Medizinische Hochschule Hannover
Institut für Toxikologie
Core Unit Massenspektrometrie - Proteomics
Effekte des C3 Exoenzyms aus
Clostridium botulinum auf das Proteom muriner Hippocampuszellen
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Naturwissenschaften
- Doctor rerum naturalium - (Dr. rer. nat.)
vorgelegt von
M. Sc. Anke Schröder
geboren am 10.08.1979 in Verden (Aller)
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 07.12.2012
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover Präsident: Prof. Dr. med. Dieter Bitter-Suermann Betreuer: Prof. Dr. rer. nat. Andreas Pich
Kobetreuer: Prof. Dr. rer. nat. Volkhard Kaever
1. Gutachter: Prof. Dr. rer. nat. Andreas Pich 2. Gutachter: Prof. Dr. rer. nat. Volkhard Kaever 3. Gutachter: Prof. Dr. rer. nat. Peter Claus
Tag der mündlichen Prüfung vor der Prüfungskommision 07.12.2012 Prof. Dr. rer. nat. Achim Gossler
Prof. Dr. rer. nat. Andreas Pich Prof. Dr. rer. nat. Volkhard Kaever Prof. Dr. rer. nat. Peter Claus
Danksagung
Als erstes danke ich meinem Betreuer und Doktorvater Prof. Dr. Andreas Pich und dem Institutsleiter Prof. Ingo Just für die Vergabe des interessanten Themas und die Möglichkeit in einem außerordentlich gut ausgestatteten Labor arbeiten zu können.
Für die Möglichkeit stets an Tagungen und Fortbildungen teilnehmen zu dürfen möchte ich mich besonders bedanken.
Ich danke Prof. Dr. Volkhard Kaever für die Betreuung meiner Arbeit und die Übernahme des Korreferats.
Harald Genth und Ralf Gerhard danke ich für die vielen Anregungen und Ratschläge während meiner Arbeit.
Weiterhin bedanke ich mich bei Astrid Rohrbeck und Sandra Hagemann für die tatkräftige Unterstützung bei der Herstellung des Exoenzyms und die vielen anregenden Diskussionen zu meinem Thema.
Für die vielen hilfreichen Tipps und die ständige moralische Unterstützung beim Betreuen der Geräte möchte ich mich bei Karin Agternkamp bedanken.
Den jetzigen und ehemaligen Mitarbeitern der „Masse“ möchte ich ebenfalls für die Unterstützung und die gute Zusammenarbeit danken.
Für die freundliche Arbeitsatmosphäre und die außerordentliche Hilfsbereitschaft bedanke ich mich bei allen Mitarbeitern des Instituts.
Ein ganz herzliches Dankeschön geht an meine Eltern Kurt und Astrid und meinen Bruder Markus, auf deren Unterstützung ich jederzeit vertrauen konnte.
Ein ganz besonderer Dank geht an Maik Oberlander für seine ständige Unterstützung besonders mit Piet in der letzten Phase der Arbeit. Seine Fähigkeit immer die Ruhe zu bewahren hat mir besonders geholfen.
Inhaltsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis ………..III
Tabellenverzeichnis………..…………III Abkürzungsverzeichnis ………..…..V
1 Einleitung ... 1
1.1 Bakterielle ADP-Ribosyltransferasen ... 1
1.2 Struktur und Wirkmechanismus des C3 Exoenzyms aus Clostridium botulinum ... 2
1.3 Rho GTPasen und die Wirkung des C3 Exoenzyms ... 3
1.4 Neurotrophe Wirkung des C3 Exoenzyms ... 5
1.5 Proteomanalytik ... 6
1.5.1 Massenspektrometrie ... 6
1.5.1.1 Elektrospray-Ionisation ... 7
1.5.1.2 LTQ Orbitrap velos ... 8
1.5.1.3 Triple-Quadrupol-MS ... 9
1.5.1.4 Peptididentifizierung mittels Massenspektrometrie ... 10
1.6 MS-Proteomanalytik ... 11
1.6.1 Trennmethoden in der Proteomanalytik ... 11
1.6.2 Isotopenmarkierte relative Quantifizierung ... 12
1.7 MaxQuant Software ... 14
1.8 Auswertung von Proteomdatensätzen ... 14
1.9 Zielsetzung dieser Arbeit ... 15
2 Material und Methoden ... 17
2.1 Verwendete Reagenzien, Chemikalien und Puffer ... 17
2.2 Proteinbiochemische Methoden ... 21
2.2.1 Proteinkonzentrationsbestimmung mittels DC-Protein Assay ... 21
2.2.2 Lysieren der Zellen und Herstellung von Proteinextrakten ... 21
2.2.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ... 22
2.2.4 Kolloidale Coomassie-Färbung ... 22
2.2.5 Western Blot ... 22
2.2.6 Tryptischer In-Gel-Verdau und Peptidextraktion... 23
2.3 Zellbiologische Methoden ... 23
2.3.1 Expression und Aufreinigung des C3 Exoenzyms C3botWT und C3botE174Q23 2.3.2 Kultivierung von murinen Hippocampuszellen HT22 ... 25
2.3.3 Einbau der isotopenmarkierten Aminosäuren in HT22-Zellen ... 25
2.3.4 Behandlung der isotopenmarkierten HT22-Zellen für 24 h und 48 h ... 26
2.3.5 Behandlung der isotopenmarkierten HT22-Zellen für 96 h und 144 h ... 26 I
2.3.6 Vereinigung der behandelten SILAC-Proben ... 27
2.4 LC-MS basierte Methoden ... 29
2.4.1 Trennung von Peptiden mittels reversed-Phase-Chromatographie ... 29
2.4.2 Analyse der SILAC-Triplex markierten Proben mittels HPLC-LTQ Orbitrap velos ……….………... 31
2.4.3 MRM-Analyse der SILAC-Triplex Proben mittels HPLC-4000 QTRAP ... 31
2.5 Prozessierung und Auswertung der LC-MS-Daten ... 32
2.5.1 Prozessierung der SILAC-Triplex-Daten und statistische Auswertung ... 32
2.5.2 Bioinformatische Analyse regulierter Proteine ... 33
2.5.3 Auswertung der MRM-Analysen ... 33
3 Ergebnisse ... 34
3.1 Die Aufnahme des C3 Exoenzyms ... 34
3.1.1 Massenspektrometrischer Nachweis ADP-ribosylierter Rho-Proteine ... 37
3.2 Quantitative shotgun-Proteomanalyse ... 39
3.2.1 Inkorporation der isotopenmarkierten Aminosäuren ... 39
3.2.2 Validierung der SILAC-Methode ... 40
3.2.3 Auswertung der shotgun-Proteomanalyse ... 43
3.2.4 Bioinformatische Analyse der Daten ... 48
3.2.5 Netzwerkanalyse regulierter Proteine ... 55
3.3 Validierung der shotgun-SILAC-Daten durch gezielte Proteomanalyse... 57
3.3.1 Vergleich der MRM-Analysen mit shotgun-Daten ... 58
4 Diskussion ... 62
4.1 Reproduzierbarkeit der SILAC-Technik ... 63
4.2 ADP-Ribosylierung der Rho-Proteine ... 65
4.3 MRM-Technik zur Verifizierung der shotgun-Proteomanalyse ... 66
4.4 Biologische Einordnung regulierter Proteine ... 68
4.5 Vergleich mit anderen Daten ... 82
5 Ausblick ... 83
6 Zusammenfassung ... 84
7 Abstract ... 86
8 Literaturverzeichnis ... 88
9 Anhang ... 95
10 Lebenslauf ... 105
11 Erklärung……… 107
II
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1 ADP-Ribosylierung von Rho durch das C3 Exoenzym ... 2
Abbildung 2 Tertiärstruktur des C3 Exoenzyms ... 3
Abbildung 3 Auswirkung der Rho-ADP-Ribosylierung ... 4
Abbildung 4 Effekte des C3bot auf primäre Hippocampusneurone (modifiziert nach [40]) ... 5
Abbildung 5 Prinzip der Elektrospray-Ionisation (modifiziert nach [45]) ... 8
Abbildung 6 LTQ Orbitrap velos (modifiziert nach [46]) ... 9
Abbildung 7 Triple Quadrupol Massenspektrometer (modifiziert nach [48]) ... 10
Abbildung 8 Prinzip der SILAC-Technik ... 13
Abbildung 9 Schematische Darstellung des Versuchsablaufs ... 27
Abbildung 10 Kombination der Zelllysate nach Behandlung für kurze Zeitpunkte ... 28
Abbildung 11 Kombination der Zelllysate für längere Behandlungsdauer ... 29
Abbildung 12 Morphologische Analyse der HT22-Zellen nach C3-Behandlung ... 35
Abbildung 13 Nachweis der C3-Aufnahme mittels Western Blot ... 36
Abbildung 14 Schematische Darstellung der SILAC-Tripletts der modifizierten Peptide der Zielproteine ... 37
Abbildung 15 Massenspektrometrischer Nachweis der ADP-Ribosylierung von RhoA ... 38
Abbildung 16 Inkorporation der isotopenmarkierten Aminosäuren ... 40
Abbildung 17 Kontrollmessung zur Festlegung der Schwankungsbreite der SILAC-Methode ... 41
Abbildung 18 Vergleich der logarithmierten Regulationsfaktoren von Kontrollzellen unterschiedlicher Zeitpunkte ... 42
Abbildung 19 Häufigkeitsverteilung der Regulationsfaktoren ... 44
Abbildung 20 Vergleich biologischer Replikate von C3botWT behandelten Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten ... 45
Abbildung 21 Vergleich biologischer Replikate von C3botE174Q behandelten Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten ... 46
Abbildung 22 Volcano Plot von unterschiedlicher Inkubationsdauer mit C3botWT ... 48
Abbildung 23 Anreicherungsanalyse der hochregulierten Proteine ... 51
Abbildung 24 Anreicherungsanalyse der herunterregulierten Proteine ... 53
Abbildung 25 Zeitliche Veränderungen der Regulationsfaktoren durch Behandlung mit C3botWT ... 55
Abbildung 26 Vereinfachtes Proteinnetzwerk der regulierten Proteine ... 56
Abbildung 27 Vorgehensweise zur Entwicklung einer MRM-Methode ... 58
Abbildung 28 Vergleich der shotgun-Daten mit MRM-Analytik ... 61
Abbildung 29 Aufbau des verwendeten HPLC-Systems ... 103
Tabellenverzeichnis Tabelle 1 Verwendete Chemikalien in der Zellkultur ... 17
Tabelle 2 Sonstige Chemikalien ... 17
Tabelle 3 Verwendete Puffer ... 19
Tabelle 4 Geräte zur Peptidanalytik und Zubehör ... 19
Tabelle 5 Sonstige Geräte... 20
III
Tabelle 6 Verwendete Software ... 21
Tabelle 7 Zusammensetzung der SDS-Gele ... 22
Tabelle 8 Zur C3 Expression und Aufreinigung verwendete Lösungen ... 25
Tabelle 9 Verwendete HPLC-Eluenten ... 30
Tabelle 10 Quantifizierbare Proteine und signifikant veränderte Proteine ... 43
Tabelle 11 Proteine der mitochondrialen Fission und Fusion (144 h) ... 71
Tabelle 12 Untereinheiten der Motorproteine ... 73
Tabelle 13 Proteine der Endozytose ... 73
Tabelle 14 Kleine GTPasen der zytoskeletalen Regulation ... 74
Tabelle 15 Effektorproteine von RhoA, Rac1 und Cdc42 ... 76
Tabelle 16 Proteine des Arp2/3-Komplexes ... 76
Tabelle 17 Proteine der Zelladhäsion ... 77
Tabelle 18 Proteine der Zellzyklusregulation ... 80
Tabelle 19 Verwendete Proteine/Peptide der MRM-Analyse ... 95
IV
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzung Bedeutung
ACN Acetonitril
ADP Adenosindiphosphat
APS Ammoniumpersulfat
Arg-10 Arginin-10 (13C6H1415N4O2) Arg-6 Arginin-6 (13C6H14N4O2)
ARTT ADP-ribosylating-toxin-turn-motif
Asn Asparagin
BSA bovines Serumalbumin
BP biological process (biologischer Prozess) C. botulinum Clostridium botulinum
C3botE174Q C3 Exoenzym Mutante E174Q aus C. botulinum C3botWT C3 Exoenzym Wildtyp aus C. botulinum
cDNA aus mRNA synthetisierte komplementäre Desoxyribonucleinsäure CC cellular compartment (zelluläres Kompartiment)
CDK cyclin-dependent kinase (Cyklin-abhängige Kinase) CE collision energy (Kollisionsenergie)
CID collision induced dissociation (kollisionsinduzierte Dissoziation) cps counts per second (Anzahl pro Sekunde)
CXP collision cell exit potential
DAVID Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium
DP declustering potential
DTT Dithiotreitol
E. coli Escherichia coli
EDTA Ethylendinitrilotetraessigsäure
EP entrance potential
EPI enhanced product ion
ER endoplasmatisches Reticulum ESI Elektrospray-Ionisation FADH2 Flavin-Adenin-Dinukleotid
FA formic acid (Ameisensäure)
FCS fetales Kälberserum
FDR false discovery rate (Häufigkeit falsch positiver Identifikationen) GAP GTPase-activating protein (GTPase aktivierendes Protein) GDI guanine nucleotide dissociation inhibitor (Guaninnukleotid-
Dissoziationsinhibitor)
GDP Guanosindiphosphat
GEF guanine nucleotide exchange factor(Guaninnukleotid-Austauschfaktor)
GO Gene Ontology
GST Glutathion-S-Transferase
GTP Guanosintriphosphat
GTPase Guanosintriphosphatase
HCD higher energy collision-induced dissociation
HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)- 1-piperazinyl)-ethansulfonsäure
V
HPLC high performance liquid chromatography (Hochleistungsflüssigkeitschromatographie) HRP horseradish peroxidase (Meerrettich-Peroxidase) IDA information dependent data aquisition
IHT Interface Heater Temperature IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid
IT ion trap (Ionenfalle)
LC liquid chromatography (Flüssigkeitschromatographie) LTQ linear trap quadrupole (linear angeordneter Quadrupol) Lys-4 Lysin-4 (C6D4H10N2O2)
Lys-8 Lysin-8 (13C6H1415N2O2)
m/z Masse/Ladung
MF molecular function
MRM multiple reaction monitoring
MS Massenspektrometrie
MTOC microtubule organizing center
MW Molekulargewicht
N Asparagin
NAD+ Nicotinamidadenindinukleotid (oxidierte Form) NL neutral loss (Neutralverlust)
PBS Phosphatgepufferte Salzlösung PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid
ppm parts per million (Teile einer Million)
PSD post-source decay (Zerfall nach der Ionenquelle)
Q Quadrupol
R Resolution (Auflösung)
RNA Ribonukleinsäure
RP reversed phase (Umkehrphase)
rpm Umdrehungen pro Minute
rRNA ribosomale RNA
RSLC rapid separation liquid chromatography (schnelle Trennung durch Flüssigkeitschromatographie)
RT Raumtemperatur
SDC Sodium deoxycholate (Natriumdeoxycholat) SDS Sodium dodecylsulfate (Natriumdodecylsulfat) SDS-PAGE SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
SILAC stable isotope labeling by amino acid in cell culture
(stabile Isotopenmarkierung durch Aminosäuren in der Zellkultur) STRING Search tool for the Retrieval of Interacting genes/proteins
TBST Tris-gepufferte Salzlösung mit Tween
TE Trypsin/EDTA
TEMED N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin TFA Trifluoressigsäure
TOF time of flight
tRNA Transfer-RNA
XIC extracted ion chromatogram (extrahiertes Ionenchromatogramm)
VI
1 1 Einleitung
1.1 Bakterielle ADP-Ribosyltransferasen
Die ADP-Ribosylierung von Proteinen ist ein weit verbreiteter Vorgang, der als Werkzeug von einigen Toxinen pathogener Bakterien genutzt wird, aber auch bei Eukaryoten eine Rolle im intrazellulären Signalsystem [1], der DNA-Reparatur [2], der Immunantwort [3] und der Zellteilung [4] spielt. Bei dieser Reaktion wird ADP-Ribose kovalent in Anwesenheit des Cosubstrates Nicotinamidadenindinukleotid (NAD+) auf Zielproteine übertragen. Die häufigsten Akzeptor-Aminosäuren der Zielproteine sind Arginin, Cystein und Asparagin.
Üblicherweise führt die durch Toxine katalysierte ADP-Ribosylierung zur Inaktivierung der Zielproteine [5], wodurch verschiedene Vorgänge in der Zelle erheblich gestört werden. Viele bakterielle Toxine sind Mono-ADP-Ribosyltransferasen, die nach ihrer Aufnahme Proteine in der Wirtszelle modifizieren. Einige bekannte ADP-ribosylierende AB-Toxine sind beispielsweise das Diphtherie-Toxin aus Corynebacterium diphtheriae und das Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A, welche das Diphthamid des Elongationsfaktors 2 modifizieren und somit die Proteinsynthese hemmen [6, 7]. Das Choleratoxin aus Vibrio cholerae und die hitzelabilen Enterotoxine LT1 und LT2 aus Escherichia coli modifizieren und inaktivieren die GTPase-Untereinheit regulatorischer G-Proteine, wodurch diese im aktiven Zustand verbleiben [8]. Eine weitere bekannte Gruppe ADP-ribosylierender Toxine sind die binären Toxine clostridialer Stämme wie das Clostridium botulinum C2 Toxin, das C. perfringens iota Toxin, das C. difficile CDT und das C. spiroforme Toxin. Diese Toxine ADP-ribosylieren in der Zielzelle das G-Aktin, wodurch es zur Depolymerisation des Aktin-Zytoskeletts kommt [9]. Eine weitere Gruppe von bakteriellen ADP-Ribosyltransferasen sind die C3-ähnlichen Exoenzyme, die nur aus einer katalytischen Domäne bestehen. Diese Gruppe modifiziert sehr spezifisch kleine GTPasen der Zielzelle, wodurch es zu unterschiedlichen morphologischen Veränderungen kommt. Bislang ist nicht bekannt, wie die C3-ähnlichen Exoenzyme in die Zelle aufgenommen werden bzw. welche Rolle sie bei Infektionen oder Erkrankungen spielen [10]. Es wurden bislang zwei Isoformen des C3 Exoenzyms aus C. botulinum beschrieben.
Neben diesen zwei Isoformen konnten fünf weitere C3-Transferasen aus den Stämmen Staphylococcus aureus [11], Bacillus cereus [12] und Clostridium limosum [13] identifiziert werden.
2 1.2 Struktur und Wirkmechanismus des C3 Exoenzyms aus Clostridium botulinum Das C3 Exoenzym aus C. botulinum (C3bot) ist ein 24 kDa großes Protein, welches zu den ADP-ribosylierenden Enzymen gehört. Es wurde 1987 erstmals von K. Aktories beschrieben und konnte in den Stämmen des Typs C und D nachgewiesen werden [14, 15]. Das Gen, welches das C3 Exoenzym kodiert, befindet sich auf demselben Phagen wie das Neurotoxin des Stammes, ist jedoch nicht mit diesem verwandt [16, 17]. Das C3 Exoenzym katalysiert unter Mitwirkung des Cosubstrates NAD+ und unter Freisetzung von Nicotinamid den Transfer von ADP-Ribose auf die Akzeptor-Aminosäure Asn-41 von Rho(A/B/C) [10, 18]
(Abbildung 1). Durch die ADP-Ribosylierung wird das Rho-Protein in eine inaktive Form überführt.
Abbildung 1 ADP-Ribosylierung von Rho durch das C3 Exoenzym
Das C3 Exoenzym katalysiert den Transfer von ADP-Ribose von NAD+ auf das Asparagin-41 der Rho-Proteine. Durch die ADP-Ribosylierung wird das Rho-Protein in einen inaktiven Zustand überführt.
Das C3 Exoenzym ist ein einkettiges Protein und besitzt keine Bindungs- bzw.
Translokationsdomäne, sondern besteht nur aus einer katalytischen Domäne. Die Struktur der C3 Exoenzyme ist hochkonserviert und besteht aus α-Helices und β-Faltblättern. Der Kern des Proteins wird von einer 5-strängigen gemischten β-Faltblattstruktur gebildet, die an eine zusätzliche α-Helix grenzt. Senkrecht zu diesen fünf β-Faltblättern stehen drei weitere antiparallele β-Faltblätter, die von vier konsekutiven α-Helices flankiert werden (Abbildung 2).
4 Rolle [27], Rab und Arf sind am Vesikeltransport beteiligt [28, 29] und Ran am nukleären Transport [30].
Die Rho-GTPasen wechseln zwischen einer inaktiven GDP-gebundenen und einer aktiven GTP-gebundenen Form und können somit die Signalweiterleitung in der Zelle steuern. Die inaktive GDP-gebundene Form liegt im Cytoplasma in gelöster Form mit dem Guaninnukleotid-Dissoziationsinhibitor (GDI) vor [31]. Die inaktive GDP-gebundene Form kann durch den Guaninnukleotid-Austauschfaktor (GEF) unter Austausch von GDP zu GTP in die aktive Form überführt werden [32]. Die aktive GTP-gebundene Form interagiert mit Effektormolekülen und trägt somit zur Signalweiterleitung bei (Abbildung 3). Durch GTPase- aktivierende Proteine (GAP) wird das gebundene GTP zu GDP und anorganischem Phosphat (Pi) gespalten und somit in die inaktive Form überführt [33].
Abbildung 3 Auswirkung der Rho-ADP-Ribosylierung
Die inaktive GDP-gebundene Form der Rho-Proteine liegt im Cytoplasma assoziert mit dem GDI vor.
Durch Austausch des GDP zu GTP durch GEF wird die inaktive Form in die aktive Form überführt.
Die aktive GTP-gebundene Form kann mit Effektormolekülen interagieren und so die Signalweiterleitung fortsetzen. Durch GAP wird gebundenes GTP in GDP und Pi gespalten und somit inaktiviert. Durch die ADP-Ribosylierung wird das sich im Cytoplasma befindliche Rho-GDP, welches mit dem GDI assoziiert ist, stabilisiert. Es kann kein Austausch von GDP zu GTP erfolgen und somit ist die Signalweiterleitung unterbrochen.
Das C3 Exoenzym aus C. botulinum ADP-ribosyliert die Proteine RhoA, RhoB und RhoC am Asn-41. Das Asn-41 liegt bei der sogenannten Switch-I-Region der Rho-Proteine, die für die Interaktion mit Effektorproteinen verantwortlich ist. Durch die ADP-Ribosylierung kann die
5 Switch-I-Region nicht mehr mit Effektorproteinen interagieren und somit werden die Rho- Proteine in einen inaktiven Zustand überführt [34, 35]. Zudem wird durch die ADP-Ribosylierung die inaktive GDP-gebundene Form der Rho-Proteine stabilisiert, so dass keine Aktivierung der Rho-Proteine durch den Austausch zu Rho-GTP erfolgen kann [35].
1.4 Neurotrophe Wirkung des C3 Exoenzyms
Die Auswirkung der ADP-Ribosylierung durch das C3 Exoenzym und der damit verbundenen Inaktivierung der Rho-Proteine ist stark abhängig vom Zelltyp. Die funktionale Inaktivierung der Rho-Proteine durch das C3 Exoenzym hat auf endotheliale Zellen einen proapoptotischen Effekt [36]. Ebenso wird durch eine C3-Behandlung bei hämatopoetischen Zellen und bei Kardiomyozyten die Apoptose induziert [37, 38]. Im Gegensatz dazu hat die Inaktivierung von RhoA eine protektive Wirkung auf Neurone [39]. Bereits 2004 wurden von Ahnert-Hilger et al. beschrieben, dass das C3 Exoenzym aus C. botulinum eine neurotrophe Wirkung auf primäre Hippocampusneurone besitzt (Abbildung 4). Diese Wirkung ist unabhängig von der enzymatischen Aktivität des C3 Exoenzyms und wird ebenfalls von der transferase- defizienten Mutante C3botE174Q erzeugt. Dadurch wird angenommen, dass die neurotrophe Wirkung auch durch ADP-Ribosyltransferase-unabhängige Effekte hervorgerufen werden kann [40]. ADP-ribosylierende C3 Exoenzyme aus anderen Bakterienstämmen mit gleichem Substratspektrum weisen hingegen keine neurotrophe Wirkung auf [40]. Weiterhin konnte auch für ein Peptid des C3 Exoenzyms mit einer Länge von 29 Aminosäuren eine neurotrophe Wirkung nachgewiesen werden [41].
Abbildung 4 Effekte des C3bot auf primäre Hippocampusneurone (modifiziert nach [40])
Primäre Hippocampusneurone bilden nach Inkubation mit dem transferase-aktiven C3botWT und der transferase-defizienten Mutante C3botE174Q typische morphologische Veränderungen aus.
6 1.5 Proteomanalytik
Das Proteom beschreibt das Proteinexpressionsmuster einer Zelle, eines Gewebes oder eines Organismus zu bestimmten Bedingungen und zu einer bestimmten Zeit [42]. Im Gegensatz zum Genom, welches eindeutig definiert ist, ist das Proteom dynamisch und kann auf innere und äußere Faktoren reagieren. Das Proteom unterliegt zudem der ständigen Neusynthese und gleichzeitiger Degradation von Proteinen, wodurch eine schnelle Änderung des Proteinprofils ermöglicht wird. Unterschiedliche posttranslationale Modifikationen können außerdem Proteine aktivieren oder inaktivieren und somit verschiedene Reaktionen in der Zelle auslösen, die sich wiederum auf das Proteom auswirken. Durch die Proteomanalyse mit geeigneten proteinanalytischen Methoden können Änderungen im Proteinexpressionsmuster und der posttranslationalen Modifikationen verfolgt werden und somit die Effekte auf das Proteom charakterisiert werden.
In der Proteomanalytik kommen verschiedene Techniken zum Einsatz. Durch die hohe Komplexität des Probenmaterials ist häufig eine Trennung in Subfraktionen erforderlich, um möglichst viele Proteine der nachfolgenden Analytik zugänglich zu machen. Zur Separation kommen Methoden wie die Gelelektrophorese oder chromatographische Techniken zum Einsatz. Für die weiterführende Proteomanalyse werden Massenspektrometer zur Identifizierung von Proteinen eingesetzt. Die Kombination von leistungsfähigen Trennmethoden und hochauflösender Massenspektrometrie ermöglicht die Analyse von sehr geringen Probenmengen. Durch eine Markierung der Proteine mit stabilen Isotopen ist es möglich neben der Identifizierung auch eine Quantifizierung der Proteine vorzunehmen.
Im Laufe der Zeit haben sich verschiedene Untergruppen der Proteomanalytik entwickelt. Bei der ungerichteten (shotgun) Proteomanalyse werden möglichst viele Proteine identifiziert und ggf. quantifiziert. Diese Methode dient als Screening-Verfahren und ermöglicht die Betrachtung von mehreren tausend Proteinen. Die gezielte (targeted) Proteomanalyse betrachtet hingegen nur bestimmte ausgewählte Proteine eines komplexen Proteingemisches.
1.5.1 Massenspektrometrie
Die Massenspektrometrie dient der Bestimmung des Masse-zu-Ladung-Verhältnisses (m/z-Verhältnis) von Molekülen. Ein Massenspektrometer besteht aus einer Ionenquelle, einem oder auch mehreren Massenanalysatoren und einem Detektor. Es stehen mehrere Verfahren zur Verfügung, um einen Analyten in die Gasphase zu überführen. Die gebräuchlichsten Ionenquellen in der Protein- und Peptidanalytik sind die Elektrospray- Ionisation (ESI) und die Matrix-gestützte Laser-Desorption/Ionisation (MALDI) [43]. Als
7 Massenanalysatoren dienen beispielsweise Flugzeit-, Quadrupol-, Ionenfallen- oder Orbitrap- Analysatoren. Sind mehrere Massenanalysatoren sequentiell angeordnet, spricht man von Tandem-MS. Der erste Massenanalysator dient in der Regel zur Isolation einer bestimmten Masse (Precursor-Masse). Nach Fragmentierung dieses Precursors werden im zweiten Massenanalysator Fragmentionen erzeugt und detektiert. Es können hierbei unterschiedliche Massenanalysatoren miteinander kombiniert werden. Üblicherweise finden in der Protein- und Peptidanalytik Triple-Quadrupol- (QqQ), Quadrupol-Flugzeit- (Q-TOF), Ionenfalle- Orbitrap- und Flugzeit-Flugzeit-Analysatoren (TOF/TOF) Verwendung. Als Detektoren werden häufig Elektronenmultiplier oder Photomultiplier verwendet. Bei komplexen Proben kann eine vorherige Trennung die Selektivität und Empfindlichkeit der Analytik erhöhen.
Gebräuchliche Trennverfahren sind Gas- und Flüssigkeitschromatographie und Kapillarelektrophorese. In Kombination mit der Elektrospray-Ionisation können die Analyten direkt (on-line) ins Massenspektrometer überführt werden.
1.5.1.1Elektrospray-Ionisation
Um Moleküle massenspektrometrisch analysieren zu können, müssen diese in die Gasphase überführt werden. Es gibt unterschiedliche Verfahren, um Peptide zu ionisieren. Eine sehr schonende Methode ist die Elektrospray-Ionisation (ESI) (Abbildung 5) [44]. Hierbei werden die gelösten Peptide durch einen Emitter geleitet, an dessen Ende eine Spannung angelegt ist.
Durch die angelegte Spannung wird die Lösung zerstäubt und bildet kleine Tröpfchen mit Ionen, die überwiegend die Polarität der angelegten Spannung aufweisen. Durch Verdampfung von Lösungsmittelmolekülen kommen sich die Ionen gleicher Ladung auf der Oberfläche immer näher, bis es durch den Überschuss gleicher Ladungen zur Abstoßung und damit zur sogenannten Coulomb-Explosion kommt, wodurch immer kleinere Tröpfchen entstehen, bis letztendlich nur noch das desolvatisierte und ionisierte Peptid vorhanden ist.
Die Ionen werden meistens in Kombination mit einem Stickstoffgegenstrom und einem Vernebelungsgas ins Massenspektrometer überführt.
8 Abbildung 5 Prinzip der Elektrospray-Ionisation (modifiziert nach [45])
Die Analyten werden durch einen Emitter geleitet, an dessen Ende eine Spannung angelegt ist. Die Lösung wird zerstäubt und durch Verdampfung kommt es zur Coulomb-Explosion bis letztendlich der Analyt einzeln in ionisierter Form vorliegt.
1.5.1.2LTQ Orbitrap velos
Die LTQ Orbitrap velos (Thermo Fisher Scientific, Abbildung 6) gehört zu den hochauflösenden Massenspektrometern und bietet eine leistungsfähige Analytik mit sehr hoher Massengenauigkeit. Nach Ionisierung mittels ESI werden die erzeugten Ionen durch mehrere Ionenoptiken fokussiert und in Richtung der linearen dualen Ionenfalle transportiert.
Die Kammern der dualen Ionenfalle sind mit unterschiedlichen Mengen Helium gefüllt. In der vorderen Kammer (Hochdruckkammer) wird Helium genutzt um die Ionen abzubremsen oder nach Isolation mittels CID zu fragmentieren. In der zweiten Kammer (Niedrigdruckkammer) werden die Ionen ausgescannt. Weniger Helium bedeutet hier eine bessere Auflösung der Spektren [46]. Wenn die Ionen mit dem Orbitrap-Massenanalysator detektiert werden, dient die Ionenfalle als Ionenoptik. Massen, die nicht im gewünschten Scan-Bereich liegen, können hier herausgefiltert werden. In der C-Trap werden die Ionen gebündelt und in die Orbitrap geleitet. Die Orbitrap besteht aus einer inneren, spindelförmigen und zwei äußeren Elektroden. Die Ionen kreisen um die innere Elektrode und bewegen sich axial, radial und rotierend. Detektorplatten registrieren über Image-Currents die axiale Oszillation der Ionen, die mithilfe der Fourier-Transformation in ein m/z-Verhältnis umgerechnet wird [47]. Die Ionen können hier über einen gewissen Zeitraum in dem Massenanalysator verbleiben, wodurch eine sehr hohe Auflösung und damit eine sehr hohe Massengenauigkeit erreicht wird. Hinter der C-Trap ist eine HCD-Kollisionszelle platziert, die Stickstoff als Kollisionsgas enthält. Zur Fragmentierung werden die Vorläuferionen in der HCD-Kollisionszelle stark beschleunigt. Die Fragmentionen werden anschließend über die C-Trap in die Orbitrap geleitet und ihr m/z-Wert bestimmt. Ein großer Vorteil dieses Tandem-Massenspektrometers
9 ist die Möglichkeit der parallelen Nutzung beider Massenanalysatoren. Während mit der Orbitrap die Ionen hochauflösend analysiert werden, können in der dualen Ionenfalle bereits ausgewählte Precursor fragmentiert werden, wodurch eine schnelle Analytik ermöglicht wird.
Mit der HCD-Fragmentierung wird nur der Orbitrap-Massenanalysator verwendet, wodurch keine parallele Nutzung möglich ist.
Abbildung 6 LTQ Orbitrap velos (modifiziert nach [46])
Die LTQ Orbitrap velos besteht nach der ESI-Quelle aus einer Ionenoptik, einer linearen dualen Ionenfalle, einem weiteren Massenfilter und der C-Trap mit hintergeschalteter HCD-Kollisionszelle.
Von der C-Trap werden die Ionen in den Orbitrap-Massenanalysator geleitet.
1.5.1.3Triple-Quadrupol-MS
Das 4000 QTRAP-System (AB Sciex, Darmstadt, Abbildung 7) gehört zu den Triple- Quadrupol-Massenspektrometern und besteht aus drei hintereinander geschalteten Quadrupolen. Der erste und der dritte Quadrupol (Q1 und Q3) werden als Massenanalysatoren verwendet. Q3 kann zusätzlich als lineare Ionenfalle (LIT) verwendet werden. Der mittlere Quadrupol (Q2) dient als Kollisionszelle. Ein Quadrupol besteht aus vier parallel zueinander angeordneten Stäben, an die ein hochfrequenter Wechselstrom angelegt ist. Dadurch können nur Ionen eines bestimmten m/z-Verhältnisses innerhalb des erzeugten elektrischen Feldes gehalten werden. Die Ionen werden über ein weiteres angelegtes Potential in Richtung des Detektors transportiert.
Das Gerät kann in verschiedenen Scan-Modi verwendet werden. Beim multiple reaction monitoring (MRM), welches zur (markierungsfreien) Quantifizierung eingesetzt werden kann, werden spezifische Fragmente des zu betrachtenden Moleküls analysiert. Dazu wird der erste Quadrupol als Massenfilter eingesetzt, wodurch das Peptid aus einem komplexen
10 Probengemisch selektiert wird. Im zweiten Quadrupol wird diese Masse fragmentiert. Im dritten Quadrupol werden schließlich ein oder mehrere spezifische Fragmente selektiert und anschließend detektiert. Die extrahierten Ionenchromatogramme (XIC) der Fragmentionen können über die Zeit integriert und anhand der Flächeninhalte eine relative Quantifizierung vorgenommen werden. Ebenso kann eine absolute Quantifizierung von Peptiden mithilfe von isotopenmarkierten Peptiden durchgeführt werden. Hierfür wird das isotopenmarkierte Peptid in bekannter Konzentration als interner Standard der Probe zugefügt und über die Flächeninhalte der MS-Signale die Konzentration in der Probe berechnet. Zur Identifikation von Peptiden wird der enhanced product ion (EPI) Scan-Modus verwendet. Hier wird die Masse in Q1 selektiert, in Q2 fragmentiert und die Fragmente mit Q3 im Ionenfallenmodus ausgescannt. Weitere sehr gebräuchliche Scan-Modi sind enhanced resolution scan (ER), enhanced MS scan (EMS), precursor ion scan und neutral loss scan (NL).
Abbildung 7 Triple Quadrupol Massenspektrometer (modifiziert nach [48])
Ein Triple-Quadrupol-Massenspektrometer besteht nach der ESI-Quelle aus einem Quadrupol, der die Ionen ins Gerät überführt (Q0) und drei weiteren in sequentieller Anordnung gelegenen Quadrupolen (Q1-Q3). Als Detektor dient ein Elektronenmultiplier.
1.5.1.4Peptididentifizierung mittels Massenspektrometrie
Zur massenspektrometrischen Identifizierung von Proteinen werden diese in der Regel zunächst proteolytisch gespalten und die resultierenden Peptide analysiert. Erste Hinweise auf die Identität eines Proteins liefert der peptide mass fingerprint (PMF) [49]. Hierfür werden die Massen der Peptide eines enzymatisch gespaltenen Proteins mit den theoretischen Massen mithilfe einer Datenbank abgeglichen und können so dem Protein nahezu eindeutig zugeordnet werden. Für komplexere Peptidgemische wird die Technik der Tandem- Massenspektrometrie verwendet. Hier werden die Peptide zunächst in einem ersten Massenanalysator isoliert und anschließend fragmentiert. Die Peptide können beispielsweise mit inerten Gasen wie Stickstoff oder Helium durch Kollision fragmentiert werden. Ebenso können Peptide spontan durch post-source decay zerbrechen [50] oder durch
11 Elektronenübertragung [51] fragmentiert werden. Die Peptide zerbrechen bei allen Fragmentierungsarten an bestimmten Stellen entlang des Peptidrückgrats in a-, b- und c- sowie x-, y- und z-Ionen. Durch den Abstand von zwei unterschiedlichen Fragmentionen eines Peptids kann auf die Aminosäuren zurückgeschlossen werden. Je höher die Anzahl der Fragmentionen ist, desto sicherer kann ein Peptid identifiziert werden. Die Fragmentionen können analog zum PMF mit einer Proteindatenbank abgeglichen werden. Hierfür werden je nach verwendeter Protease zunächst die Muttermassen der möglichen Peptide berechnet und anschließend von jedem Peptid die möglichen Fragmentionen. Die MS und MS/MS-Spektren können mit verschiedenen Suchalgorithmen mit den Datenbanken abgeglichen werden.
Häufig verwendete Suchalgorithmen sind Mascot [52], X!Tandem [53], Paragon [54] und Andromeda [55].
1.6 MS-Proteomanalytik
1.6.1 Trennmethoden in der Proteomanalytik
In der Proteomanalytik kommen verschiedene chromatographische Trennmethoden zum Einsatz, um die zumeist hochkomplexen Proben für die MS-Analyse zugänglich zu machen.
Durch hohe Trennleistungen sowie durch die sehr gute Kompatibilität mit der Elektrospray- Ionisation stellt die Füssigkeitschromatographie ein ideales Trennverfahren für anschließende massenspektrometrische Analysen dar. Die Kopplung beider Verfahren ist sehr verbreitet und LC-MS ist ein geläufiges Analyseverfahren.
In der Protein- und Peptidanalytik kommt vor allem die Umkehrphasen-Chromatographie (reversed phase) zum Einsatz. Hierfür wird eine unpolare stationäre Phase aus langen Kohlenstoffketten (C4, C8, C18) verwendet, die über hydrophobe Wechselwirkungen mit dem Analyten interagieren. Zur Elution der Analyten werden als mobile Phase unpolare organische Lösungsmittel eingesetzt. Die Analyten interagieren je nach Hydrophobizität unterschiedlich stark mit dem Säulenmaterial. Je hydrophober ein Analyt ist, desto größer muss der Anteil an organischem Lösungsmittel zur Elution sein. Bei der Gradienten-Elution wird der Anteil des organischen Lösungsmittels kontinuierlich erhöht, um eine Trennung der Analyten zu erhalten. Die Trennleistung eines HPLC-Systems ist dabei stark abhängig von der Beschaffenheit der Säule. Die Verwendung längerer Säulen mit geringer Partikelgröße sowie ein kleiner Porendurchmesser führen zu immer besseren Trennleistungen [56]. Ein großer Vorteil der Umkehrphasen-Chromatographie ist die Möglichkeit der on-line-Kopplung
12 mit der Elektrospray-Ionisation, wodurch die Analyten direkt ins Massenspektrometer überführt werden können.
1.6.2 Isotopenmarkierte relative Quantifizierung
In der Proteinanalytik stehen mehrere Verfahren zur Verfügung um Proteine relativ quantifizieren zu können. Eine sehr genaue Methode der quantitativen Proteomanalytik ist die Markierung von Proteinen oder Peptiden mit stabilen Isotopen des Kohlenstoffs (13C), des Stickstoffs (15N) oder des Wasserstoffs (2H) mit anschließender massenspektrometrischer Analyse. Die Voraussetzung für die Quantifizierung von Proteinen oder Peptiden mittels Massenspektrometrie ist eine möglichst hohe Markierungsrate sowie nahezu gleiche physiko- chemische Eigenschaften der Reagenzien bei unterschiedlicher Isotopenzusammensetzung.
Die Markierung der Proteine kann durch unterschiedliche Verfahren erfolgen. Bei der chemischen Markierung werden isotopenmarkierte Reagenzien eingesetzt, die mit den Amino- oder Thiol-Gruppen der Seitenketten der Aminosäuren reagieren. Durch den Einsatz von Reagenzien mit unterschiedlicher Isotopenzusammensetzung ist es möglich, die markierten Proteingemische von zwei oder mehreren Zellzuständen zu kombinieren und massenspektrometrisch zu quantifizieren. Bekannte Verfahren sind hier die isotope-coded protein label (ICPL) [57], isotope-coded affinity tag (ICAT) [58] und isobaric tags for relative and absolute quantitation (iTRAQ) [59].
Neben der chemischen Markierung können Proteine auch metabolisch markiert werden.
Hierzu zählt die Methode der stable isotope labeling by amino acid in cell culture (SILAC), die von Ong et al. erstmals 2002 beschrieben wurde [60]. Hier werden isotopenmarkierte Aminosäuren eingesetzt, um die Proteine zu markieren. Diese Aminosäuren werden dem Kulturmedium zugesetzt und bei der Neusynthese von Proteinen eingebaut. Nach einigen Passagen sind letztendlich alle Proteine nahezu vollständig markiert. Die Markierungsrate ist nur durch die Isotopenreinheit der Aminosäuren begrenzt. Die am häufigsten verwendeten Aminosäuren sind hier Arginin (Arg) und Lysin (Lys). Es sind für die meisten Zelllinien essentielle Aminosäuren, d.h. sie können von den Zellen nicht selbst hergestellt werden. Ein weiterer Grund, der für den Einsatz dieser Aminosäuren spricht, ist die bei der Aufarbeitung der Proteine häufig verwendete Protease Trypsin. Trypsin spaltet C-terminal von Arginin und Lysin, solange kein Prolin folgt. Dadurch ist jedes Peptid mit Ausnahme des Peptides des C- Terminus markiert und kann für die Quantifizierung auch verwendet werden. Die Länge der resultierenden Peptide ist außerdem gut geeignet um eine Trennung mittels HPLC
13 vorzunehmen. Ebenso wirken sich die basischen Seitenketten von Arginin und Lysin positiv auf die Ionisierbarkeit der Peptide aus.
Die SILAC-Methode erlaubt es bis zu drei verschiedene Zellzustände miteinander zu vergleichen (Abbildung 8). Dafür werden unterschiedliche Zusammensetzungen der isotopenmarkierten Aminosäuren verwendet. Ein Massenunterschied ab 4 Da ist für die meisten Massenspektrometer auch bei mehrfachem Ladungszustand von der Auflösung gut geeignet. Neben den nicht isotopenmarkierten Aminosäuren Arginin und Lysin (Arg-0/Lys-0) werden für die mittelschwere Markierung Arg-6 und Lys-4 sowie für die schwere Markierung Arg-10 und Lys-8 eingesetzt.
Abbildung 8 Prinzip der SILAC-Technik
Bei der metabolischen Markierung der Zellen werden dem Kulturmedium isotopenmarkierte Aminosäuren zugesetzt. Nach vollständigem Einbau dieser Aminosäuren werden die Zellen behandelt.
Es können bis zu drei Zellzustände miteinander verglichen werden. Die Proteine der Zellen werden zu gleichen Anteilen miteinander kombiniert und für die MS-Analyse aufgearbeitet. Anhand der Intensitäten oder Peakflächen können die Peptide relativ zueinander quantifiziert werden.
14 Nach vollständigem Einbau der Aminosäuren in die Proteine werden die Zellen behandelt und anschließend zu gleichen Proteinmengen miteinander kombiniert. Dieses Prinzip kann auch für die Markierung von ganzen Organismen eingesetzt werden. Bisher wurden einige bekannte Modellorganismen wie Mäuse [61], Fadenwürmer [62] und Fruchtfliegen [63]
erfolgreich markiert. Dieser Ansatz eignet sich besonders gut, um systembiologischen Fragestellungen nachzugehen.
1.7 MaxQuant Software
MaxQuant ist eine frei erhältliche Software zur quantitativen Analyse von hochauflösenden Daten der LTQ-Orbitrap-Massenspektrometer. Ursprünglich konnten mit dieser Software nur SILAC-Datensätze quantifiziert werden. Mittlerweile ist auch die Quantifizierung anderer Markierungsarten wie beispielsweise ICPL sowie die markierungsfreie Quantifizierung möglich. Die Software detektiert die Multiplets der Isotopenmarkierung aus jedem MS-Scan der Rohdaten und fügt diese zu einem dreidimensionalen Peak über die Retentionszeit zusammen. Durch Integration der Peaks wird das Volumen berechnet und zur relativen Quantifizierung verwendet [64]. Zunächst wurde für die Identifizierung der Peptide die Mascot-Suchmaschine verwendet. Diese wurde durch die Andromeda-Suchmaschine abgelöst. [55]
1.8 Auswertung von Proteomdatensätzen
Die Datensätze, die aus einer ungerichteten Proteomanalyse hervorgehen, sind aufgrund der sich immer weiter verbessernden Techniken sehr umfangreich. Es gibt verschiedene Ansätze solch große Datensätze auszuwerten. In dieser Arbeit wurde die Interaktionsdatenbank STRING (Search tool for the Retrieval of Interacting genes/proteins) verwendet, um Proteine mit veränderter Abundanz in einen sinnvollen Zusammenhang zueinander zu bringen. Die STRING-Datenbank stellt Proteine als Knotenpunkte dar, die beispielsweise durch vorhandene Koexpression, Experimente oder benachbarte Gene miteinander verknüpft werden können. Je mehr Verknüpfungen die Proteine zueinander haben, desto näher werden sie in dem Netzwerk zueinander dargestellt. So lassen sich zentrale Knotenpunkte in dem Netzwerk finden bzw. weniger bedeutsame Proteine mit weniger oder ganz ohne Verknüpfung können herausgefiltert werden. Neben der STRING-Datenbank gibt es weitere frei zur Verfügung stehende Interaktions-Datenbanken wie beispielsweise MINT (Molecular
15 Interaction database) [65], IntAct [66] oder BioGRID (Biological General Repository for Interaction Datasets) [67]. Die Netzwerke der STRING-Analyse können exportiert und mithilfe weiterer Software bearbeitet werden. Eine Möglichkeit der weiteren Bearbeitung bietet die Software Cytoscape [68]. Diese Software erlaubt es, Daten unterschiedlichen Ursprungs z. B. aus einer Proteom- oder aus einer Microarray-Studie, zu importieren und visuell mit einer Vielzahl an Gestaltungsmöglichkeiten darzustellen sowie unter Verwendung von Plugins die Netzwerke zu analysieren. Eine weitere Möglichkeit die Daten einer Proteomstudie biologisch einzuordnen, ist eine funktionelle Analyse regulierter Proteine. Die Werkzeuge der DAVID (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery) ermöglichen beispielsweise die Anreicherungsanalyse von Datensätzen anhand der Gene Ontology Annotation (GO Annotation), die Visualisierung von Stoffwechselwegen einschließlich deren Zusammenhang zu Krankheiten und die Auflistung weiterer interagierender Proteine [69].
1.9 Zielsetzung dieser Arbeit
Das C3 Exoenzym aus C. botulinum (C3botWT) ist ein 24 kDa großes Protein und gehört zu den ADP-ribosylierenden Enzymen. Es besitzt weder eine Binde- noch eine Translokationsdomäne und wird über einen bisher unbekannten Mechanismus in die Zelle aufgenommen. In der Zelle werden die Zielproteine RhoA/B/C durch die ADP-Ribosylierung inaktiviert. Abhängig vom Zelltyp hat das C3 Exoenzym eine schädigende oder positive Wirkung auf die Zellen. Für primäre Hippocampusneurone wurde eine neurotrophe Wirkung des C3 Exoenzyms nachgewiesen. C3 Exoenzyme aus anderen Stämmen mit gleichem Substratspektrum hingegen zeigten diese Wirkung nicht auf, so dass eine transferase- unabhängige Wirkung des C3botWT auf Hippocampusneurone vermutet wird.
Das Ziel dieser Arbeit war eine quantitative Proteomstudie durchzuführen, um bisher unbekannte Auswirkungen des C3 Exoenzyms auf Hippocampuszellen zu detektieren. Um auch transferase-unabhängige Effekte aufdecken zu können, sollte neben dem C3botWT auch die enzymatisch inaktive Mutante C3botE174Q bei dieser Studie zur Behandlung der Zellen eingesetzt werden. Die quantitative Proteomanalyse sollte hierbei auf der metabolischen Markierung der Proteine durch isotopenmarkierte Aminosäuren (SILAC) basieren. Um das Ausmaß der Veränderungen des Proteoms zeitlich verfolgen zu können, sollten vier Zeitpunkte mit einer Behandlungsdauer zwischen einem und sechs Tagen analysiert und ausgewertet werden. Die Ergebnisse der Proteomanalyse sollten statistisch ausgewertet und
16 anschließend bioinformatisch in Zusammenhang mit der neurotrophen Wirkung des C3 Exoenzyms gebracht werden.
Die Proteomanalyse sollte mithilfe eines hochauflösenden HPLC-MS/MS-System durchgeführt werden. Zur Verifizierung der Daten sollte eine weitere Quantifizierungsmethode mittels multiple reaction monitoring (MRM) für SILAC-Ansätze etabliert werden, die für eine Verifizierung der SILAC-Daten eingesetzt werden sollte.
17 2 Material und Methoden
2.1 Verwendete Reagenzien, Chemikalien und Puffer
Die in dieser Arbeit verwendeten Chemikalien, Puffer und Geräte sind den Tabellen 1 bis 5 aufgeführt. Die verwendete Software ist in Tabelle 6 aufgelistet.
Tabelle 1 Verwendete Chemikalien in der Zellkultur
Chemikalie Firma
100x Glutamax Life Technologies GmbH,
Deutschland 100x Penicillin/Streptomycin PAA, Österreich
10x Trypsin/EDTA-Lösung (1:250) Biochrom AG, Deutschland Arginin-10 (13C6H1415N4O2) Silantes, Deutschland Arginin-6 (13C6H14N4O2) Silantes, Deutschland Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM) Life Technologies GmbH,
Deutschland
Fetal Bovine Serum Biochrom AG, Deutschland
Fetal Bovine Serum, dialysiert Silantes, Deutschland Lysin-4 (C6D4H10N2O2) Silantes, Deutschland Lysin-8 (13C6H1415N2O2) Silantes, Deutschland
Na-Pyruvat (100 mM) Biochrom AG, Deutschland
SILAC Dulbecco's modified Eagle Medium PAA, Österreich
Tabelle 2 Sonstige Chemikalien
Name Reinheitsgrad Firma
[32P]NAD p.A. PerkinElmer, USA
Aceton ≥ 99,8% LC grade Merck KGaA, Deutschland
Acetonitril ≥ 99,9% LC-MS grade Merck KGaA, Deutschland Acrylamid/Bisacrylamid-Lösung 37,5:1 p.A. Serva Electrophoresis GmbH,
Deutschland
Acrylamid-Lösung 40% p.A. AppliChem GmbH, Deutschland
Ameisensäure 98-100% Suprapur Merck KGaA, Deutschland
Ammoniumhydrogencarbonat p.A. Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
Deutschland
Ammoniumpersulfat p.A. Serva Electrophoresis GmbH,
Deutschland
Ampicilin p.A. Serva Electrophoresis GmbH,
Deutschland
Bacto™ Tryptone (Trypton) Difco, USA
Bacto™ Yeast Extract (Hefeextrakt) Difco, USA
Benzamidin-Beads p.A. Amersham, UK
Bromphenolblau p.A. Merck KGaA, Deutschland
Calciumchlorid p.A. Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
Deutschland Complete Protease Inhibitor,
EDTA-frei p.A. Roche AG, Deutschland
Dinatriumhydrogenphosphat p.A. Merck KGaA, Deutschland
18
Name Reinheitsgrad Firma
Dithiotreitol p.A. Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
Deutschland
Essigsäure p.A. Merck KGaA, Deutschland
Ethanol ≥ 99,9% LC grade Merck KGaA, Deutschland
Gluthation-Sepharose-Beads Amersham, UK
Glycerol p.A. Merck KGaA, Deutschland
Glycin p.A. Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
Deutschland
HEPES p.A. Serva Electrophoresis GmbH,
Deutschland
Isopropanol LC grade Merck KGaA, Deutschland
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid p.A. peqlab Biotechnologie GmbH, Deutschland
Kaliumdihydrogenphosphat p.A. Merck KGaA, Deutschland
Magnesiumchlorid p.A. Merck KGaA, Deutschland
Methanol ≥ 99,9% LC-MS grade Merck KGaA, Deutschland
Natriumchlorid p.A. Merck KGaA, Deutschland
Natriumdeoxycholat p.A. Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
Deutschland
Natriumdihydrogenphosphat p.A. Merck KGaA, Deutschland
Natriumdodecylsulfat ultrapur Carl Roth GmbH + CO. KG,
Deutschland
NP-40 p.A. Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
Deutschland
PageBlue Protein Staining Solution p.A. Thermo Fisher Scientific, Deutschland
PageRulerTM Prestained Protein Ladder,
10-170 kDa p.A. Fermentas GmbH, Deutschland
PMSF p.A. Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
Deutschland
PonceauS Sodium Salt p.A. Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
Deutschland
Roti®Block Lösung p.A. Carl Roth GmbH + CO. KG,
Deutschland
SuperSignal Femto West p.A. Thermo Fisher Scientific,
Deutschland
TEMED p.A. Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
Deutschland
Thrombin p.A. Amersham, UK
Trifluoressigsäure 99% LC grade J.T. Baker, Deutschland
Tris/HCl p.A. Carl Roth GmbH + CO. KG,
Deutschland
Tween-20 p.A. Serva Electrophoresis GmbH,
Deutschland
19 Tabelle 3 Verwendete Puffer
Puffer Zusammensetzung
1xSDS-Laufpuffer 25 mM Tris/HCl, pH 8,3 192 mM Glycin
0,1% (w/v) SDS
5xSDS-Probenpuffer 100 mM Tris/HCl, pH 8,8 10% (w/v) SDS
100 mM DTT 3% (v/v) Glycerol
2 mg/ml Bromphenolblau
PBS 137 mM NaCl
3,0 mM KCl 6,6 mM Na2HPO4
1,5 mM KH2PO4
Ponceau-Färbelösung 0,15% (w/v) Ponceau S 0,5% (v/v) Essigsäure
TBST 50 mM Tris/HCl pH, 7,2
150 mM NaCl
0,05% (v/v) Tween 20 Transfer-Blotpuffer 0,2 M Glycin
25 mM Tris
20% (v/v) Methanol Zelllyse-Puffer 50 mM Tris/HCl, pH 7,6
5 mM MgCl2 150 mM NaCl 1% (w/v) SDS 0,5% (w/v) SDC 1 mM PMSF 0,01 % (v/v) NP-40
Complete Protease Inhibitor (EDTA-frei)
Tabelle 4 Geräte zur Peptidanalytik und Zubehör
Name Gerätebezeichnung Hersteller
4000 Qtrap Massenspektrometer AB SCIEX Germany GmbH,
Deutschland Ion Max Adapter -
Nanospray Probe (NSI-1) nanoESI-Quelle Thermo Fisher Scientific, Deutschland LTQ Orbitrap velos Massenspektrometer Thermo Fisher Scientific, Deutschland NanoSpray®III Source nanoESI-Quelle AB SCIEX Germany GmbH,
Deutschland Ultimate 3000 RSLCnano
System HPLC-System Dionex GmbH, Deutschland
20 Tabelle 5 Sonstige Geräte
Name Gerätebezeichnung Hersteller
Axiovert 200 MAT Mikroskop Carl Zeiss Lichtmikroskopie,
Deutschland Bandelin Sonopuls, SH213 G Ultraschallwandler mit
Stabsonotrode Bandelin electronic, Deutschland
Biofuge primo R Zentrifuge Thermo Fisher Scientific,
Deutschland
Centrifuge 5417 C Zentrifuge Eppendorf AG, Deutschland
Cyclon Phosphor Imager Phosphor Imager Scanner Canberra Packard, Österreich French pressure cell press French Press (Zellaufschluss) Polytec, Detuschland
Gel Dryer Model 583 Geltrocknungsgerät Bio-Rad Laboratories, Deutschland
Heraeus Megafuge 1.0R Zentrifuge Kendro, Deutschland
Incubator Hera Cell Brutschrank Heraeus Instruments GmbH,
Deutschland Kodak Digital ScienceTM Image
Station 440 CF Imaging Station Eastman Kodak, USA
Mini-Protean Tetra
Electrophoresis System Elektrophorese Bio-Rad Laboratories, Deutschland
NanoDrop1000 Spektrophotometer Peqlab Biotechnologie GmbH,
Deutschland
PowerPac HC Power Supply Power Supply Bio-Rad Laboratories, Deutschland
Pump P-1 Peristaltikpumpe Pharmacia Biotech,
Deutschland
Reax top Reagenzglasschüttler Heidolph Instuments GmbH,
Deutschland
Satorius ED 124S Analysenwaage Satorius AG, Deutschland
Savant SpeedVac Concentrator
DNA120 Vakuumzentrifuge Thermo Fisher Scientific,
Deutschland
SmartSpec™ 3000 Spektrophotometer Bio-Rad Laboratories, Deutschland
Sorvall RC-5B Plus Zentrifuge Thermo Fisher Scientific,
Deutschland
Thermomixer comfort 0,5 ml Thermoblock Eppendorf AG, Deutschland Trans-Blot SD Semi-Dry
Transfer Cell Blotkammer Bio-Rad Laboratories,
Deutschland
VWR Mini-Shaker Rotationsschüttler VWR International GmbH, Deutschland
21 Tabelle 6 Verwendete Software
Zur Datenaufnahme und Auswertung wurden folgende Programme verwendet:
Software Firma
Analyst 1.5.1 AB SCIEX Germany GmbH, Deutschland
Chromeleon Xpress 6.8 Dionex GmbH, Deutschland
Cytoscape 2.8.2 Cytoscape Consortium
DCMS Link 2.8 (Xcalibur) Dionex GmbH, Deutschland
DCMS Link 2.8.(Analyst) Dionex GmbH, Deutschland
Kodak 1D Image Software Eastman Kodak, USA
LTQ Tune Plus 2.6.0.1050 Thermo Fisher Scientific, Deutschland
Mascot 2.2 Matrix Science Ltd., UK
MaxQuant 1.2.0.18 Max Planck Institut für Biochemie, Deutschland
MRM Pilot 2.0 AB SCIEX Germany GmbH, Deutschland
Multiquant 1.2 AB SCIEX Germany GmbH, Deutschland
Perseus 1.2.0.17 Max Planck Institut für Biochemie, Deutschland Proteome Discoverer 1.2 Thermo Fisher Scientific, Deutschland
Xcalibur 2.1.0.1140 Thermo Fisher Scientific, Deutschland
2.2 Proteinbiochemische Methoden
2.2.1 Proteinkonzentrationsbestimmung mittels DC-Protein Assay
Die Proteinkonzentrationsbestimmung von Zelllysaten erfolgte nach dem Lowry-Prinzip und wurde mittels DC-Protein Assays (Bio-Rad, Deutschland) durchgeführt. Die Proben wurden vor der Messung im Verhältnis 1:2-1:5 mit Zelllysepuffer verdünnt, um im linearen Bereich der Methode zu messen. Es wurde zunächst Reagent A‘ hergestellt, indem auf 1000 µl Reagent A 20 µl Reagent S gegeben wurden. Es wurden 20 µl der verdünnten Probe in einem Reaktionsgefäß vorgelegt und mit 100 µl Reagent A‘ versetzt. Anschließend wurden 800 µl Reagent B zugefügt, der Ansatz wurde gemischt und für 15 min bei RT inkubiert. Die Proteinkonzentration wurde anhand einer BSA-Standardkurve von 0-1,75 mg/ml ermittelt.
Die Proteinkonzentration wurde in Dreifachmessungen bestimmt.
2.2.2 Lysieren der Zellen und Herstellung von Proteinextrakten
Zu den mit PBS gewaschenen und eingefrorenen Zellen wurden 1000 µl vorgekühlter Zelllysepuffer gegeben und die Zellen mit einem Zellschaber abgekratzt. Die Zellsuspension wurde in ein Reaktionsgefäß überführt, für 10 s mittels Reagenzglasschüttler durchmischt und anschließend für zweimal 10 s auf Eis mit Ultraschall behandelt. Zur Trennung von ungelösten Zellbestandteilen wurde für 15 min bei 16.400 x g bei 4°C zentrifugiert und der Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Zur Proteinkonzentrationsbestimmung wurde der DC-Protein Assay (2.2.1) verwendet. Die Proteinextrakte wurden bei -80°C gelagert.
22 2.2.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Proteine für den tryptischen Verdau oder für Western Blot-Analysen wurden mittels SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) im Lämmli-Puffersystem getrennt [70].
Hierfür wurden die Proben im Lämmli-Probenpuffer gelöst. Für die SILAC-Triplex-Proben wurde ein Trenngel von 12%, für die Western Blot-Analysen ein Trenngel von 15% gewählt.
Es wurde ein Sammelgel von 5% verwendet. Die genaue Zusammensetzung der Gele ist in Tabelle 7 dargelegt.
Tabelle 7 Zusammensetzung der SDS-Gele
Gelzusammensetzung 5% 12% 15%
30%,0,8% (w/v) Acryl-
/Bisacrylamid (ml) 1,67 4,0 5,0
0,5 M Tris/HCl, pH 6,8
(ml) 2,5 - -
1,5 M Tris/HCl, pH 8,8
(ml) - 2,5 2,5
H2O (ml) 5,69 3,35 2,35
10% (w/v) SDS (µl) 100 100 100
10% (w/v) APS (µl) 50 50 50
TEMED (µl) 10 5 5
2.2.4 Kolloidale Coomassie-Färbung
Die durch SDS-PAGE getrennten Proteine wurden zunächst im Gel mit 25% Isopropanol/
10% Essigsäure fixiert. Das Gel wurde dreimal für 10 min mit Reinstwasser schwenkend gewaschen und anschließend mit kolloidaller Coomassie-Färbelösung (Thermo Fisher Scientific, Deutschland) für 1 h angefärbt. Restliche Färbelösung wurde durch einen Waschschritt mit Reinstwasser entfernt.
2.2.5 Western Blot
Proteinextrakte für die Western Blot-Analyse wurden zunächst in Lämmli-Probenpuffer [70]
aufgenommen und für 5 min bei 95°C erhitzt. Die Proben und ein Proteingrößenstandard wurden im 15% SDS-PAGE getrennt (2.2.3) und anschließend mittels semi-dry Blot-System mit Transferpuffer für 1,2 h bei 17 V auf eine Nitrocellulose-Membran (Whatman GmbH, Deutschland) transferiert. Der Proteintransfer wurde durch eine Ponceau S-Färbung überprüft und die Membran anschließend mit Roti®Block-Lösung geblockt. Die Membran wurde dreimal für 10 min mit TBST gewaschen, der spezifische Erstantikörper zugegeben und über Nacht unter langsamen Schütteln bei 4°C inkubiert. Die Erstantikörper wurden unter folgenden Verdünnungen eingesetzt: mouse-anti-RhoA (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) 1:200 in TBST, mouse-anti-beta-Actin (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deutschland)
23 1:5000 in TBST. Ungebundene Erstantikörper wurden durch Waschen mit TBST entfernt. Es folgte eine Inkubation mit einem goat-anti-mouse-IgG-HRP-gekoppelten Antikörper (Rockland, USA) (1:5000 in TBST). Vor der Detektion wurde zur Entfernung des Zweitantikörpers die Membran dreimal für 10 min mit TBST gewaschen. Die Detektion erfolgte über Chemilumineszenz mit Super Signal West Femto an der Kodak Image Station.
2.2.6 Tryptischer In-Gel-Verdau und Peptidextraktion
Die mittels SDS-PAGE getrennten und angefärbten Proteine wurden manuell ausgeschnitten und in ca. 1 mm³ große Würfel zerteilt. Die Gelstücke wurden mit 200 µl 50% (v/v) ACN/50 mM NH4CO3 für 30 min bei 37°C und 500 rpm entfärbt und der Überstand verworfen. Dieser Schritt wurde bis zur vollständigen Entfärbung der Gelstücke wiederholt und die Gelstücke anschließend mit 100% ACN dehydriert und mittels Vakuumzentrifuge eingetrocknet. Die Gelstücke wurden in 10% (v/v) ACN/20 mM NH4CO3 mit 5 ng/µl Trypsin Gold für 1 h auf Eis rehydriert. Anschließend wurden die Gelstücke mit 10% (v/v) ACN/20 mM NH4CO3 überschichtet und über Nacht bei 37°C und 300 rpm inkubiert. Der Verdau wurde durch Zugabe von 200 µl 50% ACN/0,5% TFA für 10 min unter Schütteln bei RT gestoppt. Es folgten weitere Inkubationen in 100 µl 50% ACN/0,2% TFA und in 100 µl 100% ACN bei 400 rpm für jeweils 30 min. Nach jeder Inkubation wurden die Überstände abgenommen und in 0,5-ml-Reaktionsgefäßen vereinigt. Diese Peptidextrakte wurden mittels Vakuumzentrifugation getrocknet und bei -20°C gelagert.
2.3 Zellbiologische Methoden
2.3.1 Expression und Aufreinigung des C3 Exoenzyms C3botWT und C3botE174Q Für die Behandlung der neuronalen Zellen wurden in dieser Arbeit das C3 Exoenzym C3botWT und das transferase-defiziente C3 Exoenzym C3botE174Q eingesetzt. Diese Proteine wurden in dem Stamm E. coli TG1 überexprimiert. Als Expressionssystem wurde hierbei das Plasmid pGEX-2TGL eingesetzt, auf dem die Proteine C3botWT bzw.
C3botE174Q durch einen IPTG-induzierbaren Promotor als GST-Fusionsprotein mit Thrombinspaltstelle kodiert sind [41]. Die verwendeten Lösungen sind in Tabelle 8 aufgeführt.
Der entsprechende E. coli-Stamm wurde in 20 ml LB Medium mit 100 mg/L Ampicillin angeimpft und über Nacht bei 37°C schüttelnd inkubiert. Diese Vorkultur wurde in 1 L LB Medium mit 100 mg/L Ampicillin gegeben und bis zu einer OD600 von 0,6-0,7 bei 37°C und
