Aus dem Zentrum für Lebensmittelwissenschaften Institut für Lebensmitteltoxikologie und Chemische Analytik
- Chemische Analytik und Endokrinologie - Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
und der
Abteilung für Klinische und Experimentelle Endokrinologie der Universitäts-Frauenklinik in Göttingen
Effekte von Östradiol und Equol sowie der pflanzlichen Substanzen Daidzein, Puerarin und Quercetin in der Hypophyse und im
Urogenitaltrakt der ovarektomierten Ratte
INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Tina Vortherms
aus Herdecke
Hannover 2006
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. H.-O. Hoppen, Hannover Prof. Dr. W. Wuttke, Göttingen
1. Gutachter: Prof. Dr. H.-O. Hoppen, Hannover
2. Gutachter: Prof. Dr. Dr.h.c. H. Nau
Tag der mündlichen Prüfung: 14.11.2006
Für meine Eltern
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung und Ziel der Arbeit ... 11
2 Literaturübersicht... 13
2.1 Östrogene, Wirkung und Regulation ... 13
2.2 Östrogenrezeptoren ... 15
2.3 Molekulare Biologie von ausgewählten Östrogen regulierten Genen (Markergenen) ... 16
2.3.1 Truncated Estrogen Receptor Product 1 ... 16
2.3.2 Luteinisierendes Hormon ... 16
2.3.3 Insulin-like-growth-factor-1 ... 17
2.3.4 Komplementfaktor C3 ... 18
2.4 Selektive Östrogenrezeptormodulatoren ... 18
2.5 Phytoöstrogene ... 19
2.5.1 Daidzein... 21
2.5.2 Equol ... 22
2.5.3 Puerarin ... 23
2.5.4 Quercetin ... 24
2.6 Klimakterium und HRT ... 25
2.7 Uterus und Endometrium im Klimakterium ... 26
2.8 Harninkontinenz bei der Frau im Klimakterium... 27
3 Material und Methoden ... 29
3.1 Tierversuch ... 29
3.1.1 Versuchstiere und Haltungsbedingungen ... 29
3.1.2 Ovarektomie ... 29
3.1.3 Testsubstanzen ... 30
3.1.4 Versuchsablauf... 30
3.1.5 Urodynamikmessungen ... 31
3.1.6 Vaginalzytologische Proben ... 31
3.1.7 Ende des Versuchs... 32
3.2 Molekularbiologische Methoden... 32
3.2.1 Aufteilung der Proben ... 32
3.2.2 Isolierung der RNA ... 33
3.2.2.1 Homogenisieren der Gewebe ... 33
3.2.2.2 RNA-Extraktion... 33
3.2.2.3 Konzentration und Reinheitsbestimmung der RNA ... 34
3.2.3 Reverse Transkription... 34
3.2.4 Taqman®-PCR ... 35
3.2.4.1 Auswahl der Sonden und der PCR Primer ... 36
3.2.4.2 Durchführung der PCR ... 37
3.3 Hormonanalytik ... 39
3.4 Histologische Methoden ... 40
3.5 Statistische Auswertung ... 40
4 Ergebnisse... 41
4.1 Futteraufnahme... 41
4.2 Körpergewicht ... 43
4.3 Hormonwerte im Serum ... 45
4.3.1 Östradiolwerte im Serum ... 45
4.3.2 LH Werte im Serum ... 46
4.4 Ergebnisse im Uterus... 47
4.4.1 Uterusgewichte ... 47
4.4.2 Uterushistologie... 48
4.4.3 ER Genexpression im Uterus ... 53
4.4.4 ER Genexpression im Uterus ... 54
4.4.5 PR Genexpression im Uterus ... 55
4.4.6 IGF1 Genexpression im Uterus ... 56
4.4.7 C3 Genexpression im Uterus... 57
4.5 Ergebnisse in der Vagina ... 58
4.5.1 Histologie der Vagina... 58
4.5.2 Vaginalzytologie... 62
4.6 Ergebnisse in der Hypophyse ... 64
4.6.1 ER Genexpression in der Hypophyse... 64
4.6.2 ER Genexpression in der Hypophyse... 65
4.6.3 LH Genexpression in der Hypophyse ... 66
4.6.4 TERP1 Genexpression in der Hypophyse ... 67
4.7 Ergebnisse der urodynamischen Untersuchungen... 68
4.7.1 Urodynamische Veränderungen unter dem Einfluss von Östradiol... 68
4.7.2 Urodynamische Veränderungen unter dem Einfluss von Daidzein... 69
4.7.3 Urodynamische Veränderungen unter dem Einfluss von Equol... 71
4.7.4 Urodynamische Veränderungen unter dem Einfluss von Puerarin ... 72
4.7.5 Urodynamische Veränderungen unter dem Einfluss von Quercetin ... 73
4.8 Zusammenfassung aller Ergebnisse ... 75
5 Diskussion ... 76
6 Zusammenfassung... 89
7 Summary... 91
8 Literaturverzeichnis ... 92
9 Anhang ... 115
9.1 Abbildungsverzeichnis... 115
9.2 Tabellenverzeichnis... 118
9.3 Zusammensetzung des sojafreien Rattenfutters ... 120
9.4 Analysezertifikate der Testsubstanzen... 121
9.4.1 Daidzein... 121
9.4.2 Equol ... 122
9.4.3 Puerarin ... 123
9.4.4 Quercetin ... 124
Abkürzungsverzeichnis
A Adenin
BP Basenpaar
C Cytosin
C3 Komplementfaktor 3
cDNA komplementäre Desoxyribonukleinsäure CO2 Kohlendioxid
DNA Desoxyribonukleinsäure
dNTP Desoxiribonukleosid-Triphosphat E2 Estradiol-17-beta
ER Estrogen Rezeptor ER Estrogen Rezeptor alpha ER Estrogen Rezeptor beta FET Fluoreszenz-Energietransfer FSH Follikel- stimulierendes Hormon
G Guanin
GH Growth Hormone
GnRH Gonadotropin releasing hormone HCG Humanes Choriogonadotropin HE Hämatoxilin-Eosin
HERS Heart and Estrogen/Progestin Replacement Study HRT hormone replacement therapy
HT Hormontherapie i.p. intra peritoneal
IGF-1 Insulin-like growth factor 1 kDA Kilodalton
LH Luteinisierendes Hormon
LH Luteinisierendes Hormon alpha Untereinheit LH Luteinisierendes Hormon beta Untereinheit MgCl2 Magnesium Chlorid
mRNA messenger Ribonukleinsäure NaCl Natriumchlorid
OECD Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung ovx ovarektomiert
PCR Polymerase chain reaction PR Progesteron Rezeptor
REA repressor of estrogen receptor activity RNA Ribonukleinsäure
s.c. subkutan
SERM selective estrogen receptor modulator
T Thymin
TERP-1 truncated estrogen receptor product 1 TERP-2 truncated estrogen receptor product 2 TERPs truncated estrogen receptor products TSH Thyroidea-stimulating-hormone WHI Women's Health Initiative ZTE Zentrale Tiereinheit
ERKO Estrogen Rezeptor alpha knock out ERKO Double Estrogen Rezeptor knock out ERKO Estrogen Rezeptor beta knock out
1 Einleitung und Ziel der Arbeit
Die Entscheidung über die Einnahme von Hormonen in den Wechseljahren ist ein wichtiges Thema für alle betroffenen Frauen. Die abnehmende Östrogeneigenproduktion der Ovarien führt zu vasomotorischen Beschwerden (Hitzewallungen, Schlafstörungen mit Schweissausbrüchen), Problemen im Bereich des Urogenitaltrakts und des Herzkreislaufsystem, Osteoporose, Altersdemenz und Depressionen, weshalb viele Patientinnen über eine Hormonersatztherapie (HRT) nachdenken.
Die einzige medizinische Indikation, heutzutage Östrogene therapeutisch in der Postmenopause einzusetzen, ist der Bereich schwerer vegetativer Beschwerden (Hitzewallungen, Schlafstörungen, Depressionen). Für andere Erkrankungen mit Bezug zum Östrogenmangel (z.B. Osteoporose, Inkontinenz) stehen geeignete spezifische Medikamente zur Verfügung.
Nach Abbruch der groß angelegten Women's Health Initiative (WHI) Studie und den Resultaten der Heart and Estrogen / Progestin Replacement Study (HERS) mit den darauf folgenden negativen Schlagzeilen über die HRT sind viele Frauen verunsichert und suchen nach Alternativen zur klassischen HRT.
Phytoöstrogene sind pflanzliche Substanzen, die eine östrogene Wirkung haben können. Über ihr Potential bei der Beeinflussung von menopausalen Beschwerden bei Frauen wird derzeit vermehrt geforscht. Asiatischen Frauen, die lebenslang phytoöstrogenreiche Sojaprodukte als Nahrungsgrundlage haben, leiden deutlich weniger an Östrogenmangelsymptomen. Beobachtungen außerhalb Asiens lebender Asiatinnen, sprechen gegen eine genetische Veranlagung. Als Grundlage dieser unterschiedlichen Ergebnisse werden Ernährungsgewohnheiten verantwortlich gemacht. Gleichzeitig ist das Risiko, an Brust- oder Endometriumkarzinomen zu erkranken, in asiatischen Ländern deutlich verringert. Dem liegt eine antiöstrogene, organselektive Wirkung der Phytoöstrogene zu Grunde (ADLERCREUTZ u. MAZUR
1997).
Mittlerweile gibt es auf dem freien Markt hunderte verschiedener Phytoöstrogenpräparate, welche ohne jegliche Kontrolle als Nahrungsergänzungsmittel verkauft werden.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Wirkungen von drei pflanzlichen Substanzen Daidzein (und seinem Metabolit Equol), Puerarin, Quercetin - sowie Östradiol als positive Kontrolle - in einer Langzeitverabreichung an ovarektomierten Ratten untersucht. Die ovarektomierte Ratte gilt als etabliertes Modell in der Forschung über die Postmenopause. Durch Entzug der endogenen Östrogene treten bei diesen Tieren postmenopausale Symptome, wie Atrophie des Uterus und der Vaginalschleimhaut, eine Erhöhung der hypophysären Gonadotropine, sowie die Entwicklung einer Osteoporose auf.
Das Ziel dieser Arbeit war es herauszufinden, ob die untersuchten Substanzen östrogenähnliche Wirkungen an Hypophyse und Organen des Urogenitaltrakts zeigen. Es wurde untersucht, ob negative Wirkungen von diesen Substanzen ausgehen und ob selektive Östrogenrezeptor modulierende (SERM) Aktivität bei diesen Substanzen besteht.
2 Literaturübersicht
2.1 Östrogene, Wirkung und Regulation
Östrogene sind Steroidhormone mit 18 C-Atomen, welche hauptsächlich durch das Enzym Aromatase aus Androstendion gebildet werden. Vorwiegend werden Östrogene in den Granulosazellen des Ovars, während der Schwangerschaft in der Plazenta und in geringem Maß in der Nebennierenrinde gebildet. Weiterhin sind Aromataseaktivitäten in Muskel- Fett- und Nervengewebe sowie den Leydigzellen des Hodens zu finden (GRUBER et al. 2002).
Das wichtigste Östrogen im Körper ist das Östradiol (E2). Daneben kommen Östron (E1) und Östriol (E3) vor, welche vorrangig in der Leber aus Östradiol gebildet werden und eine deutlich schwächere Wirkung zeigen (HILLIER et al. 1994). Die Östradiolproduktion und Serumkonzentration sind prämenstruell am geringsten. Die Werte variieren zyklisch während des Menstruationszyklus mit den höchsten Serumkonzentrationen präovulatorisch. Durch die Verringerung der ovariellen Follikel zeigen sie perimenopausal eine stetige Abnahme. Postmenopausal liegt die Konzentration häufig unter 20 pg/ml und wird vorwiegend extragonadal aus Testosteron gebildet.
Die ovarielle Östrogenproduktion wird über einen Regelkreis zwischen Hypothalamus, Hypophyse und Ovar gesteuert. Viele Nervenzellen des Hypothalamus stehen unter dem Einfluss von Östrogenen (PFAFF et al. 2000). Die GnRH produzierenden Neurone werden von einer Reihe von Neurotransmittern (z.B.
GABA, Glutamat, Katecholaminen) kontrolliert, so dass ihr Produkt GnRH pulsatil als Bolus abgegeben wird. Die hypophysären GnRH Rezeptoren reagieren auf GnRH nur, wenn dieses in Intervallen und bolusartig ausgeschüttet wird (WUTTKE 1998).
Die Form der Steuerung durch Neurotransmitter und der synchronen Abgabe von GnRH, wird „GnRH Pulsgenerator“ genannt. Diese pulsatile Abgabe ist Voraussetzung für eine normale Abgabe von LH und FSH aus dem Hypophysenvorderlappen (KNOBIL 1980, 1990), was wiederum die Follikelreifung und Ovulation im Ovar reguliert. Die im Ovar gebildeten Östrogene verringern über negative Feedbackmechanismen die zentrale Hormonproduktion.
Östrogene sind Schlüsselregulatoren der Zellproliferation und -differenzierung und
sind somit an der Kontrolle von Wachstum und Aufrechterhaltung der Zielgewebe, Genitaltrakt, Brustdrüse, Kardiovaskuläres- und Skelettsystem beteiligt. Während des Menstruationszyklus fördern die Östrogene die Proliferation der Uterusschleimhaut und verstärken die Kontraktion der Uterusmuskulatur.
Postmenopausal ist das Risiko an einem Endometriumkarzinom zu erkranken durch vermehrte oder verlängerte Exposition mit Östrogenen erhöht. Ursächlich dafür kommen eine frühe Menarche, eine späte Menopause, die lange Einnahme von exogenen Östrogenen als HRT Therapie und ein hohes postmenopausales Körpergewicht in Frage (PATHIRAGE et al. 2006).
In der Vagina führen Östrogene zur Verdickung der Schleimhaut und zur vermehrten Abstoßung glykogenhaltiger Epithelzellen. Das Glykogen erlaubt eine vermehrte Produktion bakterieller Milchsäure, welche durch die Erniedrigung des ph-Wertes die Infektionsgefahr der Scheide verringert. Postmenopausal ist durch den Wegfall der Östrogene hiermit auch das erhöhte Infektionsrisiko im Urogenitalbereich erklärt.
Durch den Mangel an Östrogen nach der Menopause kann es durch vermehrte Fettanlagerungen zur Gewichtszunahme kommen. Dies ist ein wichtiger Risikofaktor bei der Entwicklung von Hyperlipidämien, Hyperurikämien, Diabetes Typ 2 und Hypertonie. In Langzeitversuchen über zwölf Monaten wurde gezeigt, dass ovarektomierte Ratten, bei nur in der Anfangszeit erhöhter Futteraufnahme, eine deutliche Gewichtszunahme und eine reduzierte Bewegung im Verhältnis zu intakten Tieren zeigen (SHIMOMURA et al. 1990). Die genauen Mechanismen, die für die Gewichtszunahme nach der Menopause zuständig sind, sind noch nicht bekannt (SHIMIZU 2003). Die Verringerung des Leptinlevels unter Östrogenmangel könnte in diesem Zusammenhang eine entscheidende Rolle spielen (SHIMOMURA et al.
2002). D`EON et al. (2005) zeigen an ovarektomierten Mäusen, dass neue genetische und nicht genetische Mechanismen unter Östradioleinfluss für die Verringerung des Fettgewebes, v.a. von intraabdominalem Fettdepots und der Verringerung der Adipozytengröße, zuständig sind.
Östrogene spielen außerdem eine zentrale Rolle im Knochenstoffwechsel.
Zusammen mit den „Calcium regulierenden Hormonen“, Wachstumsfaktoren und Zytokinen halten sie das Gleichgewicht bei Resorptions- und Aufbauvorgängen im
Knochen. Bei einem zirkulierenden Östrogenlevel unterhalb 200 pmol/l überwiegt das resorbtive Potential der Osteoklasten gegenüber den Osteoblasten. Dies führt zu einem Nettoeffekt von Knochenverlust, signifikant im trabekulären Knochen des Femurs, des distalen Radius und der Wirbel. Nach PURDIE (2003) sind Östrogene das Mittel der Wahl zur Behandlung und Prävention von Osteopenie und ausgeprägter Osteoporose.
2.2 Östrogenrezeptoren
Das Verständnis der molekularen Mechanismen der Östrogene ist wichtig für die weitere Entwicklung von therapeutischen Möglichkeiten, um den physiologischen Mangel an Östrogenen nach der Menopause auszugleichen. Die meisten zellulären Reaktionen auf Östrogene sind Antworten auf rezeptorvermittelte Aktionen. Es sind zwei Östrogenrezeptoren bekannt, ERα und ERβ. Sie gehören zur Familie der Kernrezeptoren (Steroidhormonrezeptoren) und arbeiten als Liganden-aktivierte- Transkriptionsfaktoren (GRANDIEN et al. 1997). ERα ist der länger bekannte ER.
Er wurde 1958 entdeckt und 1986 geklont. ERβ wurde erstmals 1996 in der Prostata von Ratten und im männlichen Hoden gefunden (KUIPER et al. 1996). Die Funktion und das Verhältnis der beiden ER-Subtypen zueinander sind noch nicht geklärt. Als eine Möglichkeit beschreibt LINDBERG et al. (2003) die „Ying-Yang“-Theorie, bei der ER eine modulierende Wirkung auf ER hat.
Die Verteilung der Rezeptoren ist in den verschiedenen Organen unterschiedlich. Es zeigt sich je nach Untersuchung und Untersucher eine differenzierte Verteilung je nach Individuum, Alter oder Zyklusstand. Laut KUIPER et al. (1997) befindet sich die höchste ERβ mRNA Expression in den Ovarien und der Prostata. Zusätzlich zeigt sich eine Expression in Hoden, Uterus, Blase und Lunge wobei in Hypophyse, Nebenhoden, Thymus und verschiedenen Hirnregionen nur eine geringe Expression zu finden ist. ERα dagegen zeigt eine deutliche Expression in Nebenhoden, Hoden, Hypophyse, Uterus, Nieren und Nebennieren, welche alle keine bis mäßige Expression von ERβ mRNA zeigen. GUSTAFSSON (1999) beschreibt eine vorherrschende Expression von ER im Urogenitaltrakt. Zur weiteren
Differenzierung der Wirkung von Östrogenen in vivo sind „knock-out-Mäuse“
( ERKO, ERKO, ERKO) entwickelt worden, denen entweder einer oder beide Östrogenrezeptoren fehlen. Diese „knock-out-Mäuse“ sind sinnvolle Modelle zur Forschung im Bereich der gewebespezifischen Wirkungen und dem Erkennen von Nebeneffekten der selektiven Östrogenrezeptormodulatoren (SERMs) (EMMEN u.
KORACH 2001).
2.3 Molekulare Biologie von ausgewählten Östrogen regulierten Genen (Markergenen)
2.3.1 Truncated Estrogen Receptor Product 1
Es gibt zwei Isoformen der TERPs (truncated estrogen receptor products), TERP1 und TERP2. Das Gen, welches Grundlage für das häufiger vorkommende TERP1 ist, besteht aus Exon 5 bis Exon 8 des ER und ist angeschlossen an eine Sequenz aus 31 BP (MITCHNER et al. 1998, SHUPNIK 2002). Von RESNICK et al. (2000) wurden TERPs ausschließlich in der Hypophyse gefunden. Allerdings ist nicht bekannt, welche Zellen TERP in der Hypophyse exprimieren. In transient transfizierten Zellassays konnte gezeigt werden, dass TERP-1 in niedriger Konzentration ER Aktivität stimuliert. In einer Konzentration größer als 1:1 hemmt es jedoch die Aktivität von ER (SCHREIHOFER et al. 1999). Der Mechanismus hinter dieser gegensätzlichen Beeinflussung ist von dem Repressor Protein (REA - repressor of estrogen receptor activity) abhängig. REA bindet sich bei niedrigen TERP Konzentrationen an TERP und gibt damit ER zur Transkription frei. Bei hoher Konzentration bindet sich REA zusätzlich an ER und bildet damit inaktive Heterodimere, welche die DNA Bindung hemmen (LIN et al. 2003). Unter einmaliger s.c. Östradiolbehandlung wird eine Steigerung des TERP1 mRNA Gehalts innerhalb von 24 h um das fünf- bis siebenfache beobachtet (MITCHNER et al. 1998).
2.3.2 Luteinisierendes Hormon
LH wird in der Hypophyse produziert und besteht als Heterodimer aus zwei
verschiedenen Proteinuntereinheiten. Die humane LH Untereinheit besteht aus 121 Aminosäuren und ist für die Spezifität von LH verantwortlich. Die LH Untereinheit zeigt eine identische Polypeptidstruktur mit Untereinheiten des TSH, FSH und HCG.
LH stimuliert im Eierstock die Follikelreifung und damit die Östrogenproduktion, die Ovulation des reifen Follikels und in der späteren Zyklushälfte die Entwicklung des Gelbkörpers, welcher Progesteron produziert (BULUN u. ADASHI 2003) Die LH Genexpression wird durch Östrogene herunterreguliert. Nach WOLINSKA-WITFORT et al. (2000) kommt es bei ovarektomierten alten Ratten nach Östradiolgabe zwar zu einer deutlichen Reduktion der LH Genexpression in der Hypophyse, allerdings zu keiner signifikanten Veränderungen im Serum-LH-Level. In Hypophysenzellkulturen verändern weder Östradiol noch Progesteron den LH mRNA Spiegel. Dagegen lassen sich nach Zugaben von GnRH sowohl der mRNA Spiegel von LH als auch die Ausschüttung von LH erhöhen (PARK et al. 1996), was für eine indirekte Steuerung der LH Ausschüttung durch Östrogene über das im Hypothalamus ausgeschüttete GnRH spricht.
2.3.3 Insulin-like-growth-factor-1
Der menschliche Insulin-like-growth-factor-1 (IGF-1), auch als Somatomedin C bekannt, besteht aus einer einzelnen Polypeptidkette mit 70 Aminosäuren und zeigt große strukturelle Ähnlichkeiten zum Insulin (RINDERKNECHT u. HUMBEL 1978).
Postnatales Wachstum und die Organentwicklung sind abhängig vom Growth Hormone (GH), welches seine Wirkung über verschiedene Mediatoren vermittelt, wovon IGF-1 der bekannteste ist. Nach der ursprünglichen „Somatomedin Hypothese“ wurde lange Zeit vermutet, dass der Effekt von GH alleine über das in der Leber produzierte und in den Blutstrom abgegebene Somatomedin vermittelt wird. Dies wurde revidiert als 1980 eine Expression von IGF-1 in fast allen Geweben festgestellt werden konnte. In neueren Untersuchungen wird in Frage gestellt, ob das in der Leber produzierte IGF-1 grundsätzlich für das postnatale Wachstum und die Entwicklung notwendig ist (LE ROITH et al. 2001).
Endometriumbindegewebszellen produzieren IGF-1 sowie die IGF binding proteins (IGFBPs), wobei Epithel – und Bindegewebszellen den zugehörigen
membranständigen IGF-Rezeptor enthalten und damit proliferative Effekte des Endometriums stimulieren. Östrogene stimulieren die IGF-1 Genexpression im Endometrium, was bei ungehinderter Proliferation ein Risiko für Tumorentstehungen im Endometrium darstellen kann. Gleichzeitig wird ein Einfluß des IGF-1 auf die Östrogenaktivität vermutet (RUTANEN 1998). Nach einmaliger Injektion von 17- beta-estradiol an prepubertale ovarektomierte Ratten steigt die IGF-1 mRNA Expression im Uterus deutlich an, wobei keine signifikanten IGF-1 Veränderungen in Leber, Nieren und Serum festgestellte werden können (MURPHY et al. 1987).
2.3.4 Komplementfaktor C3
Komplementfaktor C3 ist eines der ca. 20 Proteine des Komplementsystems, das Bestandteil der humoralen unspezifischen Immunabwehr ist. Unter Östradiolstimulation zeigt sich in Uteri von immaturen Ratten eine Synthese und Ausschüttung eines 180kDa Proteins, welches aus einer 115 kDa und einer 65 kDa Untereinheit besteht. Die cDNA zu diesem Protein in den luminalen Epithelzellen ist homolog zu derjenigen der Komplementkomponente C3. Die Stimulation von C3 als Reaktion auf Östradiol ist spezifisch für das Uterusgewebe, womit C3 einen verlässlichen Marker für die östrogene Reaktion des Uterus darstellt (KOMM et al.
1986; SUNDSTROM et al. 1989)
2.4 Selektive Östrogenrezeptormodulatoren
Substanzen, die in einigen Organen wie Östrogene wirken, in anderen wiederum keine östrogene Wirkung oder sogar eine antiöstrogene Wirkung zeigen, nennt man selektive Östrogen Rezeptor Modulatoren (SERM) (JORDAN 2001). Ein idealer SERM in der HRT wäre eine Substanz ohne Wirkung am Uterus, wo eine alleinige Östrogentherapie ohne Gestagene das Risiko von Endometriumtumoren erhöht (FEELEY u. WELLS 2001). Hinzu sind keine östrogenen Effekte in der Brustdrüse erwünscht, wo Östrogen das Tumorrisiko erhöhen (COLDITZ et al. 1995).
Erwünscht wären die Effekte im ZNS, die klimakterische Beschwerden beseitigen und eventuell eine Alzheimer Erkrankung verhindern (GREENDALE et al. 1998).
Zusätzlich sollte ein idealer SERM Osteoporose (O'CONNELL et al. 1998) und Arteriosklerose (GRODSTEIN et al. 2000) verhindern, die Vagina vor Atrophie und Trockenheit schützen und aufsteigende Infektionen in Vagina und Harnblase sowie Harninkontinenz verhindern (BLAKEMAN et al. 2001). Im Rahmen der Untersuchungen der Phytoöstrogene wird nach Substanzen gesucht, die genau diese SERM Eigenschaften zeigen. In Extrakten der Traubensilberkerze (Cimicifuga racemosa) wurden die gesuchten SERM Eigenschaften mit positiver Wirkung auf Knochen und die Hypothalamus/Hypophysen-Achse gefunden, ohne einen Einfluß auf den Uterus zu zeigen (SEIDLOVA-WUTTKE et al. 2003). Cimicifuga racemosa Extrakte wie z.B. das Klimadynon® (Bionorica) sind als Alternative zur HRT gegen menopausale Beschwerden auf dem Markt. Im Bereich der synthetischen Medikamente ist z.B. Raloxifen als SERM zu erhalten. Es zeigt östrogene Wirkung am trabekulären Knochen und antiöstrogene Effekte an Uterus und Brustgewebe (TOURAINE 2003).
2.5 Phytoöstrogene
Mitte 1940 wurden pflanzliche Isoflavone das erst Mal mit einer hormonellen Wirkung in Verbindung gebracht. Damals traten bei Schafen in Australien, nach hauptsächlicher Aufnahme von Klee (Trifolium subterraneum) massive Zuchtprobleme, das sogenannte „Clover Disease“, auf. Diese Zuchtprobleme beruhten auf dem hohen Gehalt der Isoflavone Formononetin und Biochanin A im Klee, welche von intestinalen Bakterien zu Equol metabolisiert wurden (BENNETTS 1946). Seit dieser Entdeckung sind mehr als 300 Pflanzen gefunden worden, die östrogene Wirkungen in Tieren und Menschen zeigen (BOUE et al. 2003).
Auf Grund ihrer chemischen Struktur können die Phytoöstrogene in vier Hauptgruppen eingeteilt werden: Isoflavone, Flavonoide, Stilbene und Lignane (COS et al. 2003). Die Struktur der meisten Phytoöstrogene ist der des Östrogens sehr ähnlich. Somit kommt es zu unterschiedlich starker Bindung an die ER (BRANHAM et al. 2002). Eine auffallende Eigenschaft der meisten Phytoöstrogene ist das Vorhandensein eines Phenolrings in der chemischen Struktur, der mit wenigen
Ausnahmen die Voraussetzung für die Bindung an den ER darstellt (SETCHELL 1998).
Aus den Daten vieler molekularer und zellbiologischer Experimente sowie tierexperimenteller Versuche und einiger klinischer Versuche am Menschen sind mögliche Vorteile der Phytoöstrogene für die Gesundheit im Zusammenhang mit kardiovaskulären Krankheiten, Tumorerkrankungen, Osteoporose und menopausalen Beschwerden beschrieben. Diese Einflüsse auf die Gesundheit sind einer Vielzahl möglicher östrogenrezeptorabhängiger und rezeptorunabhängiger Mechanismen zuzuschreiben (THAM et al. 1998).
Die Anzahl an postmenopausalen Frauen, welche Soja-Ergänzungen, sei es als Sojaprotein oder als „Isoflavon Pillen“ zu sich nehmen, ist weit über die zur Zeit wissenschaftlich bewiesenen positiven Effekte hinaus gestiegen (CLARKSON u.
APPT 2003). Da die meisten Substanzen auf dem freien Markt ohne jegliche Regulation beschaffbar sind, ist eine Untersuchung auf positive wie auch negative Wirkungen auch höherer Dosen notwendig.
Widersprüchliche Ergebnisse über die Wirkung verschiedener Phytoöstrogene auf die vasomotorischen Wechseljahrbeschwerden, die Hitzewallungen, sind veröffentlicht. Es gibt einige Studien in denen keine Unterschiede zwischen der Gruppe der Behandelten und der Placebo Gruppe bestehen (HIRATA et al. 1997;
QUELLA et al. 2000) sowie andere, die positive Effekte vorweisen (HAN et al. 2002;
UPMALIS et al. 2000).
2.5.1 Daidzein
Abb. 2.1 Strukturformel Daidzein
Daidzein ist das Aglycon des natürlich vorkommenden Daidzin. Dieses befindet sich hauptsächlich in Hülsenfrüchten wie Sojabohnen (Glycine max) und Kichererbsen
(Cicer arietinum L.). Beide Formen sind auch in der Wurzel der Hülsenfrucht Pueraria lobata enthalten. Sie wird in der traditionell chinesischen Medizin u.a. zur Behandlung der Alkoholabhängigkeit genutzt. Die Wirkungen von Pueraria lobata in Bezug auf die Alkoholabhängigkeit beruhen auf Daidzein und Daidzin (KEUNG u.
VALLEE 1993).
In vitro Assays zeigen Daidzein als kompletten Agonisten an beiden ER, wobei die Bindung zum ER größer ist als zu ER (CASANOVA et al. 1999).
In Studien mit jungen Zuchtratten hat die Fütterung von Daidzein keine Auswirkungen auf die Fruchtbarkeit, die Anzahl an männlichen und weiblichen Nachkommen und den Anogenitalabstand der Nachkommen (LAMARTINIERE et al.
2002). PICHERIT et al. (2000) untersuchte die Wirkung von Daidzein bezogen auf den Knochenstoffwechsel. Er stellte fest, dass Daidzein wie Östradiol in der Lage ist, die ovarektomiebedingte Abnahme der Knochendichte im kortikalen, allerdings nicht im Spongiosabereich, zu verhindern. Gleichzeitig zeigte Daidzein in diesen Versuchen an ovarektomierten Ratten keine uterotrope Wirkung.
2.5.2 Equol
Abb. 2.2 Strukturformel Equol
Equol [7-hydroxy-3-(4`-hydroxyphenyl)chroman] wurde erstmals 1932 im Urin trächtiger Stuten gefunden und bekam daher auch seinen Namen (MARRIAN G 1932). Nach Auftreten der „Clover Disease“ in Australien wurde dann begonnen intensiver über Equol zu forschen. Equol ist nicht direkt als Substanz in Pflanzen vorhanden, sondern ein metabolisches Produkt intestinaler Bakterien. Es ist das Endprodukt der Biotransformation des Phytoöstrogens Daidzein, eines der in großer Menge im Soja vorkommenden Isoflavone (SETCHELL et al. 2002). Allerdings ist nur ein Drittel der Menschheit, abhängig von ihrer Darmflora, in der Lage Daidzein zu Equol zu metabolisieren (DECROOS et al. 2005). Equol kommt in Form von R- und S-Isomeren vor, wobei S-Equol, welches bei der intestinalen Verdauung entsteht, die biologisch aktivere Form zu sein scheint (MUTHYALA et al. 2004). Equol zeigt in Bindungsassays mit menschlichen Endometrium Ishikawa Zellen, wie auch die Sojaisoflavone Genistein und Coumestrol, eine starke Affinität zu ER und ER im Vergleich zu weiteren untersuchten Phytoöstrogenen. Hierbei liegt die Bindungspräferenz von Equol eindeutig bei ER (MUELLER et al. 2004). Eine uterotrope Wirkung von Equol bei Mäusen ist sowohl nach Injektion als auch nach Fütterung beschrieben. Eine signifikante Erhöhung des Uterusfeuchtgewichts und der Epitheliumdicke zeigt sich bei SELVARAJ et al. (2004) nur nach Injektion von Equol. In Dosen im Bereich von 1g/kg Futter wird in der Vagina sowohl eine vermehrte Schichtung als auch Verhornung des Epithels beobachtet.
2.5.3 Puerarin
Abb. 2.3 Strukturformel Puerarin
Puerarin ist ein Isoflavon vorkommend in den Wurzeln von Pueraria lobata (chin.:
Ge-Gen), die seit Jahrzehnten in der traditionellen chinesischen Medizin bei den verschiedensten Indikationen Anwendung findet. Mit HPLC Analyse können elf Fraktionen in den Wurzeln von Pueraria lobata gefunden werden, u.a. die Isoflavone Puerarin, Daidzin, Daidzein und Genistein. In Bioassays mit ER positive MCF 7 Zellen, die durch ihre Proliferation die Östrogenität einer Substanz anzeigen, bewirkt von den elf Fraktionen Puerarin die größte Stimulation des Zellwachstums.
Gleichzeitig wird für die Isoflavone eine höhere Bindungsaffinität zu ER beobachtet.
Kombinierte Gaben von Puerarin und dem reinen ER Antagonisten ICI182.780 verhindern die östrogene Aktivität komplett, was eine ER abhängige Wirkungsweise vermuten lässt (BOUE et al. 2003). In Versuchen mit präpubertären Mäusen und ovx Ratten zeigen sich östrogene Wirkungen in Vaginalabstrichen durch eine erhöhte Zahl an Keratozyten. Hinzu kommt ein signifikant vermehrtes Uteruswachstum unter oraler Behandlung mit Puerarin. Allerdings wird keine Veränderung bei intakten erwachsen Mäusen und ein Hemmung des Vaginalwachstums bei östradiolbehandelten Mäusen gesehen. Dies spricht für eine schwache östrogene Wirkung unter Östrogenmangel und einen antiöstrogenen Effekt bei einem hohen Östrogengehalt (ZHENG et al. 2002). Auch in Studien von QI und QI (2002) mit Pueraria Isoflavonen wird in intakten Tieren eine antiöstrogene Wirkung bezogen auf E2 und GnRH Level festgestellt, eine östrogene Wirkung bei ovarektomierten Tieren
2.5.4 Quercetin
Abb. 2.4 Strukturformel Quercetin
Quercetin ist ein bekanntes Flavonoid, welches in einer Vielzahl von Früchten, Gemüsen und Samen, hauptsächlich in Form eines Glycosids zu finden ist. Unsere westliche Ernährung enthält ungefähr 16 mg/Tag Quercetin. Vor allem in den Schalen von Zwiebeln und Äpfeln ist ein hoher Gehalt an Quercetin enthalten, aber auch in Tee und rotem Wein ist es zu finden (HERTOG et al. 1993). Obwohl Quercetin nicht das bedeutendste Flavonoid in unserer Ernährung ist, ist es eines der am häufigsten untersuchten. Die meisten Studien zeigen eine antioxidative Wirkung von Quercetin (WILLIAMS et al. 2004) oder seine Wirkung im Bereich der Karzinogenese, der Entzündung und der kardiovaskulären Erkrankungen (MIDDLETON et al. 2000). Ob Quercetin als Phytoöstrogen klassifiziert werden kann, wird kontrovers diskutiert. Unterschiedliche Ergebnisse sind über die Bindungsaffinität von Quercetin zum ER bekannt (KUIPER et al. 1998; ZAVA u.
DUWE 1997). Einige Studien berichten über eine konzentrationsabhängige, signifikante Stimulation von ER-positiven Zellen durch Quercetin (MAGGIOLINI et al.
2001; VAN DER WOUDE et al. 2003), wobei andere Studien eher eine proliferationshemmende, antiöstrogene Wirkung zeigen (MIODINI et al. 1999;
RANELLETTI et al. 1992).
2.6 Klimakterium und HRT
Das Klimakterium (griechisch: klimaktér „Stufenleiter, kritischer Zeitpunkt im Leben“) oder die Wechseljahre bezeichnet die Zeit der Umstellung vor und nach der Menopause. Die Menopause der Frau ist das physiologische Aufhören der Menstruation (letzte Periode), welches die Fruchtbarkeit der Frau beendet.
Verursacht wird sie durch eine nach und nach abnehmende Funktion der Eierstöcke und der damit verbundenen Verringerung der Hormonkonzentrationen. Ein Jahr nach der Menopause sinkt die Östradiolkonzentration auf sehr geringe Serumwerte.
Zur gleichen Zeit steigt die maximale Konzentration von FSH um den Faktor 18,4 und LH um den Faktor 3,4. Im kommenden Jahren sinkt es wieder schrittweise auf 40-50% dieser Werte (CHAKRAVARTI et al. 1976). Dieses findet physiologisch bei den meisten Frauen zwischen dem 45. und 55. Lebensjahr statt. Die Wechseljahre sind keine Krankheit und 80 % der Frauen sind nicht auf ärztliche Behandlung angewiesen (BECKERMANN 2005). Die vorwiegenden Symptome, deretwegen Frauen einen Arzt aufsuchen, sind Hitzewallungen mit Tachykardien, Schlafstörungen, depressive Stimmungen, Menstruationsunregelmäßigkeiten, vaginale Trockenheit, Inkontinenz und vermehrte Blasenentzündungen.
Hitzewallungen und Tachykardien unter Östrogenmangel werden durch eine Überaktivität des „GnRH-Pulsgernerators“ ausgelöst. Wechselnde Mengen hypothalamischer Neurotransmitter, z.B. Norepinephrine, Serotonin und Dopamin aktivieren die den GnRH-Neuronen nahe gelegenen Neurone. Diese sind für die Regulation der Körpertemperatur und des Herzkreislaufsystems zuständig. Diese Stimulation ist ursächlich für Hitzewallungen und Tachykardien in menopausalen Frauen (NELSON et al. 2006).
Seit es die HRT gibt, wird kontrovers über die Wirkung auf das kardiovaskuläre System diskutiert. Lange Zeit wurde in vielen Studien über einen schützenden Effekt der HRT in Bezug auf das kardiovaskuläre System berichtet, bis der Östrogen/Gestagen Zweig der WHI Studie frühzeitig auf Grund einer erhöhten Rate an Brustkrebs gestoppt wurde. Hier wurde auch eine Erhöhung der koronaren Herzerkrankungen im Vergleich zur Placebogruppe beobachtet (GARBE u. SUISSA 2004).
Als HRT werden reine Östrogenpräparate bei hysterektomierten Frauen oder Östrogen-Gestagen Kombinationspräparate als orale, transdermale oder lokale Anwendungen verwendet. Für viele Frauen scheint das Risiko der HRT gegenüber den Vorteilen zu überwiegen, obwohl es durchschnittlich betrachtet ein geringes ist.
Von 10.000 Frauen der WHI Studie hat die HRT wahrscheinlich nur zu sieben zusätzlichen koronaren Herzerkrankungen, acht Schlaganfällen, acht Lungenembolien und acht Brustkrebserkrankungen geführt. Das Risiko des Kolonkarzinoms wurde dagegen um das Sechsfache und das der Hüftfraktur um das Fünffache verringert (ROSSOUW et al. 2002). Zu bemerken ist allerdings, dass 2002 eine Konsensus-Empfehlung zur HRT herausgegeben wurde, wonach die einzige Indikation zur HRT schwere vasomotorische Symptome und daraus folgende klimakterische Symptome sowie Probleme im Bereich der Urogenitalatrophie sind.
Hierbei sollte auf eine Einstellung in der niedrigsten möglichen Dosis geachtet werden. Im Bereich der Osteoporoseprophylaxe wäre Östrogen geeignet, allerdings durch die notwendige Langzeitanwendung mit potentiellen Risiken verbunden. Nicht geeignet sind Östrogene zur Prävention von koronaren Herzerkrankungen und Schlaganfällen (BECKMANN et al. 2003).
2.7 Uterus und Endometrium im Klimakterium
Hauptaufgabe des Östradiol im Uterus ist die Proliferation und Vorbereitung des Endometriums auf die progesterongesteuerte Sekretionsphase. Östrogen bindet sich an die Östrogenrezeptoren im Stratum basale des Endometriums und steuert die Synthese einer Reihe von Proteinen, einschließlich des Komplementproteins C3, des Progesteronrezeptors und des IGF1 (OEHLER et al. 2000). So wichtig diese Prozesse für die Fortpflanzung sind, desto mehr sind sie ein Problem bei der Langzeitanwendung der HRT. Regelmäßig auftretende auch unzyklische Blutungen werden von vielen Patientinnen als Grund für den Abbruch der HRT angegeben. Die kombinierte Gabe von Progesteron, entweder zyklisch oder dauerhaft, ist Ursache für dieser unregelmäßigen Blutungen. Es ist allerdings wichtig, ein ungestörtes Endometriumwachstum zu verhindern, da es durch die chronische
Östrogenstimulation eventuell zu Hyperplasien und Neoplasien kommen kann (STURDEE 1996). Lange ging man davon aus, dass eine gleichzeitige Einnahme von Progesteron das Risiko an Endometriumtumoren zu erkranken auf Kontrollniveau verringert, bis einige Publikationen Bedenken aufbrachten.
BERESFORD et al. (1997) stellt ein erhöhtes Endometriumkarzinomrisiko bei Frauen fest, auch wenn sie zehn oder mehr Tage pro Monat Östrogen-Progesteron Kombinationen einnehmen.
2.8 Harninkontinenz bei der Frau im Klimakterium
Im Rahmen des Klimakteriums tritt die Harninkontinenz als ein weiteres Symptom bei 10-40 % der Frauen in den Vordergrund (HUNSKAAR et al. 2003). Es kommt zur Harninkontinenz, wenn der Druck in der Harnblase den urethralen Verschlussdruck übersteigt, was auf verschiedenen Ursachen beruht. Eine „instabile Blase“ kann einerseits durch unwillkürliche Kontraktionen des M. detrusor vesicae verursacht werden, was die Form der Dranginkontinenz darstellt. Oder es kommt durch unzureichenden Verschluss der Urethra zur Harninkontinenz, welche in den Bereich der Stressinkontinenz fällt. Häufig betrifft Frauen im Klimakterium eine Mischform (ABRAMS u. WEIN 1998). Östrogene spielen eine wichtige Rolle im Bereich des unteren Harntrakts. ER sind in Vagina, Urethra, Blase und Beckenbodenmuskulatur zu finden (IOSIF et al. 1981). In Untersuchungen von MAKELA et al. (2000) zeigt sich im Epithel von Blase und Urethra eine reine ER mRNA Expression, während ER nur in einigen Bindegewebsbereichen des unteren Harntrakts vorhanden ist.
Untersuchungen an Ratten zeigen unter Einfluss von Östradiol eine Verringerung beider ER in der Blase, allerdings nicht in der Urethra. Daraus lässt sich schließen, dass ein Östrogenmangel für eine unkontrollierte Funktion von Detrusor und Sphinkter Muskel zuständig ist (SEIDLOVA-WUTTKE et al. 2004). Durch den Mangel an Östrogenen nach der Menopause kommt es zu atrophischen Veränderungen in diesem Bereich. Bei 70% der Frauen mit Harninkontinez im Klimakterium kann ein Zusammenhang mit diesem Östrogenmangel festgestellt werden (IOSIF u. BEKASSY 1984). Die Auswertung diverser Untersuchungen von
Inkontinenzerscheinungen bei postmenopausalen Frauen schlussfolgert eine negative Wirkung der Östrogene bzw. eine Steigerung der Harninkontinez durch die Behandlung mit Östrogenen (HENDRIX et al. 2005). WAETJEN und DWYER (2006) empfehlen zum derzeitigen Zeitpunkt keine Östrogene zur Therapie der Harninkontinenz zu verwenden.
3 Material und Methoden
3.1 Tierversuch
3.1.1 Versuchstiere und Haltungsbedingungen
Der Versuch wurde an 127 weiblichen drei Monate alten Sprague-Dawley-Ratten durchgeführt. Diese Tiere wurden in der ZTE des Universitätsklinikums Göttingen für diesen Versuch gezüchtet und bis zum Versuchsbeginn mit phytoöstrogenarmem Alleinfutter (ssniff Spezialdiäten GmbH, Soest) gefüttert. Die Ratten wurden zu 5-6 Tieren in Makrolon®-Käfigen Typ IV bei einer Raumtemperatur von 22-24° und einer relativen Luftfeuchte von 50-55% gehalten. Die Beleuchtung des Raumes erfolgte im 12-Stunden-Rhythmus von 6.00 – 18.00 Uhr. Futter und Wasser standen den Tieren zur freien Verfügung. Zu Beginn des Versuchs lag das durchschnittliche Körpergewicht bei 243 g. Jedem Tier wurde zur Kennzeichnung ein 2,12 x 13 mm großer Transponder (UNO Micro ID®) s.c. im Nackenbereich eingesetzt. Für diesen Tierversuch lag eine Versuchstiergenehmigung der Bezirksregierung Braunschweig vor. (Az.:509.42502/01-36.03)
3.1.2 Ovarektomie
Die Tiere wurden unter CO2 Betäubung i.p. mit einem Gemisch aus 2,25 mg Xylazin (0,11 ml Rompun® 2%, Fa. Bayer) und 18,75 mg Ketamin (0,19 ml Ketavet®, Fa.
Pfizer) in Narkose gelegt. Der Bereich caudal des Rippenbogens wurde rasiert und desinfiziert. Die Bauchhöhle wurde beidseits mit einem ca. 1,5 cm langen Schnitt durch Haut und beide Bauchmuskeln eröffnet und das jeweilige Ovar vorgelagert.
Zwischen Uterushorn und Ovar wurde mit einem sterilen, resorbierbaren Faden (3-0 Vicryl®, Ethicon) ligiert und das Ovar mit einem Skalpell entfernt. Die Muskelschichten wurden mit zwei Knopfheften mittels Nadel-Faden-Kombination (3-0 Vicryl®, Ethicon) genäht und die Haut geklammert (Michel-Klammern, Fa. Martin).
3.1.3 Testsubstanzen
Ab dem Tag der Ovarektomie wurden die Tiere in Gruppen von 11-12 Tieren über drei Monate mit folgendem Futter behandelt:
- Kontrolle Phytoöstrogenarmes Kontrollfutter ohne Testsubstanz - Estradiol n Estradiolbenzoathaltiges Futter (4,3 mg/kg Futter) - Estradiol h Estradiolbenzoathaltiges Futter (17,3 mg/kg Futter) - Dadzein n Daidzeinhaltiges Futter (250 mg/kg Futter)
- Dadzein h Daidzeinhaltiges Futter (1 g/kg Futter) - Equol n Equohaltiges Futter (50 mg/kg Futter) - Equol h Equolhaltiges Futter (400 mg/kg Futter) - Puerarin n Puerarinhaltiges Futter (600 mg/kg Futter) - Puerarin h Puerarinhaltiges Futter (3 g/kg Futter) - Quercetin n Quercetinhaltiges Futter (200 mg/kg Futter) - Quercetin h Quercetinhaltiges Futter (1 g/kg Futter)
Alle Futtermittel wurden von der Fa. Ssniff (ssniff Spezialdiäten Gmbh, Soest) auf Basis von sojafreiem, phytoöstrogenarmem Grundfutter (ssniff SM R/M, 10 mm) hergestellt. Die Zusammensetzung dieses Grundfutters befindet sich im Anhang.
Die Substanzen Equol, Daidzein, Puerarin und Quercetin wurden als Pulver aus China (Changzhou Dahua Imp. & Exp. Group, China) bestellt und der Firma Ssniff zur Einmischung zur Verfügung gestellt. Zur Herstellung des Östradiolfutters wurde der Firma Ssniff -Estradiol 3-Benzoate (E-8515, Lot 121K1402, SIGMA-Aldrich Chemie GmbH, St. Louis, USA) zur Verfügung gestellt.
3.1.4 Versuchsablauf
127 ovarektomierte Ratten wurden, aufgeteilt in 11 Gruppen, über einen Zeitraum von drei Monaten mit den verschiedenen Testsubstanzen in Form von pelletiertem Futter gefüttert. Die Futteraufnahme wurde zweimal wöchentlich kontrolliert, das Körpergewicht einmal monatlich. In der 11. Versuchswoche wurde eine urodynamische Blasendruckmessung und eine vaginalzytologische Probenentnahme
unter Inhalationsnarkose durchgeführt. Am Ende der 13. Woche wurden die Tiere getötet. Um die Zahl der Tierversuchen gering zu halten wurden die Tiere dieses Versuchs zusätzlich in der Woche vor der Ovarektomie sowie in der 12. Versuchswoche einer Knochendichtemessung, mittels Computertomograph (XCT Research SA+, Stratec Medizintechnik, Pforzheim) in Inhalationsnarkose, unterzogen. Die Ergebnisse dieser Messungen sind Bestandteil der Osteoporoseforschung und werden hier auf Grund der zusätzlichen Narkosen der Tiere erwähnt (Wuttke et al. in Vorbereitung).
3.1.5 Urodynamikmessungen
Im Laufe der 11. Fütterungswoche wurde bei allen Tieren eine urodynamische Blasendruckmessung durchgeführt. Die Tiere wurden mittels Maske an ein Inhalationsnarkosegerät (Penlon Sigma Delta, Penlon Ltd. Abingdon, Oxon, UK) angeschlossen und mit Isofluran (Forene® Abbott) anästhesiert. Unter Allgemeinanästhesie wurde den Tieren ein biluminaler zentralvenöser Kleinkinder- Katheter (CS-14402: Pediatric Two-Lumen Central Venous Catheterization Set with Blue FlexTip® Catheter: 4 Fr. x 5-1/8" (13 cm), Arrow) als Blasenkatheter gelegt.
Dieser wurde einerseits über Verbindungschläuche (Original Perfusor®-Leitung, 150 cm, Braun) an eine Infusionspumpe (Perfusor secura®, Braun), andererseits an einen Druckaufnehmer (DPS single-line pressure monitoring kit, Medex Medical, Great Britain) und von hier an ein Blutdruckmessgerät (Siemens sirecus 1281) zur hydrostatischen Blasendruckmessung angeschlossen. Sobald die Katheterspitze im Bereich der Blase lag, wurde über einen Zeitraum von 30 sec. 0,5 ml NaCl-Lösung (isotonische 0,9% Kochsalzlösung, Braun, Melsungen) in die Blase infundiert. Nach einer Minute folgte eine weitere Infusion von 0,5 ml über 30 sec.. Die Druckmessung über vier Minuten startete mit Beginn der ersten NaCl Infusion in die Blase.
3.1.6 Vaginalzytologische Proben
Im Anschluss an die urodynamische Messung wurde von jedem Tier eine Vaginalspülprobe entnommen. Hierzu wurde die Vagina mittels einer Pipettenspitze
(Biospere® Filter Tips 1000 µl blue, Sarstedt, Nümbrecht) mit aufgesetztem Pileusball mit 0,2 ml NaCl –Lösung (isotonische 0,9% Kochsalzlösung, Braun, Melsungen) gespült und die Spüllösung daraufhin auf einem Objektträger (microscope slides, Knittel Gläser) an der Luft getrocknet und fünf Minuten mit Methanol (J.T.Baker, Deventer, Holland) fixiert.
Später wurden die Proben 20 Minuten mit 3% Giemsa Lösung (Merck) gefärbt.
3.1.7 Ende des Versuchs
Nach dreimonatiger Fütterung wurden die Tiere unter CO2 Betäubung dekapitiert.
Das Blut wurde über einen Trichter gesammelt, direkt auf Eis gekühlt und später zur Serumgewinnung zentrifugiert (3000 g, 20 min). Für diese Arbeit wurden die Hypophyse, der Uterus und die Vagina entnommen. Die Hypophyse und eine Hälfte des Uterus von jedem Tier wurden direkt in flüssigem Stickstoff schockgefroren und somit die RNA für die weitere molekularbiologische Aufarbeitung erhalten. Die zweite Uterushälfte und die Vagina wurden jeweils für die weitere histologische Aufarbeitung in 10% Formalin fixiert.
3.2 Molekularbiologische Methoden 3.2.1 Aufteilung der Proben
Das Gewebe von Uterus und Hypophyse wurde für die Genexpression aufgearbeitet.
Da nicht alle 127 Proben der 11 Behandlungsgruppen in einem Arbeitsgang aufgearbeitet werden konnten, wurden diese in 6 Aufarbeitungen mit je 2 Proben pro Gruppe bearbeitet. Die unter den gleichen Reaktionsbedingungen verarbeiteten Proben wurden später in der statistischen Auswertung direkt miteinander verglichen.
Somit soll verhindert werden, dass eventuell labortechnisch bedingte Schwankungen während der Reaktion sich fehlerhaft auf die Auswertung auswirken.
3.2.2 Isolierung der RNA
Bei der Aufarbeitung der RNA wurde unter besonderen hygienischen Standards gearbeitet. Um Kontaminationen zu verhindern, wurde mit ethanol-gereinigten Einmalhandschuhen gearbeitet. Für die Isolierung der Gesamt-RNA muss vom Zeitpunkt der Gewebeentnahme bis zum Einfrieren eine ununterbrochene Kühlkette gewährleistet sein. Die Gewebeproben von Uterus und Hypophyse wurden direkt nach der Entnahme in Schraubröhrchen (Mikro-Schraubröhrchen 1,5 ml, Sarstedt, Nümbrecht) verpackt und in flüssigem Stickstoff transportiert, um sie dann bis zur Weiterverarbeitung bei -70°C zu lagern.
Die Isolierung der RNA erfolgte mit dem RNeasy® Mini Kit (Fa. QIAGEN, Hilden).
3.2.2.1 Homogenisieren der Gewebe
Das Uterusgewebe wurde mittels einer Stahlkugel in vorgekühlten Teflonschüttelgefäßen im Mikro-Dismembrator (Fa. Braun, Melsungen) pulverisiert und ca. 20 mg dieses noch gefrorenen Pulvers in ein mit 600 µl RLT-Lysispuffer (aus RNeasy Mini Kit, QIAGEN, Hilden) vorbereitetes Well einer 24-Wellplatte (Tissue Culture Plate 24 Well, Sarstedt,Newton, USA) verbracht. Das Hypophysengewebe wurde mittels einer Kanüle direkt in 300 µl RLT-Lysispuffer im Mikroschraubröhrchen zerkleinert. Alle Proben wurden anschließend für 10 sec. im Ultraschallbad (Bransonic 32) weiter homogenisiert.
3.2.2.2 RNA-Extraktion
Das gewonnene Lysat wurde auf eine QIAshredder-Säule in einem 2 ml- Sammelröhrchen gegeben und bei 10.000 rpm 2 Minuten zentrifugiert (EBA 12, Hettich Zentrifugen, Schütt Labortechnik, Göttingen). Zu dem Lysat wurde die zum Lysispuffer äquivalente Menge (600 bzw. 300 µl) 70% Ethanol (J.T. Baker, Deventer, Holland) gegeben und dieses durch mehrmaliges Aufziehen mit der Pipette vermischt. Dieses Lysat-Ethanolgemisch wurde auf RNeasy Mini- Zentrifugensäulchen mit Kieselgelmembran in Sammelröhrchen gegeben und 15 sec. bei 10.000 rpm zentrifugiert. Es folgten 3 Waschschritte (1. 700 µl RW1 Puffer, 15 sec., 10.000 rpm; 2. und 3. 500 µl RPE Puffer, 15 sec. bzw. 2 min,
10.000 rpm). Die nun getrocknete RNA enthaltende Kieselgelmembran-Säule wurde in ein neues Eppendorfgefäß gestellt und die RNA mittels 50 µl RNase-freiem Wasser eluiert (1 min, 10.000 rpm). Alle Schritte wurden zügig und auf Eis ausgeführt.
3.2.2.3 Konzentration und Reinheitsbestimmung der RNA
Mit einer Mischung aus 5 µl der RNA Lösung und 75 µl RNAse-freiem-Wasser wurde eine photometrische Absorptionsmessung bei 260 nm und 280 nm durchgeführt (biophotometer, Eppendorf, Hamburg). Die Proben wurden mittels Verdünnung mit RNAse-freiem-Wasser auf eine einheitliche RNA-Konzentration eingestellt, um quantitative Vergleiche der Ergebnisse möglich zu machen. Die Uterus-Proben wurden auf 16 ng/µl, die Hypophysen-Proben auf 20 ng/µl eingestellt.
3.2.3 Reverse Transkription
Mit der RNA abhängigen DNA-Polymerase, Reverse Transkriptase, wurde mRNA in amplifizierbare cDNA umgeschrieben. Als Primer dienten sequenzunspezifische
„random“-Hexamere. Die reverse Transkription wurde mit der M-MLV Reverse Transkriptase (PROMEGA, Madison, USA) durchgeführt. Die 20 µl Reaktionsvolumen setzten sich wie folgt zusammen:
10 µl RNA
1 µl (1:30 verd. Random Primer (INVITROGEN) 3 µl RNAse-freies Wasser
Diese Mischung wurde 10 Minuten bei 70°C inkubiert, um Sekundärstrukturen der RNA, die sich bei Raumtemperatur bilden, zu lösen. Folgende Substanzen wurden dann zu dieser Mischung hinzu pipettiert.
4 µl M-MLV RT 5 x Reaction Buffer (Promega, Madison, USA) 1 µl dNTP-Mix (INVITROGEN)
1 µl M-MLV Reverse Transkriptase (Promega, Madison, USA) 0,1 µl RNAsin (INVITROGEN)
Dieser Reaktionsansatz wurde dann im Thermocycler (TRIO Thermoblock, Biometra, Göttingen) wie folgt inkubiert:
10 Min. Primer-Annealing bei 22°C 50 Min. Gegenstrangsynthese bei 42°C 10 Min. Denaturierung bei 95°C
Die entstandene cDNA wurde direkt auf Eis schockgefroren, zentrifugiert und bei -20°C eingefroren.
3.2.4 Taqman®-PCR
Bei der TaqMan-PCR findet die Amplifikation und der Nachweis des PCR-Produkts simultan in einem Reaktionsgefäß statt. Sie erlaubt eine quantitative Echtzeitanalyse der PCR über die Messung von laserinduzierten Fluoreszenzsignalen. Zum PCR- Ansatz wird neben den spezifischen Primern, sense und antisense, eine sequenzspezifische Hybridisierungssonde gegeben. Diese ist am 3`-Ende mit einem Quencherfarbstoff und am 5`-Ende mit einem fluoreszierenden Reporterfarbstoff markiert. Wenn die intakte Sonde durch Licht einer spezifischen Wellenlänge (488 nm) angeregt wird, wird die Fluoreszenz-Emission des Reporterfarbstoffs durch die räumliche Nähe zum Quencher durch einen Fluoreszenz-Energietransfer (FET) unterdrückt. Während der PCR-Reaktion wird die hybridisierte DNA-Sonde durch die 5`-3`-Exonukleaseaktivität der Taq-Polymerase zerschnitten. Durch die Sondenhydrolyse wird die räumliche Nähe zwischen Reporter und Quencher unterbrochen und der Reporterfarbstoff kann das Fluoreszenzlicht emittieren. Die Hydrolyse der Sonde kann nur dann erfolgen, wenn es zu einer sequenzspezifischen Hybridisierung zwischen Sonde und Zielsequenz kommt. Entsprechend der Amplifikation des spezifischen PCR-Fragmentes steigt das Fluoreszenzsignal an.
Dabei ist die Fluoreszenzzunahme dem Zuwachs an PCR-Amplifikat direkt proportional. Die Veränderung der Fluoreszenz wird mit Hilfe des ABI PRISM 7700 Sequence Detectors (Fa. PE Applied Biosystems GmbH, Darmstadt) erfasst. Zur Quantifizierung des cDNA-Gehaltes der Proben wurden die Ergebnisse in Vergleich zu einer Standardkurve gesetzt. Die Standardkurve bestand aus mindestens fünf 1:10 Verdünnungen einer cDNA, welche der nachzuweisenden Sequenz entsprach und deren Konzentration bekannt war.
3.2.4.1 Auswahl der Sonden und der PCR Primer
Folgende Punkte sollten bei der Auswahl der Sonde berücksichtigt werden:
Das 5`-Ende der Sonde sollte sich in relativer Nähe des 3`-Endes des PCR Primers befinden.
Die Sondenlänge sollte 20 bis 30 Basenpaare umfassen.
Der GC-Gehalt sollte 40-60% betragen.
Am 5`-Ende der Sonde darf kein G liegen.
Es dürfen niemals 3x dieselbe Base hintereinander vorkommen.
Es darf keine Komplementarität zwischen Sonde und PCR Primer vorliegen.
Folgende Punkte sind bei der Auswahl der Primer zu berücksichtigen:
Die Primer sollten eine Länge von 20-30 Basen haben Der GC Gehalt darf nicht größer als 60% sein.
Der GC Gehalt sollte bei beiden Primern möglichst gleich groß sein
AT und GC-reiche Regionen sowie Strecken mit Polypurinen und Polypyrimidinen sollten vermieden werden.
Folgende Sonden und Primer wurden für diese Arbeit verwendet:
LH beta (CHIN et al. 1983):
Sense Primer: 5`-ACCTTCACCACCAGCATCTGT-3`
Antisense Primer: 5`-AGCTCACGGTAGGTGCACACT-3`
TaqMan Sonde: 5`FAM-CTGCCTTGCCTCCCGTGCCTCA-TAMRA3
TERP1 (FRIEND et al. 1995):
Sense Primer: 5`-TTGAACAGCGACCAGGCTTT-3`
Antisense Primer: 5`-AGTTAGGAGCAAACAGGAGCTTCC-3`
TaqMan Sonde: 5`-FAM-ATGATTGGTCTGGTCTGGCGCTCCA-TAMRA3`
ER (SPREAFICO et al. 1992):
Sense Primer: 5`-AAGCTGGCCTGACTCTGCAG-3`
Antisense Primer: 5`-GCAGGTCATAGAGAGGCACGA-3`
TaqMan Sonde: 5`FAM-CGTCTGGCCCAGCTCCTCCTCATC-TAMRA3`
Er (Gen Bank Accession No.: NM_12754, vom eigenen Labor entworfen) Sense Primer: 5`-CTTAGTTCCCTGCTTCCT-3`
Antisense Primer: 5`-TACTCATGGCGGTTGTCT-3`
TaqMan Sonde: 5`-FAM-TACATCCCTTCCTCCT-TAMRA3`
PR (PARK-SARGE u. MAYO 1994):
Sense Primer: 5`-CTGGTTCCGCCACTCATCAA-3`
Antisense Primer: 5`-TCAGGCTCATCCAGGAGTACTGA-3`
TaqMan Sonde: 5`FAM-CCGACACTTCCAGCTCTTTGCTGACCA-TAMRA3`
IGF-1 (SCHOENFELD et al. 1998):
Sense Primer: 5`-TGTCGTCTTCACATCTCTTCTACCTG-3`
Antisense Primer: 5`-CCACACACGAACTGAAGAGCGT-3`
TaqMan Sonde: 5`FAM-TTACCAGCTCGGCCACAGCCGGAC-TAMRA3`
C3 (MISUMI et al. 1990):
Sense Primer: 5`-CTGTACGGCATAGGGATATCACG-3`
Antisense Primer: 5`-ATGCTGGCCTGACCTTCAAGA-3`
TaqMan Sonde: 5`FAM-TGCCATCCTCACAACACTTCCGCAG-TAMRA3`
3.2.4.2 Durchführung der PCR
Vorerst wurde ein 2 fach Taqman-PCR-Puffer aus Eurogentec-Reagenzien (Eurogentec, Köln) angesetzt. Dieser wurde jeweils für 1000 Reaktionen hergestellt und war nach dem Zusammenmischen für 1 Monat, bei Kühlschranktemperatur gelagert, zu verwenden. Er bestand aus folgenden Reagenzien:
2500 µl 10 x Reaction Buffer 1750 µl 50 nM MgCl2
1000 µl 5,0 mM dNTP-Mix
125 µl PCR Enzym 250 µl UNG
6875 µl Ampuwa
Für die Taqman-PCR wurde eine 96 Well Mikrotiterplatte (MicroAmp Optical 96-Well reaction Plate, PE Applied Biosystems, Weiterstadt) mit folgender Mischung (je 25 µl pro Well) gefüllt und danach mit optischen Deckelketten (MicroAmp Optical Caps, PE Applied Biosystems, Weiterstadt) verschlossen.
Terp1 / PR / IGF1 ER alpha C3 c-DNA der Probe
bzw. Verd. des STD
2 µl 2 µl 2 µl
2 fachTaqman- PCR-Puffer
12,5 µl 12,5 µ 12,5 µ
Primer sense 0,75 µl (300 nM) 0,125 µl (50 nM) 2,25 µl (900 nm) Primer antisense 0,75 µl (300 nM) 2,25 µl (900 nm) 2,25 µl (900 nm) Sonde 0,5625 µl (225 nM) 0,5625 µl (225 nM) 0,5625 µl (225 nM)
Ampuwa 8,4375 µl 7,5625 µl 5,4375 µl
ER beta c-DNA der Probe
bzw. Verd. des STD 2 µl
2 fachTaqman- PCR-Puffer
12,5 µl
Primer Mix 1,25 µl Sonden Mix 1,25 µl
Ampuwa 8 µl
Zur Analyse wurde die gefüllte 96-Well Mikrotiter Platte in das ABI PRISM 7700 Sequence Detection System verbracht und folgende Zyklen wurden durchlaufen.
Terp1 / PR / IGF1 / ER alpha / C3 ER beta
2 min 50°C 2 min 50°C
10 min 95°C 10 min 95°C
15 sec 95°C 15 sec 95°C
1 min 60°C (40 Zyklen) 30 sec 56°C, 30 sec 76°C (40 Zyklen)
Über jedem Well befand sich eine Linse, welche den Strahl eines Argon-Lasers (488 nm), zur Fluoreszenzanregung weiterleitete. Auch die Fluoreszenzemission wurde auf diesem Weg gemessen und von einem Power Macintosh 4400 gemessen.
Die gemessenen Fluoreszenzemissionen wurden in Verhältnis mit der Standardkurve betrachtet und später statistisch ausgewertet.
3.3 Hormonanalytik
Das zum Ende des Versuchs gewonnene Serum wurde zur Analytik der LH und Östradiol Menge genutzt. Diese Hormone wurden nach dem Prinzip des Radioimmunoassays bestimmt, wobei radioaktive und nicht radioaktive Antigene um eine begrenzte Anzahl von Antikörperbindungsstellen konkurrieren. Die Menge der radioaktive markierten Antigene, welche an die Antikörper gebunden sind, ist umgekehrt proportional zur Konzentration der Probe. Die Trennung von freiem Antigen und vom Antigen-1.Antikörper-Komplex erfolgt durch Fällung mit einem 2.Antikörper. Die Radioaktivität wurde mit dem Gamma Counter Wizard 1470 (WALLAC, Schweden) gemessen und mit dem RIA-CALC-Programm ausgewertet.
Für die LH Messung wurden die Materialien vom National Institute of diabetes and digestive and kidney disease (NIDDK, Baltimore, USA) zur Verfügung gestellt. Der 2. Antikörper war eine laboreigene Herstellung. Zur Bestimmung der Östradiolwerte wurde folgendes Kit verwendet: 3rd Generation Estradiol RIA DSL-39100 (Diagnostic Systems Laboratories, Texas, USA).
3.4 Histologische Methoden
Bei der Sektion der Tiere wurde pro Tier eine Hälfte von Uterus und Vagina für 48 h in 10% Formalin fixiert. Diese Organe wurden in mehrere Querschnitte geteilt und im Entwässerungsautomat (TP 1020, Leica) dehydriert und daraufhin in Paraffin eingebettet. Später wurden mehrere 4 µm Schnitte mit Hilfe des Mikrotoms (RM 2135, Leica) angefertigt und diese auf Objektträger (SuperFrost®Plus, Menzel GmbH, Braunschweig) aufgebracht. Alle Schnitte wurden nach Standardprotokoll mit HE-Färbung (Mayers Hämalaunlösung, Merck, Darmstadt; Eosin gelblich, Merck, Darmstadt) gefärbt.
Die Schnitte wurden mit dem Axiophot Mikroskop (Zeiss), mit integrierter digitaler Kamera, welches mit dem Computersystem AnalySIS 3.0 (Soft Imaging System GmbH, Münster) verbunden ist, begutachtet und fotografiert. Kriterien zur Beurteilung der Schnitte wurden dem „Handbook of Toxicologic Pathology“
(HASCHEK WANDA M. 1991) entnommen.
3.5 Statistische Auswertung
Für die statistische Auswertung wurde das Computerprogramm PRISM® (GraphPad, San Diego, USA) benutzt.
Bei der Auswertung der Genanalysen wurde mit Prozentwerten gearbeitet um labortechnisch bedingte Schwankungen, zwischen den absoluten Messwerten der verschiedenen Aufarbeitungsgruppen, zu verhindern. Die ovarektomierten Tiere in der Kontrollgruppe dienten als Vergleichstiere und wurden 100% gleichgesetzt und alle anderen Behandlungsgruppen dazu in Relation gesetzt.
Aus den Werten aller Proben einer Behandlungsgruppe wurde der Mittelwert und der Standardfehler des arithmetischen Mittelwerts (SEM) bestimmt und graphisch in Säulendiagrammen dargestellt. Die Signifikanz wurde mit einer einfachen Varianzanalyse für wiederholte Messungen eines Faktors (ANOVA) und anschließendem Dunnett`s Comparison Test festgestellt. Hierbei wurde jeweils die Kontrollgruppe mit den 2 unterschiedlichen Dosierungen der substanzgefütterten Gruppen verglichen. Das Signifikanzniveau in den Versuchen wurde auf p<0,05 gesetzt und in den Graphen mit * gekennzeichnet.
4 Ergebnisse
4.1 Futteraufnahme
-1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0
Kontrolle Equol n
Equol h Daidzein n
Daidzein h
Puerarin n Puerarin h Quercetin n Quercetin h E2 n
E2 h
Ovx
SF
Urod.
CT1 Wochen CT2
Gewicht in g
Abb. 4.1 Futteraufnahmeverlauf über 3 Monate bei den verschiedenen Tiergruppen
Durchschnittliche Futteraufnahme Durchschnittliche Substanzaufnahme
pro Tier/Tag pro Tier/Tag
Kontrolle 17,65 g
E2 n (4,3 mg/kg) 16,33 g 0,07 mg
E2 h (17,3 mg/kg) 11,65 g * 0,20 mg
Daidzein n (250 mg/kg) 17,89 g 4,47 mg
Daidzein h (1 g/kg) 15,84 *g 15,84 mg
Equol n (50 mg/kg) 18,35 g 0,92 mg
Equol h (400 mg/kg) 16,36 g 6,54 mg
Puerarin n (600 mg/kg) 17,49 g 10,49 mg
Puerarin h (3 g/kg) 16,08 g * 48,24 mg
Quercetin n (200 mg/kg) 17,73 g 3,55 mg
Quercetin h (1 g/kg) 18,42 g 18,42 mg
Tab. 4.1 Durchschnittliche Futteraufnahme der unterschiedlichen Tiergruppen und daraus errechnete durchschnittliche Substanzmengenaufnahme. * P< 0,05 vs. Kontrolle
Die durchschnittliche Futteraufnahme, berechnet auf das durchschnittliche Tiergewicht der jeweiligen Gruppe (Abb. 4.1 und Tab. 4.1) lag zwischen 11,65 g pro Tier und Tag (E2 h) und 18,42 g pro Tier und Tag (Quercetin h). Im Verlauf der Futteraufnahme war zu sehen, dass die Östradiol gefütterten Gruppen in den ersten 4 Wochen deutlich weniger Futter aufnahmen als die restlichen Tiere. Ab der 5.
Fütterungswoche lag nur noch die E2 h Gruppe deutlich unter den Werten der anderen Tiere. In der 12. Woche war bei allen Tiere gleichermaßen ein Rückgang der Futteraufnahme zu sehen. In dieser Woche wurden zwei aufeinander folgende Narkosen für die Urodynamikmessung und die CT2 Messung durchgeführt.
4.2 Körpergewicht
-1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
200 225 250 275 300 325 350 375
Kontrolle
Equol n Equol h Daidzein n Daidzein h
Puerarin n Puerarin h Quercetin n Quercetin h E2 n E2 h
SF
Ovx Urod.
CT1 Wochen CT2
Gewicht in g
Abb. 4.2 Durchschnittliches Gewicht der Tiere in den verschiedenen Tiergruppen
Kontrolle E2 n E2 h
Daidzein n Daidzein h
Equol n Equol h
Puerarin n Puerarin h
Quercetin n Quercetin h -20
-10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
* p < 0,05
vs. Kontrolle * *
*
*
*
Körpergewichtsdifferenz während der 3 Monate in g
Abb. 4.3 Körpergewichtsveränderungen im Verlauf der 3 Monate. Alle Gewichtsveränderungen sind im Verhältnis zum jeweiligen Durchschnittsgewicht der Tiergruppe zu Beginn der Substanzfütterung berechnet. n = 11-12 Tiere/Behandlungsgruppe
Alle Tiere wurden bis zur Ovarektomie mit sojafreiem Rattenfutter gefüttert.
Abgesehen von den Östradiol gefütterten Tieren haben alle Tiere nach der Umstellung auf die substanzhaltigen Futtermittel kontinuierlich an Gewicht zugenommen (Abb. 4.2). Beide Östradiol Gruppen zeigten in der ersten Woche nach Umstellung eine geringe Gewichtsabnahme, dann allerdings eine Gewichtszunahme (E2 n) bzw. ein Halten des Körpergewichts (E2 h). Über die gesamten 3 Monate betrachtet (Abb. 4.3) sah man eine signifikant geringere Körpergewichtszunahme bei E2 n (-8,17±2,48 g) und E2 h (27,42±4,59 g), sowie Equol h (76,42±3,53 g), Daidzein h (77,18±4,95 g) und Puerarin h (47,91±3,0 g) im Verhältnis zur sojafreien Kontrolle.
