Aus dem Institut für Pathologie der Medizinischen Hochschule Hannover
Quantitative mRNA-Expressionsanalyse
von βββ-Catenin, FKBP51 und HSP70.1 in Knochenmarkzellen β von Chronischen Myeloproliferativen Erkrankungen
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der
Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Michael Neusch aus Freiburg im Breisgau
Hannover, den 05.01.2005
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 21.09.2006
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover
Präsident: Prof. Dr. Dieter Bitter-Suermann Betreuer: Prof. Dr. Oliver Bock
Referent: Prof. Dr. Matthias Eder Korreferent: Prof. Dr. Ludwig Wilkens
Tag der mündlichen Prüfung: 21.09.2006
Promotionsausschußmitglieder:
Prof. Dr. Hans-Dieter Tröger Prof. Dr. Klaus Resch Prof. Dr. Reinhard Schwinzer
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung 1
1.1. Klassifikation der CMPE 1
1.2. Ätiologie und Epidemiologie 2
1.3. Differentialdiagnose 3
1.4. Histopathologie 4
1.4.1. CML 4
1.4.2. PV 5
1.4.3. IMF 6
1.4.4. ET 7
1.5. Pathogenese der CMPE 8
1.5.1. Klonalität der CMPE 8
1.5.2. Zytogenetik der Ph-negativen CMPE 9
1.5.3. Die molekulare Pathogenese der CML 10
1.6. Ziel der Arbeit 11
2. Material und Methoden 13
2.1. Untersuchungsmaterial 13
2.2. Extraktion und Analyse von RNA 15
2.3. RNA-Extraktion aus FFPE-Knochenmark 15
2.4. Messung der optischen Dichte (OD) 16
2.5. Synthese der komplementären DNA (cDNA) 17
2.7. Real-time RT-PCR (TaqMan-PCR) 18
2.7.1. Reduktion des PCR-Kontaminationsrisikos 18
2.7.2. Methode 18
2.7.3. Durchführung 21
2.8. Evaluation der Ergebnisse 23
2.8.1. ∆∆CT-Methode 23
2.8.2. Statistik 25
3. Ergebnisse 26
3.1. Korrelationen der RT-PCR 26
3.2. Linearität der RT-PCR 27
3.3. Genexpression von ß-Catenin 28
3.4. Genexpression von FKBP51 30
3.5. Genexpression von HSP70.1. 32
4. Diskussion 34
5. Zusammenfassung 53
6. Literaturverzeichnis 55
7. Anhang 64
7.1. Abkürzungen 64
7.2. Geräte und Reagenzien 67
7.3. Danksagung 72
7.4. Lebenslauf 73
7.5. Erklärung nach § 2 Abs.2 Nrn. 5 und 6 75
1 1. Einleitung
1.1. Klassifikation der CMPE
Die chronischen myeloproliferativen Erkrankungen (CMPE) sind klonale Stammzell- erkrankungen, die klinisch und hämatopathologisch Gemeinsamkeiten aufweisen, sich aber durch unterschiedliche Ausprägung der klonalen Proliferation und durch den klinischen Verlauf unterscheiden. Gemeinsam ist den verschiedenen Entitäten die neoplastische Transformation einer pluripotenten hämatopoetischen Stammzelle mit daraus resultierender klonaler Proliferation aller drei blutbildenden Linien des Knochenmarks1.
Durch die klonale Proliferation kommt es zu einer exzessiven Produktion einer oder mehrerer Zellreihen des Blutes2. Im Gegensatz zu den Myelodysplasien oder akuten Leukämien bleibt den neoplastischen Zellen der CMPE dabei die Fähigkeit zur Ausreifung erhalten1.
Verlauf und Prognose sind durch verschiedene Komplikationen wie Thrombosen und Durchblutungsstörungen, Blutungsneigung, Anämie, Immundefizienz, Osteomyelofibrose und Transformation in eine Blastenkrise bestimmt.
Entsprechend der dritten Revision der Internationalen Klassifikation der Krankheiten für die Onkologie (ICD-O-3, Quelle: Deutsches Institut für Medizinische Dokumentation und Information) zählt die aktuelle WHO-Klassifikation der Neoplasien des blutbildenden und lymphatischen Systems folgende Entitäten zu den chronischen myeloproliferativen Erkrankungen:
- Chronische myeloische Leukämie (CML), Philadelphia-Chromosom positiv - Chronische idiopathische Myelofibrose (IMF, cIMF)
- Polycythaemia vera (PV)
- Essentielle Thrombozythämie (ET)
sowie als seltenere Subtypen:
- chronische Neutrophilen-Leukämie
- chronische Eosinophilen-Leukämie und Hypereosinophiles Syndrom - myeloproliferative Erkrankung, nicht klassifizierbar
Weiter werden in der neuen WHO-Definition3 noch die myelodysplastisch-myeloproliferativen Erkrankungen abgegrenzt:
- Chronische myelomonozytäre Leukämie - Atypische chronische myeloische Leukämie - Juvenile myelomonozytäre Leukämie
Diese Arbeit untersucht die vier CMPE-Hauptentitäten IMF, PV, ET und CML.
1.2. Ätiologie und Epidemiologie
Die Ätiologie der CMPE ist unklar. Die Exposition gegenüber radioaktiver Strahlung stellt eine Prädisposition für die CML dar4.
Bei wenigen IMF-Patienten könnten Umweltfaktoren wie Bestrahlung und Exposition gegenüber Benzol oder Toluol eine Rolle spielen5.
Die einzelnen Erkrankungen machen folgenden Anteil an den CMPE aus6:
- CML > 50-60 % - PV 15-20 % - IMF 15-20 % - ET < 10 %
Die CMPE sind seltene Erkrankungen. Die Inzidenz liegt je nach Autor und Studie bei etwa 1/100 000/Jahr für die CML, 1 - 3/100 000/Jahr für die PV, 0,4 - 1,3/100 000/Jahr für die IMF und 2,5/100 000/Jahr für die ET5,7,8.
Die CMPE sind im allgemeinen Erkrankungen des höheren Lebensalters, wobei die PV und die IMF ein signifikant höheres Erkrankungsalter aufweisen6.
3 1.3. Differentialdiagnose
Aufgrund der erheblichen Unterschiede zwischen den CMPE betreffend Komplikationen, Verlauf und Prognose ist eine exakte diagnostische Abgrenzung der Entitäten notwendig. Die WHO fordert zur Diagnose der CMPE dabei definierte klinisch-hämatologische und histopathologische Parameter.
Diese neuen WHO-Kriterien beziehen, im Gegensatz zu den früheren hauptsächlich klinisch- hämatologisch orientierten Diagnosekriterien, histopathologische Parameter mit ein. Zudem definiert die WHO-Klassifikation ein präfibrotisches Stadium der IMF.
Da jede CMPE aufgrund ihres variablen klinischen Erscheinungsbildes eine andere Erkrankung dieser Gruppe imitieren kann9, kann die Differentialdiagnose im Einzelfall jedoch schwierig sein, so daß häufig erst im Verlauf deutlich wird, um welche CMPE es sich handelt. Wenn bei Diagnosestellung die Subtypisierung unsicher bleibt, kann zudem das Risiko einer Blastenkrise oder einer Osteomyelofibrose schwer abgeschätzt werden.
Besondere Schwierigkeiten bereitet das Erkennen des initialen präfibrotischen Stadiums der IMF (CMGM [Chronisch-megakaryozytär-granulozytäre Myelose] nach der Hannover-Klassifi- kation10), bei dem histopathologisch noch keine oder nur eine minimale Fibrose feststellbar ist.
Dieses präfibrotische Stadium der IMF kann zunächst nur durch eine exzessive Thrombozytose auffallen, so daß eine Abgrenzung zur ET sehr schwierig sein kann11.
In dieser Situation wäre ein Marker hilfreich, der bei Diagnosestellung eine genaue Zuordnung zu einer Entität erlaubt und damit Rückschlüsse auf den Verlauf und die Prognose zuläßt.
Die reziproke Translokation t(9;22) und das daraus resultierende BCR-ABL-Fusionsgen sind als charakteristischer molekularer Defekt der CML bekannt und ermöglichen durch zytogenetischen Nachweis des Philadelphia-Chromosoms, durch Nachweis des Fusionsgens durch die in-situ Hybridisierung oder des BCR-ABL-Fusionstranskripts mittels RT-PCR eine sichere Abgrenzung der CML von den anderen CMPE12.
In den letzten Jahren wurden das Polycythaemia-rubra-vera-1-Gen (PRV-1) und der Thrombopoetin-Rezeptor c-Mpl als mögliche Marker einer PV bzw. ET diskutiert. Ein definitiver diagnostischer Test für eine Ph-negative CMPE ist jedoch bis heute nicht etabliert worden. Zudem sind die molekularen Veränderungen, die letztendlich zu einer CMPE führen, weiterhin unbekannt.
1.4. Histopathologie 1.4.1. CML
Die Knochenmarkhistologie zeigt bei der CML eine erhöhte Zelldichte mit einer Reduktion der Erythropoese, ein Überwiegen der linksverschobenen, lückenlos ausreifenden neutrophilen Granulopoese und oft eine Vermehrung der Megakaryopoese, wobei es sich meist um atypische, hypolobulierte Mikromegakaryozyten handelt6. Häufig findet man die Pseudo-Gaucher-Zellen, eine Subpopulation von Makrophagen, die überwiegend bei der CML zu finden ist6. Das Spektrum der histologischen Befunde bei Diagnosestellung reicht jedoch von einer ausgeprägten Proliferation der Granulopoese über eine Vermehrung der Megakaryopoese bis hin zu einer retikulären und kollagenen Myelofibrose13.
Abb. 1.1. Histopathologie der CML. Ausgeprägte Proliferation der Granulopoese mit Verdrängung des Fettmarks (Vergrößerung 200-fach).
5 1.4.2. PV
Die PV zeigt ein hyperzelluläres Knochenmark mit einer Proliferation und Linksverschiebung aller drei Zellreihen6. Bei der besonders betonten Erythropoese fallen konfluierende Erythrone mit zahlreichen Proerythroblasten und frühen Erythroblasten auf14. Die pleomorphe Megakaryopoese zeigt eine Haufenbildung von riesigen Megakaryozyten mit hyperlobulierten, hirschgeweihartig gelappten Kernen, aber auch kleinere Zellformen15. Zudem weisen die Megakaryozyten histotopographische Anomalien mit paratrabekulärer Lokalisation der Zellen auf15. Während eine Eisenspeicherung der Makrophagen kaum oder gar nicht nachweisbar ist, kann auch bei der PV bereits zum Zeitpunkt der Diagnosestellung eine geringe retikuläre Markfibrose vorhanden sein6.
Abb. 1.2. Histopathologie der PV. Hyperzelluläres Knochenmark mit atypischen, pleomorphen Megakaryozyten (Vergrößerung 200-fach).
1.4.3. IMF
Das Frühstadium der IMF zeichnet sich durch ein hyperzelluläres Knochenmark mit Proliferation der leicht linksverschobenen Granulopoese und der Megakaryopoese aus15. Die Erythropoese reift eher verzögert aus und weist vermehrt Vorläuferzellen auf6. Im Verlauf kommt es zu einer progredienten Markfibrose, wobei zunächst retikuläre, später kollagene Fasern dominieren und schließlich eine endophytische Knochenneubildung, die Osteosklerose, zu demonstrieren ist6. Mit der progredienten Myelofibrose ist das Knochenmark zunehmend hypoplastisch.
Die Megakaryozyten bilden Nester, sind oft paratrabekulär lokalisiert und liegen in enger topographischer Beziehung zum Fasernetz6. Es kommen neben nackten Kernen kleine und sehr große Megakaryozyten vor, die hypolobulierte, chromatindichte Kerne (Wolkenkerne) besitzen6.
Abb.1.3. Histopathologie der IMF. Repräsentatives „Nest“ von pleomorphen, atypischen Megakaryozyten, welches transloziert am trabekulären Knochen liegt (Vergrößerung 630-fach).
7 1.4.4. ET
Das Knochenmark der ET ist leicht hyperzellulär15. Die ET ist durch eine erhebliche Proliferation von großen, reifen Megakaryozyten mit regelrechter Kern-Plasma-Relation und tief eingelappten Kernen charakterisiert6. Die Erythro- und Granulopoese sind regelhaft nicht vermehrt11. Eine geringe retikuläre Fibrose ist nur selten zu erkennen. Die zytologischen und histotopographischen Atypien der Megakaryozyten der IMF fehlen bei der ET, was eine Differenzierung der beiden Erkrankungen ermöglichen kann6.
Abb. 1.4. Histopathologie der ET. Normozelluläres Knochenmark mit einigen großen Megakaryozyten (Vergrößerung 200-fach).
1.5. Pathogenese der CMPE
Die drei blutbildenden Systeme des Knochenmarks sind bei den CMPE in unterschiedlichem Ausmaß von der klonalen Proliferation betroffen.
Die CML zeigt vor allem eine Proliferation der Granulopoese, so daß es vorrangig zu einer übermäßigen Ausschwemmung von Leukozyten aller Reifungsstufen kommt. Die PV ist durch eine klonale Proliferation aller drei Zellreihen gekennzeichnet, wobei ins Blut hauptsächlich Erythrozyten ausgeschwemmt werden, in geringerem Ausmaß können auch Thrombozyten und Granulozyten ausgeschwemmt werden. Bei der IMF kommt es im präfibrotischen Stadium zunächst zu einer Proliferation vor allem der Granulopoese und Megakaryopoese bei reduzierter Erythropoese, wobei die Erkrankung im Verlauf aufgrund der progredienten Osteomyelofibrose zu einer Hypoplasie aller drei Reihen führt. Bei der ET ist von der klonalen Proliferation hauptsächlich die Megakaryopoese betroffen, was zur Ausschwemmung von Thrombozyten und damit zur Thrombozytose führt.
1.5.1. Klonalität der CMPE
Die CMPE werden gegenwärtig als klonale Erkrankungen einer noch nicht definitiv charakterisierten pluripotenten hämatopoetischen Stammzelle betrachtet2. Mit Ausnahme der CML existiert jedoch kein klinisch anwendbarer klonaler Marker für die Diagnostik der CMPE.
Zur Verifizierung der Hypothese der klonalen Stammzellerkrankung wurden Polymorphismen auf der Ebene der DNA, RNA und der Proteine untersucht16. Die ersten Klonalitätsnachweise basierten auf dem Verteilungsmuster der Isoenzyme A und B der auf dem X-Chromosom lokalisierten Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G6PD)17-19. Aufgrund der Seltenheit dieses Polymorphismus konnten mit diesem Test nur wenige Frauen untersucht werden19.
Spätere Ansätze verwendeten DNA-Methylierungsmuster X-chromosomaler Gene wie der Hypoxanthinphosphoribosyltransferase (HPRT), der Phosphoglyceratkinase (PGK) oder des humanen Androgenrezeptors (HUMARA)20-23 oder die mRNA-Expression X-chromosomaler Gene wie der Iduronat-2-sulfatase (IDS), des Palmitoylierten Membranproteins p55 oder der G6PD22. Durch Kombination mehrerer Tests soll inzwischen bei über 90 % der Frauen eine Klonalitätsanalyse möglich sein24.
Die Grundlage dieser Klonalitätsassays ist die Lyon-Beutler-Hypothese, die von einer zufälligen Inaktivierung eines der beiden X-Chromosome in der frühen Ontogenese ausgeht, so daß in den Zellen eines klonalen Gewebes immer das gleiche X-Chromosom aktiviert ist, während in einem
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polyklonalen Gewebe die Anzahl der Zellen mit aktiviertem mütterlichen und aktiviertem väterlichen X-Chromosom etwa gleich groß ist24.
Diese Assays ließen auf eine pluripotente hämatopoetische Stammzelle als Ursprungszelle der CMPE mit klonaler Beteiligung von Erythrozyten, Thrombozyten, Granulozyten und B- Lymphozyten schließen2. Auch die T-Lymphozyten können Teil des malignen Klons sein25. Die Aussagefähigkeit der Klonalitätsassays ist jedoch durch technische und biologische Artefakte begrenzt2. So ist der Nachweis einer monoklonalen Hämatopoese weder notwendig noch spezifisch für eine CMPE25. Noch nicht vollständig verstandene biologische Prozesse führen gerade bei älteren Menschen zum Überwiegen nur eines X-Chromosoms, so daß Klonalitätsassays eine monoklonale Hämatopoese suggerieren, ohne daß eine hämatologische Erkrankung vorliegt2. Während nur bei 63-82 % der CMPE-Patienten eine klonale Hämatopoese gefunden wird26, demonstrierte eine Studie eine solche bei 37,9 % der über sechzigjährigen gesunden Frauen27. Bei einigen Patienten ist die Klonalität auf die Megakaryopoese beschränkt26.
Vor allem die ET ist nicht selten eine polyklonale Erkrankung, wobei Patienten mit monoklonaler ET möglicherweise ein erhöhtes Thromboserisiko haben28.
Die sich teils widersprechenden Ergebnisse mögen in der mangelnden Sensitivität der Klonalitätsassays begründet sein2 oder andererseits die biologische und klinische Heterogenität der Ph-negativen CMPE widerspiegeln26.
1.5.2. Zytogenetik der Ph-negativen CMPE
Unspezifische zytogenetische Anomalien werden zum Zeitpunkt der Diagnose bei etwa einem Drittel der IMF-Patienten5, bei weniger als 20% der PV-Patienten29 und weniger als 10% der ET- Patienten gefunden26.
Am häufigsten sind die Deletionen 13q-, 20q-, die Trisomien 8+ und 9+ und Abnormitäten der Chromosomen 1, 7 und 95,29. Bei der PV ist der Verlust der Heterozygotie auf dem Chromosom 9p ein häufiger Befund30, bei der IMF kann es zum Verlust der Heterozygotie auf dem Chromosom 3p kommen31. Ausgehend von den Chromosomenaberrationen wurde die pathogenetische Bedeutung verschiedener Kandidatengene diskutiert, unter anderem das Retinoblastom-Gen RB-1 (13q-) und der Retinsäurerezeptor RARß2 (3p)5,31. Pathogenetisch entscheidende, durch die Chromosomenaberrationen betroffene Gene, konnten bisher nicht eindeutig identifiziert werden (siehe oben).
1.5.3. Die molekulare Pathogenese der CML
Das Philadelphia-Chromosom der CML wurde 1960 als erste erworbene zytogenetische Anomalie beschrieben32 und später als verkürztes Chromosom 22 (22q-) identifiziert33.
Rowley fand 1973 heraus, daß das Philadelphia-Chromosom aus einer reziproken Translokation zwischen den langen Armen von Chromosom 9 und 22 t(9;22) (q34;q11) resultiert34. In den achtziger Jahren wurde entdeckt, daß hierbei Teile des ABL-Gens von Chromosom 9q34 auf das BCR-Gen auf dem Chromosom 22q11 transloziert werden, wobei das BCR-ABL-Fusionsgen entsteht35. Eine definitive Rolle im Pathomechanismus der CML für das ebenfalls aus der reziproken Translokation gebildete ABL-BCR-Fusionsgen ist bis heute nicht demonstriert worden.
Je nach Bruchpunkt des BCR-Gens entsteht ein BCR-ABL-Fusionsgen b2a2 oder b3a2, das in die chimäre BCR-ABL-mRNA transkribiert wird, welche für ein Protein mit einem Molekulargewicht von 210 kD kodiert (p210BCR-ABL)36. Die meisten CML-Fälle weisen entweder das b2a2- oder das b3a2-Transkript auf, initial oder im Krankheitsprogreß treten durch ein zusätzliches Philadelphia-Chromosom oder durch alternatives Spleißen auch beide zugleich auf37. Gelegentlich kann auch das b2a3- oder das b3a3-Transkript nachgewiesen werden36. Seltener bricht das Chromosom 22 in der Minor Breakpoint Cluster Region (m-BCR), was zur Bildung der e1a2-mRNA und eines kleineren Proteins (p190BCR-ABL) führt37. Diese Translokation ist mit der Ph-positiven akuten lymphatischen Leukämie37 und bei der CML mit einer deutlichen Monozytose assoziiert36. Liegt der Bruchpunkt zwischen den Exons e19 und e20 (µ-BCR), entstehen die e19a2-mRNA und ein größeres Protein (p230BCR-ABL)36, was mit der Ph-positiven chronischen Neutrophilen-Leukämie und meist einer Thrombozytose assoziiert ist37.
Das ABL-Gen kodiert für eine Tyrosinkinase mit einem Molekulargewicht von 145 kD (p145ABL), wobei deren Tyrosinkinaseaktivität durch intramolekulare Bindungen streng kontrolliert wird, während die Tyrosinkinase von p210BCR-ABL konstitutiv aktiviert ist38. Das ABL- Protein spielt eine Rolle beim Zellzyklus und der Apoptose, während die biologische Relevanz des BCR-Proteins noch unklar ist36. Die unkontrollierte Tyrosinkinaseaktivität von p210BCR-ABL durch Verlust der autoinhibitorischen Region führt durch Tyrosinphosphorylierung zur Interaktion mit zahlreichen Effektorproteinen, was wiederum zu einer dysregulierten Proliferation, einer verminderten Adhäsion an das Knochenmarkstroma und zu einem verminderten apoptotischen Ansprechen der Leukämiezellen auf mutagene Stimuli führt38.
Die meisten dieser Interaktionen wurden jedoch nur in vitro untersucht, so daß ihre Relevanz für die CML in vivo unsicher bleibt38.
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Gegenwärtig wird davon ausgegangen, daß die Entstehung der Philadelphia-Translokation in einer einzigen pluripotenten hämatopoetischen Stammzelle dieser und ihren Nachkommen einen Proliferationsvorteil verschafft, der der Ph-positiven Hämatopoese die Möglichkeit gibt, die normale Hämatopoese zu verdrängen38. Wie dieser Proliferationsvorteil auf molekularer Ebene entsteht, ist nicht genau bekannt.
Während des Übergangs der chronischen Phase der CML zur akzelerierten Phase und zur Blastenkrise kommt es bei 50 bis 80 % der Patienten zu weiteren zytogenetischen und molekularen Veränderungen37. Möglicherweise ist dies durch eine erhöhte Empfänglichkeit der Ph-positiven Hämatopoese gegenüber weiteren molekularen Veränderungen begründet38. Die häufigsten Chromosomenaberrationen sind +8, +Ph, i (17q), +19, -Y, +21, +17 und die Monosomie 739. Auf molekularer Ebene sind in der Blastenkrise unter anderem eine Überexpression von BCR-ABL, eine erhöhte Telomeraseaktivität, eine Überexpression des EVI1- Gens, Mutationen von Tumorsuppressorgenen (p53, RB-1, p16INK4A)39, sowie Mutationen bzw.
Amplifikationen von RAS und c-myc beschrieben37. Aufgrund der Variabilität der zytogenetischen und molekulargenetischen Evolution der CML scheint statt eines einzelnen Defektes eine Vielzahl molekularer Mechanismen für die Transformation verantwortlich zu sein38.
1.6. Ziel der Arbeit
Aufgrund der erheblichen Unterschiede zwischen den CMPE betreffend Komplikationen, Verlauf und Prognose ist eine exakte diagnostische Abgrenzung der Entitäten notwendig.
Die CMPE sind durch ausgeprägte Überschneidungen des klinischen Bildes und klinisch- hämatologischer Parameter gekennzeichnet, so daß die Differentialdiagnose sehr schwierig sein kann. Mit Ausnahme der CML existiert jedoch kein molekularer Marker, der in der Diagnosefindung die Ph-negativen CMPE sicher voneinander abgrenzen könnte. Ebenso sind die molekularen Veränderungen, die zur neoplastischen Transformation einer pluripotenten hämatopoetischen Stammzelle führen, noch unbekannt. Vor kurzem konnte eine Studie demonstrieren, daß ß-Catenin zur Proliferation, dem Überleben und den adhäsiven Fähigkeiten von Leukämiezellen beitragen kann40.
In einer anderen Studie wurden aus isolierten CD34+-Zellen von IMF-Patienten in vitro megakaryozytäre Vorläuferzellen generiert, die eine Überexpression des FK506 binding protein 51 (FKBP51) sowohl auf der mRNA- als auch auf der Proteinebene aufwiesen41. Diese Überexpression wurde mit einer antiapoptotischen Funktion von FKBP51 in Verbindung gebracht41.
Zur Genexpression von ß-Catenin und FKBP51 im Knochenmark gibt es bisher kaum Daten.
Daher wurde in dieser Arbeit die mRNA-Expression der beiden Gene im Knochenmark der CMPE, der AML und nicht-neoplastischer Hämatopoese bestimmt.
Weiterhin sollte im Rahmen dieser Arbeit die Etablierung eines für die relative mRNA- Quantifizierung notwendigen Referenz-Gens erfolgen, um das Spektrum der bereits zur Verfügung stehenden Referenzgene zu erweitern. Hierzu muß zunächst dessen mRNA-Expression an einer größeren Zahl von Knochenmarkbiopsien gemessen werden, um das konstitutive Expressionsniveau in normaler Hämatopoese und hämatologischer Erkrankung demonstrieren zu können. Aus diesem Grund wurde in dieser Arbeit die mRNA-Expression des potentiellen neuen Referenz-Gens HSP70.1 gemessen.
13 2. Material und Methoden
2.1. Untersuchungsmaterial
Die mRNA-Expression von ß-GUS, ß-Catenin, FKBP51 und HSP70.1 wurde in formalin- fixierten, paraffin-eingebetteten (FFPE) Knochenmarkbiopsien gemessen. Die Biopsien stammten aus dem Knochenmarkregister des Instituts für Pathologie der Medizinischen Hochschule Hannover.
Untersucht wurde das Knochenmark von Patienten mit histopathologisch gesicherten chronischen myeloproliferativen Erkrankungen (n = 70) und primärer AML (n = 10). Bei den untersuchten CMPE-Fällen handelte es sich um Patienten mit Ph+-CML (n = 11), PV (n = 11), ET (n = 11) sowie zellulärer (n = 18) und fibrotischer (n = 19) IMF. Die AML-Fälle wurden nach der French- American-British- (FAB) Klassifikation als M4 (n = 4), M2 (n = 4) und M1 (n = 2) diagnostiziert.
Ein Fall wies in der Zytogenetik eine Trisomie 21 auf. Als Kontrollgruppe (n = 31) dienten Knochenmarkbiopsien mit reaktiven Hyperplasien der Megakaryo- oder Erythropoese.
Die IMF-Fälle wurden nach der Hannover-Klassifikation histopathologisch in Fälle ohne Fibrose (n = 18) und mit Fibrose (n = 19) eingeteilt10,42, um mögliche Unterschiede der Genexpression zwischen präfibrotischer und manifest fibrotischer IMF zu erfassen.
Als Kontrollbiopsien wurden durch peripheren Verbrauch (bedingt zumeist durch Herzklappen- oder Gefäßersatz) verursachte reaktive Hyperplasien des Knochenmarks ausgewählt.
Alle untersuchten Biopsien stammten aus den Jahren 2000 und 2001. Es wurde vor Auswahl der Biopsien ausgeschlossen, daß die Patienten zum Zeitpunkt der Knochenmarkbiopsie bereits eine Therapie erhalten hatten, um den Einfluß einer solchen Therapie auf die Untersuchung auszuschließen.
Eine kurze klinische Beschreibung der untersuchten Patienten ist in Tabelle 2.1. dargestellt. Die bei Diagnosestellung gemessenen Blutwerte weisen deutliche Unterschiede zwischen den Entitäten auf. Andererseits verdeutlicht die Spannweite der hämatologischen Parameter innerhalb einer CMPE die klinische Heterogenität dieser Erkrankungen.
14 n Alter Geschlecht
m/w
Hämoglobin g/dl
Erythrozyten Mio./µl
Leuko 100 CML 11 63 (41 - 84) 6/5 12,2 (8,5 - 15,3) 3,84 (2,8 - 4,97) 45,9 (11,1 IMF ohne
Fibrose 18 67 (35 - 87) 5/13 10,5 (7,2 - 15,4) 3,92 (3,31 - 5,7) 10 (4,9 IMF mit
Fibrose 19 69,5 (49 - 86) 10/9 10,6 (5,1 -15,5) 3,9 (2,03 - 6,7) 8,42 (3,2 PV 11 70 (23 - 79) 5/6 16,3 (12,4 - 19,4) 6,28 (5,04 - 7,9) 12,6 (7,1 ET 11 59 (28 - 77) 3/8 14,9 (7,9 - 15,5) 4,8 (3,75 - 5,36) 12,5 (6,9 AML 10 70 (28 - 77) 6/4 9,8 (6,3 - 13,5) 2,84 (1,93 - 4,19) 22,65 (1, Kontrolle 31 59 (23 - 81) 17/14 12,3 (4,6 - 19,0) 4,55 (0,99 - 6,3) 8,6 (4,0
Tab. 2.1. Klinische Beschreibung und hämatologische Werte der untersuchten Patienten. Es ist der Median d und dessen Minimum und Maximum angegeben.
2.2. Extraktion und Analyse von RNA
Ein Problem beim experimentellen Umgang mit RNA stellen die ubiquitär vorkommenden RNasen dar. Da der Mensch RNasen über Körperflüssigkeiten wie Speichel und Schweiß, aber auch über den Atem ausscheidet, muß ein Kontakt dieser Körperflüssigkeiten mit den Proben vermieden werden. Es wurde daher unter der Glasscheibe von UV-Laborbänken pipettiert und nicht über geöffneten Gefäßen gearbeitet.
RNA ist im Vergleich zu DNA wesentlich instabiler und temperaturempfindlicher. Bei RNA- Extraktion und der Synthese der komplementären DNA (cDNA) wurden daher die Proben stets auf Eis gestellt. Es wurden eine Kühlzentrifuge (4° C) und gekühlte Reagenzien verwendet. Beim Pipettieren mit gestopften Pipettenspitzen wurden die Proben mit einer eiskalten Metallplatte gekühlt.
Die UV-Laborbänke waren mit einer Glasscheibe ausgerüstet, unter der pipettiert wurde, so daß ein Kontakt der Probe mit dem eigenen Atem vermieden wurde.
2.3. RNA-Extraktion aus FFPE-Knochenmark
Die Paraffinblöcke wurden in ein Mikrotom (Schlitten-Mikrotom, R.Jung, Deutschland) ein- gespannt und eine Schnittdicke von etwa 15 µm gewählt. Je nach Größe und Qualität der Biopsie wurden ca. 4-7 Schnitte angefertigt und das Material mit einer Pinzette in ein 1,5 ml Eppendorfgefäß (Safe Lock Tubes 1,5 ml, Eppendorf AG, Deutschland) überführt. Nach jeder Probe wurden das Messer und die Pinzette mit Xylolersatz gereinigt.
Zum Verdau der Schnitte wurden hinzugefügt: 750 µl Digestion Solution (s. Anhang), je 100 µl DS 0,7 µl ß-Mercaptoethanol (2-Mercaptoethanol, Carl-Roth GmbH + Co, Deutschland) und 300 µl Proteinase K (20 mg/ml, Merck KGaA, Deutschland).
Die Proben wurden im Thermoshaker (Thermomixer compact, Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Deutschland) bei 55° C und 1400 rpm über Nacht verdaut.
Am folgenden Tag wurden die Eppendorfgefäße für fünf Minuten bei 4 °C mit 13 000 rpm in der Zentrifuge (Biofuge fresco, Kendro Laboratory Products, Deutschland) zentrifugiert, wodurch sich unverdautes Material am Boden absetzte und sich eine Paraffinkappe über dem Verdau bildete. Es wurden je 1000 µl der Flüssigkeit entnommen und in ein neues 2 ml Eppendorfgefäß (Safe Lock Tubes 2 ml, Eppendorf AG, Deutschland) überführt. Hierbei wurde jeder Transfer von unverdautem Material vermieden.
In die Eppendorfgefäße wurden jeweils 100 µl 3M Natrium-Acetat-Lösung (pH 5,2, Carl- Roth GmbH + Co, Deutschland), 630 µl saures, wassergesättigtes Phenol (Aqua-Roti-
Phenol pH 4-5, Carl-Roth GmbH + Co, Deutschland) und 270 µl Chloroform (Mallinckrodt Baker, Deutschland) pipettiert. Nach jedem Pipettierschritt wurde die Probe mit dem Vortexer (Vortex Mixer VM-300, neoLab GmbH, Deutschland) durchmischt und kurz anzentrifugiert. Die Gefäße wurden für 15 Minuten zur Phasentrennung auf Eis gestellt.
Anschließend erfolgte für 20 Minuten eine Zentrifugation bei 4° C und 13 000 rpm. Die obere wässrige RNA-haltige Phase wurde abpipettiert und in ein neues 2 ml Eppendorfgefäß gegeben.
In dieses Eppendorfgefäß wurden zur Fällung der RNA 1 Vol. (∼1000 µl) Isopropanol (Merck KGaA, Deutschland), und 1 µl Glykogen (= 20 µg, Glycogen for mol. biol. 20 mg/ml, Roche Diagnostics GmbH, Deutschland) als RNA-Carrier hinzugefügt.
Die Lösung wurde über Kopf geschwenkt und anzentrifugiert und danach zur Fällung der RNA für mindestens 24 Stunden bei –20° C gelagert.
Am nächsten Tag wurden die Proben aus dem Eisfach (-20° C) entnommen und für 20-30 Minuten bei 13 000 rpm zentrifugiert. Nach der Zentrifugation zeigte sich ein RNA-Pellet auf dem Boden des Gefäßes. Der Überstand wurde vorsichtig abpipettiert.
Zum Waschen des Pellets wurden 100 µl eiskaltes (-20° C) 70%iges Ethanol (Mallinckrodt Baker, Deutschland) hinzugefügt, das Pellet durch Vortexen gelöst und die Proben 5 Minuten bei 13 000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde danach erneut abpipettiert und die Proben unter den Abzug gestellt, um Ethanolreste verdampfen zu lassen.
2.4. Messung der optischen Dichte (OD)
Zur Messung der OD im Photometer wurden je nach Pelletgröße 25-40 µl kaltes H2O/DEPC hinzupipettiert. Die RNA wurde mit H2O/DEPC in einem Verhältnis von 1 : 50 verdünnt.
Entsprechend wurden 2 µl RNA und 98 µl H2O/DEPC in einem 0,2 ml PCR Tube (PCR Soft Tubes, 0,2 ml, Biozym Diagnostik GmbH, Deutschland) gemischt.
Die optische Dichte dieser 100 µl wurde mit dem Photometer (Beckman DU 640 Spectrophotometer, Beckman Instruments, USA) bei einer Wellenlänge von 260 nm (RNA) und 280 nm (Proteine) bestimmt. Die RNA-Konzentration (µg/ml) errechnete sich aus der OD bei 260 nm, der Verdünnung und einem RNA-spezifischen Multiplikationsfaktor.
2.5. Synthese der komplementären DNA (cDNA)
Zunächst wurden die Proben mit DNase behandelt, um Kontaminationen genomischer DNA zu beseitigen.
Pro Probe wurde hinzugefügt:
- 1 µl DNase-Puffer (RQ1 DNase 10x Reaction Buffer, Promega GmbH, Deutschland) - 1 Unit DNase pro µg RNA (= 1 µl) (RQ1 RNase-Free DNase 1U/µl, Promega GmbH,
Deutschland)
Inkubation für 30 Minuten bei 37° C im Thermocycler (Tpersonal 48, Biometra-GmbH, Deutschland).
Inaktivierung der DNase durch Hinzufügen von:
- DNase-Stop-Solution 1 µl/U RQ1 DNase (RQ1 DNase Stop Solution, Promega GmbH, Deutschland)
Hinzufügen von:
- 1 µl pd(N)6-random-hexamers (250 ng/µl, Amerham Biosciences Europe GmbH, Deutschland)
Inkubation für 10 Minuten bei 70° C, um Sekundär- und Tertiärstrukturen der RNA aufzuheben.
Die Anlagerung der pd(N)6-random-hexamers erfolgt bei Raumtemperatur, weshalb die Proben nach der Inkubation kurz auf Eis gestellt wurden.
Es wurden jetzt 7,5 µl des vorbereiteten Master-Mixes hinzupipettiert.
Der Master-Mix bestand aus folgenden Komponenten:
- 4,0 µl 5x-Puffer (5x First Strand Buffer, Invitrogen Life Technologies, Deutschland) - 2,0 µl DTT (0,1 M DTT, Invitrogen Life Technologies, Deutschland)
- 1,0 µl dNTP (dNTP Mix 10 mMol of each, MBI Fermentas GmbH, Deutschland) - 0,5 µl RNasin (40U/µl Ribonuclease Inhibitor, MBI Fermentas GmbH, Deutschland)
Die Proben wurden für zehn Minuten bei 25° C inkubiert.
Jetzt wurde 1 µl (200 U) der Reversen Transkriptase (SuperScriptTM Rnase H- Reverse Transkriptase, Invitrogen Life Technologies, Deutschland) hinzugefügt und die Proben für 50 Minuten bei 42° C inkubiert.
Die hierbei erfolgende Reverse Transkription wurde durch einen letzten Inkubationsschritt für 15 Minuten bei 70° C durch Inaktivierung des Enzyms beendet.
Bei jeder cDNA-Synthese wurde eine Negativkontrolle in Form einer Reaktion ohne Reverse Transkriptase (-RT-Reaktion) durchgeführt.
2.7. Real-time RT-PCR (TaqMan-PCR)
2.7.1. Reduktion des PCR-Kontaminationsrisikos
Die PCR ist in der Lage, auch geringste Mengen an DNA zu amplifizieren und ist daher für Kontaminationen äußerst anfällig. Besonders problematisch ist die Kontamination durch PCR-Produkte vorausgegangener PCR-Reaktionen. Aus diesem Grund wurden verschiedene Vorsichtsmaßnahmen eingehalten.
Das Labor war strikt in einen Prä-und Post-PCR-Bereich unterteilt. Die PCR-Vorbereitung (Pipettieren von Master-Mixen) erfolgte in einem separaten, praktisch nukleinsäurefreien Raum. Die Master-Mixe wurden über eine Schleuse in einen zweiten Raum transferiert, wo die Template-DNA zupipettiert wurde. Die Analyse der Amplifikate erfolgte ausschließlich im Post-PCR-Bereich. Materialien oder Reagenzien aus dem Post-PCR-Bereich wurden niemals in den Prä-PCR-Bereich gebracht.
Alle in den Prä-PCR-Bereich gebrachten Arbeitsmaterialien wurden zur Zerstörung eventuell vorhandener Nukleinsäuren mit einer 2%-igen Natriumhypochloridlösung äußerlich abgewischt. Beim Aufenthalt im Labor wurden stets Schutzkittel und Einmalhandschuhe getragen.
Die Arbeitsflächen wurden vor Beginn der Arbeit ebenfalls mit Natriumhypochlorid gereinigt.
Eine Dekontamination aller Arbeitsflächen und -geräte mit Natriumhypochlorid erfolgte in regelmäßigen Abständen. Das Pipettieren erfolgte unter UV-Laborbänken unter Verwendung von nukleinsäurefreien gestopften Pipettenspitzen.
Alle Gefäße mit Reagenzien und Proben wurden vor der Verwendung kurz anzentrifugiert.
2.7.2. Methode
Die Real-time RT-PCR mit dem TaqMan-System zeichnet sich dadurch aus, daß die Amplifikation des Templates und der gesamte Reaktionsablauf hinsichtlich der Kinetik verfolgt werden können und damit eine Quantifizierung der Ausgangsmenge an Template- DNA möglich wird.
Der PCR-Reaktion wird außer den Primern ein weiteres Oligonukleotid (Real-time Sonde/Probe) hinzugefügt, welches sequenzspezifisch die Template-DNA im Bereich des zu amplifizierenden Fragments bindet.
Am 5´-Ende ist die Sonde mit einem Reporter, am 3´-Ende mit einem Quencher markiert.
Reporter und Quencher sind beides fluoreszierende Moleküle (Fluorophore), die jeweils durch Licht einer charakteristischen Wellenlänge angeregt werden und ihrerseits Licht eines spezifischen Spektrums emittieren.
Reporter- und Quenchermolekül sind so gewählt, daß das Emissionsspektrum des Reporters dem Anregungsspektrum des Quenchers entspricht.
Aufgrund der räumlichen Nähe von Reporter und Quencher wird das vom Reporter emittierte Licht vom Quencher absorbiert, der wiederum Licht seines spezifischen Spektrums emittiert.
Das TaqMan-System nutzt hierbei die 5´→3´-Exonucleaseaktivität der Taq-DNA- Polymerase aus. Nach Anlagerung der Primer trifft die Taq-DNA-Polymerase bei der Elongation auf das 5´- Ende der Sonde und baut dieses durch die 5´→3´-Exonucleaseaktivität ab.
Damit ist die räumliche Nähe von Reporter und Quencher aufgehoben, und der Reporter emittiert Licht seines charakteristischen Spektrums, welches durch optische Detektoren gemessen wird. Die Fluoreszenzintensität wird von den Detektoren des Systems während jedes PCR-Zyklus gemessen.
Mit der zunehmenden Zahl der Amplifikate steigt auch die Zahl der freigesetzten Reportermoleküle und damit die Fluoreszenzintensität an.
Das TaqMan-System gibt bei der Analyse der PCR-Reaktion den CT-Wert („Threshold Cycle“) an. Der CT-Wert gibt die Zykluszahl an, bei der sich das Fluoreszenzsignal gerade deutlich vom Hintergrund abhebt. Zu diesem Zeitpunkt ist die Amplifikation exponentiell.
In der frühen Amplifikationsphase ist aufgrund der geringen Templatemenge keine exponentielle Amplifikation zu erwarten, während es in der späten Phase zu einer Sättigung der Reaktion kommt, die auf Produkthemmung, auf dem Verbrauch von Nukleotiden und Primern und auf einem Aktivitätsverlust der Polymerase aufgrund der hohen Temperaturen beruht.
Das Prinzip der Real-time RT-PCR (TaqManPCR) ist schematisch in Abb. 2.1. dargestellt.
Abb. 2.1. Prinzip der quantitativen Real-time RT-PCR (TaqMan-PCR)
cDNA
3´
5´
Denaturierung der cDNA
3´
Annealing der Sonde
R Q
5´
3´
5´
3´
3´
5´
3´
5´
5´
R Q
5´ 3´
3´
5´
5´ 3´
Annealing der Primer mit Elongation
5´-Primer
3´-Primer
R
Q
5´ 3´
3´
5´-Primer
5´
Abspaltung des Reporters vom 5´- Ende der Sonde
R Q
5´-Primer
3´ 5´
Weitere Elongation mit Degradierung
Sonde
5´
2.7.3. Durchführung
Pro PCR-Reaktion wurden in ein 0,2 ml Eppendorfgefäß pipettiert:
- 19 µl H2O (Ampuwa, Fresenius Kubi Deutschland GmbH, Deutschland)
- 3 µl 10x Puffer (10x PCR Rxn Buffer (-MgCl2), Invitrogen Life Technologies, Deutschland)
- 3 µl MgCL2 (25 mMol/l, Invitrogen Life Technologies, Deutschland)
- 0,6 µl dNTP (dNTP Mix 10 mMol of each, MBI Fermentas GmbH, Deutschland) - 10 pmol Forward Primer (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deutschland)
- 10 pmol Reverse Primer (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deutschland) - 0,3 µl ROX (Invitrogen Life Technologies, Deutschland)
Vor jeder PCR wurden pro Messung 25,75 µl Master-Mix entnommen und in ein weiteres je nach Gesamtmenge 500 µl-oder 2 ml-Eppendorfgefäß überführt.
Es wurden nun pro Messung 0,1 µl TaqMan-Sonde (50 pmol/µl) sowie 0,15 µl Taq- Polymerase (5 U/µl, Platinum Taq DNA Polymerase, Invitrogen Life Technologies, Deutschland) hinzugefügt.
26 µl Master-Mix wurden nun je nach Probenzahl in eine Reaktionsplatte (MicroAMP Optical 96-Well Reaction Plate, Applied Biosystems, USA) oder einen Reaktionsstreifen (Optical Caps, Applied Biosystems, USA) vorgelegt und 4 µl cDNA unter Mischen dazupipettiert.
Die Platte oder die Streifen wurden mit einem Deckel (Thermo-Fast 16, 0,2 ml 16 well PCR plate double cut, ABgene, Deutschland ) verschlossen und zur Reaktion in das System gestellt.
Es wurden je 45 Zyklen der Real-time RT-PCR durchgeführt.
Bei jedem Lauf der Real-time RT-PCR wurden eine Positivkontrolle und eine Negativ- kontrolle (No Template Control) durchgeführt. Ebenso wurde zum Ausschluß einer Kontamination mit genomischer DNA in jede Messung die oben beschriebene -RT-Probe miteinbezogen.
Der Ablauf eines Real-time RT-PCR-Zyklus ist in Abbildung 2.2. dargestellt. Tab. 2.2. gibt die Nukleotidsequenzen der bei der PCR verwendeten Primer und Sonden an.
Abb.2.2. Schema eines Real-time PCR-Zyklus, Zyklusdauer in Minuten
Primer und
Sonden Sequenz ( 5´ zu 3´ ) Referenz / Produkt
ß-Catenin
forward CCGCATGGAAGAAATAGTTGAAG
ß-Catenin
reverse CAATTCGGTTGTGAACATCCC
Sigma-Genosys Ltd.
Sigma-Aldrich Chemie GmbH Deutschland ß-Catenin
probe FAM- TGTACCGGAGCCCTTCACATCCTAGCT-TAMRA
71 bp GenBank X87838 BioTeZ Berlin-Buch GmbH,
Deutschland FKBP51
forward GGGTCACTAATGAAAAAGGAACAGA
FKBP51
reverse CTCTTCCCTCCTTGGCGTG
Sigma-Genosys Ltd.
Sigma-Aldrich Chemie GmbH Deutschland FKBP51
probe
FAM-CAATGGAAGAAGAGAAACCTGAGGGCCAC- TAMRA
90 bp Referenz Giraudier et al., 2002, GenBank U71321, BioTeZ Berlin-Buch GmbH,
Deutschland HSP-70.1
forward CCGGTGGTGCAGTCGG
HSP-70.1
reverse GGCTTGTCTCCGTCGGTTGA
Sigma-Genosys Ltd.
Sigma-Aldrich Chemie GmbH Deutschland HSP-70.1
probe FAM- CATGAAGCACTGGCCTTTCCAGGTG -TAMRA
62 bp GenBank NM005345, BioTeZ Berlin-Buch GmbH,
Deutschland ß-GUS
forward CTCATTTGGAATTTTGCCGATT
ß-GUS
reverse CGAGTGAAGATCCCCTTTTTA
Sigma-Genosys Ltd.
Sigma-Aldrich Chemie GmbH Deutschland ß-GUS
probe FAM- TGAACAGTCACCGACGAGAGTGCTGG -TAMRA
87 bp GenBank NM 000181, BioTeZ Berlin-Buch GmbH,
Deutschland
Tab. 2.2. Sequenzen der verwendeten Primer und Sonden 50° C
0:10
95° C 5:00
95° C 0:15
60° C 01:00
2.8. Evaluation der Ergebnisse
2.8.1. ∆∆∆∆∆∆∆∆CT-Methode
Die Real-time RT-PCR mit dem TaqMan-System ermittelt für jedes amplifizierte Gen einen CT-Wert. Der CT-Wert gibt diejenige Zykluszahl an, bei der das gemessene Fluoreszenzsignal die basale Fluoreszenz („Hintergrund“) überschreitet. Zu diesem Zeitpunkt ist die Amplifikation exponentiell.
Bei unserer Untersuchung kam das Prinzip der relativen Quantifizierung der Zielgene zur Anwendung43. Hierbei wurden die CT-Werte des Zielgens mit denjenigen des Housekeeping- Gens ß-GUS verglichen. Die konstante Expression von ß-GUS in FFPE-Knochen- markbiopsien in neoplastischer und nicht-maligner Hämatopoese war als Voraussetzung hierfür demonstriert worden44.
CT (Zielgen) – CT (Housekeeping-Gen) = ∆∆∆∆CT
Der CT-Wert des Zielgens ist direkt proportional zu dessen absoluter Konzentration im Verhältnis zum CT-Wert des Housekeeping-Gens45.
Der ∆CT-Wert der jeweiligen Erkrankung wird nun mit dem ∆CT-Wert der Kontrolle verglichen.
∆∆
∆∆∆∆∆∆CT = ∆∆∆∆CT (Erkrankung) - ∆∆∆C∆ T (Kontrolle)
Wenn diese beiden ∆CT-Werte gleich sind und der ∆∆CT-Wert somit gleich null ist, besteht kein Unterschied in der Expression des Zielgens zwischen der Erkrankung und der Kontrolle.
Unterscheiden sich die ∆CT-Werte, dann unterscheiden sich Erkrankung und Kontrolle im Transkriptlevel des untersuchten Gens.
Eine für das Ziel- und Housekeeping-Gen gleiche Reaktionseffizienz nahe 100 % vorausgesetzt, kann der Unterschied im Transkriptlevel zwischen der Erkrankung und der reaktiven Hyperplasie nach folgender Formel kalkuliert werden:
X = 2 - ∆∆∆∆∆∆∆∆CT
Ist der ∆CT-Wert der untersuchten Biopsie beispielsweise drei Zyklen niedriger als der ∆CT- Wert der Kontrollbiopsie (∆∆CT = -3), ist die Transkriptmenge des Zielgens in dieser Biopsie achtfach ( 2 – ( - 3 ) ) gegenüber der Kontrollbiopsie gesteigert44.
Die o.g. Formel geht von einer Verdopplung der cDNA bei jedem PCR-Zyklus aus, was jedoch praktisch nicht ganz erreicht wird. Es wurde daher für alle Reaktionen eine mittlere Effizienz von 95 % vorausgesetzt, also eine Vermehrung der Template-DNA um den Faktor 1,9 mit jedem PCR-Zyklus. Die ∆∆CT-Werte wurden daher nach folgender Formel in das relative mRNA-Expressionslevel umgewandelt, das den Ergebnissen dieser Arbeit zugrunde liegt:
1,9 – ∆∆∆∆∆∆∆∆CT = relatives mRNA-Expressionslevel
Für alle untersuchten Fälle wurden Doppelmessungen durchgeführt, es lagen also für jeden Fall und jedes Zielgen zwei CT-Werte vor. Nach o.g. Formel wurden pro Gen und Fall zwei
∆CT-Werte errechnet. Aus diesen beiden ∆CT-Werten wurde ein intraindividueller Mittelwert berechnet. Aus diesen intraindividuellen Mittelwerten wiederum wurde ein Mittelwert für die Gruppe gebildet. Diese gruppenbezogenen Mittelwerte wurden durch Berechnung des ∆∆CT- Wertes miteinander verglichen. Der mittlere ∆CT-Wert der Kontrollgruppe wurde gleich eins (= 1) gesetzt und von den jeweiligen ∆CT-Werten der Patienten mit der ∆∆CT-Methode zur Kalkulation des Expressionslevels subtrahiert.
Um die CT-Werte für ein Zielgen und ein Housekeeping-Gen vergleichen zu können, sollte die Reaktionseffizienz der verwendeten Primer identisch sein. Diese Effizienz wurde mit einer cDNA-Verdünnungsreihe der Mammakarzinom-Zellinie MCF-7 getestet. Als Verdünnungsstufen wurden 1:1, 1:4, 1:16, 1:64 und 1:256 gewählt. Die Beziehung zwischen der Steigung der Regressionsgeraden und der Effizienz der PCR ergibt sich aus folgender Formel (s = Steigung; E = Effizienz):
s = log ( 1 + E )
Aus den ermittelten Steigungen konnten die in Abb 3.1. dargestellten Korrelationen errechnet werden.
2.8.2. Statistik
Sofern im Rahmen der quantitativen Expressionsanalysen Unterschiede zwischen den untersuchten Patientengruppen zu demonstrieren waren, wurde mit Hilfe des SPSS- Programms unter Verwendung des Oneway-Anova-Tests eine statistische Auswertung der mRNA-Expression durchgeführt. Als Post-Hoc-Test kam der Tukey-HSD-Test zur Anwendung. Die statistische Auswertung wurde im Institut für Biometrie der Medizinischen Hochschule Hannover durch Herrn Dr. rer. nat. H. Herrmann durchgeführt.
3. Ergebnisse
3.1. Korrelationen der RT-PCR
Abb 3.1. Korrelation der RT-PCR-Reaktionen der untersuchten Zielgene über einen definierten Konzentrationsbereich,
r2 = Korrelationskoeffizient
RT-PCR-Reaktionen der untersuchten Zielgene über einen definierten Konzentrationsbereich
cDNA Verdünnung
0,1 1 10 100 1000
CT - Wert
18 20 22 24 26 28 30 32 34 36
β-GUS r2 = 0.996 β-Catenin r2 = 0.999 FKBP51 r2 = 0.995 HSP 70.1 r2 = 0.994
3.2. Linearität der RT-PCR
Abb 3.2. Linearität der Real-time RT-PCR für die untersuchten Zielgene
Um die Linearität der Real-time RT-PCR zu bestimmen, wurden die ∆CT-Werte der drei Zielgene gegen die Verdünnung der cDNA aufgetragen (Abb 3.2.). Wenn die Steigung der Geraden nahe null ( 0 ) liegt, sind die Effizienzen des Housekeeping-Gens und des Zielgens gleich und die ∆∆CT-Methode kann zur Analyse der Daten angewendet werden43. Die Steigungen in Abb 3.2. erfüllen diese Voraussetzung.
Linearität der RT-PCR für die untersuchten Zielgene über einen definierten Konzentrationbereich
cDNA Verdünnung
0,1 1 10 100 1000
∆∆∆∆ CT (CT Zielgen - CTββββ-GUS)
-4 -2 0 2 4
β-Catenin Steigung s = - 0.09 FKBP51
Steigung s = - 0.11 HSP 70.1
Steigung s = - 0.08
Heißt das nicht Konzentrationsbereich in der Überschrift?
3.3. Genexpression von ß-Catenin
IMF IMF PV ET CML AML Kontrolle - +
Abb.3.3. Relative mRNA-Expression von ß-Catenin in den CMPE, der AML und der Kontrollgruppe. Der horizontale Balken stellt den Median des Genexpressionslevels der jeweiligen Gruppe dar.
Der mittlere ß-Catenin-Genexpressionslevel lag in der Kontrollgruppe bei 1.08 ± 0.47 (0.37 – 2.96), in der PV bei 0.94 ± 0.22 (0.63 – 1.25), in der ET bei 1.1 ± 0.34 (0.54 – 1.79), in der CML bei 0.87 ± 0.33 (0.49 – 1.65) und in der AML bei 2.29 ± 1.32 (1.0 – 5.3). Der mittlere ß-Catenin-Genexpressionslevel lag in der präfibrotischen IMF (IMF -) bei 1.06 ± 0.38 (0.41 – 1.78) und bei der fibrotischen IMF (IMF +) bei 1.37 ± 0.53 (0.69 – 2.59).
βββ
β-Catenin mRNA - Expression in Chronischen myeloproliferativen Erkrankungen und Akuter myeloischer Leukämie
Relativerββββ-Catenin mRNA level
0 1 2 3 4 5 6 7
Der in Abb. 3.3. dargestellte Median des ß-Catenin-mRNA-Expressionslevels lag bei der Kontrollgruppe bei 1.0, bei der PV bei 0.97, bei der ET bei 1.09, bei der CML bei 0.83, bei der präfibrotischen IMF bei 1.04, bei der fibrotischen IMF bei 1.37 und bei der AML bei 1.42.
Der ß-Catenin-Expressionslevel von der AML war statistisch signifikant gegenüber der CML (p < 0.0001) und gegenüber der Kontrolle (p = 0.019) erhöht. Außerdem wies die IMF (gesamt) gegenüber der CML (p = 0.013) eine signifikant erhöhte Expression von ß-Catenin auf. Die Genexpression von ß-Catenin zeigte darüber hinaus keine weiteren signifikanten Unterschiede innerhalb der CMPE oder zwischen den CMPE und der Kontrolle.
3.4. Genexpression von FKBP51
IMF IMF PV ET CML Kontrolle - +
Abb. 3.4. Relative mRNA-Expression von FKBP51 in den CMPE und der Kontrollgruppe. Der horizontale Balken stellt den Median des
Genexpressionslevels der jeweiligen Gruppe dar.
Der mittlere FKBP51-Genexpressionslevel lag in der Kontrollgruppe bei 1.03 ± 0.57 (0.33 – 2.97), in der PV bei 0.84 ± 0.67 (0.26 – 2.79), in der ET bei 1.31 ± 1.14 (0.49 – 4.37) und in der CML bei 0.72 ± 0.22 (0.49 – 1.13). Der mittlere FKBP51-Genexpressionslevel lag in der präfibrotischen IMF (IMF -) bei 1.40 ± 1.23 (0.31 – 4.97) und in der fibrotischen IMF (IMF +) bei 0.74 ± 0.34 (0.12 – 1.37).
FKBP51 mRNA - Expression
in Chronischen myeloproliferativen Erkrankungen
Relativer FKBP51 mRNA level
0 1 2 3 4 5 6 7
Der in Abb. 3.4. dargestellte Median des FKBP51-mRNA-Expressionslevels lag in der Kon- trollgruppe bei 1.03, in der PV bei 0.76, in der ET bei 1.29, in der CML bei 0.77, in der präfibrotischen IMF bei 1.21 und in der fibrotischen IMF bei 1.56.
Die mRNA-Expression von FKBP51 wies keine signifikanten Unterschiede innerhalb der CMPE oder der CMPE gegenüber der Kontrolle auf (Abb. 3.4.).
3.5. Genexpression von HSP70.1
IMF IMF PV ET CML Kontrolle - +
Abb. 3.5. Relative mRNA-Expression von HSP70.1 in den CMPE und der Kontrollgruppe. Der horizontale Balken stellt den Median des
Genexpressionslevels der jeweiligen Gruppe dar.
Der mittlere HSP70.1-Genexpressionslevel lag in der Kontrollgruppe bei 1.03 ± 0.57 (0.33 – 2.97), in der PV bei 0.84 ± 0.67 (0.26 – 2.79), in der ET bei 1.31 ± 1.14 (0.49 – 4.37) und in CML bei 0.72 ± 0.22 (0.49 – 1.13). Der mittlere HSP70.1-Genexpressionslevel lag in der präfibrotischen IMF (IMF -) bei 1.40 ± 1.23 (0.31 – 4.97) und in der fibrotischen IMF (IMF +) bei 0.74 ± 0.34 (0.12 – 1.37).
HSP70.1 mRNA - Expression
in Chronischen myeloproliferativen Erkrankungen
Relativer HSP70.1 mRNA level
0 1 2 3 4 5 6
Der in Abb. 3.5. dargestellte Median des HSP70.1-mRNA-Expressionslevels lag in der Kon- trollgruppe bei 0.85, in der PV bei 0.72, in der ET bei 0.77, in der CML bei 0.68, in der präfibrotischen IMF bei 1.1 und in der fibrotischen IMF bei 0.68.
Die mRNA-Expression von HSP70.1 wies keine signifikanten Unterschiede innerhalb der CMPE oder der CMPE gegenüber der Kontrolle auf (Abb. 3.5).
Abb. 3.6. Darstellung der ∆CT-Werte (CT ß-GUS -CT HSP70.1) für CMPE- und Kontrollfälle (n = 99) im PointPlot und Darstellung der CT- Werte für ß-GUS und HSP70.1 mit Standardabweichung im BoxPlot.
Die Abb. 3.6. zeigt in der PointPlot-Darstellung die ∆CT-Werte (CT ß-GUS -CT HSP70.1) für CMPE- und Kontrollfälle (n = 99) und in der BoxPlot-Darstellung die gemessenen CT-Werte für ß-GUS und HSP70.1. Der Mittelwert und die Standardabweichung der ∆CT-Werte (CT ß- GUS -CT HSP70.1) ist 4.0 ± 0.91, dieselben Werte lagen für den CT-Wert von ß-GUS bei 30.6 ± 1.57 und für den CT-Wert von HSP70.1 bei 26.5 ± 1.57.
Fallzahl
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
CT - Werte
20 22 24 26 28 30 32 34 36 38
β ββ
β-GUS HSP-70.1
∆∆∆∆CT (CTββββ-GUS – CTHSP-70.1)
4. Diskussion
Das Knochenmarkregister des Instituts für Pathologie der Medizinischen Hochschule Hannover repräsentiert einen Querschnitt aller die Hämatopoese betreffenden Erkrankungen sowie Knochenmarkbiopsien mit dem Nachweis einer altersentsprechenden Hämatopoese.
Zu diesen Biopsien sind neben der histopathologischen Diagnose umfangreiche klinische Daten vorhanden, so daß Klinik und Krankheitsverlauf mit dem korrespondierenden histopathologischen Befund verglichen werden können. Knochenmarkbiopsien werden nahezu ausschließlich in Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Sehr selten werden noch Acrylateinbettungen durchgeführt.
Die molekulare Analyse von Nukleinsäuren in FFPE-Gewebe eröffnet grundsätzlich die Möglichkeit, Veränderungen des Genoms und Transkriptoms in praktisch allen Erkrankungen zu untersuchen. In retrospektiven Studien kann die aberrante Expression von Genen mit der Histopathologie, dem Therapieansprechen und dem klinischen Verlauf korreliert werden. Zukünftig können zudem molekulare Parameter in prospektive Studien mit einbezogen werden45.
Die Real-time RT-PCR ist gegenwärtig die am weitesten verbreitete Methode zur Quantifizierung der Genexpression46. Das Verfahren hat eine reproduzierbare, standardisierte Quantifizierung von Nukleinsäuren erheblich vereinfacht47.
Ein verläßliches RNA-Extraktionsverfahren ist für die Quantifizierung der mRNA aus archi- vierten Biopsien unabdingbar. Während die DNA-Extraktion aus FFPE-Gewebe heute auch zu diagnostischen Zwecken ein Routineverfahren ist, war die RNA-Extraktion und folgende Analyse der Genexpression wegen der erheblich beeinträchtigten Integrität der RNA in fixierten Geweben lange Zeit problematisch48.
In dieser Arbeit kam ein mittlerweile ebenfalls in der Routinediagnostik eingesetztes Protokoll zur RNA-Extraktion aus FFPE-Gewebe zur Anwendung49, das die reproduzierbare Quantifizierung der mRNA mit der Real-time RT-PCR ermöglicht45. Je nach Größe der Knochenmarkbiopsie können mit dieser Methode zwischen 3 und 30 µg RNA extrahiert werden49.
Die durch die Formalin-Fixierung bedingte ausgeprägte Quervernetzung von Proteinen und Nukleinsäuren führt zur Fragmentierung der Nukleinsäuren mit einer durchschnittlichen Länge der RNA-Fragmente von zumeist unter 200 bp45. Daher müssen die Primer so gewählt werden, daß sie möglichst kurze PCR-Produkte generieren45.
Mit der Real-time RT-PCR ist eine absolute und eine relative Quantifizierung der Genexpression möglich. Ziel der absoluten Quantifizierung ist die Ermittlung der genauen Kopienzahl der untersuchten mRNA in der Probe50.
Hierbei werden als externer Standard DNA-Verdünnungsreihen mit bekannten Template- Mengen erstellt. Aus den für die Verdünnungsstufen ermittelten CT-Werten wird eine Standardkurve ermittelt, mit deren Hilfe auf die Menge an Zielgen in der untersuchten Probe rückgeschlossen werden kann.
Die Erstellung einer Standard-Kurve ist aufwendig und beinhaltet Fehlerquellen. Die zur Bestimmung der DNA-Konzentration verwendete OD-Messung weist eine hohe Variabilität auf, zudem ist die Lagerung von Standardlösungen für eine längere Zeit ohne Degradierung vor allem hochverdünnter DNA sehr schwierig45. Die Herstellung einer neuen Standardlösung für jede PCR ist sehr arbeitsintensiv, und die bei jeder Analyse zu messende Standardreihe reduziert die Zahl der pro PCR meßbaren Proben im Gerät.
Gegen die Durchführung einer absoluten Quantifizierung von Nukleinsäuren aus FFPE- Material sprechen aber vor allem die unterschiedliche Fixierungsqualität der Biopsien, die daraus resultierende unterschiedliche Fragmentierung sowie mögliche Verunreinigungen45. Der direkte Vergleich mit den in reiner und unfragmentierter Form vorliegenden Nukleinsäuren eines DNA-Standards wird dadurch sehr problematisch.
Bei der relativen Quantifizierung der Genexpression wird die Expression des Zielgens mit der eines Housekeeping-Gens verglichen. Das Housekeeping-Gen muß als Voraussetzung hierfür zu jedem Zeitpunkt nahezu konstant im zu untersuchenden Gewebe exprimiert werden.
Housekeeping- und Zielgen werden in gleicher Weise durch unterschiedlich suffiziente Fixation oder effiziente RNA-Extraktion und -präparation in Mitleidenschaft gezogen, so daß ein Einfluß dieser Faktoren auf die Meßergebnisse verhindert wird.
Aus diesen Gründen wurde in dieser Arbeit eine relative Quantifizierung mit dem Housekeeping-Gen ß-GUS als internem Standard durchgeführt. Die konstitutive Expression von ß-GUS in neoplastischem und nicht-malignem FFPE-Knochenmark war bereits zuvor demonstriert worden44.
Die relative Quantifizierung wurde mit Hilfe der in 2.8.1. beschriebenen ∆∆CT-Methode durchgeführt43.
Voraussetzung für die relative Quantifizierung war die in 3.1. und 3.2. demonstrierte annähernd gleiche Reaktionseffizienz der verwendeten Primer.
Die CMPE sind durch klinisch-hämatologische und hämatopathologische Gemeinsamkeiten gekennzeichnet, die Ausprägung der Proliferation der einzelnen hämatopoetischen Zellreihen und der klinische Verlauf unterscheiden die Entitäten jedoch. Gegenwärtig werden die CMPE als klonale Erkrankungen einer noch nicht näher definierten pluripotenten hämatopoetischen Stammzelle betrachtet2. Die Klonalität der Hämatopoese kann bei der CML anhand ihres spezifischen Translokationsprodukts BCR-ABL demonstriert werden, bei den Ph-negativen CMPE mit Hilfe verschiedener Klonalitätsassays auf der Basis von X- Chromosom-Inaktivierungsmustern16. Den Ph-negativen CMPE fehlt aber ein definitiver molekularer Marker. Nur bei einem Teil der Patienten werden unspezifische zytogenetische Anomalien gefunden. Welche molekularen Veränderungen zur neoplastischen Trans- formation einer pluripotenten hämatopoetischen Stammzelle führen, ist weiterhin unbekannt.
Während die klonale Hämatopoese den CMPE gemein ist, ist das Knochenmark der manifesten IMF darüberhinaus durch vermehrte Stromazellen wie Fibroblasten und Histiozyten, durch vermehrte extrazelluläre Matrixproteine wie Kollagen, Fibronectin, Vitronectin, Laminin und Tenascin, durch eine gesteigerte Angiogenese und durch eine Osteosklerose gekennzeichnet25. Die Proliferation der Fibroblasten ist polyklonal und ihre funktionellen Eigenschaften gleichen denen von Fibroblasten aus normalem Knochenmark51, sie sind also nicht Teil des neoplastischen Klons.
Es wurden intra- und extrazelluläre Konzentrationsveränderungen von fibrogenen, angio- genen oder osteosklerose-fördernden Zytokinen im Knochenmark von IMF-Patienten gefunden51. Gegenwärtig wird daher davon ausgegangen, daß die Stromareaktion in der IMF ein durch die von der klonalen Hämatopoese sezernierten Zytokine vermittelter reaktiver Prozeß ist52. Sowohl die Megakaryozyten als auch die Monozyten wurden als Quelle dieser Mediatoren vermutet. Die untersuchten Zytokine können zu einer Steigerung der Fibro- blastenproliferation (z.B. Platelet-Derived Growth Factor [PDGF]), der Kollagensynthese (z.B. Transforming Growth Factor-ß [TGF-ß], Calmodulin), der Angiogenese (Vascular Endothelial Growth Factor [VEGF]), der Megakaryozytenproliferation (z.B. basic Fibroblast Growth Factor [bFGF]), der Osteosklerose (TGF-ß, bFGF) sowie zu einem verminderten proteolytischen Abbau von Matrixproteinen (Platelet Factor 4) führen25. Zur Zeit ist es jedoch noch unklar, ob diese veränderte Zytokinproduktion pathogenetisch relevant ist oder eine unspezifische Reaktion auf das neoplastische Geschehen darstellt51.
