Entwicklung eines ACTH-Bioassays;
möglicher Einsatz in der Diagnostik des Caninen Cushing-Syndroms
INAUGURAL - DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Sonja Küster aus Delmenhorst
Hannover 2003
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Hoppen 2. Gutachter: Prof. Dr. Dr. Parvizi
Tag der mündlichen Prüfung:
Inhaltsverzeichnis
Seite Inhaltsverzeichnis... I Abbildungsverzeichnis... IV Tabellenverzeichnis... V Abkürzungsverzeichnis...VII
1. Einleitung... 1
2. Schrifttum... 2
2.1. Adrenocorticotropes Hormon... 2
2.1.1. Struktur, Biosynthese und Sekretion ... 2
2.1.2. Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenachse... 4
2.1.3. Konzentrationsbestimmung... 5
2.1.3.1. Handhabung der Probe... 5
2.1.3.2. Nachweismethoden für ACTH... 6
2.2. Weitere POMC-Peptide... 9
2.2.1. Struktur und Biosynthese... 9
2.2.2. Funktion... 10
2.3. Canines Cushing-Syndrom... 10
2.3.1. Ätiologie und Pathogenese...11
2.3.2. Klinische, klinisch-chemische und röntgenologische Befunde...12
2.3.3. Diagnostik...14
2.3.3.1. Hormonwerte... 14
2.3.3.2. Endokrinologische Funktionstests...17
2.3.4. Therapie... 20
3. Material und Methoden... 24
3.1. Material und Tiere... 24
3.2. Vorversuche zur Blutprobenaufbereitung... 26
3.3. ACTH-Bioassay... 27
3.3.1. Herstellung der Lösungen... 27
3.3.2. Präparation der Nebennieren... 28
3.3.3. Durchführung des ACTH-Bioassays... 30
3.3.4. Verdünnungsreihe zur Erstellung der ACTH-Eichkurve... 31
3.3.5. Überprüfung der Funktionsfähigkeit... 31
3.3.6. Verdünnung der Blutproben... 32
3.4. Analysemethoden... 32
3.4.1. Cortisol-Radioimmunoassay (Cortisol-RIA)... 32
3.4.2. Cortisol- und ACTH-Messung mittels IMMULITE... 33
3.5. Statistische Methoden... 34
4. Ergebnisse... 35
4.1. ACTH-Bioassay... 35
4.1.1. Entwicklung des ACTH-Bioassays... 35
4.1.2. Ermittlung der optimalen Zellkonzentration... 36
4.1.3. Erste llung der ACTH-Eichkurve... 37
4.1.4. Überprüfung der Funktionsfähigkeit... 41
4.1.5. Blutproben-Aufbereitung...42
4.1.6. Beeinflussung durch Serumbestandteile... 44
4.1.7. Kontrollserum... 44
4.2. Cortisol-Radioimmunoassay (Cortisol-RIA)... 45
4.2.1. Probemenge...45
4.2.2. Extraktion der Proben... 45
4.3. Vergleich zwischen der ACTH-Immunreaktivität und der ACTH- Bioaktivität... 46
4.3.1. IMMULITE Cortisol- und ACTH-Gehalte der Blutproben...46
4.3.2. ACTH-Bioaktivität der Blutproben... 48
5. Diskussion... 50
5.1. ACTH-Bioassay... 50
5.1.1. Entwicklung des ACTH-Bioassays... 50
5.1.2. Ermittlung der optimalen Zellkonzentration... 53
5.1.3. Erstellung der ACTH-Eichkurve...53
5.1.4. Überprüfung der Funktionsfähigkeit... 54
5.1.5. Blutproben-Aufbereitung...55
5.1.6. Beeinflussung durch Serumbestandteile... 55
5.1.7. Kontrollserum... 56
5.2. Vergleich zwischen der ACTH-Immunreaktivität und der ACTH- Bioaktivität... 57
5.2.1. IMMULITE Cortisol- und ACTH-Gehalte der Blutproben...57
5.2.2. ACTH-Bioaktivität der Blutproben...57
6. Zusammenfassung... 66
7. Summary...68
8. Literaturverzeichnis...70
9. Tabellenanhang... 81
Abbildungsverzeichnis
Seite Abbildung 1: POMC-Peptidsynthese in der Pars distalis und Pars intermedia... 9 Abbildung 2: Cortisolproduktion bei einer Zellkonzentration von 1,2 x 106
Zellen/ml Zellsuspension... 37 Abbildung 3: Cortisolproduktion bei niedrigen ACTH-Zugaben... 38 Abbildung 4: ACTH-Eichkurven elf verschiedener Bioassays... 39 Abbildung 5: Cortisolproduktion bei geringer, moderater und guter Produktivität
der Zellen... 40 Abbildung 6: ACTH-Eichkurve des Bioassays Nr. 24... 41 Abbildung 7: Cortisolproduktion mit und ohne vorheriger Extraktion der Proben... 46
Tabellenverzeichnis
Seite
Tabelle 1: Klinische Befunde beim caninen Hyperadrenocorticismus... 13
Tabelle 2: Klin.-chem. Befunde beim caninen Hyperadrenocorticismus... 13
Tabelle 3: Normbereiche von Cortisol beim Hund... 14
Tabelle 4: Normbereiche von ACTH beim Hund... 15
Tabelle 5: Qualitätskriterien der verwendeten Hormonassays... 33
Tabelle 6: Cortisol- und ACTH-Gehalte der humanen und porcinen ACTH Lösungen, gemessen im IMMULITE... 41
Tabelle 7: Cortisol- und ACTH-Gehalte vor und nach Einfachextraktion mit verschiedenen Lösungsmitteln... 42
Tabelle 8: Cortisol- und ACTH-Gehalte vor und nach Zweifachextraktion mit 1-Butanol und Ethylacetat... 43
Tabelle 9: bioACTH-Werte der Seren zur Überprüfung eines Serumeffektes... 44
Tabelle 10: Cortisol- und ACTH-Gehalte der untersuchten Blutproben, gemessen im IMMULITE... 47
Tabelle 11: irACTH- und bioACTH-Werte der untersuchten Blutproben... 49
Tabelle A1: Kreuzreaktion des Cortisol-Antikörpers im RIA... 81 Tabelle A2: Spezifität des Antiserums zu ACTH-Fragmenten... 81 Tabelle A3: Kreuzreaktion des Cortisol-Antikörpers im IMMULITE... 82 Tabelle A4: Cortisolproduktion bei 0,4, bis 0,8 x 106 Zellen/ml
Zellsuspension... 83 Tabelle A5: Cortisolproduktion bei 1,2, bis 1,6 x 106 Zellen/ml
Zellsuspension... 84 Tabelle A6: Cortisolproduktion bei unterschiedlichen ACTH-Konzentrationen.. 85 Tabelle A7: Korrelation der ACTH-Eichkurven verschiedener Bioassays... 86 Tabelle A8: Cortisolproduktion bei guter, moderater und geringer
Produktivität der porcinen Nebennierenrindenzellen... 88 Tabelle A9: Cortisolproduktion mit und ohne Extraktion der
Zellsuspensionen im RIA... 88
Abkürzungsverzeichnis
ACTH Adrenokortikotropes Hormon (Kortikotropin)
ADH Antidiuretisches Hormon
ALT Alanin-Amino-Transferase
AP Alkalische Phosphatase
AST Aspartat-Amino-Transferase
AVP Arginin-Vasopressin
bioACTH ACTH-Bioaktivität
BSA Bovines Serumalbumin
CLIP Corticotropin-like intermediate lobe peptide
CRH Corticotropin-Releasing-Hormon
EDTA Ethylendiamintetraazetat
END Endorphin
FBS Fötales Bovines Serum
HEPES 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure
i.m. intramuskulär
irACTH ACTH-Immunreaktivität
i.v. intravenös
LPH Lipotropes Hormon (Lipotropin)
MSH Melanozyten-stimulierendes-Hormon (Melanotropin)
NNR Nebennierenrinde
o,p´-DDD ortho-para-Dichlordiphenyldichlorethan
PBS phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung
POMC Pro-Opiomelanocortin
RIA Radioimmunoassay
RPMI Roswell Park Memorial Institute
1. Einleitung
Das canine Cushing-Syndrom oder caniner Hyperadrenocortizismus ist heutzutage eine der am häufigsten diagnostizierten Endokrinopathien des Hundes.
In über 80% der Fälle ist das Cushing-Syndrom beim Hund hypophysär bedingt mit einer übermäßigen Sekretion des adrenocorticotropen Hormons (ACTH).
In der Literatur wird zur Unterscheidung zwischen hypophysärem und adrenalem Hyperadrenocorticismus häufig die Bestimmung der basalen ACTH-Konzentration empfohlen.
Im hiesigen Labor werden die ACTH-Konzentrationen mit einem Festphasen- Sandwich-Chemilumineszenz-Immunoassay gemessen, der hochspezifisch für intaktes, humanes ACTH1-39 ist. In der Mehrzahl der Proben, bei denen mittels Low- Dose-Dexamethason Hemmtest ein Hyperadrenocorticismus diagnostiziert wurde, sind jedoch, entgegen der Erwartung, nur minimale ACTH-Konzentrationen zu messen.
ROTERMUND (2000) bestätigt dies in ihrer Dissertation, in der lediglich einer von 36 Hunden einen über der Norm befindlichen Basalwert aufweist, und die ACTH- Basalkonzentration von 12 Hunden sogar unterhalb der Nachweisgrenze liegt.
Es stellt sich nun die Frage, inwiefern die Ergebnisse des Immunoassays (irACTH) auch die ACTH-Bioaktivität (bioACTH) zum Ausdruck bringen.
Vor diesem Hintergrund hat die vorliegende Studie folgende Zielsetzung:
• Entwicklung eines ACTH-Bioassays mit porcinen Nebennierenrindenzellen
• Erstellen einer ACTH-Eichkurve zur Bestimmung des bioACTH in caninen Blutproben
• Vergleich zwischen der ACTH-Immunreaktivität und der ACTH-Bioaktivität in caninen Blutproben
2. Schrifttum
2.1. Adrenocorticotropes Hormon
2.1.1. Struktur, Biosynthese und Sekretion
Struktur
ACTH ist ein aus 39 Aminosäuren bestehendes Peptidhormon, dessen N-terminales Ende aus den Aminosäuren 1-18 biologisch aktiv ist (FELDMAN u. NELSON 1996).
Peptide mit weniger als 16 Aminosäuren stimulieren die Nebennierenrinde (NNR) nicht mehr, besitzen jedoch eine erhöhte melanotrope Aktivität (LABHARDT u.
MÜLLER 1978).
Die Aminosäurensequenz ist in den ersten 24 Aminosäuren bei allen bisher untersuchten Spezies identisch. Das canine ACTH unterscheidet sich nur in einer Aminosäure im C-terminalen Ende des Moleküls von dem des Menschen. Beim Menschen befindet sich an der Position 37 die Aminosäure Leucin, während der Hund an dieser Stelle die Aminosäure Valin besitzt (MOL et al. 1991).
Biosynthese
In der Adenohypophyse wird ACTH aus dem Vorläufermolekül Proopiomelanocortin (POMC) synthetisiert. Neben ACTH werden noch viele weitere POMC-Peptide freigesetzt (Kap.2.2.) (RIJNBERK 1996a).
Im Unterschied zum Menschen besitzt die Adenohypophyse des Hundes neben der Pars distalis eine gut ausgebildete Pars intermedia. HALMI et al. (1981) finden in ihren Untersuchungen heraus, dass die Pars intermedia beim Hund aus zwei immunocytochemisch unterschiedlichen Zellarten besteht. Die vorherrschenden A- Zellen sind typische Pars intermedia Zellen (Melanotrope) mit starker Immunoreaktivität für α-Melanotropin (α-MSH; Melanozyten-stimulierendes-Hormon)
und geringer Immunoreaktivität für ACTH. Die in geringerer Zahl vorkommenden B- Zellen gleichen immunocytochemisch den Pars distalis Corticotropen mit hoher Immunoreaktivität für ACTH und β-Lipotropin (β-LPH), jedoch nicht für α-MSH. Sie sind, so vermuten die Autoren, für die hohe ACTH-Bioaktivität der caninen Pars intermedia verantwortlich.
Sekretion
Die ACTH-Sekretion aus der Adenohypophyse wird durch den Hypothalamus und das Zentrale Nervensystem reguliert über Neurotransmitter, die die hypothalamischen Hormone Corticotropin-Releasing-Hormon (CRH) und Arginin- Vasopressin (AVP), auch bekannt als Antidiuretisches Hormon (ADH), freisetzen (VAN WIJK et al. 1994).
Nach RIJNBERK (1996a) können vier Mechanismen der neuroendokrinen Kontrolle unterschieden werden:
1. die episodische Sekretion 2. Streßreaktionen
3. Feedbackhemmung durch Cortisol 4. immunologische Faktoren
Bei der episodischen ACTH-Sekretion, die im Gegensatz zum Menschen jedoch keinen zirkadianen Verlauf aufweist, variieren die Frequenz und Amplitude der Sekretions-Peaks individuell stark und sind im allgemeinen bei Hündinnen häufiger und größer als bei Rüden (KEMPPAINEN u. SARTIN 1984). Streßreaktionen haben ihren Ursprung im Zentralen Nervensystem und führen über eine erhöhte Freisetzung von CRH und AVP zur Stimulation der ACTH-Sekretion. An der Feedbackhemmung durch Glucocorticoide sind zwei verschiedene Rezeptormoleküle beteiligt, die Mineralocorticoidrezeptoren (MR) und die Glucocorticoidrezeptoren (GR). Die Hemmung der ACTH-Sekretion durch Glucocorticoide wird vorwiegend durch die MRs vermittelt. Die GRs spielen vor allem bei der Feedbackhemmung nach Streßreaktionen eine Rolle (RIJNBERK 1996a).
Nach REUL et al. (1991) kommt es bei alten Hunden zu einer progressiven Dysfunktion der Hypothalamus-Hypophysen-Nebenierenachse mit erhöhten basalen ACTH- und Cortisolkonzentrationen. Den Grund dafür sehen die Autoren in einer Abnahme der MRs bei alten Hunden um 50-75%.
Bei den immunologischen Faktoren sollen vor allem die Cytokine eine Rolle spielen.
Dabei handelt es sich um Polypeptide, die von aktivierten Immunzellen freigesetzt werden. Nach BUCKINGHAM et al. (1992) erhöht insbesondere das von aktivierten Makrophagen produzierte Interleukin-1 die ACTH-Freisetzung.
2.1.2. Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenachse
Die Hypothalamus-Hypophysen-Nebenierenachse ist gekennzeichnet durch stimulierende Hormone und negative Feedbackkontrolle.
Der paraventrikuläre Nukleus des Hypothalamus synthetisiert CRH und AVP, welche über das hypothalamisch-hypophysäre Portalsystem zum Hypophysenvorderlappen gelangen und dort die Corticotropen zur ACTH-Freisetzung anregen. ACTH stimuliert die Synthese und Sekretion von Cortisol aus den Zellen der Zona fasciculata und Zona reticularis der NNR. Die Glucocorticoide regulieren wiederum die ACTH- Freisetzung durch negativen Feedback sowohl am Hypothalamus als auch an der Hypophyse.
ZERBE (1999) weist darauf hin, dass beim Hund nicht nur diese klassisch definierte Achse eine Rolle spielt, sondern auch die Vorgänge an der Pars intermedia beachtet werden müssen. Die Pars intermedia ist weniger gut durchblutet und wird vor allem direkt neuroendokrin durch dopaminerge Hemmung und β-adrenerge bzw.
serotinerge Stimulation reguliert (KRIEGER 1983). Des weiteren haben laut KEMPPAINEN et al. (1989) Somatostatin, Norepinephrin und Epinephrin eine hemmende Wirkung. Die ACTH-Sekretion in der Pars intermedia unterliegt nicht der negativen Feedbackkontrolle durch Glucocorticoide (PETERSON et al. 1986;
KEMPPAINEN et al. 1989).
ACTH reguliert nicht nur die Synthese der corticosteroiden Hormone, sondern ebenso das Wachstum und die Replikation der corticalen Zellen. Ein ACTH-Mangel führt zur Atrophie, ein ACTH-Überschuß zu Hyperplasie und Hypertrophie der NNR (GILL 1972).
ORTH u. KOVACS (1998) bezeichnen die Einleitung der Cortisolbiosynthese als akuten ACTH-Effekt, der innerhalb von Minuten seine Wirkung entfaltet, und das Wachstum der NNR-Zellen als chronischen Effekt, welcher Stunden oder Tage benötigt.
Die Zona fasciculata bildet eine funktionelle Einheit mit der Zona reticularis. In diesen beiden Zonen der NNR werden Glucocorticoide (Cortisol und Corticosteron) und Androgene produziert. Der äußeren Zona glomerulosa fehlt das Enzym 17α- Hydroxylase, so dass hier keine Glucocorticoide, sondern Mineralocorticoide (vor allem Aldosteron) gebildet werden.
ACTH bindet an Rezeptoren, über die in der Zelle aus Lipoproteinen freies Cholesterol freigesetzt wird. Cholesterol ist die Ausgangssubstanz der Steroidbiosynthese und wird über mehrere Zwischenstufen, unter anderem Pregnenolon und Progesteron, zu allen anderen Steroidhormonen umgebildet.
Verschiedene Cytochrom P-450 Enzyme katalysieren diese Umwandlungen. Da in den Zellen der NNR kein Cortisol gespeichert werden kann, setzt die Synthese unmittelbar nach der Stimulation ein (RIJNBERK 1996a).
2.1.3. Konzentrationsbestimmung
2.1.3.1. Handhabung der Probe
Die Handhabung der Probe, von der Blutentnahme über den Versand bis hin zur Lagerung, hat einen großen Einfluß auf die gemessene ACTH-Konzentration.
Eine große Bedeutung hat dabei die Halbwertzeit des im Blut zirkulierenden ACTHs, wobei zwischen der biologischen und der immunreaktiven Halbwertzeit unterschieden wird. Die immunreaktive Halbwertzeit ist abhängig von der Aminosäurensequenz, die der jeweilige im Testverfahren eingesetzte Antikörper
erkennt. Die biologische Halbwertzeit des ACTHs ist kürzer als die immunreaktive und beträgt nur wenige Minuten. (BESSER et al. 1971).
Nach STOUFFER u. LIPSCOMB (1963) bindet ACTH reversibel an Glasoberflächen, woraus falsch niedrig gemessene ACTH-Konzentrationen resultieren. KEMPPAINEN et al. (1994) finden jedoch lediglich unerhebliche Unterschiede im ACTH-Gehalt zwischen Plastik- und Glasröhrchen.
DUPPOUY et al. (1985) berichten, dass Heparin die ACTH-Messung beeinflusst. Es bindet entweder direkt an die ACTH-Moleküle und/oder führt zur Aggregation der ACTH-Moleküle. Dies führt zu einer reduzierten Bindung von Antigen und Antikörper und folglich zu falsch hoch gemessenen ACTH-Konzentrationen. HEGSTAD et al.
(1990) bestätigen dies und dokumentieren höhere ACTH-Konzentrationen in Heparin-Plasma im Vergleich zu EDTA-Plasma.
Proteolytische Enzyme bewirken eine Instabilität von ACTH in Blut und Plasma (REES et al. 1976). In Vollblut ist ACTH weniger stabil als in Plasma (BESSER et al.
1971). Bei dem enzymatischen Zerfall entstehen ACTH-ähnliche Fragmente, die, je nach verwendetem Antikörper, an diesen binden oder nicht. Dies kann zu falsch hohen oder falsch niedrigen ACTH-Konzentrationen führen (DUPOUY et al. 1985).
Der enzymatische Abbau des Polypeptids ACTH erfolgt durch Proteasen, den sog.
Kallikreinen (MUTSCHLER 1991). Aprotinin ist ein Proteasenhemmer, der die Aktivität von Kallikrein und anderen proteolytischen Enzymen hemmt (GEBHARD et al. 1986).
BESSER et al. (1971) berichten, dass Aprotinin sowohl die biologische als auch die immunreaktive Halbwertzeit von ACTH verlängert. KEMPPAINEN et al. (1994) dokumentieren deutliche Konzentrationsunterschiede zwischen zusatzfreien und aprotininversetzten Proben nach eintägiger Lagerung. Nach Meinung von HEGSTAD et al. (1990) macht der Zusatz von Aprotinin jedoch keinen nennenswerten Unterschied.
Nach ROTERMUND (2000) ist der Einfluß von Aprotinin auf die ACTH-Konzentration bei Lagertemperaturen von –22 und 6°C unwesentlich. Signifikant wird der Unterschied bei einer Lagerung bei 20°C.
Die Lagertemperatur spielt eine wesentliche Rolle für den enzymatischen Zerfall des
ACTHs. Daher empfehlen ORTH (1979), PETERSON (1984) und FELDMAN u.
NELSON (1996) die Entnahme in gekühlte Röhrchen, Transport auf Eis und Zentrifugation bei 4°C.
HEGSTAD et al. (1990) können nach 90 Minuten bei 4°C oder Raumtemperatur (22- 25°C) keine signifikanten Unterschiede in der ACTH-Konzentration beobachten.
ROTERMUND (2000) fasst in Ihrer Dissertation zusammen: Die Stabilität des ACTH ist bei niedrigen Lagertemperaturen und/oder Aprotininzusatz deutlich höher.
Neben dem enzymatischen Abbau können auch Veränderungen der chemischen Struktur des ACTH-Moleküls, z.B. durch Acetylierung oder Oxidation einzelner Aminosäuren, sowohl die biologische als auch die immunreaktive Aktivität verringern (ORTH 1979).
HEGSTAD et al. (1990) empfehlen die Entnahme in EDTA-Röhrchen, Zentrifugation innerhalb von 15 bis 90 Minuten und Aufbewahrung in Plastikgefäßen bei –20°C für maximal einen Monat.
ROTERMUND (2000) empfiehlt für den Versand, zunächst 500 KIE Aprotinin (Trasylol) in EDTA-Röhrchen vorzulegen und diese bei –18°C bis zur Blutentnahme aufzubewahren. Nach Zentrifugation innerhalb 90 Minuten sollte der Versand in einem mit Kühlflüssigkeit gefüllten Kühlkontainer erfolgen.
2.1.3.2. Nachweismethoden für ACTH
a) Immunoassays
Immunoassays sind Meßverfahren, welche die spezifische Bindungsreaktion zwischen Antikörpern und dem gesuchten Analyt nutzen.
Der in der Literatur am häufigsten beschriebene Immunoassay zum Nachweis von ACTH ist der Radioimmunoassay (RIA) (BERSON u. YALOW 1968; ORTH 1979;
GUTKOWSKA et al. 1982). RIAs sind hochempfindliche Nachweisverfahren für Eiweißverbindungen im Piko- oder Nanogrammbereich. Das Grundprinzip besteht in der Konkurrenz zwischen radioaktiv markiertem Hormon und dem unmarkierten nachzuweisenden Hormon der Probe hinsichtlich der spezifischen Bindung an einen
im Unterschuß vorliegenden Antikörper. Daher wird der RIA auch häufig als kompetitive Analyse bezeichnet. Mit steigender Hormonkonzentration der Probe verringert sich die gemessene Radioaktivität.
Den Vorteil des RIAs im Vergleich zum Bioassay sehen GUTKOWSKA et al. (1982) in der höheren Sensitivität, dem geringeren Zeitaufwand und der Möglichkeit, viele Proben in einem Ansatz messen zu können. Jedoch weisen sie auf die Erkenntnisse von BESSER et al. (1971) hin, dass die biologischen und immunreaktiven Eigenschaften von ACTH mit unterschiedlichen Abschnitten des Moleküls in Zusammenhang stehen.
Ein automatisiertes System zur Messung der ACTH-Konzentration bietet der IMMULITE. Dieser von BABSON (1991) beschriebene Festphasen-Sandwich- Chemilumineszenz-Immunoassay (Chemiluminescent Enzyme Immunometric Assay
= CEA) stellt ein nichtkompetitives Verfahren dar, welches mit einem Reagenzüberschuß arbeitet. Ein spezifischer Antikörper bildet die Festphase, an die das nachzuweisende Hormon bindet. Ein zweiter, mit einem Enzym markierter Antikörper bindet an eine zweite Bindungsstelle des Hormons. Nun wird ein Chemilumineszenzsubstrat hinzugefügt, welches durch das Enzym zur Lichtemission angeregt wird. Die Stärke der gemessenen Lichtemission ist der gesuchten Hormonkonzentration direkt proportional.
b) ACTH-Bioassay
Der Begriff Bioassay beschreibt die Untersuchung der Reaktion lebender Versuchsobjekte auf bestimmte dosisabhängige Faktoren. Daraus resultiert eine spezifische Dosis-Wirkungs-Beziehung. Für ACTH wurden zahlreiche biologische Nachweisverfahren entwickelt, die verschiedene biologische Effekte dieses Hormons nutzen. Die ACTH-Aktivität kann anhand lebender Versuchstiere, Nebennieren oder NNR-Zellkulturen untersucht werden mittels Messung der Ascorbinsäure- vermindernden oder der corticosteroiden Aktivität (GUTKOWSKA et al. 1982). Die Autoren erwähnen des weiteren Redoxassays, die darauf basieren, dass ACTH in der NNR reduzierende Gruppen vermindert, sowie Radiorezeptorassays, in denen adrenocorticale Zellrezeptoren verwendet werden. Am häufigsten werden in der
Literatur zur Messung des bioACTH NNR-Zellkulturen beschrieben. Verwendet werden vor allem Zellen von Meerschweinchen (LAMBERT et al. 1983;
ROBERTSON u. BIDEY 1990; O`CONNELL et al. 1992) oder Ratten (GASSON 1979; BATEMAN 1986; SZALAY 1993), seltener von Schafen und Rindern (CATHIARD et al. 1985) oder Menschen (EGGENS et al. 1987). Gemessen wird die ACTH-Bioaktivität in diesen Studien anhand der Cortisolproduktion.
2.2. Weitere POMC-Peptide
2.2.1. Struktur und Biosynthese
Die POMC-Peptide werden alle aus dem gemeinsamen Vorläufermolekül Proopiomelanocortin (POMC) freigesetzt, welches sowohl in der Pars distalis als auch in der Pars intermedia der caninen Adenohypophyse synthetisiert wird. Nach RIJNBERK (1996a) werden ACTH und β-LPH in den A-Zellen der Pars intermedia weiter prozessiert zu α-MSH (ACTH1-13) und CLIP (corticotropin-like intermediate lobe peptide, ACTH18-39) bzw γ-LPH und β-END (β-Endorphin):
Pars distalis
Pars intermedia
Abb.1: POMC-Peptidsynthese in der Pars distalis und Pars intermedia (modifiziert nach RIJNBERK 1996a)
FELDMAN u. NELSON (1996) berichten, dass sowohl β-LPH als auch β-END die gleiche Sekretionsdynamik aufweisen wie ACTH.
Das aus den Aminosäuren 1-76 bestehende N-terminale Ende des POMC-Moleküls
N-POMC 1-76 J Peptid ACTH 1-39 β-LPH
N-POMC 1-48 γ3-MSH J Peptid α-MSH CLIP γ-LPH β-END
wird in der Literatur zum Teil bezeichnet als 16k-Fragment (PEDERSEN et al. 1980;
PHAM-HUU-TRUNG et al. 1986) oder als pro-γ-MSH (LOH u. LORIAUX 1982;
LOWRY et al. 1987) und wird in der Pars intermedia weiter prozessiert, wobei unter anderem γ3-MSH entsteht.
α-MSH, das bei allen bisher untersuchten Spezies identisch ist, besteht aus 13 Aminosäuren, die mit den ersten 13 Aminosäuren von ACTH übereinstimmen.
β-MSH, das aus einem weiteren Abbau von γ-LPH entsteht, besteht bei den meisten Tieren aus 18 Aminosäuren (LABHARDT u. MÜLLER 1978).
2.2.2. Funktion
Die physiologische Funktion der meisten POMC-Peptide ist nicht bekannt (RIJNBERK 1996a). Lediglich einigen MSH-Arten und dem β-END können bestimmte Eigenschaften zugeordnet werden:
Nach ORTH u. KOVACS (1998) sind α-, β-, und -γ-MSH melanocytenstimulierende Hormone, welche diese Zellen zur Melaninsythese anregen LOWRY et al. (1987) beschreiben einen mitogenen Effekt des pro-γ-MSH auf die NNR. Des weiteren potenziert es laut PEDERSEN et al. (1980) die ACTH-Wirkung auf die Steroid- biosynthese. β-END spielt eine wichtige Rolle als endogenes Peptid mit opioiden Eigenschaften (MOL et al. 1991).
2.3. Canines Cushing-Syndrom
Das canine Cushing-Syndrom oder caniner Hyperadrenocorticismus, entsteht durch die exzessive endogene Produktion oder die exogene Zuführung von Glucocorticoiden und ist eine der am häufigsten diagnostizierten Endokrinopathien des Hundes (HERRTAGE 1996).
2.3.1. Ätiologie und Pathogenese
Die unterschiedlichen Ursachen des caninen Cushing-Syndroms werden in der Literatur folgendermaßen klassifiziert (FELDMAN 2000):
1. hypophysäres Cushing-Syndrom
verursacht entweder durch einen Tumor der Hypophyse (Morbus Cushing) oder durch eine Hypothalamus-Fehlfunktion mit gesteigerter CRH-Sekretion und nachfolgender Hyperplasie der Hypophyse. In beiden Fällen führt die exzessive ACTH-Sekretion zu einer sekundären Hyperplasie der NNR.
2. adrenales Cushing-Syndrom
infolge einer primären NNR-Erkrankung mit gesteigerter Cortisolproduktion . 3. iatrogene Ursachen
durch überhöhte ACTH- (selten) oder Glucocorticoid-Medikation (häufig).
Eine ektopische ACTH-Produktion, wie beim Menschen beschrieben, ist beim Hund bisher nicht dokumentiert worden.
Sehr selten treten Tumore der Hypophyse und der NNR gemeinsam auf.
PETERSON (1984) hält es für möglich, dass sich ein adrenaler Tumor unter bestimmten Umständen sekundär aufgrund der anhaltend vermehrten Stimulation durch ACTH entwickelt. MEIJER (1980) fand in seinen Untersuchungen heraus, dass etwa 80% der spontanen Erkrankungen hypophysär bedingt sind, wobei in 20%
dieser Fälle ein Hypophysentumor entdeckt wurde. Es können sowohl Tumore der Pars distalis als auch der Pars intermedia zugrunde liegen. PETERSON et al.
(1982a) finden bei 21 am Cushing-Syndrom erkrankten Hunden 15 (71%) mit Tumoren der Pars distalis und sechs (29%) mit Tumoren der Pars intermedia. Dabei können die Tumore der Pars intermedia sowohl von den A-Zellen als auch von den B-Zellen ausgehen (PETERSON et al. 1986).
Es können alle Rassen betroffen sein, prädisponiert sind Toy-Pudel, Dackel und Boxer. Laut HERRTAGE (1996) sind auch kleine Terrier, Yorkshire- und Jack Russel-Terrier sowie Staffordshire Bullterrier häufiger betroffen. Der hypophysäre Morbus Cushing ist eine Erkrankung der mittelalten und alten Hunde, wobei das durchschnittliche Alter bei Diagnosestellung sieben Jahre beträgt. Weibliche Tiere
scheinen häufiger betroffen zu sein als männliche (MEIJER 1980).
PETERSON et al. (1982a) konnten in einer Untersuchung mit immuncytochemischer Färbung bei 80% der Hunde mit hypophysärem Cushing-Syndrom Hypophysen- adenome nachweisen. Dabei handelt es sich für gewöhnlich um < 1cm große Mikroadenome. Makroadenome mit einem größeren Durchmesser zeigen häufig ein langsames Wachstum und führen nur in wenigen Fällen zu neurologischen Symptomen. Maligne Hypophysentumore sind selten (HERRTAGE 1998).
Die restlichen 20% der Erkrankungen beruhen auf in der Regel unilateral auftretenden, gut- oder bösartigen, Tumoren der NNR. Diese Tumore sind häufig autonom, d.h. die Cortisolproduktion erfolgt unabhängig von der hypophysären ACTH-Stimulation. Deutlich wird dies anhand der Atrophie der nicht betroffenen NNR. Beim adrenalen Cushing-Syndrom gibt es keine Rassenpräferenz. Es sind vor allem alte Hunde mit einem durchschnittlichen Alter von 10 bis 11 Jahren betroffen, wobei Hündinnen dreimal häufiger erkranken als Rüden (MEIJER 1980).
Tumore der NNR kommen bei großen Hunderassen häufiger vor. Adenome der NNR sind klein und nicht invasiv, während Karzinome meist groß, lokal invasiv, hämorrhagisch und nekrotisch sind. Häufig bilden sich Leber-, Lungen- und Nierenmetastasen. In beiden Fällen kommt es bei etwa 50% der Hunde zu partiellen Verkalkungen (HERRTAGE 1998).
2.3.2. Klinische, klinisch-chemische und röntgenologische Befunde
Das Cushing-Syndrom entwickelt sich meist schleichend über mehrere Monate oder Jahre und wird von den Besitzern anfangs meist als normaler Alterungsprozeß betrachtet. Die klinischen Symptome sind vielfältig und können auch intermittierend oder progressiv auftreten (PETERSON et al. 1982b).
Die klinischen und klinisch-chemischen Befunde (Tabellen 1 und 2) sind das Resultat der metabolischen Effekte eines über längere Zeit andauernden Hypercortisolismus (MEIJER 1980).
Tab.1: Klinische Befunde beim caninen Hyperadrenocorticismus (nach MEIJER 1980)
Klinische Befunde % der Fälle
Vergrößertes Abdomen 95
Hepatomegalie 90
Hautatrophie 90
Polydypsie/Polyurie/Polyphagie 85
Geringe Widerstandskraft gegenüber Anstrengungen 80
Muskelatrophie 70
Vermehrtes Hecheln 70
Lethargie 65
Verfettung 55
Intoleranz gegenüber warmer Umgebung 40
Exophthalmus 30
Anöstrus 85
Hodenatrophie 60
Tab.2: Klin.-chem. Befunde beim caninen Hyperadrenocorticismus (nach MEIJER 1980)
Klinisch-chemische Befunde % der Fälle
Erhöhte Alkalische Phosphatase (AP) 90
Eosinopenie 90
Lymphopenie 75
Neutrophilie 60
Erhöhte Alanin-Amino-Transferase (ALT) 50
Erhöhte Aspartat-Amino-Transferase (AST) 30
Hyperglycämie 30
Hyperglycämie/Glucosurie 10
Hypokaliämie 5 (hypophysär),
45 (adrenal)
Hypernatriämie 30
Erniedrigtes Thyroxin (T4) 50
Die Hautveränderungen können mit einer Komedonenbildung durch Verstopfung der Haarfollikel oder, in selteneren Fällen, mit einer Hyperpigmentierung oder Kalzifizierung der Haut (Calcinosis cutis) einhergehen (HERRTAGE 1998).
Röntgenologisch werden laut MEIJER (1980) v.a. eine Hepatomegalie mit erhöhter Röntgendichte des Lebergewebes, Osteoporose sowie die Kalzifikation verschiedener Gewebe, insbesondere der Bronchien und der Haut, beobachtet.
Laut HERRTAGE (1998) erhöht sich die Alkalische Phosphatase gewöhnlich um das 5-40 fache des Normwertes und ist vermutlich einer der zuverlässigsten Indikatoren eines Cushing-Syndroms.
2.3.3. Diagnostik
2.3.3.1. Hormonwerte
Aufgrund der episodischen Sekretion sowohl des Cortisols als auch des ACTHs hat die Einzelwert-Bestimmung zu einem beliebigen Zeitpunkt keinen diagnostischen Wert, da sich die basalen Hormonwerte von gesunden und am Cushing-Syndrom erkrankten Hunden stark überschneiden. Einige Normwerte von Cortisol und von ACTH beim Hund sind in den Tabellen 3 und 4 angeführt. Die Werte variieren geringfügig entsprechend den angewandten Nachweisverfahren bzw. der verwendeten Antikörper.
Cortisol-Normbereiche
Tab. 3: Normbereiche von Cortisol beim Hund
Autor Cortisol (ng/ml) Anzahl der Hunde
KEMPAINEN u. ZERBE (1989) 5-40 Keine Angabe
Zentrumsabteilung für Chemische Analytik und Endokrinologie (2003)
15-35 Routinelabor
PETERSON et al. (1986) 5-50 160
OWENS u. DRUCKER (1977) 17-38 19
FELDMAN (2000) 5-60 Keine Angabe
Basale Cortisol-Konzentrationen bei Hunden mit Cushing-Syndrom
Die exzessive Cortisolsekretion bei erkrankten Hunden kann nur ungenügend durch die Messung der Basalkonzentration erfasst werden, da die meisten Hunde aufgrund der episodischen Sekretion häufig Cortisolwerte innerhalb des Normbereiches aufweisen. Über den gesamten Tag gesehen wird jedoch vermehrt Cortisol produziert (FELDMAN 2000). PETERSON (1984) bestätigt dies und berichtet ebenfalls, dass die Cortisolbasalkonzentrationen bei Hunden mit Hyperadreno- corticismus häufig innerhalb des Normbereiches liegen. Zudem können auch nicht am Cushing-Syndrom erkrankte Hunde zum Teil erhöhte Cortisolwerte aufweisen. So ist beispielsweise allgemein bekannt, dass Antiepileptika häufig zu einer Erhöhung der Cortisolbasalwerte führen. Des weiteren kann eine Vorbehandlung mit synthetischen Glucocorticoiden wie z.B. Prednisolon oder Prednison aufgrund von Kreuzreaktivitäten mit dem Cortisol-Assay zu falsch hohen Werten führen (KEMPPAINEN u. ZERBE 1989).
ACTH-Normbereiche
Tab.4: Normbereiche von ACTH beim Hund
Autor ACTH (pg/ml) Anzahl der Hunde
PETERSON et al. (1986) 10,0 – 115,0 160
KEMPAINEN u. ZERBE (1989) 10,0 – 70,0 Keine Angabe HEGSTAD et al. (1990) 10,0 – 70,0 Keine Angabe
VAN WIJK et al. (1994) 20,0 – 125,0 16
HERRTAGE (1998) 20,0 – 80,0 Keine Angabe
FELDMAN u. NELSON (1996) 10,0 – 110,0 Keine Angabe
Basale ACTH-Konzentrationen bei Hunden mit Cushing-Syndrom
Generell sind beim hypophysären Morbus Cushing sowohl die Frequenz als auch die Amplitude der ACTH-Sekretions-Pulse chronisch erhöht (FELDMAN 2000).
Allerdings findet man zu den ACTH-Basalkonzentrationen bei erkrankten Hunden in der Literatur sehr vielfältige Angaben. Aufgrund der verschiedenen verwendeten Analyse-Verfahren ist es nahezu unmöglich, die unterschiedlichen Angaben
miteinander zu vergleichen.
So untersucht FELDMAN (1983) 57 Hunde mit caninem Hyperadrenocorticismus und bestimmt die ACTH-Konzentration im Plasma mittels RIA. Dabei weisen 12 Hunde, die nachweislich einen adrenalen Tumor haben, ACTH-Konzentrationen von <36 pg/ml auf, während die ACTH-Konzentrationen der 45 Hunde mit hypophysärem Cushing-Syndrom zwischen 29 bis 340 pg/ml liegen. Nach FELDMAN und NELSON (1996) besteht bei Konzentrationen <10,0 pg/ml der Verdacht auf einen adrenocorticalen Tumor, während 90% der untersuchten Hunde mit einem hypophysären Cushing-Syndrom ACTH-Werte >45,0 pg/ml aufweisen. Den Autoren zufolge zeigen 35% dieser Tiere Werte >100,0 pg/ml.
ORTH et al. (1988) entnehmen bei einem erkrankten Hund innerhalb von 24 Stunden alle 30 Minuten Blut und stellen starke Schwankungen zwischen 10,0 und 250,0 pg/ml fest. PETERSON et al. (1986) dokumentieren ACTH-Konzentrationen, die im Mittel zwar 2,5 bis 5 mal höher sind als in gesunden Hunden, allerdings überschneiden sich viele Einzelwerte beträchtlich mit den Normalwerten. Die Ergebnisse von ORTH et al. (1988) und PETERSON et al. (1986) bringen die Problematik, die sich durch die episodische Sekretion des ACTHs ergibt, deutlich zum Ausdruck.
Im Unterschied zu den oben genannten Autoren ermittelt ROTERMUND (2000) in ihrer Dissertationen bei Hunden mit Hyperadrenocorticismus (n=36) eine mittlere Basalkonzentration, die unter jener gesunder Tiere liegt. Sie verwendet in ihrer Arbeit das automatisierte IMMULITE-System, das fast ausschließlich intaktes ACTH1-39
erfasst. Dabei befinden sich 34% ihrer Werte unter 10,0 pg/ml, 46% zwischen 10,0 und 45,0 pg/ml, 17% über 45,0 pg/ml und nur 3% über 100,0 pg/ml.
Cortisol-Creatinin-Ratio im Urin
Laut KOLEVSKA und SVOBODA (2000) liegen über 90% des im Blut zirkulierenden Cortisols in gebundener Form vor. Das restliche Cortisol in freier, physiologisch aktiver Form, wird über den Urin ausgeschieden. HERRTAGE (1998) erläutert, dass sich bei erhöhten Cortisolkonzentrationen im Blut auch die Konzentrationen im Urin erhöhen. Indem man die Cortisolkonzentration (in µmol/l) in Relation zur
Creatininkonzentration (in µmol/l) angibt, können Unterschiede in der Konzentrierung des Urins korrigiert werden, sofern die Nierenfunktion nicht beeinträchtigt ist. Die Messung des Cortisol-Creatinin-Ratio erfolgt im Morgenurin. Bei Hunden mit Hyperadrenocorticismus liegen die Werte über der Norm (>10 x 10-6). Nach FELDMAN (2000) zeichnet sich die Bestimmung des Cortisol-Creatinin-Ratio im Urin durch eine hohe Sensitivität aus, d.h. Hunde mit Hyperadrenocorticismus zeigen abnorm hohe Werte. Allerdings ist sie nicht sehr spezifisch, da viele anderweitig erkrankten Tiere ebenfalls keine normalen Werte aufweisen. Der Autor findet abnorme Werte bei Hunden mit Diabetes mellitus, Diabetes insipidus, Pyometra, Hypercalcämie und Lebererkrankungen.
2.3.3.2. Endokrinologische Funktionstests
Das klassische Bild des caninen Cushing-Syndroms mit dem typischen cunshingoiden Habitus, wie es die Lehrbücher vermitteln, wird in der Praxis nur selten beobachtet. Oft sind die Symptome unspezifisch und zeigen sich nur vereinzelt. Daher sind endokrinologische Funktionstests zur Abklärung des Vorliegens eines Hyperadrenocorticismus unverzichtbar.
Die Differenzierung zwischen hypophysär und adrenal bedingten Erkrankungen ist oftmals schwierig. Empfohlen werden in der Literatur die Durchführung eines High- Dose-Dexamethason Hemmtestes, die Messung der endogenen ACTH- Konzentrationen oder bildgebende Untersuchungsmethoden (Ultraschall, Computer- tomographie oder Magnetresonanztomographie) der Nebennieren (FELDMAN 1983;
PETERSON 1984).
ACTH-Stimulationstest
Der ACTH-Stimulationstest wird angewandt zur Diagnose des Hyperadreno- corticismus, zur Unterscheidung zwischen spontanem und iatrogenem Cushing- Syndrom, zur Diagnose eines Morbus Addison sowie zur Kontrolle einer Lysodren- Therapie.
Durch Zufuhr einer maximal stimulierenden ACTH-Dosis (1,0 ml pro Tier
Tetracosapeptid β1-24, Synacthen-Injektionslösung, Novartis Pharma GmbH, Nürnberg) wird die Sekretionskapazität der NNR-Zellen überprüft. Übersteigt die daraus resultierende Cortisolkonzentration einen bestimmten Wert (abhängig von der jeweiligen Messmethode), bei gleichzeitigem Vorhandensein klinischer Symptome, spricht dies für das Vorliegen eines endogenen Hyperadrenocorticismus. Dabei ist nicht der prozentuale Anstieg zu bewerten, sondern die Absolutwerte. Beim iatrogenen Cushing-Syndrom ist die Antwort auf die Stimulation wie auch beim Morbus Addison und bei der Lysodren-Therapie erniedrigt.
Laut HERRTAGE (1996) können mit diesem Test >50% der Hunde mit einem adrenalen und etwa 85% der Tiere mit einem hypophysären Cushing-Syndrom erfaßt werden, jedoch kann der Test nicht zuverlässig zwischen beiden differenzieren. Des weiteren hat der Autor abnormale Reaktionen auf ACTH beim Diabetes mellitus und beim Vorliegen einer Pyometra beobachtet. Schließlich zeigen ca. 15-20% der Hunde mit Hyperadrenocorticismus eine normale Reaktion auf ACTH (KEMPPAINEN u. ZERBE 1989). FELDMAN (2000) spricht sogar von 30-40% falsch negativen Ergebnissen.
Im hiesigen Labor wird von der Durchführung eines ACTH-Stimulationstestes zur Diagnostik eines Hyperadrenocorticismus aufgrund der geringen Zuverlässigkeit abgeraten. Wir empfehlen diesen Test zur Einschätzung des noch vorhandenen stimulierbaren NNR-Gewebes bei Verdacht auf Vorliegen eines Morbus Addison und zur Überprüfung der Lysodren-Therapie.
Low-Dose-Dexamethason Hemmtest
Dies ist ein weiterer Screening-Test zur Diagnose eines endogenen Hyperadrenocorticismus. Iatrogen bedingte Erkrankungen können durch diesen Test jedoch nicht erfasst werden, da die endogenen Cortisolkonzentrationen bereits durch die über längere Zeit exogen zugeführten Glucocorticoide gedrückt sind.
Nach Entnahme einer Basalblutprobe erfolgt die Injektion von 0,02 mg/kg KGW Dexamethason-Natrium-Phosphat i.v. (Dexamethason-Injektionslösung ad us. vet., cp-pharma, Burgdorf). Über die negative Feedbackkontrolle wird dadurch ACTH und nachfolgend das endogene Cortisol supprimiert. Die Diagnose Cushing-Syndrom
wird gestellt, wenn die Cortisolkonzentration nach 4 und 8 Stunden nicht ausreichend erniedrigt wird. Im hiesigen Labor erwarten wir bei gesunden Tieren eine Supprimierung auf Werte unterhalb der Nachweisgrenze des Assays (<2,0 ng/ml).
Liegen die supprimierten Werte höher, kann bei gleichzeitigem Vorhandensein der entsprechenden Symptomatik von dem Vorliegen eines Hyperadrenocorticismus ausgegangen werden.
Dieser Test ist laut HERRTAGE (1996) zuverlässiger als der ACTH-Test, da er in allen Fällen von adrenalem und bei 90-95% der Hunde mit einem hypophysären Hyperadrenocorticismus die Diagnose erbringt. Wenn die Cortisolkonzentration im 4- Stunden-Wert deutlich supprimiert ist, im 8-Stunden-Wert jedoch wieder ansteigt, spricht dies PETERSON (1984) und FELDMAN (2000) zufolge für eine hypophysäre Ursache des Cushing-Syndroms. 20% der Hunde mit hypophysärer Ursache zeigen jedoch wie Hunde mit adrenalen Tumoren keine nennenswerte Suppression.
Im hiesigen Labor wird dieser Test zur Diagnostik eines Hyperadrenocorticismus empfohlen. Da jedoch auch andere Grunderkrankungen (z.B. Diabetes mellitus) die Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenachse und somit die Ergebnisse dieses Testes beeinflussen können, weisen wir darauf hin, das Testergebnis immer nur im Zusammenhang mit der vorliegenden klinischen Symptomatik zu bewerten.
High-Dose-Dexamethason Hemmtest
Dieser Test dient der Differenzierung zwischen adrenalem und hypophysärem Cushing-Syndrom. Beim hypophysären Cushing-Syndrom hemmt die hohe Dexamethason-Dosis (0,1 mg/kg) über das negative Feedback die ACTH-Sekretion der Hypophyse und führt zu einem Abfall des Cortisolspiegels. Da Tumore der NNR häufig autonom sind, wird die Cortisolsekretion in diesen Fällen nicht unterdrückt.
Jedoch zeigen in den Untersuchungen von KEMPPAINEN u. ZERBE (1989) 20% der Hunde mit hypophysär bedingtem Hyperadrenocorticismus keine Suppression durch hohe Dosen Dexamethason.
PETERSON et al. (1986) finden einen signifikanten (p<0,05) Unterschied in der Sensitivität zu hohen Dexamethason-Dosen zwischen Hunden mit Tumoren der Pars distalis und solchen mit Tumoren der Pars intermedia. Bei Tieren mit Adenomen der
Pars distalis wird das Plasma-Cortisol fast vollständig supprimiert, bei Adenomen der Pars intermedia jedoch nur moderat. Drei Hunde mit Tumoren der Pars intermedia zeigen keine Reaktion auf das Dexamethason. Hier deuten die Ergebnisse der Autoren auf eine Entartung der A-Zellen hin, während eine Suppression bei vier anderen Hunden auf ein B-Zell-Adenom der Pars intermedia schließen läßt.
Die Erfahrungen im hiesigen Labor zeigen, dass dieser Test oftmals nicht das erwartete Ergebnis liefert. Zum einen sind nicht alle NNR-Tumore vollständig autonom, zum anderen scheint es auch durchaus autonome Hypophysenadenome zu geben, so dass sowohl falsch negative als auch falsch positive Resultate zu beobachten sind.
FELDMAN (2000) warnt generell davor, einen Hund allein aufgrund eines positiven Testergebnisses zu therapieren, da bei allen Testverfahren falsch positive Ergebnisse vorkommen.
2.3.4. Therapie
Das Mittel der Wahl zur Behandlung des hypophysär bedingten Morbus Cushing ist die cytotoxische Verbindung Mitotane (Lysodren, Bristol Myers Oncology, Princeton, NJ). Hinter dem Trivialnamen Mitotane steht das o,p`DDD (1,1-dichloro-2-(p- chlorophenyl)ethan), eine aus dem Insektizid DDT (Dichlordiphenyl-trichlorethan) abgeleitete Substanz. Mitotane führt zur selektiven Nekrose und Atrophie der adrenocorticalen Zona fasciculata und Zona reticularis (PETERSON 1983). Laut FELDMAN (2000) sind die einzigen darüber hinaus beobachteten Effekte eine moderate fettige Degeneration der Leber, centrolobuläre Atrophie und Kongestion.
Weiterhin berichtet der Autor, dass Hunde mit adrenaler Hyperplasie empfindlicher auf Mitotane reagieren als gesunde Hunde. Sie sprechen zu 85% innerhalb von fünf bis neun Tagen auf die Therapie an und zeigen häufig Anzeichen eines Hypoadrenocorticismus.
Empfohlen wird eine initiale Dosierung von 50 mg/kg pro Tag. FELDMAN (2000) empfiehlt, diese Dosis auf eine zweimal tägliche Verabreichung zu verteilen.
Während HERRTAGE (1998) und FELDMAN (2000) eine gleichzeitige Glucocorticoidgabe nicht für nötig erachten, befürwortet PETERSON (2001) die Supplementation mit Prednison oder Prednisolon, um während der Initialphase Nebenwirkungen durch rapide sinkende Cortisolkonzentrationen zu vermindern. Bei gleichzeitig vorliegendem insulin-resistenten Diabetes mellitus empfiehlt es sich laut PETERSON u. KINTZER (1994) die initiale Mitotane-Dosis auf die Hälfte zu reduzieren und die Glucocorticoidgabe auf das Doppelte zu erhöhen. Dadurch soll verhindert werden, dass die täglich benötigte Insulin-Dosis während der Erhaltungsphase zu stark schwankt. Mitotane sollte aufgrund seiner fettlöslichen Natur zusammen mit dem Futter verabreicht werden.
HERRTAGE (1998) betont, dass jeder Hund individuell reagiert und dementsprechend therapiert werden muß. Bei Anzeichen eines (iatrogenen) Morbus Addison oder spätestens nach 10 Tagen (PETERSON 2001) wird vor Einleitung der Erhaltungsdosis und nachfolgend in regelmäßigen Abständen zur Überprüfung der Therapie die Stimulationsfähigkeit der NNR mittels ACTH-Stimulationstest untersucht. Das Ziel ist ein Cortisolbasalwert im unteren Normbereich und keine oder nur geringe Stimulation nach ACTH-Gabe (PETERSON 2001). Die Erhaltungsdosis beträgt 50 mg/kg pro Woche. HERRTAGE (1998) berichtet, dass es häufig zu Rückfällen oder Phasen mit Überdosierungserscheinungen kommt, und die Dosis daher individuell erhöht oder gesenkt bzw. die Dosierungsintervalle verlängert oder verkürzt werden müssen. Er stellt bei 5-17% der behandelten Tiere einen Hypoadrenocorticismus mit Gluco- und Mineralocorticoidmangel fest, der vorwiegend innerhalb des ersten Therapiejahres auftritt.
KINTZER u. PETERSON (1994) führen die Mitotane-Therapie an 32 Hunden durch, die an einem adrenocorticalen Tumor leiden. Sie berichten, dass Mitotane auch bei diesen Tieren eine effektive und akzeptable Behandlungsalternative darstellt. Im Durchschnitt ist die benötigte Dosis jedoch sowohl in der Einleitungs- als auch in der Erhaltungsphase höher als bei Hunden mit hypophysärer Ursache der Erkrankung.
HERRTAGE (1998) warnt aufgrund der starken Wirkung eindringlich vor einer empirischen Anwendung von Mitotane.
Eine weitere Therapieform stellt die chirurgische Entfernung des betroffenen Organs dar. Während die Hypophysektomie noch recht selten durchgeführt wird, da sie technisch sehr schwierig und mit hoher Morbidität und Mortalität verbunden ist (HERRTAGE 1998), ist die Adrenalektomie das Mittel der Wahl bei Hunden mit unilateralen adrenalen Tumoren (RIJNBERK 1996a).
Zahlreiche weitere medikamentelle Behandlungsmöglichkeiten, deren Effizienz in der Literatur zur Zeit kontrovers diskutiert wird, stehen zur Verfügung. In den Fachbüchern werden vor allem die Steroidbiosynthese-Hemmer Ketokonazol und Trilostane sowie der Dopaminagonist L-Deprenyl angeführt.
Ketokonazol (Nizoral, Jannsen Pharmaceutica Inc, Piscataway, NJ) ist ein Antimykotikum, welches die Steroidgenese hemmt. Die initiale Dosierung beträgt 5 mg/kg zweimal täglich über einen Zeitraum von sieben Tagen. Treten keine Nebenwirkungen auf (Anorexie, Erbrechen, Durchfall, Hepatopathie), wird die Dosis auf 10 mg/kg für 14 Tage erhöht. Der Erfolg der Therapie wird durch einen ACTH- Stimulationstest überprüft. Ist die erzielte Suppression nicht ausreichend, wird eine Dosis von 15 mg/kg verabreicht, in seltenen Fällen sind 20 mg/kg erforderlich (HERRTAGE 1998). FELDMAN u. NELSON (1996) berichten von positiven Behandlungsergebnissen (in 80% der Fälle sinken die Cortisolkonzentrationen rapide) und sehen den Vorteil in der geringen Toxizität und der reversiblen Wirkungsweise. Jedoch ist das Medikament teuer und in 25% der Fälle nicht effektiv (HERRTAGE 1998). Auch PETERSON (2001) führt die geringeren Nebenwirkungen im Vergleich zu Mitotane als Vorteil an. In seinen Studien zeigt sich Ketokonazol jedoch in einem Drittel bis der Hälfte aller Hunde nicht effektiv. Einen weiteren Nachteil sieht der Autor in der Notwendigkeit, das Medikament zweimal täglich zu verabreichen.
Trilostane (Modrenal, Wanskerne Limited, Cornwall, England) unterdrückt als kompetitiver Hemmer der 3β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase reversibel die Steroidbiosynthese. RUCKSTUHL et al. (2002) untersuchen in ihrer Studie den Effekt einer Trilostane Therapie an 11 Hunden mit hypophysärem Cushing-Syndom.
Sie verabreichen Hunden mit einem Gewicht unter fünf kg 30 mg pro Tag und Hunden mit einem Gewicht über fünf kg 60 mg pro Tag. Die Autoren stellen bei neun Tieren (82%) eine deutliche Besserung der klinischen Symptomatik sowie bei allen Hunden signifikant niedrigere Cortisolkonzentrationen nach ACTH-Stimulation fest.
Sie berichten von geringen Nebenwirkungen (Lethargie und Anorexie in jeweils einem Hund) und schätzen Trilostane als sichere und effektive Alternative zu Mitotane ein. NEIGER et al. (2002), die 78 Hunde mit Trilostane behandeln, schließen sich dieser Meinung an. Sie verwenden das gleiche Dosierungsschema wie RUCKSTUHL et al. (2002) für Hunde mit einem Gewicht unter und über fünf kg, führen jedoch eine weitere Stufe hinzu, indem Sie Hunden über 20 kg 120 mg Trilostane täglich verabreichen. Nur zwei Hunde entwickelten einen iatrogenen Morbus Addison. Allerdings starben auch zwei Hunde zwei Tage nach Beginn der Behandlung, wobei unklar ist, ob die Trilostane-Therapie als Ursache dieser Todesfälle anzusehen ist.
Sowohl RUCKSTUHL et al. (2002) als auch NEIGER et al. (2002) weisen darauf hin, dass die Dosierung von Trilostane, vergleichbar mit der Mitotane Therapie, je nach klinischer Symptomatik und Ergebnis des ACTH-Stimulationstests individuell angepasst wird.
L-Deprenyl (Selegilin-Hydrochlorid) vermindert die ACTH-Sekretion, indem es die endogenen Dopaminkonzentrationen erhöht. Die initiale tägliche Dosierung beträgt 1 mg/kg. Zeigt sich nach zwei Monaten keine adäquate Besserung der Symptomatik, wird die Dosis auf das Doppelte erhöht (HERRTAGE 1998). Allerdings dokumentieren REUSCH et al. (1999) in der Mehrzahl der behandelten Hunde (80%) keine Besserung der Cushing-Symptome. PETERSON (1999) sieht jedoch den großen Vorteil dieses Medikamentes in den äußerst geringen Nebenwirkungen. Er hält es für sinnvoll, einen möglichen Effekt von L-Deprenyl in leichten Fällen mit geringer Progressivität zunächst zu testen, bevor Mitotane angewandt wird.
3. Material und Methoden
3.1. Material und Tiere
Die für den ACTH-Bioassay verwendeten Nebennieren stammten von Schlachtschweinen des Schlachthofes Hannover.
Zur Untersuchung einer möglichen Beeinflussung des ACTH-Bioassays durch Serumbestandteile wurden die Seren von vier Pferden und einem Hund untersucht, bei denen ein Dexamethason-Suppressionstest durchgeführt wurde.
Für den Vergleich zwischen der immunreaktiven und der biologischen Aktivität des endogenen ACTHs wurden 3 Versuchsgruppen mit jeweils 5 Hunden untersucht:
Gruppe 1: gesunde Hunde
Gruppe 2: am Cushing-Syndrom erkrankte Hunde Gruppe 3: mit Lysodren therapierte Hunde
Alle Blutproben wurden zu diagnostischen Zwecken an das hiesige Labor eingesandt.
Gruppe 1: gesunde Hunde
Hierbei handelte es sich um Serumproben von klinisch gesunden Hündinnen, welche aus dem Institut für Reproduktionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover zur Kontrolle des Progesteronwertes (Kontrolle des Zyklusstandes) eingesandt wurden. Die Hündinnen waren zwischen drei und neun Jahre alt und gehörten den Rassen Deutscher Schäferhund (n=2), Großpudel (n=1), Irish Setter (n=1) und Kangal (n=1) an.
Gruppe 2: am Cushing-Syndrom erkrankte Hunde
Die hier untersuchten Serumproben stammten von Patienten der Klinik für kleine Haustiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover, die unabhängig von Rasse,
Geschlecht und Alter zusammengestellt wurden. Die Hunde waren zwischen sieben und 11 Jahre alt und gehörten den Rassen Mischling (n=1), Australian Shepherd (n=1), Rauhhaarteckel (n=1), Cocker Spaniel (n=1) und West Highland White Terrier (n=1) an. Drei Hunde waren weiblich, zwei männlich. Zwei der Hündinnen und einer der Rüden waren kastriert. Zur Auswahl kamen ausschließlich Hunde, die nicht mit Glucocorticoiden vorbehandelt wurden und die klinische Symptomatik eines Hyperadrenocortizismus (u.a. Polyurie/Polydipsie, Stammfettsucht, erhöhte AP- Werte, Alopezie) aufwiesen. Die NNR-Funktion wurde mit Hilfe des Low-Dose- Dexamethason Hemmtestes überprüft. Nach Entnahme der Basalblutprobe erfolgte die Injektion von 0,02 mg/kg KGW Dexamethason-Natrium-Phosphat i.v.
(Dexamethason-Injektionslösung ad us. vet., cp-pharma, Burgdorf). Vier und acht Stunden später wurden weitere Blutproben entnommen. Bei allen Hunden wurde aufgrund der unzureichenden Suppression im 4- und 8-Stunden-Wert das Vorliegen eines Hyperadrenocortizismus diagnostiziert. Im Bioassay wurden lediglich die Basalblutproben analysiert.
Gruppe 3: mit Lysodren therapierte Hunde
Diese Proben stammten von Patienten verschiedener umliegender Kliniken, die ebenfalls unabhängig von Rasse, Geschlecht und Alter zusammengestellt wurden.
Die Tiere waren zwischen sieben und 15 Jahre alt und gehörten den Rassen Yorkshire Terrier (n=3), Berner Sennhund (n=1) und Pinscher (n=1) an. Drei Hunde waren männlich, zwei weiblich. Keines dieser Tiere war kastriert. Die Patienten wiesen einen mittels Low-Dose-Dexamethason Hemmtest diagnostizierten Hyperadrenocorticismus auf, der mit Lysodren therapiert wurde. Die eingesandten Blutproben stammten aus ACTH-Stimulationstests, welche zur Therapiekontrolle durchgeführt wurden. Nach Entnahme einer Basalblutprobe erfolgte die Injektion von 1,0 ml Tetracosactid β1-24 (Synacthen-Injektionslösung, Novartis Pharma GmbH, Nürnberg) pro Tier. Eine weitere Blutprobe wurde eine Stunde später entnommen (RIJNBERK 1996b).
Die Proben 3.1 und 3.2 waren Lithium-Heparinplasma, die Probe 3.3 Serum. Bei den Proben 3.4-5 handelte es sich um EDTA-Plasma, welches mit Aprotinin (500 KIE/ml
Blut Trasylol-Injektionslösung, Bayer Leverkusen) versetzt wurde (siehe Tab.10, Seite 47).
Als Kontrollserum wurde das Serum eines Pferdes mit gemessen, welches klinische Symptome eines Equinen Cushing-Syndroms aufwies. Die Blutprobe wurde nach Reinigung und Desinfektion der Punktionsstelle aus der Vena jugularis externa entnommen. Nach Zentrifugieren der Probe wurde der Serumüberstand abpipettiert und mittels IMMULITE der Cortisolgehalt (40,0 ng/ml) und der ACTH-Gehalt (70,0 pg/ml) bestimmt. Anschließend wurde das Serum bis zur Verwendung im Bioassay aliquotiert bei –20°C eingefroren.
3.2. Vorversuche zur Blutprobenaufbereitung
Zur Entfernung des endogenen Cortisols aus den nativen Blutproben vor deren Einsatz im Bioassay wurden zwei Vorgehensweisen versucht:
1. Cortisolabsorption an Aktivkohle
Es wurde eine Aktivkohle-Suspension hergestellt aus 0,33 g Aktivkohle (Dextran coated charcoal; Sigma: C-6197) und 1 ml EDTA-Puffer (Kap 3.3.1.). 500 µl des auch als Kontrollserum verwendeten Serums eines erkrankten Pferdes (Kap. 3.1.) wurden mit 50 µl Aktivkohle-Suspension versetzt. Nach einer Kontaktzeit von 20 Minuten wurde das Gemisch zentrifugiert und der Überstand, in dem zunächst mittels IMMULITE die Cortisol- und ACTH-Werte bestimmt wurden, im Bioassay eingesetzt.
2. Extraktion mit Lösungsmitteln
Die Seren von am Equinen Cushing-Syndrom erkrankten Pferden wurden im IMMULITE auf ihre Cortisol- und ACTH-Werte untersucht.
Jeweils 0,5 ml Serum wurden mit je 1 ml 1-Butanol (Merck: 101990), 3 ml Ethylacetat (Merck: 868), 2 ml Diethylether (Merck: 100921) oder 2 ml n-Hexan (Merck: 104368)
extrahiert, für 30 Minuten geschüttelt und bei –20°C eingefroren. Nach Entfernen und Verwerfen der organische Phase wurde die wäßrige Phase in einer Vakuumzentrifuge lyophilisiert. Die Trockenrückstande wurden in 0,5 ml Aqua dest.
aufgenommen und im IMMULITE die Cortisol- und ACTH-Werte ermittelt.
Die Extraktionen mit 1-Butanol und Ethylacetat wurden in nachfolgenden Versuchen durch Zweifachextraktion optimiert und die extrahierten Proben im Bioassay eingesetzt.
3.3. ACTH-Bioassay
Die ACTH-Bioaktivität wurde mit Hilfe eines im Rahmen dieser Studie entwickelten ACTH-Bioassays mit NNR-Zellen vom Schwein untersucht. Als Vorlage diente ein Protokoll von ROBERTSON und BIDEY (1990), welches einen Bioassay mit NNR- Zellen von Meerschweinchen beschreibt. Aufgrund der unterschiedlichen Anforderungen der Zellen und in Ermangelung einiger Gerätschaften im hiesigen Labor wurde dieses Protokoll in vielen Punkten modifiziert.
3.3.1. Herstellung der Lösungen
Phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung (PBS)
Für 500 ml Lösung wurden 4,09 g Natriumchlorid (NaCl; Merck: 106404) und 0,69 g Natriumdihydrogenphosphat-Monohydrat (NaH2PO4; Merck: 6348) in Reinstwasser (Milli-Q) gelöst und mit 2M Natronlauge (NaOH; Merck: 6498) auf pH 7,2 – 7,4 eingestellt.
RPMI-1640-Medium
Für 500 ml Lösung wurden 5,21 g RPMI-1640-Trockenmedium (Biochrom AG, Seromed®: T 121-01), 3,0 g HEPES (Biochrom AG, Seromed®: L 1603) und 0,5 g
Natriumbicarbonat (NaHCO3; Biochrom AG, Seromed®: L 1703) in Reinstwasser (Milli-Q) gelöst und mit 2M Natronlauge (NaOH; Merck: 6498) auf pH 7,3 eingestellt.
RPMI-1640-Medium + Kollagenase
Zugabe von 0,2 g Kollagenase (Typ CLS, 187 U/mg; Biochrom AG, Seromed®: CI- 22) zu 100 ml RPMI-1640-Medium.
Kulturmedien A und B
(Beim Kultumedium B handelt es sich lediglich um einen frischen Ansatz)
Zugabe von 0,08 g Calciumchlorid (CaCl2; Merck: 102083), 0,5 g BSA (Fraktion V, lyophilisiertes Pulver; Paesel + Lorei GmbH & Co.: 102565) und 0,6 ml FBS (Biochrom AG, Seromed®: S-0115) zu 100 ml RPMI-1640-Medium.
EDTA-Puffer
Für 1 Liter Puffer wurden 3,72 g Titriplex® III (EDTA; Merck: 8418) und 1,37 g Natriumdihydrogenphosphat-Monohydrat (NaH2PO4; Merck: 6348) in Reinstwasser (Milli-Q) gelöst und mit 2M Natronlauge (NaOH; Merck: 6498) auf pH 7,2 eingestellt.
3.3.2. Präparation der Nebennieren
Es wurde jeweils eine Nebenniere von zwei jungen Schlachtschweinen entnommen und das umgebende Fett entfernt. Der Transport der Nebennieren erfolgte in einem mit PBS-Puffer gefüllten Probenbehältnis auf Eis.
Im Labor wurden die Nebennieren sofort in einer zur Verhinderung der Austrocknung des Gewebes mit RPMI-1640-Medium gefüllten Petrischale weiter bearbeitet. Das restliche Fettgewebe, die Nebennierenkapsel sowie das Nebennierenmark wurden entfernt.
Anschließend wurde die NNR möglichst gewebeschonend mit Skalpell und Pinzette in ca. 1x1 mm große Stücke zerkleinert.
Die Gewebestücke wurden dreimal mit jeweils 10 ml RPMI-1640-Medium gewaschen und mit 20 ml RPMI-1640-Medium + Kollagenase in einen Vereinzelungsapparat verbracht. Dabei handelte es sich um ein Rührgerät zur schonenden Vereinzelung der Zellen. An dem Deckel eines Glasgefäßes war an einem um die Längsachse drehbaren Stab ein Magnetrührstäbchen angebracht. Über dem Rührstäbchen befanden sich an dem Stab kleine Plastikflügel, durch die die im Gefäß enthaltene Gewebesuspension gleichmäßig durchmischt wurde. Die Suspension wurde für 10 Minuten bei 37°C inkubiert. Dabei befand sich der Vereinzelungsapparat in einer mit 37°C warmem Wasser gefüllten Plastikschale auf einem Magnetrührer mit 60-100 U/min. Das Wasserbad diente dabei der schnelleren und gleichmäßigeren Temperaturanpassung und gewährleistete eine ausreichende Luftfeuchtigkeit.
Nach der Inkubation wurde der Vereinzelungsapparat 5-10 min. zum Absetzen der Suspension bei Zimmertemperatur stehengelassen. Der Überstand wurde mit einer Pasteurpipette abgesaugt und verworfen. Anschließend wurden die Zellen in 20 ml RPMI-1640-Medium + Kollagenase resuspendiert und für weitere 25 min. unter den oben genannten Bedingungen inkubiert. Auch der zweite Überstand wurde nach Absetzen der Suspension verworfen. Dieser Vorgang mit 25 minütiger Inkubation wurde zweimal wiederholt, wobei der dritte und der vierte Überstand jeweils in ein 50 ml fassendes konisches Polypropylen-Zentrifugenröhrchen verbracht wurden.
Je 25 µl der Überstände 3 und 4 wurden mit 25µl Trypan-Blau (mit physiologischer Kochsalzlösung 1:10 verdünnte Lösung; Biochrom AG, Seromed® : L 6323) angefärbt. Mittels Neubauer-Zählkammer wurden unter dem Mikroskop die lebenden Fasciculata-Zellen, die durch Trypan-Blau nicht angefärbt werden und eine deutliche, dunkle Zellwand sowie große Lipidgranula besitzen, gezählt. Anhand der Zellzahl wurde die Zellkonzentration je ml Zellsuspension errechnet.
Die Überstände mußten zur weiteren Verwendung eine ausreichende Zellqualität (intakte Zellwand und deutliche, große Granula) und eine Zellzahl von mindestens 40 gezählten Zellen je zwei Großquadrate aufweisen.
Die Überstände wurden zusammengeschüttet und für 5 Minuten bei 20°C und 1000
UPM zentrifugiert. Nach Verwerfen des Überstandes wurden die Zellen in 5 ml frischem Kulturmedium A resuspendiert. Dabei wurde eine Pasteurpipette verwendet, deren Spitze vorher abgebrochen und die scharfen Kanten unter Hitzeeinwirkung abgerundet wurden, um eine Schädigung der Zellen weitestgehend zu vermeiden.
Nach erneuter Zentrifugation und Entfernung des Überstandes wurden die Zellen in 40 ml Kulturmedium A aufgenommen.
Die Zellsuspension wurde in einer mit Deckel versehenen Petrischale vorinkubiert.
Die Präinkubation erfolgte für eine Stunde bei 37°C in einem Schüttelwasserbad mit hoher Luftfeuchtigkeit.
3.3.3.Durchführung des ACTH-Bioassays
Nach erfolgter Präinkubation wurde die Zellsuspension in einem 50 ml konischen Polypropylen-Zentrifugenröhrchen für fünf Minuten bei 20°C und 1000 UPM zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die Zellen in 30 ml frisch angesetztem Kulturmedium B resuspendiert. Die Suspension wurde anschließend durch Glaswolle filtriert, die zuvor mit Kulturmedium B getränkte wurde. Durch Nachspülen mit 10 ml Kulturmedium B betrug das Endvolumen der Zellsuspension 40 ml.
25 µl der Zellsupension wurde mit 25 µl Trypan-Blau angefärbt, und in der Neubauer- Zählkammer wurden erneut die lebenden Fasciculata-Zellen gezählt. Anschließend wurde die Suspension mit Kulturmedium B auf eine Konzentration von 1,2 x 106 Zellen/ml Kulturmedium B eingestellt.
Je 100 µl der Zellsuspension wurden unter ständigem Aufschütteln, um eine gleichbleibende Zellkonzentration je Ansatz zu gewährleisten, in Glasröhrchen pipettiert. Im Doppelansatz wurden je 100 µl der folgenden Proben zur Suspension hinzugefügt:
Leerprobe (Kulturmedium B ohne Zusatz der Zellsuspension) oder
Proben aus der Verdünnungsreihe zur Erstellung der ACTH-Eichkurve (Kap. 3.2.4.) oder
Kontrollserum (Kap. 3.1.) oder
Blutproben (Kap. 3.1. und 3.2.5.)
Die Zellsuspension wurde im Schüttelwasserbad bei 37°C für 90 Minuten inkubiert.
Anschließend wurden die Proben in den Glasröhrchen mit 4°C kaltem 10 mM EDTA- Puffer 10fach verdünnt und bis zur Cortisolmessung mittels RIA (Kap. 3.3.1.) bei –20°C eingefroren.
3.3.4.Verdünnungsreihe zur Erstellung der ACTH-Eichkurve
Für die Verdünnungsreihe wurden Synacthen-Injektionslösung (Novartis Pharma GmbH, Nürnberg) und Kulturmedium B verwendet. 1 ml der Synacthen- Injektionslösung enthält 0,28 mg Tetracosactidhexaacetat. Dies entspricht 0,25 mg Tetracosactid (ACTH1-24; Molekulargewicht: 2933,5 g/mol) und somit 25 I.E. ACTH.
Weitere Bestandteile sind Essigsäure, Natriumacetat, Natriumchlorid und Wasser.
Die ACTH-Eichkurve wurde aus dem Nullwert (Zellsuspension ohne ACTH-Zusatz) und den Verdünnungen 2,5 bis 1.250 pg ACTH/ml erstellt.
3.3.5. Überprüfung der Funktionsfähigkeit
Zur Überprüfung der Funktionsfähigkeit des ACTH-Bioassays wurden humanes ACTH1-10 (Sigma: A 1709), humanes ACTH1-39 (Bachem: H-1160.1000) sowie porcines ACTH1-39 (Sigma: A 6303) eingesetzt.
Es wurden jeweils 1 mg humanes ACTH1-10 und humanes ACTH1-39 in 1 ml, sowie 100 IU porcines ACTH1-39 in 4 ml physiologischer Kochsalzlösung (NaCl; Merkt:
1.06404) aufgenommen und der pH-Wert durch Zugabe von Essigsäure (Merck:
1.00063) auf 4,5 eingestellt. Im Bioassay wurde eine 105 fache Verdünnung dieser Ausgangslösungen eingesetzt und zuvor im IMMULITE die Cortisol- und ACTH- Werte ermittelt.
Um zu überprüfen, ob auch canines ACTH im Bioassay mit porcinen NNR-Zellen eine Steigerung der Cortisolproduktion bewirkt, wurde die Serumprobe eines an Morbus Addison erkrankten Hundes untersucht, welche im IMMULITE kein Cortisol (<2,0 ng/ml) und einen hohen ACTH-Gehalt (109 pg/ml) aufwies. Die Probe stammte aus der Klinik für kleine Haustiere. Es handelte sich um eine neun Jahre alte, nicht kastrierte Mischlingshündin. Die Erkrankung war durch einen NNR-Stimulationstest diagnostiziert worden.
3.3.6. Verdünnung der Blutproben
Zunächst wurden alle Blutproben unverdünnt im Bioassay eingesetzt. Da die Werte jedoch bei einigen Proben außerhalb der Eichkurve lagen, wurden diese Proben vor ihrem Einsatz im Bioassay 4fach mit Medium B verdünnt.
3.4. Analysemethoden
3.4.1. Cortisol-Radioimmunoassay (Cortisol-RIA)
Die Cortisolmessung der Proben aus dem Bioassay, sowie der entsprechenden nativen Blutproben, erfolgte mittels Cortisol-RIA (KLEIN et al. 1989).
Für den Ansatz wurden 10 µl der zuvor im Bioassay eingesetzten Proben verwendet.
Die nativen Blutproben mussten, entsprechend der jeweiligen Verdünnung der im Bioassay eingesetzten Proben, vor dem Einsatz im RIA mit Medium B 20fach bzw.
80fach verdünnt werden. Die untere Nachweisgrenze betrug 0,3 ng/ml.
Laut KLEIN et al. (1989) ergeben sich folgende Qualitätskriterien: Interassay- Variationskoeffizient 10,9% und Intraassay-Variationskoeffizient 9,2%. Die Spezifität
des Antiserums ist in Tabelle A1 im Tabellenanhang aufgelistet.
3.4.2. Cortisol- und ACTH-Messung mittels IMMULITE®
Die Bestimmung des irACTHs und der Cortisolwerte der nativen Blutproben erfolgte unter Verwendung eines Analyseautomaten (IMMULITE, DPC Biermann, Bad Nauheim).
Der IMMULITE-ACTH-Assay ist ein Festphasen-Sandwich-Chemilumineszenz- Immunoassay, der hochspezifisch für intaktes, humanes ACTH1-39 mit geringer Kreuzreaktivität zu anderen im Plasma vorkommenden ACTH-Fragmenten ist (siehe Tab. A2 im Tabellenanhang).
Der IMMULITE-Cortisol-Assay ist ein Festphasen-Chemilumineszenz-Enzym- immunoassay. Die Spezifität des Antiserums zu anderen im Blut vorkommenden Hormonen ist der Tabelle A3 im Tabellenanhang zu entnehmen.
Anhand equiner Plasmaproben validierte FROIN (1998) das IMMULITE-Testsystem am hiesigen Institut und gibt einen Intraassay-Variationskoeffizienten zwischen 3,9- 13,5 % an.
Die Herstellerangaben sind in Tabelle 5 angegeben:
Tab.5: Qualitätskriterien der verwendeten Hormonassays (DPC Biermann Produktinformation 2000)
Nachweisgrenze Variationskoeffizient (%) Hormon Katalog-Nr.
untere obere Intraassay- Interassay-
ACTH LKAC1 5 pg/ml 1250 pg/ml 3,1-9,6 5,1-9,4
Cortisol LKC01 2 ng/ml 500 ng/ml 6,8-9,0 9,9-10,3
3.5. Statistische Methoden
Die statistische Auswertung wurde im Institut für Biometrie und Epidemiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover mit Hilfe des Programmes Statistical Analysis Systems (SAS) durchgeführt.
Die Korrelationskoeffizienten zwischen nicht normal verteilten Stichproben wurde mit Hilfe des Rangkorrelationskoeffizienten nach Spearman bestimmt. Alle p-Werte ≤0,05 wurden als signifikant gewertet.
4. Ergebnisse
4.1. ACTH-Bioassay
4.1.1. Entwicklung des ACTH-Bioassays
Zur Entwicklung des ACTH-Bioassays mit NNR-Zellen vom Schwein musste das als Vorlage dienende Protokoll von ROBERTSON und BIDEY (1990), welches einen Bioassay mit NNR-Zellen von Meerschweinchen beschreibt, in vielen Punkten modifiziert werden.
Da im hiesigen Institut kein Mc Ilwain Gewebezerkleinerer, wie ihn ROBERTSON und BIDEY (1990) verwendeten, zur Verfügung stand, wurden die Nebennieren mit einem Skalpell zerkleinert. Dabei wurde auf einen besonders schonenden Umgang mit dem Gewebe geachtet. Versuche, in denen Nebennieren älterer Tiere verwendet wurden, ergaben eine schlechte Qualität der Zellen.
Während der enzymatischen Vereinzelung der Zellen wurde zunächst ein Magnetrührstäbchen eingesetzt, das die Gewebesuspension auf dem Boden eines Becherglases durchmischte. Bei der anschließenden mikroskopischen Begutachtung fanden sich vorwiegend Zelltrümmer. Deutlich mehr intakte Zellen konnten gewonnen werden, nachdem der in Kap. 3.3.2. beschriebene Vereinzelungsapparat eingesetzt wurde. Dadurch konnte die Suspension gleichmäßig durchmischt werden, ohne dass das Magnetrührstäbchen die Zellen auf dem Boden des Becherglases zerrieb. Damit die Gewebesuspension während der Vereinzelung schneller die gewünschte Temperatur von 37°C erreichte, wurde der Vereinzelungsapparat in einem vorgewärmten Wasserbad inkubiert.
ROBERTSON und BIDEY (1990) verwenden in ihrem Assay Eagle`s minimum essential medium (EMEM) zur Suspension der Zellen. Dies wurde in dieser Studie aus Gründen der Praktikabilität ausgetauscht durch RPMI-1640-Medium.
Die Zufuhr von 100% Sauerstoff während der Präinkubation, wie sie für die Meerschweinchenzellen empfohlen wird, erwies sich als schädigend für die hier
