Terminale Prozesse des anaeroben Abbaus in sauren Torfmooren der Subarktis und des südlichen Boreals

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(1)Terminale Prozesse des anaeroben Abbaus in sauren Torfmooren der Subarktis und des südlichen Boreals. Dissertation. zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.). dem Fachbereich Biologie der Philipps-Universität Marburg/Lahn vorgelegt von Martina Metje aus Bad Gandersheim. Marburg/Lahn 2006.

(2) Die Untersuchungen zur vorliegenden Arbeit wurden von Januar 2004 bis Dezember 2006 am Max-Planck-Institut für Terrestrische Mikrobiologie in Marburg/Lahn unter der Leitung von Prof. Dr. Peter Frenzel durchgeführt.. Vom Fachbereich Biologie der Philipps-Universität Marburg als Dissertation angenommen am: Erstgutachter:. Prof. Dr. Peter Frenzel. Zweitgutachter:. Prof. Dr. Rolf Thauer. Tag der Disputation:.

(3) Die in dieser Dissertation beschriebenen Ergebnisse sind in Originalpublikationen veröffentlicht bzw. zur Veröffentlichung eingereicht:. folgenden. Metje, M. and Frenzel, P. (2005). Effect of Temperature on Anaerobic Ethanol Oxidation and Methanogenesis in Acidic Peat from a Northern Wetland. Appl. Environ. Microbiol., 71 (12): 8191-8200. Metje, M. and Frenzel, P. Methanogenesis and methanogenic pathways in acidic peat from subarctic permafrost. Environ. Microbiol. (in press). Metje, M. and Frenzel, P. Methanogenesis and Anaerobic Acetate Turnover in an Acidic Peat Bog (submitted).. Folgendes Manuskript ist in Vorbereitung: Metje, M. and Frenzel, P. The role of Geobacteraceae in Anaerobic Acetate Oxidation in an Acidic Bog of the Southern Boreal (in preparation)..

(4) Inhaltsverzeichnis __________________________________________________________________________________________________________________________________________________. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS .............................................................................. 3 ZUSAMMENFASSUNG ......................................................................................... 4 1. EINLEITUNG...................................................................................................... 7 1.1. Die Bedeutung von Feuchtgebieten und Permafrostböden im globalen Kohlenstoffkreislauf............................................................................................................ 7 1.2. Moortypen..................................................................................................................... 9 1.3. CH4 und CO2 als Spurengase in der Atmosphäre ................................................... 10 1.4. Die terminale Mineralisation..................................................................................... 11 1.5. Syntrophe Kooperationen.......................................................................................... 13 1.6. Nutzen für die Erforschung der frühen Erdgeschichte und für die extraterrestrische Forschung ........................................................................................... 14 1.7. Molekulare Marker in der mikrobiellen Ökologie.................................................. 16 1.8. Ziele der Arbeit........................................................................................................... 19 2. MATERIAL UND METHODEN......................................................................... 20 2.1. Chemikalien und Gase ............................................................................................... 20 2.2. Standorte und Moorcharakteristika......................................................................... 20 2.3. Inkubation................................................................................................................... 22 2.4. Chemische und physikalische Analysen................................................................... 23 2.4.1. Gaschromatographie (CH4, CO2 und H2).............................................................. 23 2.4.2. HPLC (organische Säuren und Alkohole)............................................................. 24 2.4.3. Alkohol-Gaschromatographie ............................................................................... 25 2.4.4. Ionenchromatographie (Sulfat, Nitrat und Nitrit) ................................................. 25 2.4.5. GC-C-IRMS (CH4 und CO2) und LC-IRMS (organische Fettsäuren).................. 27 2.4.6. Bestimmung der Radioaktivität zugegebener Substrate........................................ 28 2.4.7. Messung der pH-Werte und Redoxpotentiale ....................................................... 29 2.4.8. Trockengewichte und Ascheanteile ...................................................................... 29 2.4.9. Bestimmung von Fe(II) durch saure Extraktionsmethoden .................................. 29 2.5. Rechnungen................................................................................................................. 30 2.5.1. Produktionsraten von CH4 und CO2 ...................................................................... 30 2.5.2. Acetatumsatz ......................................................................................................... 31 2.5.3. δ- Notation............................................................................................................. 32 2.5.3. Thermodynamische Berechnungen ....................................................................... 32.

(5) Inhaltsverzeichnis __________________________________________________________________________________________________________________________________________________. 2.6. Molekularbiologische Analyse................................................................................... 33 2.6.1. DNA-Extraktion aus Torfmoorproben .................................................................. 33 2.6.2. Quantifizierung von Nukleinsäuren....................................................................... 34 2.6.3. PCR-Amplifikation................................................................................................ 34 2.6.4. Real-Time-PCR...................................................................................................... 36 2.6.5. T-RFLP-Analyse ................................................................................................... 37 2.6.6. Klonierung............................................................................................................. 38 2.6.7. Sequenzierung ....................................................................................................... 39 2.7. Bioinformatische Analyse .......................................................................................... 40 2.7.1. Bearbeitung der Sequenzen ................................................................................... 40 2.7.2. Phylogenetische Analyse des 16S rRNA-Gens ..................................................... 40 2.7.3. Phylogenetische Analyse des mcrA-Gens ............................................................. 41 2.7.4. Phylogenetische Analyse des fhs-Gens ................................................................. 42 2.8. Statistische Datenanalyse ........................................................................................... 42 2.8.1. Der Shannon-Wiener-Index................................................................................... 42 2.8.2. Der Spearman-Rangkorrelationskoeffizient .......................................................... 43 3. ERGEBNISSE.................................................................................................. 46 3.1. Der Einfluss der Temperatur auf die anaerobe Ethanoloxidation und die Methanogenese in saurem Torf aus einem nördlichen Feuchtgebiet............................ 46 3.2. Methanogenese und methanogene Stoffwechselwege in Torf aus einem subarktischen Permafrostgebiet....................................................................................... 57 3.3. Methanogenese und anaerober Acetatumsatz in einem sauren Hochmoor.......... 85 3.4. Die Rolle von Mitgliedern der Familie Geobacteraceae bei der anaeroben Acetatoxidation in einem sauren Hochmoor................................................................. 132 4. ZUSAMMENFASSENDE DISKUSSION .........................................................155 4.1. Syntrophie – ein allgemeines Phänomen in Mooren? ........................................... 156 4.2. Die Struktur der methanogenen Gemeinschaft – Spiegelbild der vorherrschenden Prozesse? .......................................................................................................................... 157 4.3. Methanogene in zeitweilig oder dauerhaft kalten Habitaten ............................... 163 4.4. Schlussbetrachtung und Ausblick........................................................................... 166 5. LITERATUR ....................................................................................................168.

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(7) Abkürzungsverzeichnis __________________________________________________________________________________________________________________________________________________. Abkürzungsverzeichnis AAcO BES DOC DW FW FTHFS fhs FL GC-FID GC-MS GCC-IRMS IC MB MCR MF mcrA ppmv PW RI SibS SibT Slurry/-ies SOC sp. T-RF T-RFLP U · min-1 rpm UV v/v w/v. Anaerobe Acetatoxidation (Anaerobic Acetate Oxidation) Bromethansulfonat Gelöster Organischer Kohlenstoff (dissolved organic carbon) Trockengewicht (Dry Weight) Frischgewicht (Fresh Weight) Formyl-tetrahydrofolate-Synthetase Gen für die Formyl-tetrahydrofolate-Synthetase Finnland Gaschromatograph mit Flammenionisationsdetektor Gaschromatograph mit massenselektivem Detektor Gaschromatograph mit Verbrennungs-IsotopenverhältnisMassenspektrometer (Gas Chromatography Combustion Isotope Ratio Mass Spectrometry) Ionenchromatograph Männikjärve Bog Methyl-CoenzymM-Reduktase (methyl coenzymeM reductase) Männikjärve Fen Gen für die α-Untereinheit der Methyl-CoenzymM-Reduktase parts per million by volume Porenwasser (porewater) Brechungsindex (Refraction Index) Sibirien Start Sibirien nach Inkubation bei 30°C Bodensuspension/-en An Boden gebundener organischer Kohlenstoff (Soil Organic Carbon) Art (species) Terminales Restriktionsfragment (Terminal Restriction Fragment) Terminaler Restriktions-Längen-Polymorphismus (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism) Umdrehungen pro Minute Umdrehungen pro Minute (Rounds per minute) Ultraviolett Volumen pro Volumen (volume by volume) Gewicht pro Volumen (weight by volume). Weitere Abkürzungen wurden entsprechend der Information for Authors des European Journal for Biochemistry verwendet.. 3.

(8) Zusammenfassung __________________________________________________________________________________________________________________________________________________. Zusammenfassung Moorgebiete spielen als CO2-Senken und CH4-Quellen eine herausragende Rolle im globalen Kohlenstoffkreislauf. Insbesondere die Moore der nördlichen Hemisphäre sind bedeutende Reservoire für im Boden gebundenen organischen Kohlenstoff. Eine bereits voranschreitende globale Erwärmung macht diese Kohlenstoffreservoire mikrobiell verfügbar und kann zu einer Erhöhung der CH4- und CO2-Emissionen führen. Während die Physiologie und die Thermodynamik der Methanogenese sehr gut untersucht worden sind, besteht. noch. methanogener. erheblicher. Forschungsbedarf. Gemeinschaften.. hinsichtlich. Insbesondere. die. Struktur. regulierenden. und. Funktion. Faktoren. der. Methanogenese und der methanogenen Gemeinschaft in leicht sauren bis sauren Mooren sind weitgehend unerforscht. Am Beispiel des Ökosystems Moor wurden in dieser Arbeit zentrale Fragen zur Charakterisierung der methanogenen Gemeinschaften und zu den mit der Methanogenese gekoppelten Prozessen bearbeitet. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde mit Hilfe von Prozessmessungen erstmals die Bedeutung von endogenem Ethanol als Substrat für die Methanogenese und die Fe(III)Reduktion in einem subarktischen Moor in Nord-Finnland gezeigt. Die Berechnung der Kohlenstoffbilanzen zeigte, dass jeweils 50% des Ethanols in die Methanogenese und in die Fe(III)-Reduktion eingingen. 80% des gebildeten CH4 stammten aus H2/CO2. Entsprechend ergab die phylogenetische Analyse des 16S rRNA-Gens und des Gens für die α-Untereinheit der Methyl-CoenzymM-Reduktase, dass mutmaßlich ein einziges Mitglied der Familie Methanobactericeae für die Methanogenese verantwortlich war. Das gemeinsame Temperaturoptimum von anaerober Ethanoloxidation, Methanogenese und Fe(III)-Reduktion bei 25°C lässt auf eine enge Kopplung der Prozesse schließen. Dennoch war die CH4-Bildung auch bei 4°C noch relativ hoch, was auf die Präsenz einer psychrophilen Gemeinschaft hindeutet. Während die Analyse der T-RFLP-Muster eine stabile. Zusammensetzung. der. archaellen. Gemeinschaft. über. den. gesamten. Temperaturgradienten hinweg ergab, zeigte die Real-Time-PCR ein temperaturabhängiges Wachstum. sowohl. der. bakteriellen. als. auch. der. archaeellen. Gemeinschaft.. Zusammenfassend waren sowohl Substratumsatz als auch das Wachstum der mikrobiellen Gemeinschaft stark temperaturabhängig und eng miteinander gekoppelt.. 4.

(9) Zusammenfassung __________________________________________________________________________________________________________________________________________________. Wie im finnischen Moor wurde mit Hilfe von Prozessmessungen der Zusammenhang zwischen der syntrophen Oxidation von flüchtigen Fettsäuren wie vor allem Propionat, Butyrat und Caproat und der Methanogenese in einem sibirischen Moor gezeigt. Die Berechnung der Kohlenstoffbilanzen ergab, dass die syntrophe Oxidation von Butyrat teilweise zur Methanogenese beitrug. Die Inhibierung der acetoclastischen Methanogenese mit CH3F zeigte, dass >70% des gebildeten CH4 aus der acetoclastischen Methanogenese stammten. Aufgrund des stöchiometrischen Verhältnisses der aus der syntrophen Butyratoxidation stammenden Produkte H2 und Acetat wird dieser Prozess hier als Hauptlieferant für die methanogenen Substrate angesehen. Die phylogenetische Analyse des Gens für die 16S rRNA zeigte, dass Miglieder der Familien Methanosarcinaceae und der. Methanobacteriaceae. mit. Methanosarcina. lacustris. und. Methanobacterium. beijingense als nächste kultiverte Verwandte für die Methanogenese verantwortlich waren. Die Bilanzierung von CO2 und CH4 ergab, dass CO2 innerhalb des Temperaturbereichs der Methanogenese ausschließlich aus der acetoclastischen Methanogenese stammte. Alle Prozesse waren stark temperaturabhängig. Das Temperaturoptimum der Methanogenese lag zwischen 26 und 28°C. Es gibt einige Hinweise dafür, dass die Methanogenese nicht direkt durch die Temperatur stimuliert wurde, sondern indirekt durch die Substrat liefernden syntrophen Prozesse. Erstmalig für ein saures Hochmoor (Estland) wurde mit Hilfe von [2-14C]-AcetatMarkierungsexperimenten die syntrophe Oxidation von Acetat gezeigt. Dieser Prozess ist bisher nur in Bioreaktoren und Seesedimente experimentell bewiesen worden. Das Temperaturoptimum der Methanogenese lag bei 25°C. 60-100% des gebildeten CH4 stammten. aus. der. hydrogenotrophen. Methanogenese.. Entsprechend. zeigte. die. phylogenetische Analyse des 16S rRNA-Gens und des Gens für die α-Untereinheit der Methyl-CoenzymM-Reduktase Markierungsexperimente. mit. eine 14. sehr. C-Bicarbonat. diverse wiesen. methanogene auf. die. Gemeinschaft.. Anwesenheit. von. Homoacetogenen hin, die durch die Inkubation mit H2 stimuliert werden konnte. Die phylogenetische Analyse des Gens für die Formyltetrahydrofolat-Synthetase (fhs), eines Schlüsselenzyms. des. Acetyl-CoA-Wegs,. unterstützte. die. Anwesenheit. von. Homoacetogenen. Die bisher bekannten Isolate oxidieren Acetat syntroph über den reversen Acetyl-CoA-Weg, sodass auch hier Homoacetogene für die syntrophe Acetatoxidation verantwortlich gewesen sein könnten.. 5.

(10) Zusammenfassung __________________________________________________________________________________________________________________________________________________. Im Hochmoor wurden trotz Abwesenheit alternativer Elektronenakzeptoren wie Fe(III) Mitglieder der Familie Geobacteraceae mit 16S rRNA-Gen spezifischen Primern detektiert. Da diese Mikroorganismen eine wichtige Rolle bei der Fe(III)-Reduktion in Fe(III)-reichen Habitaten spielen, wurde der Effekt von Ferrihydrit und FeCl3 auf die Mineralisation, die Methanogenese und die methanogene Gemeinschaft untersucht. Ferrihydrit führte zu einer vorübergehenden Hemmung der Methanogenese, aber nicht zu höheren Mineralisationsraten. FeCl3 verursachte eine dauerhafte Hemmung der Methanogenese und führte zu einem sprunghaften Anstieg der Mineralisationsrate. Weitere Experimente mit autoklavierten Proben zeigten, dass dieser Effekt abiotisch war. Insgesamt spielte die Fe(III)-Reduktion eine untergeordnete Rolle: Nur 4-6% des vorhandenen Fe(III) wurden zu Fe(II) reduziert, obwohl die phylogenetische Analyse eine hohe Diversität von Mitgliedern der Fe(III)-reduzierenden Familie Geobacteraceae zeigte. Mitglieder der Familie Geobacteraceae, die für gewöhnlich aus Fe(III)-reichen Habitaten isoliert werden, sind also nicht zwingend an der Fe(III)-Reduktion beteiligt und scheinen ein breiteres Spektrum an ökologischen Nischen einzunehmen als bisher angenommen. Zusammenfassend lassen die hier präsentierten Ergebnisse den Schluss zu, dass syntrophe Prozesse von genereller Bedeutung in Mooren der nördlichen Hemisphäre sein könnten. Wegen der anoxischen Bedingungen in Mooren ist der mikrobielle Abbau stark gebremst, sodass die Mikroorganismen dauerhaft Substrat limitierenden Bedingungen ausgesetzt sind und am thermodynamischen Limit agieren. Aus diesem Grund mag das Überleben der Mikroorganismen von den aus thermodynamischer Sicht ungünstigen syntrophen Prozessen abhängen. Das Verhältnis von acetoclastischer zu hydrogenotropher Methanogenese variierte neben dem Substratangebot auch mit dem pH. Während in leicht sauren Mooren mit einem pH zwischen 5 und 6 CH4 vorwiegend aus Acetat stammte (Sibirien und Estland Männikjärve Fen), führte ein saurer pH um 4 zu einem höheren Anteil der hydrogenotrophen Methanogenese (Finnland und Estland Männikjärve Bog).. 6.

(11) 1. Einleitung __________________________________________________________________________________________________________________________________________________. 1. Einleitung 1.1. Die Bedeutung von Feuchtgebieten und Permafrostböden im globalen Kohlenstoffkreislauf Feuchtgebiete kommen von der Tundra bis hin zu den Tropen in allen Klimazonen vor (Matthews, 1984; Matthews and Fung, 1987; Mitra et al., 2005). Ihre Bedeutung als Kohlendioxidsenke und ihr Einfluss auf die Emission von Treibhausgasen macht sie zu wichtigen Untersuchungsobjekten der Klimaforschung. Auch als Dokumente der Klimaund Erdgeschichte sind sie von beachtlichem naturwissenschaftlichen Wert. Nach der über Jahrhunderte hinweg währenden Zerstörung genießen Feuchtgebiete seit den 70er Jahren einen. hohen. politischen. Stellenwert,. der. in. großflächigen. Schutz-. und. Regenerierungsmaßnahmen mündet. Nach der Ramsar-Konvention von 1971 sind zu den Feuchtgebieten „Feuchtwiesen, Moor- und Sumpfgebiete oder Gewässer, die natürlich oder künstlich, dauernd oder zeitweilig, stehend oder fließend, Süß-, Brack- oder Salzwasser sind, einschließlich solcher Meeresgebiete, die eine Tiefe von sechs Metern bei Niedrigwasser nicht übersteigen“ zu zählen (The Ramsar Convention Bureau, 1999). Bei lang anhaltendem Wasserbilanzüberschuss (Stauwasser), der unter semihumiden bis humiden Klimabedingungen durch unzureichenden Wasserabfluss entsteht, kommt es in Feuchtgebieten rasch zur Anoxie, die den Abbau organischen Materials extrem verlangsamt. Feuchtgebiete werden so zu bedeutenden Kohlenstoffsenken (IPCC, 2001). Nährstoffverfügbarkeit und Torfablagerung oder die Ablagerung von organischen Sedimenten werden durch die Frequenz von Flutung und Austrocknung bestimmt, die sich saison-, aber auch jahresabhängig verändern kann. In Hochmooren, die dauerhaft geflutet sind, kann Torf über mehrere Jahrtausende hinweg akkumulieren (Smith et al., 2004). Ein niedriger Wasserstand dagegen stimuliert den oxidativen Abbau von organischem Kohlenstoff und kann zum Verlust riesiger Kohlenstoffreservoire innerhalb weniger Jahrzehnte führen (IPCC, 2001). Obwohl Feuchtgebiete nur 4-6% der Erdoberfläche bedecken (Aselmann and Crutzen, 1989; Matthews and Fung, 1987), speichern sie einen Großteil des im Boden gebundenen organischen Kohlenstoffs (soil organic carbon = SOC). Schätzungen hinsichtlich der global gespeicherten Kohlenstoffmenge in Feuchtgebieten variieren zwischen 202 und 535 Gt C (Mitra et al., 2005). Gorham hat für boreale und. 7.

(12) 1. Einleitung __________________________________________________________________________________________________________________________________________________. subarktische Torfböden einen Kohlenstoff-Pool von 460 Gt berechnet (Gorham, 1991). Jüngste Schätzungen ergaben, dass west-sibirische Moore 50-70 Gt Kohlenstoff enthalten (Smith et al., 2004). Nach Matthews könnten 44-71% des im Boden gebundenen organischen Kohlenstoffs (SOC) als Torf vorliegen (Matthews, 1984). Neben ihrer Funktion als Kohlenstoffsenken spielen Feuchtgebiete eine herausragende Rolle im globalen Methan-Kreislauf. Schätzungen ergaben, dass Feuchtgebiete bis zu 550 Tg Methan emittieren (Mitra et al., 2005). An der Gesamtheit der Methan emittierenden Quellen haben Sie einen Anteil von 10-30 % und sind damit die größte unter den natürlichen Methanquellen (Bartlett and Harriss, 1993; Fung et al., 1991; IPCC, 1996; Matthews and Fung, 1987). Eine herausragende Rolle spielen die Feuchtgebiete der nördlichen Hemisphäre: ~50% aller Feuchtgebiete sind zwischen 50 und 70°N zu finden (Mitra et al., 2005). Diese sehr torfreichen Regionen tragen zu 35-60% der Methanemission aus Feuchtgebieten bei (Aselmann and Crutzen, 1989; Bartlett and Harriss, 1993; Matthews and Fung, 1987). Große Mengen an organischem Kohlenstoff befinden sich in den ausgedehnten Permafrostgebieten Kanadas, Alaskas, Sibiriens, Chinas, der Mongolei und der tibetischen Hochebene (Brown et al., 1998; Lawrence and Slater, 2005). Permafrostböden sind durch mittlere Bodentemperaturen < 0°C über mindestens zwei Jahre hinweg charakteriesiert. Die daraus resultierende Wasserundurchlässigkeit vermindert einen mikrobiellen Angriff auf den vorhandenen organischen Kohlenstoff. Der in Permafrostgebieten gebundene organische Kohlenstoff ist deshalb sehr alt und kann mit der Radiocarbon-Methode bis zum Ende des Pleistozäns (Eiszeit) zurückdatiert werden. Der Anteil des organischen Kohlenstoffs in der Active Layer (obere Schicht des Bodens, die im Sommer auftaut) stammt aus postglazialer Zeit und wird auf ein Alter von bis zu 5000 Jahren geschätzt. General circulation models (GCMs) prognostizieren, dass Regionen im hohen Norden am stärksten von einer bereits voranschreitenden globalen Erwärmung betroffen sein werden (2005; Billings, 1987; IPCC, 2001). Man rechnet bis zum Ende des 21. Jahrhunderts mit einer schwerwiegenden Reduktion oberflächennahen Permafrosts und dem Anwachsen der Active Layer. (Lawrence and Slater, 2005; Zhang, 2005). Ein Auftauen der. Permafrostgebiete wird zur schlagartigen Ausbreitung von Feuchtgebieten führen und so die glazialen Kohlenstoffspeicher für Mikroorganismen verfügbar machen (Zimov et al.,. 8.

(13) 1. Einleitung __________________________________________________________________________________________________________________________________________________. 2006). Nachfolgende höhere Mineralisationsraten könnten sich in einem Anstieg der CH4und CO2-Emissionsraten äußern, die über positive Rückkopplungsmechanismen wiederum den Treibhauseffekt beeinflussen könnten.. 1.2. Moortypen Abhängig von Vegetation, Hydrologie, Bodenbeschaffenheit, Azidität und Trophie unterscheidet man zwischen Hoch- und Niedermooren, Sümpfen (swamp) und Marschen (marsh). Hochmoore (bogs) sind saure, Torf akkumulierende Feuchtgebiete, deren Vegetation und Chemie vor allem durch Sphagnum-Moose, an saure, kalte, dauernd geflutete und extrem nährstoffarme Bedingungen angepasste Bryophyten, geprägt wird. Aufgebaut sind Sphagnum-Moose hauptsächlich aus Polysacchariden wie Glucose und Glucuronsäure. Letztere ist aufgrund der hohen Kationenaustauschkapazität für den sauren Charakter der Moose verantwortlich. Anstelle von Lignin enthalten Sphagnum-Moose ein stabiles Netzwerk aus Polyphenolen [p-hydroxy-beta-carboxymethyl-Zimtsäure], das einen hocheffektiven Schutz gegen den Polysacharidabbau und eine Konservierung auch über Zehntausende von Jahren hinweg gewähren (Vanbreemen, 1995). Phenoloxidasen können diese Phenole abbauen, sind aber auf molekularen Sauerstoff angewiesen. Die in Torfmooren herrschenden anaeroben Bedingungen unterbinden die Aktivität dieser Enzyme und fördern damit den von Phenolen ausgehenden inhibierenden Effekt auf Torf abbauende hydrolytische Enzyme (Freeman et al., 2001). Hyalinzellen, die 80% des Pflanzenvolumens einnehmen, begründen die hohe Wasserspeicherkapazität. von. Sphagnum-Moosen,. die. bei. kontinuierlich. hohem. Wasserstand zu anoxischen Bedingungen und zur Hemmung des Abbaus von organischem Material führt. Dadurch wächst die Torfschicht, wölbt sich über die umgebende Mineralbodenoberfläche und isoliert die Pflanzen vom Grundwasser, die von nun an ihre Nährstoffe aus dem Niederschlag beziehen (Rydin and Jeglum, 2006). Diese ombrotrophen Bedingungen stehen im Gegensatz zu minerotrophen Bedingungen, bei denen Nährstoffe vor allem aus dem Grundwasser bezogen werden. Die in den minerotrophen Torfen der Niedermoore benötigten Nährstoffe werden aus den umgebenden Mineralböden herausgewaschen oder reichern sich infolge der Grundwasserbewegung an. Im Gegensatz. 9.

(14) 1. Einleitung __________________________________________________________________________________________________________________________________________________. zu Hochmooren sind Niedermoore weniger sauer und nährstoffreicher, beides Bedingungen für eine höhere Artenvielfalt. In der vorliegenden Arbeit wird ein breites Spektrum von Torftypen und ihren Übergangsformen untersucht. Während die Torfproben aus Estland ein typisches Niederund Hochmoor vertreten (Männikjärve), stehen die Proben aus Finnland und Sibirien stellvertretend für die Active Layer über diskontinuierlichem beziehungsweise kontinuierlichem Permafrost. Natürlich gibt es Gebiete in denen Nieder- und Hochmoore und ihre Übergangsformen abwechselnd vorkommen. Die daraus resultierende Sequenz von trockener Erhebung (Hummocks in Hoch-, Strings in Niedermooren) und feuchter Depression (Pools, Hollows in Hochmooren, Flarks in Niedermooren) innerhalb eines Moores bestimmt die Richtung des Wasserflusses und damit auch die Verfügbarkeit von Nährstoffen für Mikroorganismen.. 1.3. CH4 und CO2 als Spurengase in der Atmosphäre CH4 ist der einfachste Kohlenwasserstoff (Alkan) und neben CO2 das wichtigste klimaaktive Spurengas (Cicerone and Oremland, 1988). Aufgrund seiner Molekülstruktur (sp3-hybridisiert) ist seine Klimaaktivität 21 mal höher als die von CO2. Als natürlicher Bestandteil der Erdatmosphäre führt CH4 zu chemischen Reaktionen, die sowohl die Konzentration des Ozons in der Troposphäre als auch die des Wasserdampfs in der Stratosphäre (beides treibhausaktive Bestandteile) beeinflussen. In der Stratosphäre wird CH4 über Photolyse und chemische Reaktionen abgebaut und liefert als Endprodukt H2O. Durch die räumliche Nähe zu den Reaktionsprodukten wird die Fähigkeit von CH4 verstärkt, Infrarotstrahlung absorbieren und in die Atmosphäre abstrahlen zu können und so das Klima und die Temperatur auf der Erde zu beeinflussen. Das CH4Mischungsverhältnis ist seit 1750 um 150 % angestiegen: von ungefähr 0,7 ppmv im präindustriellen Zeitalter auf 1,745 ppmv im Jahre 1998 (IPCC, 1996). Diese anthropogen bedingte Erhöhung der Methanemission trägt zu einer globalen Erwärmung bei, die eine höhere mikrobielle Aktivität und damit einen Anstieg der natürlichen Methanemission verursachen kann (IPCC, 1996). Die wichtigsten Methanquellen sind Feuchtgebiete, Reisfelder, Sedimente, Wiederkäuer, Termiten, fossile Brennstoffe, geothermale Quellen. 10.

(15) 1. Einleitung __________________________________________________________________________________________________________________________________________________. und Mülldeponien (Garcia et al., 2000). Nicht nur das Mischungsverhältnis von CH4, sondern auch das des atmosphärischen CO2 ist seit dem Beginn des Industriezeitalters kontinuierlich angestiegen, was deutlich darauf hinweist, dass sich die Funktion von Feuchtgebieten als Treibhausgassenken zu der als Treibhausgasquellen hin verschoben hat. Es gibt Hinweise dafür, dass ein Anstieg der atmosphärischen CO2-Konzentration die CH4Akkumulation stimuliert (Vann and Megonigal, 2003; Ziska et al., 1998) und die Menge an gelöstem Kohlenstoff erhöht (dissolved organic carbon = DOC) (Freeman et al., 2004). So sollte die CH4-Akkumulation immer im Zusammenhang mit der CO2-Akkumulation und deren Limitierungen betrachtet werden. Damit ist die Veränderung des CH4/CO2Quotienten ein Maß dafür, wie sich die Balance zwischen miteinander konkurrierender Prozessen verändert (Christensen et al., 2001).. 1.4. Die terminale Mineralisation Natürliche Lebensräume, vor allem das Ökosystem Boden, sind normalerweise von suboptimalen Wachstumsbedingungen geprägt, die mit einer Substratlimitierung einhergehen. So kommt es zur Ausbildung von Nischen, in denen unterschiedliche mikrobielle Gilden um Elektronendonoren konkurrieren. Sind Elektronenakzeptoren wie NO3-, Fe3+ und SO42- vorhanden, kommt es bei Substratlimitierung zur vom Redoxpotential bestimmten sequentiellen Reduktion der Elektronenakzeptoren (NO3-> Fe3+ > SO42- > CO2). Die Kompetition beruht auf unterschiedlichen minimal nutzbaren Substratkonzentrationen („Threshold“), die von den Km-Werten der beteiligten Enzyme determiniert werden (geringer Km ~ höhere Affinität) und von der Verfügbarkeit der Elektronenakzeptoren abhängen. In Süßwasserhabitaten wie Hoch- und Niedermooren liegen die SO42--Konzentrationen gewöhnlich unter dem physiologischen Schwellenwert (~10mM in marinen Sedimenten), sodass die Reduktion von SO42- hier praktisch keine Rolle spielt. In Abwesenheit von alternativen Elektronenakzeptoren ist die Methanogenese der terminale Elektronen akzeptierende Schritt in der Mineralisation. Methanogene sind auf wenige Substrate spezialisiert. Die wichtigsten sind Acetat und H2/CO2 oder Formiat. Beim Abbau von 1 mol Glucose entstehen 3 mol CO2 und 3 mol CH4. Dabei wird zunächt Glucose zu Acetat, CO2 und H2 (oder zu Formiat) fermentiert:. 11.

(16) 1. Einleitung __________________________________________________________________________________________________________________________________________________. C6H12O6 + 2 H2O Æ 2 CH3COO- + 2 H+ + 2 CO2 + 4 H2. ∆G0’ = -215,7 kJ mol-1. Die Gärprodukte werden anschließend von Methanogenen zu CH4 umgewandelt: CH3COO- + H+ ÆCO2 + CH4. ∆G0´= -36 kJ mol-1 ∆G0’ = -131 kJ mol-1. 4 H2 + CO2 Æ CH4 + 2 H2O. Aus 1 mol Glucose werden so theoretisch 2 mol CH4 auf dem acetoclastischen Weg und 1 mol CH4 auf dem hydrogenotrophen Weg gebildet. 33 % der Methanogenese erfolgen also hydrogenotroph, wenn Glucose das primäre Substrat ist (Conrad, 1999). Bei niedrigen Temperaturen oder unter sauren Bedingungen konkurrieren hydrogenotrophe Methanogene mit Homoacetogenen um H2/CO2 (Kotsyurbenko et al., 2001), sodass neben CH4 auch Acetat. als. Endprodukt. auftreten. kann.. Obwohl. der. theoretische. Anteil. der. hydrogenotrophen Methanogenese von 33% für viele Habitate bestätigt worden ist, können die Beobachtungen hinsichtlich der Anteile hydrogenotropher und acetoclastischer Methanogenese und der Rolle von Acetat als Endprodukt auch anders ausfallen: In Sedimenten, z. B. vom Knaack-See oder Bodensee, war Acetat das einzige methanogene Substrat (Phelps and Zeikus, 1984; Schulz and Conrad, 1996). In anderen methanogenen Habitaten spielte die acetoclastische Methanogenese entweder eine sehr geringe oder keine Rolle (Galchenko, 1994; Lansdown et al., 1992; Metje and Frenzel, 2005; Namsaraev et al., 1995). Als dominierendes Endprodukt des anaeroben Abbaus tauchte Acetat in Mooren Alaskas und New Hampshires auf: Hier übertrafen die Acetatakkumulationsraten die Methanakkumulationsraten um bis zu 120x (Duddleston et al., 2002; Hines et al., 2001). Im Gegensatz dazu war Acetat in einem Tundragebiet des polaren Urals das wichtigste methanogene Substrat (Nozhevnikova et al., 2000). Diese Beispiele verdeutlichen die Diversität und Variabilität terminaler Prozesse in unterschiedlichen, aber auch ähnlichen Ökosystemen. Bis heute gibt es nur wenige Hinweise auf die regulierenden Mechanismen. Als ein bestimmender Faktor wird die Substratverfügbarkeit in Mooren angesehen, die von der Struktur und Nutzbarkeit der dominierenden Pflanzenreste abhängen dürfte.. 12.

(17) 1. Einleitung __________________________________________________________________________________________________________________________________________________. 1.5. Syntrophe Kooperationen Der anaerobe Abbau komplexen organischen Materials zu CH4 und CO2 liefert nur einen Bruchteil der Energie, die beim aeroben Abbau freigesetzt wird. Um auch kleinste Energiemengen nutzen zu können, kommt es unter anaeroben Bedingungen zur Ausbildung von effizienten Kooperationen zwischen Bakterien mit unterschiedlichen metabolen Fähigkeiten. Komplexes organisches Material wie Cellulose wird durch die aufeinanderfolgende Aktivität von mindestens vier verschiedenen funktionellen Gilden vollständig zu CH4 und CO2 abgebaut. Daran beteiligt sind primäre und sekundäre Fermentierer sowie hydrogenotrophe und acetoclastische Methanogene (Schink and Stams, 2002; Stams, 1994). In der Abwesenheit von alternativen Elektronenakzeptoren können die beim anaeroben Abbau entstehenden Elektronen auf Protonen übertragen werden. Der Abbau von Vorstufen wie Acetat, Butyrat oder Ethanol durch sekundäre Gärer ist dann aus thermodynamischen Gründen nur möglich, wenn der H2–Partialdruck sehr niedrig gehalten wird (Conrad, 1999; Schink, 1997). Das geschieht durch Mikroorganismen, wie zum Beispiel Methanogene, die H2 als Substrat nutzen und aus dem Gleichgewicht entfernen können. Diese besondere Form der Kooperation bezeichnet man als Syntrophie. In natürlichen anoxischen Habitaten kann nach Hoehler und Kollegen die für syntrophe Bakterien nutzbare Energie zwischen -10 und -19 kJ/ mol Reaktion liegen (Hoehler et al., 2001). Unter Standardbedingungen benötigt eine lebende Zelle aber +32 kJ/mol für die Synthese von einem mol ATP. In aktiv wachsenden Zellen ([ATP] = 10 mM; [ADP] = 1 mM; and [Pi] = 10 mM), werden sogar +49 kJ/mol benötigt (Schink, 1997; Schink and Stams, 2002; Thauer et al., 1977). Die Energie eingerechnet, die als Wärme bei irreversiblen Reaktionsschritten verloren geht (~20 kJ/mol ATP), ergeben sich insgesamt ~70 kJ/mol synthetisiertem ATP. Demnach ist für die Synthese von 1 mol ATP eine im Mittel fünffach höhere Energiemenge nötig als den Mikroorganismen in syntrophen Kooperationen zur Verfügung steht. Dieses Problem wird auf struktureller Ebene umgangen: Die ATP-Bildung ist an den vektoriellen Transport geladener Gruppen, typischerweise Protonen,. über. eine. semipermeable. 13. Membran. gekoppelt. (Mitchell,. 1966)..

(18) 1. Einleitung __________________________________________________________________________________________________________________________________________________. Strukturuntersuchungen der F1-F0 ATPasen (Cherepanov et al., 1999; Engelbrecht and Junge, 1997; Seelert et al., 2000; Stock et al., 1999)ergaben, dass ATPasen vier bis fünf Protonen binden können. Das kleinste Quantum metabolisch umsetzbarer Energie entspricht deshalb einem über die zytoplasmatische Membran transportierten Ion, also einem Viertel bis Fünftel einer ATP-Einheit. Das minimale Energiequantum, das noch für die ATP-Synthese verwendet werden kann, liegt demnach bei -15 oder -12 kJ/mol Reaktion und enspricht der Energie, die den Mikroorganismen einer syntrophen Kooperation zur Verfügung steht. Die syntrophe Oxidation von Acetat ist bisher nur für mesophile und thermophile Biogasreaktoren und für Seesedimentproben beschrieben worden (Karakashev et al., 2006; Nüsslein et al., 2001; Schnürer et al., 1999; Zinder, 1994). Die bisher isolierten Organismen oxidieren Acetat über den Acetyl-CoA-Weg mit einem Methanogenen als syntrophen Partner und H2 als Elektronenüberträger (Hattori et al., 2000; Hattori et al., 2005; Lee and Zinder, 1988b; Schnürer et al., 1996; Schnürer et al., 1999; Zinder and Koch, 1984). Die syntrophe Acetatoxidation wird als Reversion der Homoacetogenese angesehen. In welcher Richtung der Prozess ausgeführt wird, hängt stark vom H2Partialdruck ab (Hattori et al., 2000; Hattori et al., 2005). Andere Elektronenüberträger wie zum Beispiel Formiat sind jedoch nicht auszuschließen und Gegenstand der aktuellen wissenschaftlichen Diskussion. In den hier vorliegenden Arbeiten spielte dieser Elektronenüberträger jedoch keine Rolle.. 1.6. Nutzen für die Erforschung der frühen Erdgeschichte und für die extraterrestrische Forschung Aufgrund der extremen Bedingungen, die in permanent kalten Regionen der Erde herrschen, sind Permafrostgebiete und Extremophile zu Modellsystemen für die extraterrestrische Forschung geworden (Wagner et al., 2002). Die Entdeckung von möglicherweise auch biogenem CH4 in der Marsatmosphäre und von Wasser auf dem kalten Planeten Mars und dem Jupitermond Europa hat das Forschungsgebiet in jüngster Zeit weiter stimuliert (Formisano et al., 2004; Jakosky et al., 2003; Squyres et al., 1983). Neben. den. vergleichbaren. extremen. Bedingungen. lassen. die. ähnlichen. Oberflächenstrukturen von Mars und Permafrostregionen auf eine ähnliche Evolution. 14.

(19) 1. Einleitung __________________________________________________________________________________________________________________________________________________. schließen, sodass die Erforschung von mikrobiellen Adaptationsstrategien in terrestrischem Permafrost sowie biogeochemische und physikalische Analysen nicht nur Erkenntnisse über die frühe Erdgeschichte, sondern auch über die Marsgeschichte liefern könnten. Unter extremen Bedingungen wird lithoautrophes Wachstum als Voraussetzung für das Langzeitüberleben von Mikroorganismen angesehen (Morita, 1999). Lithoautotrophe Mikroorganismen erzeugen Energie aus der Oxidation anorganischer Substrate wie H2 und nutzen als einzige Kohlenstoffquelle CO2. Ein Beispiel für lithotrophes Wachstum sind methanogene Archaea, die in Millionen von Jahren alten Permafrostsedimenten (Rivkina et al., 1998), in Wüstenböden (Peters and Conrad, 1995) oder in heißen Quellen (Stetter et al., 1990) zu finden sind. Aufgrund ihrer hohen Anpassungsfähigkeit an Bedingungen wie sie in der frühen Erdgeschichte geherrscht haben (kein O2, keine oder wenige organischen Substrate) werden sie als eine der frühesten Lebensformen auf der Erde betrachtet. Während Wächtershäuser den reversen Citratzyklus als ursprünglichsten CO2-fixierenden Weg propagiert (Energie aus der Pyrit-Synthese) (Wächtershäuser, 1988; Wächtershäuser, 1990), wird in neueren Theorien vertreten, dass die biochemische Evolution mit der Reduktion von CO2 durch H2 in katalytischen FeS-Kompartimenten hydrothermalen Hügel begann (Russell and Martin, 2004). Daraus soll im weiteren Verlauf der Evolution der Acetyl-CoA-Weg, ein exergoner, linearer Stoffwechselweg hervorgegangen sein, der ohne komplexe. Intermediate. auskommt.. Dafür. sprechen. die. (Fe,Ni)S-Zentren. der. Kohlenmonoxid-Dehydrogenase und der daran gekoppelten Acetyl-CoA-Synthase, beides Schlüsselenzyme des Acetyl-CoA-Wegs, deren Co-Faktoren bekannten (Fe,Ni)SMineralstrukturen ähneln. Das Produkt des Acetyl-CoA-Wegs ist das Acetyl-CoA. Dieser Thioester ist eine energiereiche hochreaktive Verbindung, deren Rolle in vielen biochemischen. Prozessen. (Glykolys,. Citratzyklus,. Fettsäurebiosynthese,. Isoprenoidsynthese, etc.) auf eine essentielle Funktion in der frühen Phase der biochemischen Evolution schließen lässt (DeDuve, 1991). Während der Acetyl-CoA-Weg mit Acetyl-CoA als Produkt in vielen autotrophen Eubacteria und Archaebacteria vorkommt, produzieren rezente Homoacetogene anstelle der energiereichen Verbindung Acetat als Abfallprodukt (Shock, 1992). Diese Reaktion ist exergoner als die ThioesterVariante:. 15.

(20) 1. Einleitung __________________________________________________________________________________________________________________________________________________. 4 H2 + 2 CO2 Æ CH3COOH + 2 H2O. (6). Unter Standardbedingungen ist allerdings die H2-Oxidation durch Methanogene energetisch günstiger, sodass bei geringem H2-Partialdruck die Homoacetogenen den Methanogenen unterliegen. Tiefe Temperaturen und niedrige pH-Werte dagegen begünstigen die Homoacetogenese, sodass in kalten und/oder sauren Habitaten Elektronen häufig zum Acetat und nicht zum CH4 fließen (Kotsyurbenko et al., 2001), was zur Akkumulation von Acetat führt. Die Funktion von Homoacetogenen im Kohlenstofffluss ist weitgehend ungeklärt. Doch durch ihre metabole Vielfalt können sie mehrere Substrate simultan nutzen und so mit anderen Organismen konkurrieren. Das Spektrum an maximalen Wachstumstemperaturen zeigt, dass weder Methanogenese noch die wichtigsten energetischen und biosynthetischen Prozesse in methanogenen Archaea Temperatur stringiert sind (Saunders et al., 2003). Komplexere Stoffwechselwege und zelluläre Prozesse sind daher nicht essentiell für die Kälteadaptation (Cavicchioli, 2006), sodass unter den hermetischen Bedingungen eines permanent gefluteten Moores oder eines über Jahrtausende hinweg gefrorenen und damit ungestörten Permafrostgebiets die Evolution langsamer voranschreiten mag. Die ursprünglichen biochemischen Stoffwechselwege wie Methanogenese, Homoacetogenese und auch die syntrophe Acetatoxidation, die als Umkehrung des Acetyl-CoA-Wegs angesehen wird, mögen unter den oligotrophen Bedingungen, wie sie in Mooren und Permafrostgebieten herrschen, an Bedeutung gewinnen.. 1.7. Molekulare Marker in der mikrobiellen Ökologie Nach neuesten Schätzungen könnte es bis zu 1 Milliarde verschiedener Prokayroten-Arten auf der Erde geben. Ein verschwindend geringer Anteil (<1%) ist bisher kultiviert worden, sodass die Klassifizierung nach morphologischen, physiologischen oder biochemischen Kriterien in den meisten Fällen unmöglich ist. Deshalb wurden kultiverungsunabhängige Methoden. entwickelt,. mit. denen. die. phylogenetische. Gemeinschaften auf molekularer Ebene möglich ist.. 16. Einordnung. mikrobieller.

(21) 1. Einleitung __________________________________________________________________________________________________________________________________________________. Theoretisch kann jeder Satz orthologer Gensequenzen phylogenetisch beschrieben werden. Das untersuchte Gen muss jedoch einige essentielle Bedingungen erfüllen: 1. Ubiqität zumindest innerhalb der betrachteten Gruppe von Mikroorganismen, 2. Immunität gegen lateralen Gentransfer zwischen unterschiedlichen Abstammungslinien und 3. einen auswertbaren Grad an Homologie, der sich in hochkonservierten Regionen innerhalb des Gens äußert. Der universelle Baum des Lebens basiert auf dem Gen für die 16S/18S ribosomale RNA. Archaea bilden neben den Bacteria und den Eukarya eine der drei Domänen des Lebens. Die Domäne der Archaea wird weiter in die Abteilungen Euryarchaeota und Crenarchaeota unterteilt. Wichtige Vertrete der Euryarchaeota sind die Methanogenen, denen aufgrund ihrer Fähigkeit CH4 zu bilden, in dieser Arbeit ein besonderes Interesse gelten soll. Der auf dem 16S rRNA-Gen basierende phylogenetische Stammbaum klassifiziert die Methanogenen in die Ordnungen Methanobacteriales, Methanococcales, Methanosarcinales und Methanomicrobiales (Whitman et al., 2001) und weiter in die Familien (Methanobacteriaceae, Methanothermaceae, Methanococcaceae, Methanomicrobiaceae, Methanocorpusculaceae und Methanosarcinaceae) unterteilt werden. Bisher sind 19 Genera. und 68 methanogene Spezies beschrieben worden. (Whitman et al., 2001). Neben universellen 16S rRNA-Primern, die entweder alle Archaea oder alle Bacteria erfassen, können 16S rRNA-Primer verwendet werden, die spezifisch für eine Gruppe von Mikroorganismen konstruiert worden sind. In der vorliegenden Arbeit wurden Primer verwendet, die spezifisch für die Detektion von Mitgliedern der Familie Geobacteraceae sind (Cummings et al., 2003). In den letzten Jahren wurden verstärkt auch funktionelle Gene zur phylogenetischen Einordnung der korrespondierenden Spezies verwendet. So das Gen für die lösliche und die partikuläre Methanmonooxygenase von Methanotrophen (McDonald and Murrell, 1997), das Gen für die Ammoniummonooxygenese von Ammonimoxidierern oder die Gene für Schlüsselenzyme von Nitrat- oder Sulfatreduzierern (Braker and Tiedje, 2003). Die. Methyl-CoenzymM-Reduktase. (MCR),. der. teminale. Enzymkomplex. der. Methanogenese, katalysiert die Reduktion der an CoenzymM gebundenen Methylgruppe zu CH4. Dieser Enzymkomplex ist ubiqitär in Methanogenen (Thauer, 1998). Das Gen für die α-Untereinheit des MCR-Komplexes (mcrA) wurde für die phylogenetische Analyse von Methanogenen verwendet und erfolgreich zur Detektion von Methanogenen in verschiedensten Habitaten verwendet: Reisfeldboden (Lueders et al., 2001), Moore (peat. 17.

(22) 1. Einleitung __________________________________________________________________________________________________________________________________________________. bogs) (Hales et al., 1996; Juottonen et al., 2005; Lloyd et al., 1998; Merilä et al., 2006; Nercessian et al., 1999), Termitendärmen (Ohkuma et al., 1995) und marinen Habitaten (Bidle et al., 1999). Ein Problem ergibt sich bei der phylogenetischen Einordnung von Umweltsequenzen neuer bislang unkultivierter Acetogener. Ihre phylogenetische Diversität verbietet die Verwendung der universellen 16S rRNA-Primer für die Identifikation dieser funktionellen Gruppe aus Umweltproben. Einige Enzyme des Acetyl-CoA-Wegs, über den aus C1Vostufen Acetat synthetisiert wird, sind für phylogenetische Analysen struturell und funktionell ausreichend konserviert (Ljungdahl, 1986; Lovell et al., 1990; Ragsdale, 1991). Insbesondere das Gen für die Formyltetrahydrofolate-Synthetase, die die ATP-abhängige Aktivierung von Formiat katalysiert, ist hoch konserviert (Lovell and Hui, 1991). Für die vorliegende Arbeit (Ergebnisteil 3.3) wurden Primer verwendet, die für die Amplifikation von partiellen fhs-Sequenzen konstruiert wurden (Leaphart and Lovell, 2001).. 18.

(23) 1. Einleitung __________________________________________________________________________________________________________________________________________________. 1.8. Ziele der Arbeit Für dieses Jahrhundert wird ein Temperaturanstieg um 1,4 bis 5,8°C prognostiziert (IPCC, 2001). Zusammen mit einer Änderung der Niederschlagsraten ist das der wichtigste Aspekt des Klimawandels, der einen Einfluss vor allem auf die von Feuchtgebieten ausgehende Feedback-Regulation hinsichtlich ihrer Rolle als Quelle und Senke von Treibhausgasen haben könnte. Der Einfluss des Klimawandels auf die Verteilung und die Struktur von Feuchtgebieten ist bis heute weitgehend unbekannt und kann deshalb nicht in Klimamodelle integriert werden. Eine detaillierte Untersuchung der Responz von Feuchtgebieten auf erhöhte Temperaturen ist deshalb unumgänglich. Da die Temperatur sowohl die Thermodynamik einer Reaktion als auch die Enzymkinetik beeinflusst, hat eine Temperaturänderung immer auch Einfluss auf die Substratverfügbarkeit und damit auf die miteinander um Substrat konkurrierenden mikrobiellen Gemeinschaften. Daraus ergaben sich folgende Fragestellungen: 1. Wie wirken sich steigende Temperaturen auf die Methanogenese, die methanogene Gemeinschaft und auf die verwendeten Substrate aus? 2. Welche methanogenen Substrate werden vorwiegend genutzt? 3. Korreliert die Art der Substratnutzung mit der methanogenen Gemeinschaft? 4. Spielen syntrophe Prozesse eine Rolle? Im Zusammenhang mit dem niedrigen Substratangebot in Sphagnum-dominierten Hochmooren wurde die Rolle von Acetat untersucht: 5. Ist Acetat ein Hauptintermediat, das auch unter thermodynamisch ungünstigen Bedingungen syntroph oxidiert wird? 6. Spielen syntrophe Prozesse eine Rolle als Energieträger in Habitaten mit niedrigem Substratangebot oder sind sie sogar von allgemeiner Bedeutung? In dem untersuchten Hochmoor spielte Fe(III)-Reduktion keine Rolle, es wurden aber Mitglieder der Fe(III)-reduzierenden Familie Geobacteraceae detektiert. Deshalb wurde zusätzlich der Effekt von Fe(III)-Spezies (Ferrihydrit und FeCl3) auf die anaerobe Mineralisation untersucht.. 19.

(24) 2. Material und Methoden __________________________________________________________________________________________________________________________________________________. 2. Material und Methoden 2.1. Chemikalien und Gase Alle verwendeten Chemikalien wurden, soweit nicht anders angegeben, im Reinheitsgrad „zur Analyse“ oder in vergleichbaren Reinheitsgraden von den im folgenden genannten Firmen bezogen: Fluka (Buchs, Schweiz), Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe) und Sigma-Aldrich (Steinheim). Enzyme und molekularbiologische Reagenzien wurden von den Firmen Amersham Pharmacia Biotech (Freiburg), Applied Biosystems (Weiterstadt), Promega (Mannheim), Qbiogene (Carlsbad, USA), Roche Diagnostics (Mannheim) und Sigma-Aldrich (Steinheim) geliefert. Die Synthese von Oligonukleotiden wurde bei der Firma MWG-Biotech (Ebersberg) in Auftrag gegeben. Alle verwendeten Gase stammen von der Firma Messer-Griesheim (Darmstadt).. 2.2. Standorte und Moorcharakteristika Die untersuchten Torfmoorproben stammen von unterschiedlichen Standorten des Boreals und der Subarktis (Tabelle 2.1). Alle Proben wurden unterhalb der Wasseroberfläche in einer Tiefe von 20-40 cm entnommen und luftblasenfrei in sterile Polyethylenterephthalate-Flaschen (Nalgene®, Neerijse, Belgien) gefüllt. Bei Probenentnahme wurden in situ Temperatur und in situ pH bestimmt. Bis zur weiteren Analyse wurden die Proben bei 4°C gelagert.. 20.

(25) 2. Material und Methoden __________________________________________________________________________________________________________________________________________________. 21.

(26) 2. Material und Methoden __________________________________________________________________________________________________________________________________________________. 2.3. Inkubation Alle untersuchten Torfproben wurden zunächst 1:1 mit O2-freiem, autoklaviertem, destilliertem Wasser verdünnt und homogenisiert. Die resultierenden Slurries (6 mL) wurden in Pressure-Tubes (V = 16 mL, Ochs, Göttingen) oder Serumflaschen (150 mL) abgefüllt und mit Butylgummistopfen verschlossen. Alle Schritte wurden in einer Anaerobenbox unter N2-Atmosphäre durchgeführt. Die. Slurries. aus. den. finnischen. und. sibirischen. Proben. wurden. in. einem. spezialangefertigten Temperaturgradientenblock, der an einem Ende geheizt und am anderen Ende gekühlt wurde, inkubiert (Fey and Conrad, 2000; Schulz et al., 1997). Der Gradient umfasste einen Temperaturbereich von 4°C bis 60°C in 2°C-Schritten. Zwei Replikate pro Temperatur wurden für 28 Tage inkubiert. Torfproben von den anderen Standorten (siehe Tabelle 1) wurden bei 25°C inkubiert. Der Anteil der acetoclastischen Methanogenese wurde durch die spezifische Inhibierung des Prozesses mit Methylfluorid (CH3F; Mischungsverhältnis 1%) determiniert (Frenzel and Bosse, 1996; Janssen and Frenzel, 1997; Penning and Conrad, 2006). Zur Inhibierung der. gesamten. Methanogenese. wurde. eine. O2-freie. Lösung. von. Natrium-2-. Bromethansulfonat (BES, Endkonzentration 40mM) zugegeben. In einer Pilotstudie mit saurem Torf stellte sich heraus, dass die doch recht hohe Konzentration von 40mM notwendig war, um die Methanogenese vollständig zu inhibieren. Gasphasenkonzentrationen von CH4, CO2 und H2 wurden nach Equilibrierung von Gasund Flüssigphase mit Hilfe eines Gaschromatographen gemessen. Porenwasserproben wurden auf Fettsäuren und Alkohole hin untersucht. Weitere Slurryproben wurden entnommen, um die Fe(II)-Konzentrationen zu bestimmen.. 22.

(27) 2. Material und Methoden __________________________________________________________________________________________________________________________________________________. 2.4. Chemische und physikalische Analysen 2.4.1. Gaschromatographie (CH4, CO2 und H2) Mischungsverhältnisse von CH4 und CO2 wurden mit einem GC-FID SRI-9300 (SRI Instruments, Torrance, USA) bestimmt. CO2 wurde nach Reduktion im vorgeschalteten Methanisator. als. CH4. gemessen.. Bei. 14. C-Tracer-Experimenten. wurde. das. Mischungsverhältnis von markiertem und unmarkiertem CH4 und CO2 mit einem GC-FID (Shimadzu,. Japan). bestimmt,. Radioaktivitätsproportionalitätszähler. an. den. neben. angeschlossen. dem. war. Methanisator. (Raytest,. ein. Straubenhardt,. Germany). Nach Equilibrierung zwischen Gas- und Flüssigphase wurden mit einer gasdichten Spritze der Marke Pressure Lok® (Baton Rouge, Louisiana, USA) Gasproben aus der Gasphase entnommen und analysiert. Einpunkteichungen wurden entweder mit 1000 ppmv oder 5%-igem Eichgas (CH4 und CO2) durchgeführt. Tabelle 2.2: Betriebsdaten der Gaschromatographen.. Säule. GC-FID SRI-9300. GC-FID Shimadzu. 2 m Edelstahlsäule; Durchmesser:. 2 m Edelstahlsäule; Durchmesser:. 1/8``; Trägermaterial: Poropack QS 1/8``; Trägermaterial: Poropack Q 80/100 mesh; Temperatur: 80°C. 50/80 mesh; Temperatur: 40°C. Detektor. Flammenionisationsdetektor; Brenngase: H2 und synthetische Luft. Methanisator. Eigenbau; 20 cm Edelstahlsäule, Durchmesser 1/8``; NiCr-NiKatalysator (Chromopack, Middelburg, Niederlande); Temperatur: 350°C. Trägergas. Wasserstoff 5.0. Wasserstoff 5.0. H2 wurde mit einem GC-TCD (Shimadzu, Kyoto, Japan) analysiert. Nach Equilibrierung zwischen Gas- und Flüssigphase wurden mit einer gasdichten Spritze der Marke Pressure Lok® (Baton Rouge, Louisiana, USA) Gasproben aus der Gasphase entnommen und analysiert. Einpunkteichungen wurden mit 1000 ppmv H2 durchgeführt. Die Auswertung erfolgte mit Peak Simple (SRI Instruments, Torrence, Kalifornien).. 23.

(28) 2. Material und Methoden __________________________________________________________________________________________________________________________________________________. Tabelle 2.3: Betriebsdaten des GC-TCD. Anionentrennsäule. LCA A14; 7 Anionen nach TVO; 3,0 x 250 mm (Sykam). Fließmittel. 5 mM Natriumcarbonat; Fluss: 1,5 ml/min. Ofentemperatur. 70°C. Detektor. Leitfähigkeitsdetektor; UV-Detektor, λ = 220 nm. 2.4.2. HPLC (organische Säuren und Alkohole) Porenwasserproben wurden durch einen 0,2 µm Membranfilter filtriert (FP 30/0.2 CA-S, nicht-pyrogen, Schleicher & Schuell) und bis zur Analyse von Fettsäuren und Alkoholen bei –20°C gelagert. Organische Fettsäuren (Lactat, Formiat, Acetat, Propionat, Butyrat and Caproat) und Ethanol wurden mit einem Hochdruckflüssigkeitschromatographen detektiert, der mit einer Aminex HPX – 87H Ionenausschluss-Säule (300 mm x 7.8 mm, BIO-RAD, Hercules, California, USA), einem Brechungsindexdetektor (RI2000, Sykam, Gilching, Germany) und einem UV-Detektor (UV/VIS S3200, Sykam, Gilching, Germany) ausgestattet war. Das Detektionslimit lag zwischen 5µM und 50 µM (Krumböck and Conrad, 1991).. 14. C-markierte Fettsäuren und Ethanol wurden mit einem Radioactivity. Monitoring Analyser (Raytest, Straubenhardt, Germany) detektiert. Tabelle 2.4: Betriebsdaten der verwendeten HPLC-Systeme. Säule. Aminex HPX – 87H Ion Exclusion Column (BIORAD). Flussmittel. 1 mM H2SO4. Flussrate. 0,5 mL/min. Ofentemperatur. 65°C. Detektoren. RI-Detektor; UV-Detektor. Betriebstemperatur. 40°C. 24.

(29) 2. Material und Methoden __________________________________________________________________________________________________________________________________________________. 2.4.3. Alkohol-Gaschromatographie Alkohole und Aceton wurden mit Hilfe des Alkohol-GC Carlo Erba 8000 quantifiziert. Gemessen wurden Methanol, Propanol, Isopropanol, Butanol, Isobutanol, Ethanol und Aceton. Zusätzlich zu den externen 1mM und 10 mM Standards wurde n-Amylalkohol als interner Standard verwendet. Dazu wurden zu 90 µL Probenvolumen 10 µL einer 100 mM n-Amylalkohol-Stammlösung gegeben (Endkonzentration: 10 mM). Die Auswertung erfolgte mit Peak Simple (SRI Inc.) ausgewertet. Tabelle 2.5: Betriebsdaten Alkohol-GC Carlo Erba 8000 Injektor. Split/splitless, Temperatur: 240°C. Detektor. FID, Temperatur: 240°C. Injektionsvolumen. 1 µL. Split. 120 mL/min. Flow. 2,4 mL/min bzw. 1,1 mL/min. Temperaturprogramm. 50°C (4 min bzw. 5 min); 10°C/min; 200°C (2 min). Säule. BP 20; 0,32 mm ID; 25 m Länge; 0,5 µm Filmdicke (SGE, Ort). Trägergas. Stickstoff 5.0. 2.4.4. Ionenchromatographie (Sulfat, Nitrat und Nitrit) Zur Messung von Sulfat, Nitrat, Nitrit und anderen anorganischen Ionen wurde ein Ionenchromatograph der Firma Sykam verwendet (Sykam, Fürstenfeldbruck). Die Anlage bestand aus einer Pumpe S1121, einem Säulenofen mit einer Anionentrennsäule, einem Leitfähigkeitsdetektor S3110 zur Bestimmung aller Ionen, einem Suppressorsystem S4260A/B) und einem nachgeschalteten UV/VIS-Detektor (UVIS S3200). Die Probenaufgabe (50µL) erfolgte mit Hilfe des automatischen Sample Injectors S5200. Als Eichstandard wurde eine 1,0 mM Referenzlösungen mit Nitrat, Nitrit und Sulfat verwendet. Die Auswertung erfolgte mit Peak Simple (SRI Instruments, Torrence, Kalifornien).. 25.

(30) 2. Material und Methoden __________________________________________________________________________________________________________________________________________________. Tabelle 2.6: Betriebsdaten des Ionenchromatographen (Sykam). Anionentrennsäule. LCA A14; 7 Anionen nach TVO; 3,0 x 250 mm (Sykam). Fließmittel. 5 mM Natriumcarbonat; Fluss: 1,5 ml/min. Modifier. 1 mL/L (1 g Hydroxybenzunitril bzw. Paracyanophenol. in 50 mL Methanol. reinst.) Ofentemperatur. 70°C. Detektor. Leitfähigkeitsdetektor; UV-Detektor, λ = 220 nm. 26.

(31) 2. Material und Methoden __________________________________________________________________________________________________________________________________________________. 2.4.5. GC-C-IRMS (CH4 und CO2) und LC-IRMS (organische Fettsäuren) Stabile Isotopenhäufigkeiten wurden in der üblichen δ-Notierung dargestellt. Hierbei wird der relative Unterschied des Isotopenverhältnisses (13C/12C) der Probe zu einem internationalen. Standard. in. ‰. ausgedrückt.. Der. Standard. für. Kohlenstoff-. Isotopenverhältnismessungen ist gemäß internationaler Übereinkunft der Vienna Pee Dee Belemnite (V-PDB) mit einem Rstandard = 11180.2 × 10-6 ± 2.8 × 10-6 . Die stabilen Isotopensignaturen von CH4 und CO2 wurden mit einem Gaschromatographen mit. Verbrennungs-Isotopenverhältnis-Massenspektrometer. (GC-C-IRMS,. Thermo. Electron, Bremen) bestimmt. Das Prinzip dieser Methode wurde von Brand (1996) beschrieben. Tabelle 2.7: Betriebsdaten des GC-IRMS Finnigan MAT delta plus (Thermo Electron, Bremen) GC. Hewlett Packard 6890 (Waldbronn). Injektor. Split/Splitless. Säule. Pora PLOT Q, 27,5 m (inklusive 2,5 m Partikelfalle), 0,32 mm i.d., Filmdicke 10 µm (Chrompack, Frankfurt). Konditionen. Probengröße: 40-400 µL Split : Fluss = 10 : 1 Fluss: 2,6 mL/min Injektortemperatur: 150°C Säulentemperatur: 30°C Trägergas: Helium 45,0. GC/C-Interface. Standard GC Combustion Interface III (Thermo Electron) Oxidationsreaktor: 940°C; Reduktionsreaktor: 650°C. Auswertung. ISODAT™ NT 2.0 (Thermo Electron). Referenzgas. CO2 4,8 (Reinheitsgrad 99.998 %; Messer-Griessheim, Düsseldorf). Das Referenzgas wurde mit dem Arbeitsstandard Methylstearat (Merck) kalibriert. Methylstearat wurde am MaxPlanck-Institut für Biogeochemie (Jena) gegen die internationalen Standardmaterialien NBS22 und USGS24 geeicht. 27.

(32) 2. Material und Methoden __________________________________________________________________________________________________________________________________________________. Die Kohlenstoffverbindungen der wässrigen Lösungen wurden über HPLC aufgetrennt und dann mit Natriumperoxodisulfat (0,42 M; Fluka) und Phosphorsäure (1,35 M; Merck) bei 99.9°C vollständig zu CO2 oxidiert. CO2 wurde über eine Membran in einen Heliumstrom überführt und zum IRMS weitergeleitet. Das Prinzip dieser Methode wurde von Krummen et al. (2004) beschrieben. Tabelle 2.8: Betriebsdaten des HPLC-IRMS Finnigan Delta + Advantage. Probenaufgeber. HTC Pal (CTC Analysis, Zwingen, Schweiz). HPLC-Anlage. Pumpe SpectraSYSTEM P 1000 (Thermo Finnigan, Jan Jose, CA, USA) , Säulenofen Mistral (Spark, Emmen, Niederlande),. Säule. Trägermaterial: Sulfuriertes DivinylBenzol-Styren (Aminex HPX-87H, Bio Rad) 300 x 7,8 mm, Partikelgröße : 9 µm. Temperatur. 35°C. Mobile Phase. 2 mM H2SO4. Flow. 0,3 mL/min. Detektor. IRMS Finnigan Delta + Advantage (Thermo Electron, Bremen). Interface. Finnigan LC IsoLink Reagenzpumpe 1: 50 g/L Na2S2O8 Reagenzpumpe 2: 1,5 M H3PO4 Flow: 50 µL/min. Reaktortemperatur 99,9°C Auswertung. ISODAT™ NT 2.0 (Thermo Electron). 2.4.6. Bestimmung der Radioaktivität zugegebener Substrate Die Radioaktivität der zugegebenen Substrate ([2-14C]-Acetat and. 14. C-Bicarbonat) wurde. mit einem Mehrzweck-Szintillationszähler LS6500 (Beckman Instruments, Inc., Fullerton,. 28.

(33) 2. Material und Methoden __________________________________________________________________________________________________________________________________________________. CA, USA) und Quicksafe A als Szintillationscocktail. (Zinsser, Frankfurt, Germany). bestimmt. Die Radioaktivität der zum Experimentende getrockneten Torfproben wurde für jeden Ansatz separat in Biolute-S (Zinsser, Frankfurt, Germany) und Instant Scint-Gel Plus (Packard Instruments, Meridan, CT, USA) bestimmt. Die Wiederfindungsrate der Radioaktivität lag zwischen 70 und 120%. 2.4.7. Messung der pH-Werte und Redoxpotentiale Die Redoxpotentiale wurden mit Hilfe einer Pentrode (Orion) gemessen. Die pH-Werte wurden mit einer InLab 427 pH-Elektrode (Mettler Toledo) bestimmt. 2.4.8. Trockengewichte und Ascheanteile Um das Trockengewicht zu bestimmen, wurden Torfproben mit bekanntem Frischgewicht über Nacht bei 60 °C getrocknet. Anschließend wurden die getrockneten Torfproben über Nacht bei 500 °C verascht. Daraus ergaben sich die Anteile aus organischem und mineralischem Material. 2.4.9. Bestimmung von Fe(II) durch saure Extraktionsmethoden Die Fe(II)-Bestimmung wurde nach einer von Ratering modifizierten Methode von Lovley durchgeführt (Lovley and Phillips, 1987). Weil sich die Methode zur Bestimmung von Gesamteisen als unzuverlässig erwies, wurde nur die Fe(II)-Konzentration gemessen. Die Fe(II)-Konzentration wurde sowohl zu Beginn als auch am Ende des Experiments bestimmt. Dazu wurden die Torfproben (0,5 g FG) zunächst über Nacht bei –20°C in 4,5 mL 0,5 M HCl eingefroren. Anschließend wurden die Proben im Wasserbad (30°C) aufgetaut und eine weitere halbe Stunde bei 30°C inkubiert. Während dieser Zeit erfolgte die Extraktion des Fe(II). Fe(II) wurde dann mit einer 0,1%-igen Ferrozin-Lösung (3-(2pyridyl)-5,6-bis(4-phenylsulfonsäure 1,2,3-Triazin-dinatriumsalz) in 50 mM HEPES (N-2Hydroxyl-ethylpiperazin-N’-2-Ethansulfonsäure)). (pH. 7,. mit. NaOH. eingestellt). photometrisch bei λ = 562 nm nachgewiesen. Dazu wurde der Reaktionsansatz nach Zugabe von 0,9 mL Ferrozin-Reagenz zu 0,1 mL des verdünnten (1:100) beziehungsweise des unverdünnten Extrakts eine Minute im Dunkeln inkubiert. Dabei reagieren drei Ferrozin-Moleküle mit einem Fe(II)-Atom zu einem farbigen Komplex (Stookey, 1970), in. 29.

(34) 2. Material und Methoden __________________________________________________________________________________________________________________________________________________. dem ein Pyridyl-Stickstoff und das 2. oder das 4. Triazin-Stickstoff. mit dem Fe(II). interagieren. Anschließend wurde der Reaktionsansatz für fünf Minuten bei 13.000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und dessen Absorption bei 562 nm photometrisch bestimmt. Als Eichstandard wurde FeSO4 x 7 H2O (0,01, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,5, 0,75, 1,0 mM) verwendet. Die Fe(II)-Konzentrationen wurden in µmol · g TG-1 angegeben. Da die Extraktion aber an ungetrocknetem Material erfolgte, musste das Frischgewicht in Trockengewicht umgerechnet werden: Zunächst wurde der Mittelwert aus allen. ermittelten. Trockengewicht/Frischgewicht-Quotienten. (TG/FG). gebildet. (Endbestimmung). Die Multiplikation dieses Mittelwertes mit den bei der Fe(II)-Extraktion eingesetzten Frischgewichten ergab das jeweilige Trockengewicht. 2.5. Rechnungen 2.5.1. Produktionsraten von CH4 und CO2 Die Produktionsraten von CH4 und CO2 wurden wie folgt berechnet: Aus der Konzentration des Eichgases (in ppmv) und dem Mittelwert der gewonnenen Eichwerte wurde ein Quotient gebildet, der als Faktor zur Umrechnung der Messwerte in ppmv dient. Mit Hilfe des Gasgesetzes für ideale Gase wurde das Molvolumen des Gases entsprechend der Inkubationstemperatur bestimmt:. n=. pV RT. (1). n = Stoffmenge [mol] V = Volumen [L] p = Druck [Pa] (1 ppmv = 0,1 Pa) R = universelle Gaskonstante (8,314 J · mol–1 · K–1) T = Temperatur [K] Die Produktionsraten wurden in µmol · g TG-1 angegeben: (ppmv(CH4) · Gasraum) · (Molvolumen · g TG)-1 = µmol · g TG-1. 30.

(35) 2. Material und Methoden __________________________________________________________________________________________________________________________________________________. 2.5.2. Acetatumsatz Die aus HCO3- stammende CH4-Fraktion wurde über die Konversion von 14CO2 zu 14CH4 unter Einbeziehung der spezifischen Radioaktivitäten (Bq · µmol-1) von CH4 (SRCH4) und CO2 (SRCO2) berechnet (Schütz et al. 1989): fH 2 = SRCH 4 ⋅ SRCO 2. −1. (2). Die Summe der Radioaktivität aller Produkte (Σ14C-Produktemax) in Bq · gTG-1 am Ende des Experiments wurde als der verfügbare Acetat-Pool für die Produktion von CO2, CH4, Ethanol, Propionat und Butyrat angesehen. Da CH3F die acetoclastische Methanogenese spezifisch hemmt, wurde angenommen, dass die Summe von. 14. CH4 und. 14. CO2 in inhibierten Proben komplett aus der anaeroben. Oxidation von [2-14C]-Acetat stammte. Die Fraktionen von. 14. C-Acetat und. 14. C-Bicarbonat (14C-Substrate), die nach den. betrachteten Zeitabschnitten noch verfügbar waren (nach 1, 6, 18 und 28 Tagen), wurden nach Nüsslein und Kollegen und Phelps und Kollegen berechnet (Nüsslein et al., 2001; Phelps, 1991):.  (14 C − Pr odukte( t max .) −14X (ti ) )  ln Fraktion14C − Substrat ( ti ) = ln   (14 C − Pr odukte( t max .) )  . (3). Mit X = 14CO2, Σ(14CH4 + 14CO2), Σ(14CH4 + 14CO2 + 14C-Ethanol + 14C-Propionat + 14CButyrat) oder Σ(14CH4 +. 14. CO2 + 14C-Ethanol +. 14. C-Propionat + 14C-Butyrat) nach jedem. betrachteten Zeitabschnitt. Darauf basierend wurde die Ratenkonstante k, also die Fraktion des Acetat-Pools, der innerhalb des betrachteten Zeitabschnitts anaerob zu CO2 oxidiert wird, berechnet:. k=. (ln Fraktion14 C − Substrate. (t 2). − ln fraktion14C − Substrate ( t1) ). (t 2 − t1 ). (4). Die Acetatoxidationsrate wurde über Multiplikation der Ratenkonstante k mit der totalen Acetatakkumulation Acetatakku [µmol · gTG-1] für jeden Zeitpunkt separat berechnet.. 31.

(36) 2. Material und Methoden __________________________________________________________________________________________________________________________________________________. Vac =. k ⋅ Acetat akku ⋅ X ∑ 14C − Pr oduktemax. (5). Der Anteil der anaeroben Acetatoxidation (AAcO) am totalen Acetatumsatz wurde wie folgt berechnet:. AAcO[%] =. Vac ⋅100 ( Acetat akku − (−Vac )). (6). 2.5.3. δ- Notation. Der Fraktionierungsfaktor für CH4 aus H2/CO2 wird nach Hayes wie folgt definiert (Hayes, 1993):. α CO 2−CH 4 =. (δ 13CCO 2 + 1000) (δ 13CCH 4 + 1000). (7). Die Isotopensignaturen von neu geformtem CH4 (δn) wurden aus den Isotopensignaturen zu den Zeitpunkten t=1 (δ1) und t=2 (δ2) mit Hilfe der folgenden Gleichung berechnet:. δ 2 = f nδ n + (1 − f n )δ 1. (8). mit fn, der Fraktion des neu gebildeten CH4 relativ zum Zeitpunkt t=2 (Penning et al., 2005). Nach Penning und Kollegen wurden dann die für die experimentellen Bedingungen berechneten Gibbs freien Energien und der Fraktionierungsfaktor αCO2-CH4 gegeneinander aufgetragen. 2.5.3. Thermodynamische Berechnungen. Standard-Gibbs freie Energien (∆G0) wurden aus den standardisierten Gibbs freien Bildungsenergien (Gf0) der Reaktanten und Produkte berechnet (Dean and Lange, 1992). The standard reaction enthalpies (∆H0) were calculated from the enthalpies of formation (Hf0) of the reactants and products (Conrad and Wetter, 1990; Dean and Lange, 1992; Lee and Zinder, 1988a). Über die Van’t Hoff-Gleichung wurde die Temperatur in die ∆G0Werte eingerechnet (Stumm and Morgan, 1996). Die tatsächlichen Gibbs freien Energien. 32.

(37) 2. Material und Methoden __________________________________________________________________________________________________________________________________________________. für die experimentellen Bedingungen wurden über die Nernst-Gleichung (Conrad and Wetter, 1990) berechnet (Beispiel hydrogenotrophe Methanogenese):   pch 4  ∆G = ∆G 0 + RT ln 4  ( p H 2 ) ⋅ pCO 2 . (9). H2, CH4, und CO2 wurden als Gase behandelt, alle anderen Reaktanten und Produkte als im Wasser gelöst. Aufgrund des sauren pH in den untersuchten Moorproben wurde anstelle von Bicarbonat CO2 in die Rechnungen einbezogen. Zur Berechnung der ∆G-Werte wurden die tatsächlich gemessenen Konzentrationen [M] und Partialdrücke [atm] verwendet.. 2.6. Molekularbiologische Analyse 2.6.1. DNA-Extraktion aus Torfmoorproben. Die Proben wurden zu Beginn und am Ende des Experiments entnommen und mit einem Mörser homogenesiert, um makroskopische Pflanzenstrukturen aufzuschließen. DNA wurde mit dem FastDNA SPIN Kit for soil nach den Angaben des Herstellers extrahiert (Qbiogene, Carlsbad, USA). Die Volumenangaben im Protokoll des Herstellers wurden für jeweils 300 mg Torf berechnet. Da mit der DNA auch Substanzen extrahiert werden, die die PCR hemmen können (Juniper et al., 2001), müssen zusätzliche Reinigungsschritte eingefügt werden, um diese so gut wie möglich zu entfernen. Inhibitoren sind zum Beispiel Huminsäuren, Zucker oder Schwermetalle. In den vorliegenden Proben sind Huminsäuren von größerer Bedeutung. Sie hemmen die PCR, indem sie durch Interaktion mit der DNA das Anbinden der Primer verhindern. Der genaue Mechanismus der Interaktion ist nicht bekannt. Der Reinigungsschritt besteht in zwei Waschschritten mit 5,5 mM Guanidin-Thiocyanat (Sigma) nach Binden der DNA an die Binding Matrix. Der Nachteil dieser Methode besteht in den recht hohen DNA-Verlusten.. 33.

(38) 2. Material und Methoden __________________________________________________________________________________________________________________________________________________. 2.6.2. Quantifizierung von Nukleinsäuren. Die DNA wurde durch photometrische Messung der Absorption (λ = 260 nm) verdünnter DNA-Lösungen (3µL DNA + 67µL PCR-Wasser) quantifiziert (BioPhotometer, Eppendorf). Dazu wurde die Konzentration doppelsträngiger DNA nach c [ng · µL-1] = 50 · Verdünnungsfaktor ·. A260nm berechnet. Als Blindwert wurde PCR-Wasser (Sigma-. Aldrich) verwendet.. 2.6.3. PCR-Amplifikation. Alle in dieser Arbeit verwendeten Primerpaare zur Amplifikation von DNA in Umweltextrakten aus Torfmooren (Tabelle 2.1) sind in Tabelle 2.6 aufgeführt. Alle PCRReaktionen wurden in einem Gesamtvolumen von 50µL angesetzt. Als Negativkontrolle wurde PCR-Wasser verwendet. Tabelle 2.9: Verwendete PCR-Primer für die Amplifikation der Gene für die 16S rRNA, die Formyltetrahydrofolate-Synthetase und die Methyl-CoenzymM-Reduktase. Primer. Sequenz (5’→ 3’). Zielsequenz. Referenz. Ar915r –FAM. GTGCTCCCCCGCCAATTCCT. Archaea 16S rDNA. (Stahl and. Ar109f. AC(GT)GCTCAGTAACACGT. (~800 bp). Amann, 1991). Geo564f. AAG CGT TGT TCG GAW TTA T. Geobacteraceae 16S. (Cummings et. Geo840r. GGC ACT GCA GGG GTC AAT A. rDNA (~280 bp). al., 2003). Fhsf. TTY ACW GGH GAY TTC CAT GC. Formyltetrahydro-. (Leaphart and. Fhsr. GTA TTG DGT YTT RGC CAT ACA. folate-Synthetase. Lovell, 2001). MCRf. TA(CT)GA(CT)CA(AG)AT(ACT)TGG(CT)T. mcrA (~500 bp). (Springer et al.,. MCRr. AC(AG)TTCAT(AGCT)GC(AG)TA(AG)TT. ME1. GCMATGCARATHGGWATGTC. ME2. TCATKGCRTAGTTDGGRTAGT. 1995) mcrA (~760 bp). (Hales et al., 1996). PCR-Amplifikation archaeeller 16S rRNA-Gene. Die 16S rRNA ist ein aus ungefähr 1500 Basen bestehendes Polynukleotid. Das Molekül ist Teil der kleinen Untereinheit prokaryotischer Ribosomen (small subunit = SSU) und ein. 34.