infiltrativ zwischen die Skelettmuskelfasern eingewachsen sind. Zwischen den Tumorzellen befinden sich deutlich sichtbare Interzellularräume (Pfeile), ihre Zellkerne enthalten meist einen deutlichen Nukleolus.
Abb. 20: Zentrale Nekrose des Neuroblastoms. Als Reste der abgestorbenen Tumorzellen findet man leere Plasmalemmvakuolen (mit gekennzeichnet). In den zentralen Anteilen der Neuroblastome findet sich eine ausgeprägte Nekrose. Die Zellkerne der untergehenden Zellen zeigen randständig viel Heterochromatin (vergleiche mit der Kernstruktur vitaler Tumorzellen in Abb. 19). Einige der apoptotischen Zellen sind mit gekennzeichnet.
4.2.2 Lungenmetastasierung
Um den Einfluss des Proteasomeninhibitors Bortezomib auf die Lungenmetastasierung zu untersuchen, wurden HE gefärbte Schnitte angefertigt und die Anzahl der Metastasen mittels Lichtmikroskopie bestimmt. Nach Berechnung mittels der Formel von Jojovic und Schumacher (2000), wurde die Gesamtanzahl der Metastasen in den Lungen bestimmt.
Es wurden keine Metastasen in den Lungen der Bortezomibgruppe gefunden. Hingegen konnten Lungenmetastasen in 5 Lungen von insgesamt 20 scid-Mäusen der Kontrollgruppe nachgewiesen werden. Die Anzahl der Lungenmetastasen betrug 42, 168, 192, 24 und 48 in den jeweiligen Kontrollmäusen.
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 0 50 100 150 200 Tumorgewicht [g] A n za h l d e r M e ta s ta s e n
Abb:21: Anzahl der Metastasen in den fünf Lungen der Kontrollgruppe der scid-Mäuse. Die Anzahl der Metastasen wurde nach der Formel von Jojovic und Schumacher (2000) berechnet (Mittelwert 95, SEM 35). Es bestand keine Korrelation zwischen Tumorgewicht und Anzahl der Metastasen.
Die Metastasen waren sowohl in den Lungenarterien als auch in den Alveolarsepten zu finden. Die malignen Zellen wiesen eine zugunsten des Kernes verschobene Kern-Plasma-Relation und ovale, z.T. eingedellte Zellkerne mit prominenten Nukleoli auf. Die Metastasen grenzten sich gut gegen das restliche Lungengewebe ab (Abb. 22).
Abb. 22: Lunge eines Kontrolltieres mit Metastasen (HE Färbung). Die Pfeile markieren Metastasen im Lungengewebe. Sie liegen in den Ästen der A. pulmonalis und im periarteriellen Raum. Die malignen Zellen weisen eine verschobene Kern-Plasma-Relation und atypische Zellkerne mit prominenten Nukleoli auf und grenzen sich gut gegen das Lungengewebe ab.
4.2.3 Disseminierte Tumorzellen im Blut
In Abbildung 23 ist ein typischer LightCycler Lauf dargestellt. Bei Zunahme der Anzahl der Durchgänge kommt es zu einer Amplifikation der DNA. Es besteht eine Abhängigkeit zwischen der Anzahl der freien Tumorzellen im Blut und der Anzahl der Zyklen die benötigt werden, um einen Anstieg der Amplifikationskurve auszulösen. Bei wenigen DNA-Zyklen ist ein Anstieg der Amplifikationskurve nur bei den ersten fünf Proben der Eichreihe zu erkennen (Abb. 23). Probe 1 der Eichkurve (106Tumorzellen) zeigte eine erkennbare Amplifikation nach sechs Zyklen, Probe 2 (105 Tumorzellen) nach acht Zyklen, Probe 3 (104 Tumorzellen) nach zwölf Zyklen, Probe 4 (103 Tumorzellen) nach 15 Zyklen und Probe 5 (102 Tumorzellen) nach 18 Zyklen. Bei Probe 6 der Eichkurve (101 Tumorzellen) zeigte sich ein Anstieg der Kurve erst nach ca. 21 Amplifikationszyklen. Hierbei gab es schon einzelne DNA-Proben der scid-Mäuse, bei denen ein Anstieg vor der letzten Eichprobe zu beobachten war. Die danach folgenden Kurven der DNA-Proben der scid-Mäuse der Kontrollgruppe wiesen demnach nur noch geringe Anzahlen an freien Tumorzellen auf. Zur besseren Übersicht zeigt Abbildung 24 den Kurvenverlauf von einigen Blutproben ohne die Eichkurve. Die erste DNA-Probe der scid-Mäuse verzeichnete nach 22 Zyklen der Amplifikation einen Anstieg. Für die weiteren
DNA-Proben der Tiere waren weitere Zyklen erforderlich, um einen Nachweis von freien Tumorzellen zu erzielen.
Mittels der Real-time PCR wurde festgestellt, dass es keine Differenz in der Anzahl der freien Tumorzellen (15 freie Tumorzellen) zwischen der Kontrollgruppe und der behandelten Gruppe gab (Abb. 25).
Abb. 23: LightCyclerlauf der Kontrollgruppe. Die vertikale Achse zeigt den Grad an Amplifikationen des SYBR-Green Ι Fluoreszenz und die horizontale Achse repräsentiert die Anzahl an Zyklen der Amplifikation.
Abb. 24: Blutproben der Kontrollgruppe in einem LightCyclerlauf. Nach 22 Zyklen konnte bei der ersten Probe der scid-Maus aus der Kontrollgruppe ein Anstieg der Kurve verzeichnet werden. Für die anderen DNA-Proben waren mehr Zyklen notwendig, um den Anstieg der Kurve und somit einen Nachweis von freien Tumorzellen zu erzielen. Der Pfeil markiert die erste Probe.
Abb. 25: Anzahl der freien Tumorzellen im Blut. Die Menge der freien Tumorzellen wurde anhand der DNA – Konzentration bestimmt. Gezeigt ist der Vergleich von freien Tumorzellen zwischen der Kontrollgruppe und der Bortezomibgruppe. Dargestellt ist der Mittelwert ± SEM. Es gibt keinen signifikanten Unterschied zwischen den Mittelwerten der beiden Gruppen.
Kontrolle (n=20) Bortezomib (n=19) Tumorgewicht (g) n.s. 0,29 (±0,05) 0,26 (±0,05) Lungenmetastasen
5 von 18 (28%) Mäusen, Anzahl der Lungenmetastasen: 42; 168; 192; 24; 48.
0 Anzahl von apoptotischen
Zellen im Tumor (%) *** 5,04 (±0,18) 10,00 (±0,25) Anzahl von mitotischen
Zellen im Tumor (%) *** 6,56 (±0,17) 5,08 (±0,12) Anzahl von nekrotischen
Anteilen im Tumor (%) n.s. 62,5 (±4,11) 56,6 (±5,30) Disseminierte Tumorzellen im Blut (Zellen/ml) n.s. 1,36 (±0,12) 1,38 (±0,17) (n=18)
Tab. 5: Effekte von Bortezomib auf das Wachstum der humanen SK-N-SH Neuroblastom Zelllinie in einem scid-Mausmodel. Die Ergebnisse repräsentieren den Mittelwert (±SEM) ausgenommen Anzahl der Lungenmetastasen. Die statistische Analyse wurde mittels des Student´s t-test (ungepaart) durchgeführt. n.s. nicht signifikant; * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001. Kontrolle Bortezomib 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Z e ll e n / m l
4.2.4 Imaging 4.2.4.1 MRT
Zur Bestimmung der Tumorvolumina wurden MRT-Bilder angefertigt und diese mit dem Voxel Programm (Voxel Man Gruppe, Hamburg) bearbeitet. Die Aufnahmen wurden im MRT sowohl in T1 als auch in T2 Gewichtung angefertigt. Die anatomischen Strukturen waren mit der T1 Gewichtung sehr gut zu beurteilen, jedoch waren die Abgrenzung des Neuroblastoms, die nekrotischen Anteile und die perifokalen Ödeme in den T2 gewichteten Aufnahmen deutlich besser zu bestimmen. Für alle weiteren Beurteilungen und Berechnungen wurden deswegen die sagittal oder coronal geschnittenen T2 Bilder benutzt.
Abb. 26: MRT-Aufnahme von scid-Maus Nr. 7.2. In der gezeigten MRT-Aufnahme ist die scid-Maus Nr. 7.2 in sagittaler Schnittrichtung und in T2 Gewichtung gezeigt. zeigt den Primärtumor.
Danach wurden das Segmentationsverfahren und die automatische Erfassung zusammenhängender Volumenelemente (Voxel) im Bereich der Tumore angewandt. Die korrespondierenden Tumorvolumina wurden jeweils aus der Anzahl der segmentierten Voxel und deren räumlichen Abmessungen berechnet. Gezeigt ist in Abb. 27 ein MRT Bild in coronaler Schnittführung und die dazugehörigen durch die Voxel-Man Software bearbeiteten Tumoranteile (rot dargestellt).
Abb. 27: MRT-Aufnahmen der scid-Maus nativ. Dargestellt ist die MRT-Aufnahme einer scid-Maus in coronaler Schnittführung und eine Bearbeitung des gleichen Bildes durch das Voxelprogramm. Der Tumor ist rot dargestellt.
Zudem wurde das berechnete Tumorvolumen mit dem tatsächlich am Tötungstag gemessenen Tumorgewicht verglichen (Abb. 28). Mittels einer Produkt-Moment-Korrelation (nach Pearson) wurde der Zusammenhang zwischen Tumorgewicht und Tumorvolumen überprüft. Es ergab sich ein Korrelationskoeffizient von 0,6, der allerdings statistisch nicht signifikant war.
Abb. 28: Graphische Darstellung der Korrelation zwischen Tumorvolumen und Tumorgewicht. Es besteht eine positive Korrelation zwischen dem durch die Voxel-Man Software bestimmten Tumorvolumen und dem tatsächlichen Tumorgewicht. Korrelationskoeffizient: 0,6.
Weiterhin konnte durch die VOXEL-MAN Arbeitsgruppe Hamburg eine dreidimensionale Darstellung des Primärtumors der scid-Maus Nr. 7.2 hergestellt werden. Zum Vergleich wurden Fotos am Tötungstag von dem Tumor der scid-Maus Nr. 7.2 angefertigt, so dass ein direkter Vergleich möglich ist (Abb. 29).
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 0 100 200 300 400 500 Tumorgewicht [g] T u m o rv o lu m e n [ m m 3 ]
Abb. 29: Mittels Computerbearbeitung erstelltes 3D Bild eines Tumors sowie Foto desselben Tumors direkt nach Entnahme am Tötungstag. Die Abbildungen ermöglichen den direkten Vergleich zwischen der durch die Voxel-Man Software bearbeiteten MRT Tumordarstellung und dem Foto des resizierten nativen Tumors. Hierbei ist zu sehen, dass die Bearbeitung mittels des Voxel Programms eine gute Methode darstellt, um das Aussehen und die Form eines Tumors in situ nachzubilden.
