Einfluss der Spenderzelldifferenzierung auf die Effizienz des somatischen Kerntransfers beim Schwein

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Detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über http://dnb.ddb.de abrufbar.

1. Auflage 2006

ISBN 3-938026-82-0

Verlag: DVG Service GmbH Frankfurter Straße 89

35392 Gießen 0641/24466 geschaeftsstelle@dvg.net

www.dvg.net

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Aus dem Institut für Tierzucht (Mariensee) der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft (FAL)

Braunschweig

Einfluss der Spenderzelldifferenzierung auf die Effizienz des somatischen Kerntransfers beim Schwein

I NAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer DOKTORI N DER VETERI NÄRMEDIZI N

(Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von Nadine Hornen

aus Witten

Hannover 2006

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Wissenschaftliche Betreuung: Apl.-Prof. Dr. H. Niemann

1. Gutachter: Apl.-Prof. Dr. H. Niemann

2. Gutachter: Priv.-Doz. Dr. A. Petrunkina

Tag der mündlichen Prüfung: 30.05.2006

Die vorliegende Arbeit wurde von der H. WILHELM SCHAUMANN-Stiftung gefördert.

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Meinen Eltern, meiner Schwester Nicole

und Karsten

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1 Einleitung ...- 1 -

2 Schrifttum ...- 3 -

2.1 Physiologische Grundlagen ...- 3 -

2.1.1 Befruchtung und Embryonalentwicklung beim Schwein...- 3 -

2.1.2 Spenderzellen im somatischen Klonen ...- 7 -

2.1.2.1 Differenzierung ...- 7 -

2.1.2.2 Pluripotenz, Totipotenz ...- 8 -

2.1.2.3 Primäre und permanente Zelllinien ...- 10 -

2.1.2.4 Relevante Aspekte des Zellzyklus...- 11 -

2.2 Biotechnologische Grundlagen...- 13 -

2.2.1 In-vitro-Reifung porziner Oozyten...- 13 -

2.2.2 In-vitro-Entwicklung von Schweineembryonen ...- 14 -

2.2.3 In-vitro-Entwicklung porziner parthenogenetischer Embryonen...- 16 -

2.2.4 Transfer porziner Embryonen auf Empfängertiere ...- 20 -

2.3 Somatisches Klonen beim Schwein...- 22 -

2.3.1 Effizienz des Kerntransfers bei unterschiedlichen Spezies...- 22 -

2.3.2 Einflussfaktoren auf die Effizienz des Kerntransfers und die anschließende Entwicklung des Embryos ...- 24 -

2.3.2.1 Kerntransferverfahren ...- 24 -

2.3.2.2 Spenderzelle ...- 27 -

2.3.2.3 Empfängerzelle...- 29 -

2.3.2.4 Qualität und Entwicklungspotential der erstellten Oozyten-Spenderzell- Komplexe ...- 29 -

2.3.3 In-vitro- und In-vivo-Entwicklungspotential porziner Kerntransferembryonen...- 30 -

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2.4 Einfluss der Donorzellen auf die Kloneffizienz ...- 34 -

2.4.1 Donorzelltypen ...- 34 -

2.4.1.1 Blastomeren...- 34 -

2.4.1.2 Embryonale Stammzellen ...- 34 -

2.4.1.3 Primordiale Keimzellen...- 35 -

2.4.1.4 Adulte Stammzellen ...- 36 -

2.4.1.5 Differenzierte Zellen ...- 37 -

2.4.1.6 Fetale somatische Stammzellen (FSSCs)...- 37 -

2.4.2 Rolle des ‚Nuclear Reprogramming’ ...- 39 -

3 Material und Methoden ...- 45 -

3.1 Ziele und experimentelles Design...- 45 -

3.2 Arbeitsmaterialien...- 46 -

3.2.1 Pipetten...- 46 -

3.2.2 Medien...- 47 -

3.2.2.1 Zellkulturmedien ...- 47 -

3.2.2.2 Medien für den Kerntransfer ...- 47 -

3.3 Oozyten als Empfängerzellen für den Kerntransfer...- 47 -

3.3.1 Gewinnung von Kumulus-Oozyten-Komplexen...- 47 -

3.3.2 In-vitro-Reifung der Kumulus-Oozyten-Komplexe...- 48 -

3.3.3 Präparation der Kumulus-Oozyten-Komplexe für Kerntransfer bzw. Parthenogenese...- 49 -

3.4 Gewinnung, Kultur und Präparation der Donorzellen ...- 49 -

3.4.1 Erstellung einer Explantatkultur...- 49 -

3.4.2 Kultivierung der Spenderzellen...- 51 -

3.4.3 Zellzyklusbestimmung der FSSCs aus gepickten Kolonien und Sphäroiden...- 53 -

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3.4.4 Präparation der Spenderzellen für den Kerntransfer ...- 54 -

3.5 Kerntransfer ...- 55 -

3.5.1 Enukleation...- 55 -

3.5.2 Transfer der Spenderzellen in enukleierte Oozyten ...- 57 -

3.5.3 Fusion der Oozyten-Spenderzell-Komplexe ...- 59 -

3.5.4 Artifizielle Aktivierung ...- 60 -

3.5.4.1 Elektrische Aktivierung...- 60 -

3.5.4.2 Chemische Aktivierung...- 60 -

3.6 Erstellung parthenogenetischer Embryonen ...- 61 -

3.7 In-vitro-Entwicklung porziner Kerntransfer-Embryonen...- 61 -

3.7.1 In-vitro-Kultur porziner Kerntransfer-Embryonen ...- 61 -

3.7.2 Beurteilung der in-vitro-Entwicklung ...- 62 -

3.7.2.1 Bestimmung der Blastozystenrate...- 62 -

3.7.2.2 Qualität der Blastozysten ...- 62 -

3.7.2.2.1 Bestimmung der Kernzahlen...- 62 -

3.7.2.2.2 Bestimmung von Inner-Cell-Mass und Trophektoderm mittels Differentialfärbung...- 63 -

3.8 In-vivo-Entwicklung porziner Kerntransfer-Embryonen...- 64 -

3.8.1 Synchronisation der Empfängertiere...- 64 -

3.8.2 Transfer porziner Kerntransfer-Embryonen im Zygotenstadium...- 64 -

3.8.3 Aufrechterhaltung der Trächtigkeit...- 65 -

3.9 Statistische Auswertung...- 66 -

4 Ergebnisse ...- 67 -

4.1 Zellzyklusbestimmung der FSSCs aus gepickten Kolonien und Sphäroiden ...- 67 -

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4.2 Versuch 1: Einsatz von FSSCs aus isolierten Kolonien als

Spenderzellen im Kerntransfer...- 68 -

4.2.1 Blastozystenraten ...- 68 -

4.2.2 Durchschnittliche Kernzahlen ...- 69 -

4.3 Versuch 2: Einsatz von FSSCs unterschiedlicher Größe aus Sphäroiden als Spenderzellen im Kerntransfer ...- 70 -

4.4 Versuch 3: Einsatz von FSSCs mittlerer Größe aus Sphäroiden als Spenderzellen im Kerntransfer...- 72 -

4.4.3 Verhältnis von Inner-Cell-Mass und Trophectoderm-Zellen...- 75 -

4.5 In-vivo-Entwicklung rekonstruierter Kerntransferembryonen ...- 75 -

5 Diskussion ...- 80 -

5.1 FSSCs im somatischen Kerntransfer...- 81 -

5.2 Zusammenfassende Betrachtung und Ausblick ...- 86 -

6 Zusammenfassung...- 89 -

7 Summary ...- 92 -

8 Literaturverzeichnis...- 95 -

9 Abkürzungsverzeichnis...- 123 -

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10 Anhang ...- 126 -

10.1 Zellkulturmedien ...- 126 -

10.2 Medien für den Kerntransfer ...- 127 -

11 Abbildungsverzeichnis ...- 129 -

12 Tabellenverzeichnis...- 131 -

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1 Einleitung

Der somatische Kerntransfer (=Klonen) ist, sowohl für die Grundlagenforschung, als auch für die Erstellung transgener Tiere eine viel versprechende Methode. Durch gezielte Veränderungen des Erbgutes der Spenderzellen können identische Gruppen transgener Tiere erstellt werden mit Einsatzbereichen in der Landwirtschaft und Biomedizin (KUES u.

NIEMANN 2004). Seit dem ersten aus somatischen Zellen geklonten Tier, dem Klonschaf

„Dolly“ (WILMUT et al. 1997), sind bis heute elf Säugetierspezies erfolgreich geklont worden. Trotz intensiver Bemühungen, die Methode des somatischen Kerntransfers und die in-vitro-Kulturtechniken zu verbessern, ist jedoch die Effizienz des Klonens bei allen Spezies noch gering. Beim Rind können zwar Erfolgsraten von 15-20% (Nachkommen/übertragene Embryonen) erreicht werden, aber gerade bei Klonkälbern kann es zu Wachstumsabnormalitäten, wie erhöhtes Geburtsgewicht und vergrößerte Plazenta (das so genannte Large Offspring Syndrom) kommen. Bei allen anderen Spezies liegen die Effizienzen <3%. Beim Schwein resultieren weniger als 1% der rekonstruierten Embryonen in der Geburt eines geklonten Ferkels (KUES u. NIEMANN 2004). Die Gründe für die, im Vergleich zum Rind, geringeren Erfolgsraten liegen zum einen wahrscheinlich in einer noch nicht so ausgefeilten in-vitro-Kulturtechnik und zum anderen darin, dass mindestens 4 lebensfähige Embryonen benötigt werden, um die porzine Gravidität zu erkennen und aufrecht zu erhalten (RÜSSE 1999).

Für die geringe Effizienz wird vor allem eine unzureichende oder fehlerhafte Rückprogrammierung der Spenderzellen verantwortlich gemacht (JAENISCH et al. 2002).

Insbesondere dem Differenzierungsgrad der Spenderzellen wird eine große Bedeutung für den Erfolg des Klonens zugeschrieben. Je weniger eine Zelle differenziert ist, umso weniger muss sie zurückprogrammiert werden. Mittlerweile wurden verschiedene Spenderzelltypen auf ihre Fähigkeit hin geprüft, gesunden geklonten Nachwuchs hervorzubringen. Die meisten unterstützen zwar die Entwicklung bis zur Blastozyste, aber viele führten nicht zu einer weiteren Entwicklung nach Transfer auf Empfängertiere (KATO et al. 2000; WAKAYAMA u. YANAGIMACHI 2001). Sowohl mit Stammzellen, als auch mit differenzierten Zellen konnten erfolgreich Nachkommen geklont werden. Bei der Maus konnte durch den Einsatz von embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) die Effizienz des Klonen um das 5-15fache (15%) gegenüber 1-3%, Nachkommen/übertragene Embryonen, bei differenzierten Zellen gesteigert

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werden (WAKAYAMA et al. 1999). Bisher konnten bei Nutztieren jedoch keine echten ES- Zellen gewonnen werden.

Mit der vorliegenden Arbeit sollten zwei Spenderzellpopulationen mit unterschiedlichem Differenzierungsgrad auf ihre Eignung die Kloneffizienz beim Schwein zu verbessern, untersucht werden. Am Institut für Tierzucht der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft (FAL) in Mariensee wurde kürzlich ein Verfahren entwickelt, um aus Explantat-Kulturen fetale somatische Stammzellen (fetal somatic stem cells, FSSCs) zu gewinnen, die ähnliche Eigenschaften wie ES-Zellen aufweisen (KUES et al. 2005). Die FSSCs wurden im Rahmen dieser Arbeit als Kernspenderzellen im Vergleich zu den herkömmlichen fetalen Fibroblasten eingesetzt. Für die Isolierung der Kernspenderzellen wurden Explantat-Kulturen von Feten angelegt. Dabei konnten aus identischen Explantaten sowohl Fibroblasten (differenziert) als auch somatische Stammzellen mit pluripotenten Eigenschaften abgeleitet werden.

Die einzelnen Arbeitsschritte des somatischen Kerntransfers sind im Labor in Mariensee bereits etabliert (HOELKER 2003). Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag daher in der Untersuchung der verschiedenen Zelltypen als geeignete Spenderzellen.

Da Versuche zur Prüfung der in-vivo-Entwicklung, vor allem aufgrund der Trächtigkeitsdauer von 114 Tagen beim Schwein, sehr zeitaufwendig sind, wurden die beiden Spenderzelltypen zunächst anhand der in-vitro-Entwicklung porziner Kerntransfer-Embryonen bis zur Blastozyste untersucht. Dabei dienten parthenogenetische Embryonen zur Kontrolle der Qualität von Oozyten, Aktivierung und in-vitro-Kultur. Die Beurteilung der Kerntransfer- Embryonen erfolgte anhand der Blastozystenrate und –qualität. Durch die Bestimmung der Gesamtzellzahl und des Verhältnisses von Zellen der inneren Zellmasse (Inner-Cell-Mass-, ICM-Zellen) zur Gesamtzellzahl nach Differentialfärbung wurde die Qualität der Blastozysten beurteilt. Im letzten Schritt wurden geklonte Embryonen mit FSSCs als Spenderzellen auf synchronisierte Empfängertiere übertragen, um die in-vivo-Entwicklung der so erstellten Embryonen zu untersuchen.

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2 Schrifttum

2.1 Physiologische Grundlagen

2.1.1 Befruchtung und Embryonalentwicklung beim Schwein

Die Befruchtung ist definiert als Vereinigung des mütterlichen und väterlichen Erbmaterials durch Verschmelzung der Vorkerne beider Geschlechtszellen. Die Oozyten sind vor dem Eintritt der Pubertät in der Prophase der 1. Reifeteilung, im Stadium des Diplotän, arretiert (FULKA et al. 1972). Die Wiederaufnahme der Meiose erfolgt mit dem Östrus unter Einfluss des LH-Peaks (HUNTER 1966). Die 1. Reifeteilung endet erst mit der Abschnürung des 1. Polkörpers während der Ovulation. Vor dem Eindringen des Spermiums befindet sich die Oozyte dann in der zweiten Reifeteilung, die aber erst nach Eindringen des Spermiums mit dem Abschnüren des 2. Polkörpers vollendet wird (SCHNORR 1996). Die Befruchtung der Oozyten findet am Übergang von der Eileiterampulle zum Isthmus statt. Entscheidend für die Befruchtungsfähigkeit der Spermien ist deren Kapazitation während des Transportes durch den weiblichen Genitaltrakt. Dabei kommt es zu Veränderungen an der Struktur der Plasmamembran, die eine wesentliche Voraussetzung für die folgende Akrosomreaktion sind.

Erreicht ein Spermium die Zona pellucida, wird durch den Kontakt die Akrosomreaktion ausgelöst. Es werden akrosomale Enzyme freigesetzt, die ein Eindringen des Spermiums in die Zona ermöglichen. Im Folgenden lagert sich das Spermium mit der Längsfläche seines Kopfes parallel an die Eizelle an. Der Kontakt mit den Mikrovilli der Eizelle erfolgt dabei zunächst nur im postakrosomalen Bereich des Spermienkopfes (SINOWATZ 1999). Das Spermium bindet dabei wahrscheinlich an einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor und aktiviert dadurch die an ihn gebundene Phospholipase C (PLC), welche wiederum Phosphatidylinositolbiphosphat aktiviert (SAUNDERS et al. 2002). Dadurch kann extrazelluläres Calcium in die Eizelle einströmen. Calcium wird auch aus den intrazellulären Speichern des endoplasmatischen Retikulums freigesetzt (BEN-YOSEF u. SHALGI 1998).

Dieser Anstieg von Ca²⁺-Ionen im Zytoplasma läuft in Oszillationen ab, die bis zu 70 Minuten nach dem ersten Kontakt der Oozyte mit dem Spermium anhalten können (PARRINGTON et al. 1996). Durch die Ca²⁺-Oszillationen wird die Eizelle aktiviert und die zweite Reifeteilung

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mit Abschnürung des Polkörperchens wird zu Ende geführt. Die Ca²⁺-Oszillationen bewirken eine Umstrukturierung der Plasmamembran der Eizelle und eine Ausschüttung der kortikalen Granula, welches ein Eindringen weiterer Spermien verhindert (Polyspermieblock) (SINOWATZ 1999) (Zum Überblick siehe Abbildung 1).

Abbildung 1: Mechanismus der spermieninduzierten Aktivierung der Säugetieroozyten.

Das Spermium bindet an einen G-Protein gekoppelten Rezeptor (G-protein) oder alternativ an einen tyrosin-phosphorylierten (PTK) Rezeptor (R) und induziert dadurch einen Anstieg der intrazellulären Ca²⁺-Konzentration. Ein lösliches Spermaprotein (Oscillin) kann ebenfalls für die Ca²⁺-Antwort verantwortlich sein. Das Ca²⁺ stammt aus dem endoplasmatischen Retikulum (ER). Für eine kontinuierliche Oszillation wird ein Ca²⁺-Influx von ausserhalb benötigt, um die intrazellulären Speicher wieder aufzufüllen. Die erhöhte intrazelluläre Ca²⁺-Konzentration induziert auf der einen Seite die Wiederaufnahme der Meiose und die Aktivierung des Zellzyklus und auf der anderen Seite die Ausschüttung kortikaler Granula, was wiederum zum Polyspermieblock führt. Durch die erhöhte Ca²⁺- Konzentration werden Ca²⁺-abhängige Enzyme aktiviert, die die Aktivierung vom nicht-Rezeptor-Protein Tyrosinkinase (PTK) oder Inaktivierung vom Protein Tyrosinphosphatase (PTP) unterstützen. Der hohe intrazelluläre pH-Wert einer ovulierten Eizelle bietet den Enzymen, die durch Ca²⁺ aktiviert werden, eine angemessene Umgebung. Die kortikale Reaktion kann durch den initialen Ca²⁺-Anstieg, oder durch die Ca²⁺-abhängige Proteinkinase C (PKC) ausgelöst werden. DAG: Diacylglycerol; IP3: Inositol 1,4,5-tris- phosphat; PIP2: Phosphatidylinositol 4,5-biphosphat; PLC: Phospholipase C. (BEN-YOSEF u. SHALGI 1998)

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Erst nach Vollendung der zweiten Reifeteilung werden der weibliche und der männliche Vorkern gebildet (RÜSSE u. SINOWATZ 1998). In dieser Zeit (ca. 12 Stunden) erfolgt die Reduplikation der DNA als Vorbereitung auf die erste Furchungsteilung. Anschließend bewegen sich beide Vorkerne aufeinander zu und verschmelzen miteinander. Mit der Vorkernverschmelzung kommt es zur Rekombination der DNA und mit ihrer Vollendung ist eine Zygote mit einem diploiden Chromosomensatz entstanden. Gleichzeitig ist die Prophase der ersten, mitotischen Furchungsteilung erreicht (SINOWATZ 1999). Die Wanderung der Embryonen durch den Eileiter dauert beim Schwein insgesamt 72 Stunden; die Embryonen erreichen die Uterushornspitze im 4-8-Zell Stadium. Das Morulastadium wird am 5. Tag erreicht. Bereits nach der vierten oder fünften Teilung kommt es zur ersten Differenzierung in zwei unterschiedliche Zelltypen. Der eine Teil der Zellen ordnet sich außen an und stellt damit das Trophektoderm (TE) dar. Aus dem TE gehen später das Chorion- und Amnionepithel (Fruchthüllen) hervor. Der andere Teil der Zellen bildet die innere Zellmasse (Inner Cell Mass, ICM), aus der sich der Embryo entwickelt. Der Anteil an TE-Zellen ist immer deutlich höher als der Anteil an ICM-Zellen (PAPAIOANNOU u. EBERT 1988). (Zur Übersicht siehe Abbildung 2)

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Abbildung 2: Ovulation, Befruchtung und Furchung beim Säuger (SCHNORR 1996)

Schematische Darstellung der Lokalisation der Eizelle zum Zeitpunkt der Ovulation bzw. Befruchtung und des Embryos in seinen unterschiedlichen Furchungsstadien beim Säuger.

Mit der Aufnahme von Flüssigkeit kommt es zur Hohlraumbildung und aus der Morula entsteht eine Blastozyste, welche an Tag 7 (6-8) aus der Zona pellucida schlüpft. Am 8. bis 9.

Tag der Gravidität beginnt die Gastrulation und am 12. Tag entsteht mit dem Eintreten des Elongationsstadiums ein länglicher Embryo. Ungefähr zu diesem Zeitpunkt erfolgt auch die Erkennung der Trächtigkeit durch das Muttertier. Eine ausreichend große Anzahl vitaler Embryonen in beiden Hörnern ist beim Schwein Voraussetzung für die Aufrechterhaltung einer Gravidität (POLGE et al. 1966). Der Grund dafür liegt in der Produktion von Östradiol- 17β durch die Blastozysten. Zwischen Tag 10 und 16 der Gravidität produzieren die Blastozysten Östrogen und verhindern damit die Bildung und Ausschüttung des luteolytischen Hormons PGF2α. Zur Erhaltung der Trächtigkeit ist jedoch eine ausreichende Konzentration

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an Östradiol-17β notwendig, die nur von mindestens 4 lebensfähigen Embryonen produziert werden kann (RÜSSE 1999). Die Implantation der Blastozyste beginnt beim Schwein an Tag 12 der Gravidität und ist bis spätestens Tag 15 abgeschlossen. Bis dahin sind Blastozysten im Uterus frei beweglich (RÜSSE 1999). Bei der Implantation falten sich das Endometrium und der eng anliegende Trophoblast stark ein, wodurch der Trophoblast in das Lumen ragende Endometriumspfropfen kappenartig umhüllt (RÜSSE 1999). Ab Tag 14 flacht diese so genannte „enge Apposition“ wieder ab und die Verbindung wird durch beiderseitige Ausbildung von Mikrovilli intensiviert. Schon während der Implantation entwickeln sich Amnion und Allantois. Dabei erhebt sich die Amnionfalte und schließt sich über dem Embryo. Die Allantois beginnt als kleines Divertikel, welches aus dem Enddarm auswächst und bis zum Tag 25 das gesamte Exocoel mit Ausnahme des dorsalen Bereichs des Embryos ausfüllt. Die Keimscheibe der ovoiden Blastozyste ist um Tag 12 von Mesoderm unterlagert, das von Tag 14 an aussprosst und sich in ein viszerales und ein parietales Blatt spaltet.

Dadurch entsteht das intra- und extraembryonale Coelom (RÜSSE 1999). Um die Tage 13 und 14 entwickeln sich die Neuralplatte und das erste Somitenpaar. An Tag 15/16 sind es 10 und am 20. Tag 25 Somitenpaare. Die Entwicklung ab der 3. Graviditätswoche verläuft sehr rasch. Die Körperform ändert sich und der Embryo nimmt schnell an Länge zu. Während er an Tag 17 noch eine Länge von 4mm aufweist, liegt sie an Tag 24 schon bei 16mm. Zu diesem Zeitpunkt sind die meisten Organsysteme angelegt (RÜSSE 1999). Die Gesamtdauer der Gravidität liegt beim Schwein bei 114 Tagen. Die durchschnittliche Wurfgröße liegt bei 8-12 Ferkeln. Zu beachten ist, dass die pränatale Sterblichkeit zwischen 35 und 40% liegt und der höchste Anteil davon noch vor der Implantation beobachtet wird (POPE et al. 1972).

2.1.2 Spenderzellen im somatischen Klonen 2.1.2.1 Differenzierung

Bei der Differenzierung von Zellen spricht man von einer morphologischen und funktionellen Reifung und Spezialisierung (WIESNER u. RIBBECK 2000). Die Entwicklung beginnt mit einer fertilisierten Eizelle, die die Kopie des maternalen und paternalen Genoms enthält (SZUTORISZ u. DILLON 2005). Es folgt eine Reihe von mitotischen Teilungen, während derer die Zellen totipotent (s.u.) bleiben, bevor sie sich in spezifische Zellen differenzieren, bis hin zur Organisation von Geweben und Organen (KONO 1997). Im Blastozystenstadium

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hat bereits eine Restriktion stattgefunden. Die Zellen der ICM bringen alle embryonalen Gewebe hervor und beteiligen sich zum Teil an extraembryonalen Membranen. Die TE- Zellen bilden zusammen mit den extraembryonalen Membranen den fetalen Teil der Plazenta (GARDNER 1989). Die ersten kritischen Weichenstellungen finden also zwischen der Fertilisation und der Bildung der Blastozyste statt (SZUTORISZ u. DILLON 2005). Die Differenzierung geht mit der Etablierung spezifischer Genexpressionsprogramme einher, da Zellen unterschiedlichste Eigenschaften und Morphologien erhalten, je nachdem welchen Differenzierungsweg sie einschlagen (SZUTORISZ u. DILLON 2005). Dabei spielen sowohl interzelluläre Aktionen, aber auch Einflüsse aus der extrazellulären Matrix eine Rolle. Die Zentriolen und das Zytoskelett, das durch die Zentriolen gebildet wird, sind Strukturen, die möglicherweise die Differenzierung bestimmen. So könnten Veränderungen in der Struktur der Zentriolen frühe Marker der Zelldifferenzierung sein (TKEMALADZE u.

CHICHINADZE 2005).

2.1.2.2 Pluripotenz, Totipotenz

In der Entwicklungsbiologie wird der Begriff der ‚Potenz’ immer dann eingesetzt, wenn man von der Fähigkeit bestimmter Zellen spricht, sich zu differenzieren (s.o.). Dabei werden die Zellen in verschiedene Grade der Potenz eingeteilt, bei der die Fähigkeit zur Differenzierung von totipotent, über pluripotent, multipotent und oligopotent bis hin zu unipotent immer weiter abnimmt (SCHÖLER 2005) (Zur Übersicht siehe Abbildung 3). Von Totipotenz spricht man bei Zellen, die in der Lage sind, alle Zelltypen eines Organismus hervorzubringen. Ein Beispiel dafür ist die befruchtete Eizelle. Von Totipotenz spricht man aber auch bei einer Stammzelle, die sich in alle Zelltypen eines Organismus differenzieren kann, wobei das wichtigste Kriterium für Totipotenz von Stammzellen die Beteilung an der Keimbahn in Chimären oder das Starten einer neuen Entwicklung nach dem Kerntransfer ist (NIEMANN u. KUES 2003). Auf molekularer Ebene, scheint die Expression des Transkriptionsfaktors OCT4 zu definieren, ob eine Zelle totipotent ist (PAN et al. 2002).

OCT4 ist ein Transkriptionsfaktor und seine Expression findet man ausschließlich in frühen Embryonen, der Keimbahn und in Stammzellen. Ohne OCT4 verlieren zum Beispiel die Zellen der ICM ihre Fähigkeit sich in unterschiedliche Zelllinien zu differenzieren, sondern können nur noch TE-Zellen hervorbringen. Die Anwesenheit von OCT4 verhindert, dass

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ES-Zellen sich in TE-Zellen differenzieren, indem es die Expression und Aktivität eines anderen Transkriptionsfaktors, Cdx2, blockiert. Cdx2 ist für die Differenzierung in TE-Zellen verantwortlich (SMITH 2005). Pluripotenz beschreibt die Fähigkeit einer Zelle sich unter geeigneten Bedingungen noch in nahezu alle Zellen differenzieren zu können, wie zum Beispiel die Abkömmlinge der drei Keimblätter. Ein Beispiel dafür sind die embryonalen Stammzellen. Multipotente Zellen, wie hämatopoetische Stammzellen, sind dazu in der Lage sich in eine Vielzahl von Abkömmlingen zu differenzieren, während sich oligopotente Zellen nur noch in wenige Zellen differenzieren können, wie lymphoide oder myeloische Stammzellen. Unipotente Zellen schließlich können nur noch einen Zelltyp hervorbringen, wie zum Beispiel Fibroblasten (SCHÖLER 2005).

Abbildung 3: Differenzierung am Beispiel der Hämatopoese

Schematische Darstellung der Differenzierung von der totipotenten, fertilisierten Eizelle, über pluri-, multi- und oligopotente Stadien bis hin zu den differenzierten Zellen des Blutes. TE: Trophektoderm, ICM: Innere Zellmasse.

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2.1.2.3 Primäre und permanente Zelllinien

Primäre Zellen sind Zellen in Kultur, die direkt aus einem Donororganismus entnommen und noch nicht subkultiviert wurden. Subkultivieren bedeutet, dass die Zellen passagiert wurden.

Dabei werden aus der ursprünglichen Kultur unter Verdünnung mehrere neue Kulturen erstellt. Zum Erstellen von primären Zelllinien stehen verschiedene Möglichkeiten zur Verfügung. Zum einen kann das Gewebe, aus dem eine Zelllinie angelegt werden soll, mechanisch und/oder enzymatisch zu Einzelzellen vereinzelt und anschließend durch physikalische und enzymatische Hilfsmittel in möglichst homogene Zellpopulationen überführt werden. Bei der zweiten Möglichkeit werden Gewebe- oder Organstücke, so genannte Explantate, auf ein Tropfen aus recalcifiziertem bovinem Plasma gelegt, aus dem Einzelzellen auswandern können (FRESHNEY 2000). Primärkulturen kann man Zellen entnehmen und subkultivieren und diese Schritte über längere Zeit in großer Zahl wiederholen. Allerdings unterliegen die meisten Zellen der Zellalterung, die gekennzeichnet ist durch verlangsamte Proliferation, sowie Veränderungen in der Morphologie, Biochemie, Genexpression und Chromosomenstruktur (HAYFLICK u. MOORHEAD 1961). Primäre porzine Zellen zeigen zum Beispiel nach 40 Populationsverdopplungen einen veränderten Karyotyp (DENNING et al. 2001). Die Zellalterung ist bedingt durch eine ständige Verkürzung der Telomeren mit jeder Zellteilung. Telomeren sind repetetive DNA-Sequenzen samt assoziierten Proteinen, die sich an den Enden der Chromosomen befinden (ALBERTS et al. 2004b). Die Verkürzung der Telomeren einer Zelle begrenzt ihre regenerativen Möglichkeiten und wird neben Zellalterung in Verbindung mit Krebs und chronischen Krankheiten gebracht (SCHAETZLEIN et al. 2004). Dagegen zeigen permanente Zelllinien keine Anzeichen von Zellalterung. In der Kultur können Zellen ihre Eigenschaften verändern.

Ein Prozess, der als Transformation bezeichnet wird. Diese Zellen proliferieren häufig schneller und können aus einer kleineren Zellzahl eine Kultur starten. Ihre Ansprüche gegenüber der Zusammensetzung der Medien sind meist stark reduziert. Die Zellen einer solchen Linie können sich im Allgemeinen immer wieder teilen und haben eine potenziell unbegrenzte Lebensdauer erlangt (Immortalisation) (EAGLE 1955).

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2.1.2.4 Relevante Aspekte des Zellzyklus

Im Zellzyklus wird die DNA verdoppelt und anschließend die Kopien aufgeteilt, so dass zwei genetisch identische Tochterzellen entstehen. Der Zellzyklus lässt sich in 4 Abschnitte unterteilen. Während der S-Phase (Synthese-Phase,) wird die DNA verdoppelt. Auf die S- Phase folgt die G2-Phase (g = gap), in der die Zellen als Folge der DNA-Verdopplung einen tetraploiden Chromosomensatz besitzen (BOQUEST et al. 1999). Im Anschluss folgt die M- Phase (Mitose-Phase), in der die eigentliche Zellteilung stattfindet. Die Mitose beginnt mit der Prophase. In dieser Phase zerfällt die Kernmembran, der Inhalt des Zellkerns kondensiert zu sichtbaren Chromosomen und zelluläre Mikrotubuli bilden die Mitosespindel, die schließlich die Chromosomen trennt. Daraufhin scheint die Zelle kurz in einem als Metaphase bezeichneten Stadium zu verharren, in welchem die bereits verdoppelten Chromosomen an der Mitosespindel aufgereiht werden. Die Trennung der verdoppelten Chromosomen markiert den Beginn der Anaphase, in der sich die Chromosomen zu den jeweiligen Polen der Spindel hinbewegen, wo sie in der Telophase dekondensieren und neue intakte Zellkerne bilden. In der sich anschließenden Zytokinese teilt sich die Zelle in zwei Tochterzellen, was als das Ende der M-Phase des Zellzyklus betrachtet wird (ALBERTS et al. 2004a). Es folgt die G1- Phase, die ebenso wie die G2-Phase eine Art Verzögerungselement im Zellzyklus darstellt, in der jedoch ein diploider Chromosomensatz vorliegt (BOQUEST et al. 1999). In dieser Phase kann nicht nur die Größenzunahme der Zelle stattfinden, sondern die Zelle hat auch die Möglichkeit, sich auf die äußeren Bedingungen einzustellen. Die Dauer der G1-Phase variiert je nach Zelltyp und Einflüssen aus der Umgebung. Zellen können den Zellzyklus in der G1- Phase stoppen und gehen dann in eine Ruhephase, die G0-Phase über (ALBERTS et al.

2004a). In der Zellkultur kann dieses zum Beispiel durch Kontaktinhibition oder Serumentzug erreicht werden (BOQUEST et al. 1999). Ein länger andauernder Serumentzug führt bei porzinen Fibroblasten jedoch zu apoptotischen Erscheinungen (KUES et al. 2002). G1-, S- und G2-Phase zusammen werden auch als Interphase bezeichnet (ALBERTS et al. 2004a).

Einen Überblick über die Phasen des Zellzyklus gibt Abbildung 4.

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Abbildung 4: Schematische Darstellung des Zellzyklus einer Säugerzelle

S-Phase (Synthese-Phase): Phase der DNA-Verdopplung; G2-Phase (G=gap): Zelle besitzt tetraploiden Chromosomensatz; M-Phase (Mitose-Phase): Zellteilung; G1-Phase: Zelle besitzt diploiden Chromosomensatz; G0-Phase: Ruhephase.

Eine Kontrolle des Zellzyklus erfolgt durch Proteinkinasen, die Cyclin-abhängigen Kinasen (Cdks, cyclin-dependent kinases). Die Aktivität dieser Kinasen nimmt im Laufe des Zellzyklus zu und wieder ab. Durch diese Veränderungen, ändern sich auch Phosphorylierungszustände intrazellulärer Proteine, die an der Steuerung der wesentlichen Zellzyklusvorgänge, wie DNA-Replikation, Mitose und Cytokinese, beteiligt sind (ALBERTS et al. 2004a). Die Schwankungen der Kinasen werden durch ein komplexes System aus Enzymen und anderen Proteinen hervorgerufen. Die entscheidensten Cdk- Regulatoren sind Cycline. Die Aktivität eines Cdks ist dabei davon abhängig, an ein Cyclin gebunden zu sein. Die Cycline unterliegen wiederum selbst periodischen Schwankungen, wodurch auch die Cyclin-Cdk-Komplexe periodisch zusammengebaut und aktiviert werden.

Die Aktivierung dieser Komplexe schaltet wiederum die Zellzyklusvorgänge an (ALBERTS et al. 2004a).

Teilung

Interphase

Neuer Zyklus

G0-Phase G1-Phase

(2C) S-Phase

(2-4C) G2-Phase

(4C) M-Phase Tochterzelle

(27)

2.2 Biotechnologische Grundlagen

2.2.1 In-vitro-Reifung porziner Oozyten

Die vollständige Reifung der Oozyten (Maturation) ist die Voraussetzung für die erfolgreiche Entwicklung geklonter Kerntransferkomplexe. Sie gliedert sich auf in die Kernreifung (nukleäre Maturation) und Reifungsvorgänge im Ooplasma (zytoplasmatischen Maturation).

Bei der Kernreifung löst sich zunächst die Kernmembran auf, anschließend verschwinden die Nucleoli und es folgt die Kondensation der Chromosomen. Die Reifungsvorgänge im Ooplasma dienen dazu, nach der Fertilisation (in-vivo bzw. bei in-vitro-Fertilisation) den männlichen Vorkern bilden zu können und die ersten Zellteilungen einzuleiten (CHANG 1968). Bei der in-vitro-Reifung kommen in der Regel primäre Oozyten, die im Diplotän arretiert sind, aus Ovarien geschlachteter präpubertaler Sauen zum Einsatz. Dieses hat rein praktische Gründe, da nur diese in größeren Mengen aus Schlachthofmaterial regelmäßig zur Verfügung stehen. Oozyten postpubertaler Sauen weisen aber eine höhere Entwicklungskompetenz auf, als Oozyten präpubertaler Sauen (HYUN et al. 2003b;

MARCHAL et al. 2001). Zur Gewinnung der Oozyten werden 2-8mm große Follikel mit einer Nadel punktiert und die Oozyten mit den sie umgebenden Kumuluszellen und der Follikelflüssigkeit aspiriert. Oozyten aus kleineren Follikeln zeigen eine geringere Reifungsrate, Vorkernbildungsrate und Blastozystenrate (YOON et al. 2000). Anschließend werden KOK (homogenes Ooplasma, mindestens 2-3 Lagen intakte Kumuluszellen) selektiert und bei 38,5°C und 5% CO2 kultiviert (HOELKER 2003). Die Kumuluszellen unterstützen die Reifung bis zum Metaphase-II-Stadium und sind an der zytoplasmatischen Reifung beteiligt (NAGAI 2001). In der Kultur hat sich das North Carolina State University (NCSU) 37-Medium als am besten geeignet erwiesen (FUNAHASHI et al. 1997; PETTERS u.

WELLS 1993). Diesem Medium werden zunächst für die ersten 22 Stunden hCG, PMSG und zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) zugesetzt. Anschließend erfolgt ein Mediumwechsel in NCSU 37-Medium ohne hCG, PMSG und cAMP und die Kultur wird weitere 18 Stunden fortgesetzt. Die Zugabe von hCG, PMSG und cAMP in den ersten 22 Stunden bewirkt die Synchronisation der Kern- und der zytoplasmatischen Reifung (FUNAHASHI et al. 1997; FUNAHASHI u. DAY 1993), wobei cAMP die Arretierung im Diplotän aufrechterhalten soll. Dabei dienen Gap junctions zwischen Oozyte und

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Kumuluszellen dem Transport dieser Moleküle (KUMAR u. GILULA 1996). Die Zugabe von cAMP zum Reifungsmedium trägt demnach zu einer korrekten zytoplasmatischen Reifung bei und der Entzug von cAMP in den letzten 18 Stunden bewirkt die Aufhebung der meiotischen Arretierung, so dass die Metaphase erreicht werden kann (FAN et al. 2002; FUNAHASHI et al. 1997; SOMFAI et al. 2003). Außerdem verbessert eine Hormonzugabe während der ersten 20 Stunden die Kumulusexpansion sowie die Bildung eines männlichen Vorkerns nach IVF (FUNAHASHI u. DAY 1993). Als Proteinquelle dient die Zugabe von Follikelflüssigkeit vom Schwein zum Reifungsmedium, welche gleichzeitig durch eine antioxidative Wirkung eine zusätzliche Verbesserung der Reifung bewirken kann (ABEYDEERA et al. 1998b;

FUNAHASHI et al. 1997; TATEMOTO et al. 2004). Inzwischen konnten in-vitro zwar Reifungsraten von bis zu 90% erreicht werden, die Qualität der in-vitro gereiften Oozyten reicht jedoch nicht an die in-vivo gereifter heran. Trotz der geringeren Qualität wurden in- vitro gereifte Oozyten erfolgreich in der IVF mit anschließendem Embryotransfer (KIKUCHI et al. 1999; MATTIOLI et al. 1989; YOSHIOKA et al. 2002) und beim Klonen von Schweinen eingesetzt (BETTHAUSER et al. 2000; PARK et al. 2001a; POLEJAEVA et al.

2000; WALKER et al. 2002).

2.2.2 In-vitro-Entwicklung von Schweineembryonen

Das in-vitro-Entwicklungspotential porziner Embryonen ist nach wie vor, trotz Anstrengungen zur Verbesserung der Kulturbedingungen in den letzten Jahren, geringer, als das in-vivo produzierter Embryonen. Zu unterscheiden sind in-vivo- und in-vitro Kultursysteme. Als in-vivo-Kultursysteme dienen Eileiter von Mäusen, Kaninchen oder Schafen in Organkultur. In-vitro-Systeme lassen sich wiederum in Co-Kulturen von Eileiterzellen und dem Einsatz mehr oder weniger standardisierter Kulturmedien einteilen (PETTERS u. WELLS 1993; REED et al. 1992). Eines der Hauptprobleme bei der in-vitro- Entwicklung porziner Embryonen stellt der ‚Vierzellblock’ dar. Der Vierzellblock ist ein Entwicklungsstop in-vitro produzierter Embryonen im Vierzellstadium. Der Vierzellblock trifft genau mit dem Zeitpunkt zusammen, in dem die maternal gesteuerte Entwicklung endet und durch das embryonale Genom übernommen wird (JARRELL et al. 1991; TELFORD et al. 1990). Durch Zugabe der Aminosäuren Taurin und Hypotaurin zum Kulturmedium konnte der Vierzellblock überwunden werden (PETTERS u. REED 1991). So konnten inzwischen

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nach in-vitro-Fertilisation (IVF) und anschließender in-vitro-Kultur Blastozystenraten von bis zu 50% erreicht werden (WANG u. DAY 2002). Allerdings weisen in-vitro entwickelte Embryonen eine schlechtere Qualität auf, als entsprechende in-vivo-Stadien. Verglichen mit in-vivo Embryonen zeigen sie eine geringere Gesamtzellzahl und ein aberrantes Verhältnis von ICM- zu TE-Zellen (KOO et al. 2004; MACHATY et al. 1998; YOSHIOKA et al. 2002).

Durch den Einsatz verschiedener Basismedien und die Zugabe unterschiedlicher Substanzen versucht man diese Probleme zu beheben. Als Basismedium wurden vor allem Whitten’s Medium (WM) (WHITTEN u. BIGGERS 1968), Beltsville Embryo Culture Medium (BECM-3) (DOBRINSKY et al. 1996), NCSU 23-Medium (PETTERS u. REED 1991) und Porzine Zygote Medium (PZM) (YOSHIOKA et al. 2002) eingesetzt. Dabei ist nur das PZM ein definiertes Medium. In diesem Medium wurde anstelle von BSA Polyvinylalkohol (PVA) zugegeben. Durch Zugabe von BSA ist die Standardisierung von Medien erschwert, da BSA erheblich in seiner Zusammensetzung schwanken kann (BAVISTER 1995; KANE 1983).

Außerdem erhöht der Einsatz von BSA als Proteinquelle zwar die Blastozystenrate (DOBRINSKY et al. 1996), verringerte jedoch das Verhältnis von ICM- zu TE-Zellen (RATH et al. 1995). Die Zugabe von Glukose und Glutamin als Energiequellen fördert die Entwicklung von Schweinembryonen bis zum Blastozystenstadium und unterstützt das Schlüpfen (PETTERS et al. 1990). Die bisher genannten Kulturverfahren berücksichtigen jedoch noch nicht die Millieuveränderungen, denen der Embryo beim Übergang vom Eileiter in den Uterus ausgesetzt ist. Deshalb wurde ein zweiphasiges Kultursystem entwickelt, in dem in den ersten 3 Tagen Glukose als Energiequelle durch Pyruvat/Lactat ersetzt wurde (KIKUCHI et al. 2002). Es konnte gezeigt werden, dass dadurch auch die präimplantative Entwicklung von Kerntransferembryonen verbessert werden konnte (LEE et al. 2003b; SAGE 2005). Ein weiterer Ansatz zur Verbesserung der in-vitro Kultur porziner Embryonen sind die Ergebnisse von (NGUYEN et al. 2003). Demnach stellen porzine Embryonen während der ersten 48 Stunden der Entwicklung andere Anforderungen an die Osmolarität, als zu späteren Entwicklungsphasen. Die Arbeit zeigte, dass ein isotones Medium (280-310 mOS) zwar die Entwicklung während der ersten 48 Stunden fördert, aber ein hypotones Medium (220-270 mOs) die Entwicklung zur Morula und Blastozyste begünstigt, indem es die Bildung von Blastocoel fördert.

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2.2.3 In-vitro-Entwicklung porziner parthenogenetischer Embryonen

Unter Parthenogenese versteht man die Entwicklung von Embryonen aus unbefruchteten Eizellen. Parthenogenese findet im Tierreich, mit der Ausnahme von Säugern und Vögeln, relativ häufig statt. So kommt sie natürlicherweise bei Insekten, Reptilien und Fischen vor (WEHNER u. GEHRING 1995). Dabei unterscheidet man die gamophasischen Parthenogenese von der zygophasischen Parthenogenese. Bei der gamophasische Parthenogenese entstehen haploide Nachkommen aus haploiden Eizellen, wie zum Beispiel bei Bienen. Bei der zygophasischen Parthenogenese bildet sich eine diploide Eizelle, die eine parthenogenetische Zellvermehrung beginnt. Bei der Letzteren unterbleibt entweder die Meiose, oder die haploide Eizelle verdoppelt ihren Chromosomensatz, zum Beispiel durch Verschmelzung mit einem ihrer Polkörper. Ein solche Parthenogenese findet beispielsweise bei Blattläusen statt. Bei den Säugern spielen für eine erfolgreiche embryonale Entwicklung nicht nur der diploide Chromosomensatz eine Rolle, sondern auch maternale und paternale geprägte Gene (so genanntes Imprinting), besonders bei der Embryonalentwicklung (MONK et al. 1987; SURANI et al. 1984). Tarkowski et al. gelang es 1970 erstmals bei der Maus experimentell eine parthenogenetische Entwicklung auszulösen. Surani et al. (1984) zeigten, dass Eizellen, die einen männlichen Vorkern erhielten, sich entwickeln können, während Eizellen, die einen weiblichen Vorkern erhielten, sich nach der Implantation schlecht entwickelten, bzw. die Entwicklung abbrachen.

Zur Erstellung parthenogenetischer Embryonen müssen die biochemischen Vorgänge, die das Spermium bei der Fusion mit der Plasmamembran aktiviert, artifiziell ausgelöst werden.

Dabei sind die durch das Spermium ausgelösten Ca²⁺-Oszillationen der entscheidendste Vorgang (siehe dazu 2.1.1.). Darüber hinaus muss jedoch auch die Ausschleusung des zweiten Polkörpers verhindert werden, um einen diploiden Chromosomensatz beizubehalten (KAUFMAN u. SACHS 1976). Die Ausschleusung des zweiten Polkörpers kann durch Einsatz chemischer Substanzen, die die Struktur der Spindel stören, erreicht werden. So entstehen zwei Chromosomensätze, aber die Zellteilung bleibt aus. Cytochalasin B und 6-Dimethylaminopurin stellen solche Substanzen dar. Beim Schwein konnte so eine parthenogenetische Entwicklung induziert werden (JOLLIFF u. PRATHER 1997; KURE- BAYASHI et al. 2000). Nach Embryotransfer auf Empfängertiere konnte eine

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postimplantative Entwicklung bis zum 30. Trächtigkeitstag gezeigt werden. Solche Embryonen zeigen jedoch deutlich reduziertes Körpergewicht (ZHU et al. 2003), hochgradige Missbildungen, wie Herz- und Leberzysten, sowie Missbildungen in der Kopfregion, oder Kopflosigkeit (KURE-BAYASHI et al. 2000).

Die meisten Methoden zur Aktivierung von Oozyten simulieren die Befruchtung durch ein Spermium und führen somit zu einer intrazytoplasmatischen Ca²⁺-Erhöhung. Dabei unterscheidet man physikalische, chemische und biochemische Reize. Ein kurzzeitiger DC Puls im elektrischen Feld gehört zu den physikalischen Reizen. Er führt zur Öffnung von Membranporen in der Eizelle (PRATHER et al. 1989; ZIMMERMANN u. VIENKEN 1982) und bei Medien mit hohen Ca²⁺-Konzentrantionen kommt es zu einem Ca²⁺-Einstrom (PRATHER et al. 1989; TARKOWSKI et al. 1970). Zudem wird vermutet, dass durch den elektrischen Impuls auch Calcium aus intrazellulären Speichern freigesetzt wird (MACHATY et al. 1999; ZIMMERMANN u. VIENKEN 1982). Obwohl durch diesen, wie auch durch andere Reize, die intrazelluläre Ca²⁺-Konzentration nicht oszilliert, sondern konstant ansteigt, um nach einer Plateauphase wieder abzufallen (RICKORDS u. WHITE 1992; SUN et al.

1992; TESARIK et al. 1994; TESARIK u. TESTART 1994), konnte diese Methode bei verschiedenen Spezies erfolgreich eingesetzt werden (PRATHER et al. 1989; TARKOWSKI et al. 1970). Weitere physikalische Reize stellen eine Hitzebehandlung, oder ein Kälteschock dar. Durch die Temperaturerhöhung kommt es zu Strukturveränderungen in der Zellmembran, während der Temperaturabfall eine Umstrukturierung der Meiosespindel bewirkt, was die Aggregation der Chromosomen hervorruft, die sich anschließend in einem neuen Kern neu organisieren (LONGO 1974). Mit beiden Methoden ist eine Entwicklung bis zu Blastozyste möglich (CHANG 1954; KOMAR 1973; LONGO 1975).

Das Ca²⁺-Ionophor A23187, Ethanol, sowie Thimerosal stellen chemische Reize dar, die durch unterschiedliche Mechanismen die Aktivierung bewirken können. A23187 bewirkt einen Transport von Ca²⁺-Ionen über Membrankompartimente hinweg und bewirkt dadurch eine Verteilung des Calciums zugunsten des Zytoplasmas. Dadurch werden die Exozytose der kortikalen Granula, sowie die Ausschleusung des 2. Polkörpers hervorgerufen und ermöglichen eine präimplantative Entwicklung (KLINE u. KLINE 1992; WANG et al. 1998;

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WANG et al. 1999). Auf der Oberfläche der Ca²⁺-Speicher befinden sich Inositol3-Phosphat- und Ryanodinrezeptoren. Ethanol beeinflusst diese Rezeptoren und bewirkt somit, als vorübergehender Zusatz zum Medium, eine intrazelluläre Inositol3-Phosphat (IP3) Bildung und damit eine Ca²⁺-Freisetzung aus den Speichern (CUTHBERTSON 1983; NAGAI 1987).

Thimerosal stellt eine organische Quecksilberverbindung dar. Es oxidiert Sulfhydrylgruppen an Rezeptoren der intrazellulären Ca²⁺-Speicher und bewirkt dadurch die Ausschüttung von Ca²⁺(SWANN 1991). Thimerosal kann jedoch auch die meiotische Spindel zerstören. Aus diesem Grund muss seine Wirkung nach ~10 Minuten durch den Antagonisten Dithiothreitol aufgehoben werden (MACHATY et al. 1997; TAO et al. 2000). Zu den biochemischen Reizen werden Enzyme oder andere Triggersubstanzen gezählt, deren Wirkung im Auslösen einer Reaktionskaskade besteht, die zur Aktivierung der Eizelle führt. Die Injektion von Guanosintriphosphat (GTP) zum Beispiel aktiviert das intrazelluläre G-Protein, wodurch wiederum Phospholipase C stimuliert wird, die Synthese von IP3 zu katalysieren (MACHATY et al. 1995). Eine weitere Substanz ist ein Extrakt aus porzinem Ejakulat (‚Cytosolic Sperm Factor, CSF). Damit wurde versucht, möglichst nah an die physiologischen Verhältnisse heranzukommen. Eine Injektion von CSF in Schweineoozyten führte, vergleichbar mit der physiologischen Aktivierung, zu wiederholten Ca²⁺-Oszillationen, Exozytose kortikaler Granula, Wiederaufnahme der Meiose und Bildung von Vorkernen (MACHATY et al. 2000; SAUNDERS et al. 2002). Neben dem Ansatzpunkt der intrazytoplasmatischen Ca²⁺-Erhöhung, gibt es bei den biochemischen Reizen auch die Möglichkeit, die Aktivierung durch Steuerung des Zellzyklus hervorzurufen. Der Zellzyklus der Oozyte wird über den ‚Maturation Promoting Factor’ (MPF) reguliert, ein Heterodimer aus p34^cdc2 Kinase und Cyclin B. Die Arretierung der Oozyte in der Metaphase II wird durch eine hohe Aktivität des MPF aufrechterhalten. Es muss ständig Cyclin gebildet werden, um den MPF-Anteil im Zytoplasma hoch zu halten. Nur so ist ein Übergang aus der G2-Phase in die mitotische M-Phase möglich. Die Ca²⁺-Oszillationen, ausgelöst durch ein Spermium, bewirken eine Abnahme der MPF-Konzentration und ermöglicht der Eizelle einen Übergang in die Interphase (ITO et al. 2003). Die Bildung von Cyclin kann zum Beispiel durch Proteinsyntheseinhibitoren wie Cycloheximide und Puromycin gehemmt werden. Als Folge kommt es zum Abfall der MPF-Konzentration. Diese Methode konnte erfolgreich bei Eizellen von Mensch und Maus eingesetzt werden (SIRACUSA et al. 1978), aber bei Rind und

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Schwein konnte so keine Aktivierung erreicht werden (NUSSBAUM u. PRATHER 1995).

Eine Kombination aus elektrischem (MARTINEZ DIAZ et al. 2002; NUSSBAUM u.

PRATHER 1995; TANAKA u. KANAGAWA 1997) oder chemischem Reiz (PRESICCE u.

YANG 1994) zur Ca²⁺-Stimulation mit einem Proteinsyntheseinhibitor zeigten deutlich bessere Ergebnisse in der Aktivierung als bei alleiniger Anwendung eines Verfahrens. Ein weiterer Angriffspunkt ist die Hemmung von Proteinkinasen, zum Beispiel der

‚Mitogen-Activated-Protein’-Kinase (MAPK). Sie steuert die Fortsetzung der zweiten Reifeteilung (KUBELKA et al. 2002; LE BEUX et al. 2003). Wird sie gehemmt, werden die Oozyten aktiviert (ITO et al. 2003). Während zum Beispiel 6-Dimethylaminopurin (6-DMAP) die Hemmung allgemeiner Proteinkinasen bewirkt (FULKA et al. 1991; JILEK et al. 2001), zielen Roscovitine und Butyrolactone spezifisch auf Cyclin-abhängige Kinasen ab (BING et al. 2003; LE BEUX et al. 2003). Eine Kombination aus Ca²⁺-Ionophor (BOQUEST et al.

2002; ROH u. HWANG 2002) oder Elektrostimulation (GRUPEN et al. 2002; HOELKER 2003) und 6-DMAP zeigte bessere Ergebnisse als ein Stimulus allein.

Die effiziente Erstellung parthenogenetischer Embryonen ist auch für den Kerntransfer bedeutsam, da die im Kerntransfer erstellten Kerntranfer-Spenderzell-Komplexe genauso wie parthenogenetische Embryonen aktiviert werden müssen. Darüber hinaus spielen die parthenogenetisch erstellten Embryonen auch eine wichtige Rolle als Kontrollgruppe zur Beurteilung der Eizellqualität und der Kultur- und Aktivierungsbedingungen (BETTHAUSER et al. 2000; KOO et al. 2000). So gab es in den letzten Jahren Bestrebungen, die Aktivierungsprotokolle immer weiter zu verbessern. Inzwischen werden Blastozystenraten von 49,6% (Tag 6), 46,0% und 68% (Tag 7) erreicht (BING et al. 2003; NGUYEN et al.

2003; ZHU et al. 2003). Die Teilungsraten parthenogenetischer und durch Kerntransfer erstellter Embryonen sind vergleichbar, wo hingegen die Blastozystenraten der Kerntransferembryonen geringer sind, als die parthenogenetischer Embryonen (GRUPEN et al. 2002; KOO et al. 2000; PARK et al. 2001c; ZHU et al. 2002). Die durchschnittliche Kernzahl parthenogenetischer Blastozysten ist geringer als die bei Blastozysten aus IVF (KOO et al. 2000; WANG et al. 1998). Diese Unterschiede entstehen vermutlich aufgrund des fehlenden paternalen Genoms oder durch einen haploiden Chromosomensatz (KURE- BAYASHI et al. 2000; KURE-BAYASHI et al. 1996; SURANI et al. 1984; SURANI et al.

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1990). Beim Einsatz parthenogenetischer Embryonen als Kontrollgruppe müssen hinsichtlich der Interpretation der Ergebnisse die oben aufgeführten Probleme berücksichtigt werden.

2.2.4 Transfer porziner Embryonen auf Empfängertiere

Das Schwein als multipare Spezies benötigt an Tag 11 und 12 mindestens 4 lebende Feten im Uterus, um eine Trächtigkeit zu erkennen. Feten produzieren Östradiol-17β, welches die PGF2α-Produktion oder –Ausschüttung verhindert und damit den luteolytischen Effekt überwindet (HEAP et al. 1979; HEAP et al. 1981; POLGE et al. 1966; POPE et al. 1972). Bei einer nicht ausreichenden Anzahl von Feten oder bei Embryonen mit geringerem Entwicklungspotential gibt es mehrere Möglichkeiten, die Aufrechterhaltung der Trächtigkeit zu unterstützen. Durch Gabe von exogenem Östradiol-17β zwischen Tag 11 und 15 kann der intrauterine Mangel ausgeglichen werden (FRANK et al. 1977). Die Injektion von eCG und hCG an Tag 9 und 12 der Trächtigkeit kann die Bildung von akzessorischen Corpora lutea hervorrufen, die die Aufrechterhaltung der Trächtigkeit unterstützen (CHRISTEN u. DAY 1971). King et al. (2002) konnten mit Hilfe dieser Methoden Trächtigkeiten mit weniger als 4 Embryonen erfolgreich etablieren. Eine weitere Möglichkeit besteht in dem Co-Transfer von parthenogenetischen Embryonen als so genannte Helferembryonen. So war es möglich, nach Transfer von 3 Zygoten und 60 parthenogenetischen Embryonen 2 Ferkel zu produzieren (KING et al. 2002). Die Geburt von Ferkeln nach Embryotransfer (ET) ist von vielen Gruppen berichtet worden. Darunter befanden sich sowohl IVF-Embryonen aus in-vivo gewonnenen (NAGAI et al. 1988; YOSHIDA 1987), als auch aus in-vitro gereiften Oozyten (ABEYDEERA et al. 1998a; MATTIOLI et al. 1989; RATH et al. 1999). Die Stadien, die übertragen wurden, reichten von der Zygote (KIKUCHI et al. 1999), über 2-8-Zeller (ABEYDEERA et al. 1998a; KIKUCHI et al. 1999; MATTIOLI et al. 1989; NAGAI et al.

1988; RATH et al. 1999) bis hin zur Morula und Blastozyste (ABEYDEERA et al. 1998a;

BEEBE et al. 2002; KIKUCHI et al. 2002; MISUMI et al. 2003). Dabei muss berücksichtigt werden, dass Morulae und Blastozysten, ihrem Entwicklungsstand entsprechend, in das Uterushorn (CAMERON et al. 2000; HUANG et al. 2002; KIKUCHI et al. 2002; MISUMI et al. 2003), während Stadien bis zum Vierzeller in den Eileiter transferiert werden müssen (KIKUCHI et al. 1999; KING et al. 2002; RATH et al. 1994). Inzwischen ist es sogar gelungen tiefgefrorene und wieder aufgetaute Blastozysten auf Empfängertiere zu übertragen

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und so Ferkel zu produzieren (BEEBE et al. 2002; MISUMI et al. 2003). Die Anzahl der Embryonen, die pro Empfängertier übertragen wurden, variierte zwischen 17 und 100. Ein weiterer Faktor, der die embryonale Entwicklung nach dem ET beeinflusst, ist die Synchronisation der Empfängertiere. Mittels eines ‚asynchronen Anspritzschemas’, bei dem die Ovulation der Empfängertiere einen Tag nach dem ET stattfindet, konnten auch mit dem Transfer einer geringeren Anzahl an Embryonen (durchschnittlich 93) Trächtigkeiten etabliert und Ferkel produziert werden (HARRISON et al. 2004).

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2.3 Somatisches Klonen beim Schwein

2.3.1 Effizienz des Kerntransfers bei unterschiedlichen Spezies

Mit dem somatischen Kerntransfer steht eine Methode zur Verfügung, die sowohl für die biologische Grundlagenforschung als auch für die Erstellung transgener Nutztiere viel versprechende Möglichkeiten bietet. Der Vorteil dieser Methode ist, dass durch die genetische Modifikation der Spenderzelle Veränderungen am Erbgut gezielte vorgenommen und anschließend identische Gruppen transgener Tiere erstellt werden können (DENNING et al.

2001). Darüber hinaus ist die Keimbahngängigkeit des Transgens gegeben, da die Tiere aus der Erbinformation einer einzigen Zelle entstanden sind. Das erste durch somatischen Kerntransfer geklonte Säugetier war Schaf „Dolly“ und wurde 1996 geboren (WILMUT et al. 1997). Die Geburt der ersten geklonten Ferkel wurde von mehreren Gruppen im Jahr 2000 publiziert (BETTHAUSER et al. 2000; ONISHI et al. 2000; POLEJAEVA et al. 2000). Bis zum jetzigen Zeitpunkt wurde der somatische Kerntransfer bei 11 Säugertierspezies erfolgreich eingesetzt. (Tabelle 1)

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Tabelle 1: Übersicht über die Erfolgsraten bisher durch den somatischen Kerntransfer geklonten Spezies (nach Kues und Niemann (2004))

Spezies

Anzahl der Nachkommen/Anzahl

übertragener Embryonen

Geschätzte Anzahl weltweit

lebender Klontiere

Erstes gelungenes Experiment

Schwein < 1% ~ 250

(BETTHAUSER et al. 2000;

ONISHI et al. 2000;

POLEJAEVA et al. 2000)

Rind 15-20% ~ 3000 (CIBELLI et al. 1998)

Schaf 5-8% ~ 400 (CAMPBELL et al. 1996)

Ziege 3% ~400 (BAGUISI et al. 1999)

Pferd ~ 1% 1 (GALLI et al. 2003)

Maultier ~ 1% 1 (WOODS et al. 2003)

Katze < 1% 1 (SHIN et al. 2002)

Hund < 1% 1 (LEE et al. 2005a)

Kaninchen < 1% 6 (CHESNE et al. 2002)

Maus < 2% ~ 300 (WAKAYAMA et al. 1998)

Ratte ~ 2% 4 (ZHOU et al. 2003)

Aufgrund reproduktionsbiologischer Besonderheiten und wenig ausgereifter in-vitro- Kulturtechniken für porzine Embryonen ist die Effizienz des somatischen Klonens beim Schwein aber noch sehr gering. So resultieren lediglich ≤ 1% der rekonstruierten Embryonen in der Geburt geklonter Ferkel. Im Gegensatz dazu wird beim Rind mit 15-20% lebensfähigen Nachkommen pro übertragenen Embryo bereits eine höhere Entwicklungsrate erreicht. Dies wird darauf zurückgeführt, dass beim Schwein die In-vitro-Kulturtechnik noch nicht so ausgereift ist, wie beim Rind und dass zur Erkennung der Gravidität (Tag 10-14) mindestens 4 lebensfähige Embryonen vorhanden sein müssen (s.o.). Ein weiterer Punkt ist der Übergang von der maternalen zur embryonalen Genexpression. Während beim Rind dieser Übergang zwischen dem 8- und 16-Zell Stadium stattfindet (LEQUARRE et al. 2003), geschieht dieses beim Schwein bereits beim 4-Zeller (MADDOX-HYTTEL et al. 2001). Beim Rind bleibt also mehr Zeit zur Rückprogrammierung des transferierten Kerns, wodurch vermutlich mehr Kerne korrekt zurückprogrammiert werden, als in der relativ kurzen Zeit beim Schwein.

(38)

Trotz dieser methodischen Schwierigkeiten wurden inzwischen von mehreren Arbeitsgruppen transgene Schweine, sogar mehrfach transgene und Knockout Tiere erstellt (LAI et al. 2002a;

PARK et al. 2001a; PETERSEN et al. 2006; PHELPS et al. 2003; RAMSOONDAR et al.

2003).

2.3.2 Einflussfaktoren auf die Effizienz des Kerntransfers und die anschließende Entwicklung des Embryos

2.3.2.1 Kerntransferverfahren

Bei den Kerntransferverfahren unterscheidet man grundsätzlich drei Methoden. Die

‚klassische’ Fusionsmethode, die intrazytoplasmatische Injektion der Spenderzelle und das so genannte ‚Hand-Made-Cloning’ (HMC). Die ‚klassische’ Methode erfolgt mit Hilfe von Mikromanipulatoren. Mit einer Enukleationspipette werden der gereiften Oozyte durch Aspiration der erste Polköper und die Metaphase II-Platte entfernt (PRATHER et al. 1999).

Das aspirierte Volumen muss so gering wie möglich gehalten werden, da es maternale mRNA, die während der Reifung der Oozyte gebildet wurde (MADDOX-HYTTEL et al.

2005), und maternale Proteine enthält, die für Bildung der Spindel während der initialen Zellteilungen und Rückprogrammierung verantwortlich sind. Eine Entfernung dieser Zytoplasmabestandteile wird unter anderem als Grund für eine geringe Effizienz des Kerntransfers angenommen (GURDON et al. 2003). Zur besseren Kontrolle, ob auch das gesamte genetische Material aus der Oozyte entfernt wurde, werden die Oozyten nach Hoechstfärbung kurzzeitig mit UV-Licht bestrahlt, was das Risiko zu einer Schädigung der Oozyte beinhalten kann. Im Anschluss an die Enukleation erfolgt die Injektion einer intakten Spenderzelle in den perivitellinen Raum. Durch einen elektrischen Impuls werden Spenderzelle und Empfängerzelle fusioniert und schließlich durch einen zweiten elektrischen Impuls aktiviert. Alle diese Schritte stellen eine weitere Belastung für die Oozyte dar. Zur Übersicht siehe Abbildung 5a. Auch bei der intrazytoplasmatischen Injektion der Spenderzelle werden Mikromanipulatoren benötigt (LEE et al. 2003c; ONISHI et al. 2000).

Bei dieser Methode wird die Oozyte genauso wie beim ‚klassischen’ Klonen entkernt, anschließend jedoch die Spenderzelle in das Ooplasma der Oozyte injiziert. Eine Fusion ist nicht erforderlich, wobei die Inkorporation des neuen Zellkerns nicht immer gesichert ist. Zur

(39)

Übersicht siehe Abbildung 5b. Das HMC ist eine vereinfachte und schnellere Kerntransfermethode, die keine Mikromanipulatoren benötigt (KRAGH et al. 2004; VAJTA et al. 2005). Bei dieser Methode werden die Oozyten zunächst mit Demecolcin behandelt. Es bewirkt eine Erweichung des Zytoskeletts und damit eine Vorwölbung der Metaphase II am Rand der Oozyte (KAWAKAMI et al. 2003; YIN et al. 2002). Anschließend wird die Zona pellucida durch Pronase entfernt. Nun kann mit Hilfe eines Skalpells, das von Hand geführt wird, die Oozyte in Karyo- und Zytoplast geteilt werden (VAJTA et al. 2001). Die Lysisrate hierbei liegt bei Schweineoozyten bei 10-30% (VAJTA et al. 2005). Nach erfolgreicher Enukleation werden die Zytoplasten durch Inkubation in Phythämagglutinin ‚klebrig’

gemacht und immer zwei Zytoplasten und eine Spenderzelle miteinander fusioniert und aktiviert. Die Fusion erfolgt in einer Fusionskammer zwischen zwei parallel ausgerichteten Drähten. Durch Anlegen einer Wechselstromspannung werden die Komplexe zunächst ausgerichtet, bevor sie durch einen Gleichstromimpuls fusioniert werden (PEURA et al.

1998). (Zur Übersicht siehe Abbildung 5c) Es folgt die Aktivierung und eine in-vitro-Kultur der Embryonen für 7 Tage, da sie zu diesem Zeitpunkt auch physiologischerweise aus der Zona pellucida schlüpfen würden. Aufgrund der fehlenden Zona pellucida stellen die empfindlichen Rekonstrukte besondere Bedindungen an die Kultur. Beim Rind wurde daher für die Kultur das so genannte „Well of the Well“-System (WOW) entwickelt (VAJTA et al.

2000). Eine weitere Besonderheit bei dieser Methode ist, dass in den rekonstruierten Embryonen die DNA drei unterschiedlicher Mitochondrien nachweisbar ist, da 2 Oozyten und eine Spenderzelle miteinander fusioniert werden. Ein Embryotransfer kann bei dieser Methode erst im Blastozystenstadium erfolgen, da die Embryonen vorher zu empfindlich sind, und es im Eileiter oder Uterus zu einer Fusion oder Trennung der Blastomeren kommen kann (VAJTA et al. 2005). Das HMC ist bisher erst beim Rind routinemäßig etabliert (OBACK et al. 2003; VAJTA et al. 2001). Bei Schwein sind die in-vitro-Entwicklungsraten mit 4,8 bis 6% (Blastozysten an Tag 7) noch sehr gering und erlauben noch keine Übertragung auf Empfängertiere.

(40)

a) b) c)

Abbildung 5: Schematische Darstellung der Kerntransferverfahren. a) ‚klassische’ Fusionsmethode, b) intrazytoplasmatische Injektion des Karyoplasten, c) HMC (Hand-Made-Cloning)

Fusion

Fusion Aktivierung

Polkörper Metaphase II

Spenderzellen

(41)

2.3.2.2 Spenderzelle

Für die geringe Effizienz des Klonens von Säugetieren nach Kerntransfer wird besonders eine fehlerhafte Rückprogrammierung der Spenderzellen verantwortlich gemacht. Inzwischen wurden verschiedene Spenderzelltypen auf ihre Fähigkeit hin geprüft, nach Übertragung in Oozyten geklonten Nachwuchs hervorzubringen. Bei Säugetieren sind mehr als 200 verschiedene Zelltypen bekannt; weniger als 5% wurden bisher als Kernspender getestet. Fast alle erlaubten die Entwicklung bis zum Stadium der Blastozyste; aber viele waren mit einer weiteren Entwicklung nicht vereinbar (KATO et al. 2000; WAKAYAMA u.

YANAGIMACHI 2001). Gründe für die unterschiedliche Klonierbarkeit der Zellen liegen in genetischen oder epigenetischen Unterschieden im Spendergenom, fehlender oder unvollständiger genetischer oder epigenetischer Rückprogrammierung, oder einer Kombination aus beidem (OBACK u. WELLS 2002). Insbesondere dem Differenzierungsgrad der Spenderzellen wird eine große Bedeutung für den Erfolg des Klonens zugeschrieben (JAENISCH et al. 2002). Sowohl mit Stammzellen als auch mit differenzierten Zellen konnten erfolgreich Nachkommen geklont werden. Tabelle 2 zeigt eine Übersicht über die bisher eingesetzten Spenderzellen. (Siehe auch 2.4.) Um bei den erstellten Oozyten-Spenderzell-Komplexen einen diploiden Chromosomensatz zu erhalten, müssen sich die Spenderzellen in der G0/G1-Phase des Zellzyklus befinden. Es konnte gezeigt werden, dass sich mehr kleinere Fibroblasten in der G0/G1-Phase befinden, als größere Fibroblasten (BOQUEST et al. 1999; TAO et al. 1999).

(42)

Tabelle 2: Kloneffizienzen verschiedener somatischer Spenderzellen

Ursprungsgewebe Zelltyp Spezies Kloneffizienz^a

[%] Referenzen

Embryonal /Fetal/

Neugeboren

gesamter Fetus Fibroblasten Rind, Ziege,

Maus 0,05-1,2

(BAGUISI et al. 1999;

CIBELLI et al. 1998;

ONISHI et al. 2000)

Schwein, Schaf (ONO et al. 2001;

SCHNIEKE et al. 1997)

Herz Kardiomyozyten Rind 2,4^b (LUCAS-HAHN et al. 2004)

Embryonalscheibe Epitheliale Zellen Schaf 0,8 (CAMPBELL et al. 1996)

Hoden unreife Sertolizellen Maus 0,6 (OGURA et al. 2000)

Gonaden Fibroblasten? Maus 1,2 (WAKAYAMA u.

YANAGIMACHI 2001)

Leber Fibroblasten? Rind 3,1 (KATO et al. 2000)

Haut Fibroblasten? Rind 7 (KATO et al. 2000)

Adult

Milchdrüse Epitheliale Zellen Rind, Schaf 0,4-0,7 (KISHI et al. 2000; WILMUT et al. 1997) Follikel Granulosazellen Rind, Schwein 0,3-6,9 (POLEJAEVA et al. 2000;

WELLS et al. 1999)

Follikel Kumuluszellen Maus 0-4,3 (WAKAYAMA u.

YANAGIMACHI 2001)

Hoden reife Sertolizellen Maus 0 (WAKAYAMA u.

YANAGIMACHI 2001)

Eileiter Epithel Rind 4 (KATO et al. 2000)

Schwanzspitze Fibroblasten Maus 0,4 (WAKAYAMA u.

YANAGIMACHI 2001)

Haut Fibroblasten Rind 2,3 (KATO et al. 2000)

Thymus Lymphozyten Maus 0 (WAKAYAMA u.

YANAGIMACHI 2001)

Peritonealhöhle Makrophagen Maus 0 (WAKAYAMA u.

YANAGIMACHI 2001)

Milz Leukozyten Maus 0 (WAKAYAMA u.

YANAGIMACHI 2001)

Blut Leukozyten Rind 0,4 (GALLI et al. 1999)

Gehirn Neuronen?,

Gliazellen? Maus 0 (WAKAYAMA et al. 1998)

Blut B-/T-Zellen Maus 0,003 (HOCHEDLINGER u.

JAENISCH 2002) a: Nachkommen/rekonstruierte KT-Embryonen; b: Blastozysten/rekonstruierte KT-Embryonen