Funktionelle Charakterisierung von rekombinanten LCMV-Vektoren für die Therapie von Infektions- und Tumorerkrankungen

Medizinische Hochschule Hannover

Klinik für Gastroenterologie, Hepatologie und Endokrinologie

Funktionelle Charakterisierung von rekombinanten LCMV- Vektoren für die Therapie von Infektions- und

Tumorerkrankungen

INAUGURALDISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer Doktorin oder eines Doktors der Naturwissenschaften

- Doctor rerum naturalium - (Dr. rer. nat.)

vorgelegt von

Jessica Wingerath, geb. Heemcke aus Itzehoe

Hannover 2017

Angenommen durch den Senat: 16.01.2018

Präsident: Prof. Dr. med. Christopher Baum

Wissenschaftliche Betreuung: PD Dr. med. Thomas Wirth

Wissenschaftliche Zweitbetreuung: Prof. Dr. rer. nat. Reinhard Schwinzer

1. Referent: PD Dr. med. Thomas Wirth

2. Referent: Prof. Dr. rer. nat. Reinhard Schwinzer

3. Referent: Prof. Dr. rer. nat. Ulrich Kalinke

Tag der mündlichen Prüfung: 16.01.2018

Prüfungsausschuss

Vorsitz: Prof.‘in Dr. rer. nat. Christine Falk

1. Prüfer: PD Dr. med. Thomas Wirth

2. Prüfer: Prof. Dr. rer. nat. Reinhard Schwinzer

3. Prüfer: Prof. Dr. rer. nat. Ulrich Kalinke

1 Zusammenfassung ______________________________________________________ 6 2 Abstract _______________________________________________________________ 7 3 Einleitung ______________________________________________________________ 8 3.1 Immunologische Grundlagen ________________________________________________ 8

3.1.1 Angeborenes und adaptives Immunsystem ____________________________________________ 8 3.1.2 Primäre (1°) und sekundäre (2°) CD8⁺T-Zell-Immunantworten _____________________________ 9 3.1.3 Subpopulationen der CD8⁺T-Gedächtniszellen (T_EM und T_CM) _____________________________ 10 3.1.4 Coinhibitorische Moleküle ________________________________________________________ 11 3.2 Etablierte Vakzinierungsvektoren ___________________________________________ 13

3.2.1 Lymphozytäre-Choriomeningitis-Virus (LCMV) ________________________________________ 13 3.2.2 LCMV als Vakzine ________________________________________________________________ 15 3.2.3 Vacciniavirus ___________________________________________________________________ 16 3.2.4 Adenovirus _____________________________________________________________________ 16 3.2.5 Listeria monocytogenes __________________________________________________________ 17 3.3 Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) _________________________________________ 18

3.3.1 Das hepatozelluläre Karzinom als Tumormodell _______________________________________ 18 3.4 Zielsetzung _____________________________________________________________ 20 4 Ergebnisse ____________________________________________________________ 21

4.1 Analyse der rLCMV-OVA-induzierten Immunantwort____________________________ 21 4.1.1 Die optimale Dosierung von rLCMV-OVA _____________________________________________ 21 4.1.2 Kinetik der durch rLCMV-OVA und LCMV-WT induzierten Immunantworten ________________ 24 4.1.3 Frequenz und Phänotyp von T_CM und T_EM nach Vakzinierung mit verschiedenen Vektoren _____ 27 4.1.4 Gewebeverteilung von SIINFEKL-spezifischen CD8⁺T-Zellen (OT-I-Zellen) nach Vakzinierung mit

OVA-exprimierenden Vektoren ____________________________________________________ 29 4.1.5 Zytokinexpression von SIINFEKL-spezifischen CD8⁺T-Zellen (OT-I-Zellen) nach rLCMV-OVA-

Vakzinierung ___________________________________________________________________ 31 4.1.6 Funktionalität von rLCMV-Vektoren mit anderen Antigenen als Ovalbumin _________________ 32 4.2 Priming-Boosting-Strategien unter Verwendung von rLCMV-OVA _________________ 34

4.2.1 Vergleichende Kinetik der primären und sekundären Immunantwort nach rLCMV-OVA-

Vakzinierung (Priming und Boosting) ________________________________________________ 34 4.2.2 Einfluss des zeitlichen Abstands zwischen rLCMV-OVA-Priming und -Boosting auf den Anstieg der

spezifischen Immunantwort _______________________________________________________ 35 4.2.3 Vergleich der Immunantworten nach homologem Boosting mit unterschiedlichen OVA-

exprimierenden Vektoren _________________________________________________________ 37 4.2.4 Eignung von rLCMV-OVA im heterologen Boosting _____________________________________ 40 4.2.5 Der Einfluss von Präinfektionen auf den Vakzinierungserfolg _____________________________ 44 4.3 Untersuchung der Funktionalität und protektiven Eigenschaften von rLCMV-OVA im

tumorfreien Modell ______________________________________________________ 46 4.3.1 Qualität der spezifischen CD8⁺T-Gedächtniszellen _____________________________________ 46 4.3.2 Quantifizierung der in vivo Zytotoxizität von spezifischen CD8⁺T-Gedächtniszellen ___________ 48 4.3.3 Untersuchung der protektiven Wirkung von Vakzinierungen mit rLCMV-OVA und anderen

Vektoren gegen bakterielle Infektionen ______________________________________________ 48 4.4 Die Eignung von LCMV-basierten Vektoren zur Therapie von HCC _________________ 50

4.4.1 Präimmunsierung mit rLCMV-OVA verhindert das Entstehen von OVA⁺HCC _________________ 50 4.4.2 Tumortherapie mit rLCMV ist abhängig von der Wahl des richtigen Antigens ________________ 53

5 Diskussion ____________________________________________________________ 55 5.1 rLCMV-induzierte Immunantworten und systemische Inflammation _______________ 57

5.1.1 Die besonderen Eigenschaften des replikationsinkompetenten rLCMV-Vektors ______________ 57 5.1.2 Analyse der funktionellen Eigenschaften von rLCMV-OVA im Vergleich mit anderen Vektoren __ 59 5.2 Priming-Boosting-Vakzinierungen mit verschiedenen Vektoren ___________________ 61

5.2.1 Homologes Boosting _____________________________________________________________ 61 5.2.2 Heterologes Boosting ____________________________________________________________ 62 5.2.3 Die Proliferationsfähigkeit spezifischer CD8⁺T-Gedächtniszellen __________________________ 63 5.2.4 Der Einfluss von präexistierender Immunität auf den Vakzinierungserfolg __________________ 64 5.3 Die Eignung von rLCMV zur Tumortherapie ___________________________________ 66

5.3.1 Präventive Vakzinierung gegen HCC vor Tumorinduktion ________________________________ 66 5.3.2 Therapie von HCC nach Tumorinduktion _____________________________________________ 67 5.4 Ausblick ________________________________________________________________ 69 6 Material und Methoden _________________________________________________ 70

6.1 Material ________________________________________________________________ 70 6.1.1 Verbrauchsmaterialien, Chemikalien und Reagenzien __________________________________ 70 6.1.2 Antikörper und Tetramer für FACS-Analysen __________________________________________ 71 6.1.3 Angesetzte Medien und Lösungen __________________________________________________ 72 6.1.4 Geräte und sonstige Materialien ___________________________________________________ 73 6.1.5 Software ______________________________________________________________________ 74 6.1.6 Peptide ________________________________________________________________________ 74 6.1.7 Plasmide zur Induktion von Lebertumoren mittels HDI__________________________________ 74 6.1.8 Zelllinien ______________________________________________________________________ 75 6.1.9 Viren, Bakterien und Vektoren _____________________________________________________ 75 6.1.10 Versuchsmäuse _________________________________________________________________ 76 6.2 Zellbiologische Methoden _________________________________________________ 76

6.2.1 Passage der Zellen _______________________________________________________________ 76 6.2.2 Gewinnung von Zellüberstand _____________________________________________________ 77 6.2.3 Einfrieren und Auftauen von Zellen _________________________________________________ 77 6.3 Molekularbiologische Methoden ____________________________________________ 77

6.3.1 Konjugation von SIINFEKL-H-2K^b-Tetramer-APC (SIINFEKL-Tetramer) ______________________ 77 6.3.2 Titration von SIINFEKL-Tetramer ___________________________________________________ 77 6.4 Immunologische Methoden ________________________________________________ 78

6.4.1 Amplifikation und Injektion von LM-OVA _____________________________________________ 78 6.4.2 Aufreinigung und Antigenbeladung von dendritischen Zellen (DC) ________________________ 78 6.4.3 Erstellung von Zellsuspensionen für Durchflusszytometrie oder ICS _______________________ 79 6.4.4 Lyse der Erythrozyten ____________________________________________________________ 79 6.4.5 FACS-Färbung mit extrazellulären Antikörpern oder Tetramer ___________________________ 79 6.4.6 Intrazellulare Zytokinfärbung (ICS) __________________________________________________ 80 6.4.7 TAPI-2 Präinkubation bei CD62L-Färbung in ICS _______________________________________ 80 6.4.8 Darstellung von FACS-Daten in FlowJo _______________________________________________ 81 6.4.9 „Gating“-Strategie für FACS-Daten __________________________________________________ 82 6.4.10 Phänotypisierung der OT-I-Spendermäuse ___________________________________________ 84 6.4.11 Adoptiver OT-I-Transfer __________________________________________________________ 84 6.4.12 Adoptiver Transfer von T-Gedächtniszellen __________________________________________ 84 6.4.13 Passiver Serumtransfer __________________________________________________________ 84 6.4.14 Protektions-Versuch _____________________________________________________________ 85 6.4.15 In vivo Zytotoxizitätsversuch ______________________________________________________ 85 6.5 Tierexperimentelle Methoden ______________________________________________ 87

6.5.1 Maushaltung ___________________________________________________________________ 87 6.5.2 Durchführung der Tierversuche ____________________________________________________ 87

6.5.3 Zucht transgener Thy 1.1⁺ OT-I-Spendermäuse ________________________________________ 87 6.5.4 Applikationen in Mäuse __________________________________________________________ 88 6.5.5 Dosierungen von Viren, Bakterien und Vektoren ______________________________________ 88 6.5.6 Blutgewinnung Maus ____________________________________________________________ 88 6.5.7 Organentnahme Maus ___________________________________________________________ 89 6.5.8 Abbruchkriterien für immunologische Versuche und Tumorversuche ______________________ 89 6.6 Statistische Methoden ____________________________________________________ 90

6.6.1 Statistische Auswertung von FACS-Daten ____________________________________________ 90 6.6.2 Statistische Auswertung von Überlebenskurven _______________________________________ 91

7 Anhang ______________________________________________________________ 108 7.1 Abkürzungsverzeichnis ___________________________________________________ 108 7.2 Abbildungsverzeichnis ___________________________________________________ 110 7.3 Lebenslauf _____________________________________________________________ 112 7.4 Publikationen und Posterpräsentation ______________________________________ 113 7.4.1 Publikationen __________________________________________________________________ 113 7.4.2 Posterpräsentation _____________________________________________________________ 113 7.5 Erklärung über die selbstständige Arbeit_____________________________________ 114 7.6 Verfügbarkeit der Originaldaten ___________________________________________ 114 7.7 Einverständniserklärung zur Überprüfung mithilfe einer Plagiatssoftware __________ 114 7.8 Danksagung ____________________________________________________________ 115

1 Zusammenfassung

Mit Hilfe von Vakzinen ist es möglich, spezifische adaptive humorale oder zelluläre Immunantworten gegen schwere Infektionserkrankungen oder Krebs zu induzieren. Die wirksame Induktion von CD8⁺T-Zell-Immunantworten wird jedoch häufig durch Antikörper limitiert, die gegen den Vektor gerichtet sind und eine wiederholte Immunisierung erschweren.

Es ist für Vakzinierungstherapien daher von größter Bedeutung, Vektoren zu entwickeln, die starke zytotoxische CD8⁺T-Zell-Immunantworten (CTL) trotz bereits vorliegender Vektorimmunität des Patienten hervorrufen. In der vorliegenden Arbeit wurde der rekombinante Lymphozytäre-Choriomeningitis-Virus-Vektor (rLCMV) funktionell in Mäusen analysiert. Dieser replikationsinkompetente Vektor ist in der Lage, wirksame CTL- Immunantworten gegen das eingebrachte Zielantigen, in diesem Fall Ovalbumin (rLCMV-OVA), zu induzieren. In dieser Arbeit wurde rLCMV-OVA direkt mit Wildtyp-LCMV oder anderen ovalbumin-exprimierenden Vektoren basierend auf Adenovirus (rAd-OVA), Vacciniavirus (rVV- OVA) oder Listeria monocytogenes (attLM-OVA) verglichen.

Zunächst wurde gezeigt, dass rLCMV-OVA in der Lage ist deutliche CD8⁺T-Zell-Immunantworten zu induzieren. Die Kinetik zeigte dabei einen früheren Kontraktionsbeginn als die Kinetik der durch LCMV-WT hervorgerufenen Immunantworten. Durch rLCMV-OVA wurden langlebige, multifunktionale, gegen bakterielle Infektionen protektive und in vivo zytotoxische spezifische Gedächtniszellen mit einem überwiegenden Phänotyp für Effektor-T-Gedächtniszellen (TEM) generiert. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass sich rLCMV-OVA-induzierte CTL deutlich eher als beim Wildtyp homolog boosten ließen. Im direkten Vergleich mit anderen Vektoren erzeugte rLCMV-OVA eine geringe Gesamtaktivierung aller CD8⁺T-Zellen, aber einen hohen Anteil spezifischer CD8⁺T-Zellen. Im heterologen Boosting zeigte sich rLCMV-OVA sowohl als primäre als auch als sekundäre Vakzine effektiv, wobei rLCMV-OVA als gering inflammatorische Vakzine vor allem beim Priming einen großen Vorteil darstellte. rLCMV-OVA induzierte spezifische T-Gedächtniszellen, welche in der Lage waren, nach erneuter Antigenexposition stark zu proliferieren. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass eine Präinfektion mit Wildtyp-LCMV den Vakzinierungserfolg mit rLCMV-OVA nicht einschränkte.

Es wurde zudem die Eignung von rLCMV-OVA zur Therapie des ovalbuminexprimerenden hepatozellulären Karzinoms (OVA⁺HCC) überprüft. Der Tumor zeigte dabei einen Einfluss auf die Qualität der spezifischen CD8⁺T-Zellen. Dennoch wurde durch rLCMV-OVA-Therapie das Gesamtüberleben der Tiere verlängert. Zudem konnte durch eine Vakzinierung mit rLCMV-OVA vor der Tumorinduktion die Entstehung des Tumors sogar vollständig verhindert werden.

Die vorliegende Arbeit bietet viele neue und aufschlussreiche Einblicke in die Quantität und Qualität der rLCMV-induzierten Immunantworten und damit in die Nutzbarkeit LCMV-basierter replikationsinkompetenter Vektoren.

2 Abstract

Vaccines are capable of inducing adaptive humoral or cellular immune responses against severe infectious diseases or cancer. However, the induction of an effective CD8 T cell immune response is often limited by vector-directed antibodies hampering repeated immunizations. Therefore, it is a major goal for vaccine therapies to design vectors inducing strong cytotoxic CD8 T cell (CTL) immune responses despite pre-existing vector immunity in patients. In the present work, the recombinant lymphocytic choriomeningitis virus vector (rLCMV) was functionally characterized in mice. This replication-defective vector can induce effective CTL immune responses against expressed target antigens, in this case ovalbumin (rLCMV-OVA). In this work, rLCMV-OVA was directly compared to wildtype LCMV or other ovalbumin expressing vectors based on adenovirus (rAd-OVA), vaccinia virus (rVV-OVA) or Listeria monocytogenes (attLM-OVA).

First of all, it was shown that rLCMV-OVA is able to induce prominent CD8 T cell immune responses. The kinetics of rLCMV-OVA-induced immune responses showed an earlier onset of contraction compared to LCMV-WT-induced immune responses. rLCMV-OVA vaccination generated long-living and multifunctional specific memory T cells with a predominant effector memory phenotype (TEM), which are in vivo cytotoxic and protective against bacterial infection.

Furthermore, it was shown that rLCMV-OVA induced CTLs can be homologously boosted significantly earlier than CTLs generated by the wildtype virus. Compared to other vectors, rLCMV-OVA showed less overall activation of vector-specific CD8 T cells, but a high proportion of target-antigen-specific CD8 T cells. In heterologous boosting setups, rLCMV-OVA was a successful vaccine for priming as well as for boosting. Due to its lower systemic inflammation, rLCMV-OVA was most suitable for priming. rLCMV-OVA-induced specific memory cells showed a strong capacity to proliferate after repeated antigen exposure. In addition, it was shown that rLCMV-OVA vaccination was not affected by LCMV-WT pre-infection.

Moreover, the suitability of rLCMV-OVA for therapy of ovalbumin expressing hepatocellular carcinoma (OVA⁺HCC) was verified. It could be shown, that the tumor affected the quality of the specific CD8 T cells. However, rLCMV-OVA therapy could prolong the overall survival of the animals. Furthermore, tumor formation could be inhibited due to rLCMV-OVA vaccination before tumor induction.

The present work provides many new revealing insights in the quantity and quality of rLCMV- OVA induced immune responses as well as in the usability of LCMV-based replication-deficient vectors.

3 Einleitung

3.1 Immunologische Grundlagen

3.1.1 Angeborenes und adaptives Immunsystem

Das angeborene Immunsystem ist evolutionär sehr früh entstanden, es dient der Abwehr von eindringenden Pathogenen z.B. bei Verletzungen und ist die Voraussetzung für das Entstehen einer adaptiven Immunantwort (Beutler, 2004). Maßgeblich für das angeborene Immunsystem ist die schnelle Reaktionsfähigkeit durch die Erkennung von typischen Mustern, die körperfremd und mit Pathogenen assoziiert sind, sogenannte PAMPs (= engl.: „pathogen associated molecular patterns“), zu denen unter anderem bakterielle Lipoproteine (BLPs), bakterielles Lipopolysaccarid (LPS), Peptidoglykane, doppelsträngige virale RNA oder nicht-methylierte DNA zählen (Aliprantis et al., 1999; Medzhitov and Janeway, Jr., 1997) Das adaptive Immunsystem hingegen ist antigensspezifisch und in der Lage, ein immunologisches Gedächtnis aufzubauen.

Dabei reagiert es bei primären Immunantworten deutlich langsamer als das angeborene Immunsystem und ist abhängig von antigenpräsentierenden Zellen (engl.: „antigen presenting cells“ = APCs). Dendritische Zellen (engl.: „dendritic cells“ = DCs) können primäre adaptive Immunantworten erzeugen, indem sie Pathogene phagozytieren und deren Proteine als kurzkettige Antigene (= Epitope) präsentieren (Reis e Sousa et al., 1993; Inaba et al., 1993). DCs befinden sich in lymphoiden und nichtlymphoiden Organen und bewegen sich über das Blut- und das Lymphgefäßsystem (Steinman, 1991). Zur Präsentation werden die Epitope auf Haupthistokompatibilitätskomplexe (engl.: „major histocompatibility complex“ = MHC) geladen.

Über sogenannte Toll-like Rezeptoren (TLRs) sowie Zytokine und weitere inflammatorische Signale kommt es zur erhöhten Expression costimulatorischer Moleküle. Dadurch wird die Expression weiterer Zytokine induziert und die DCs migrieren in sekundäre lymphatische Organe, zu denen die Milz, die Lymphknoten und mukosa-assoziierte Lymphfollikel (MALT) zählen. Dort treffen sie auf naïve Lymphozyten (Yang et al., 1998; Banchereau et al., 2000; Heath and Carbone, 2001).

Es gibt zwei Klassen von MHC-Molekülen mit unterschiedlicher Funktion: Auf der einen Seite werden Peptide, die durch Phagozytose von APCs aufgenommen werden, auf MHC-Klasse-II- Molekülen präsentiert. Diese werden dann von CD4⁺T-Helferzellen oder B-Zellen erkannt, wodurch eine humorale Immunantwort ausgelöst wird (Doyle and Strominger, 1987). Auf der anderen Seite werden Peptide, die von intrazellulären Proteinen oder von eindringenden Viren stammen, auf den MHC-Klasse-I-Komplex geladen. Über dieses Molekül werden für dieses Antigen spezifische CD8⁺T-Zellen stimuliert und eine zelluläre, zytotoxische Immunantwort erzeugt (Nelson et al., 1994; Zinkernagel, 1996). Mittels Kreuzpräsentation, welche in erster Linie durch DCs erfolgt, können auch exogene Antigene und damit virale und tumorale Antigene

auf MHC-Klasse-I-Molekülen präsentiert werden (Ackerman et al., 2003). Gleichzeitig können DCs aber auch autoimmune Reaktionen verhindern, indem sie die Toleranz von T-Lymphozyten gegenüber körpereigenen Antigenen fördern (Kurts et al., 1997; Forster and Lieberam, 1996).

3.1.2 Primäre (1°) und sekundäre (2°) CD8

T-Zell-Immunantworten

Die T-Zell-Rezeptoren (engl. = „T cell receptor“ = TCR) naïver CD8⁺T-Zellen sind hoch variabel und das gesamte Repertoire an naïven T-Zellen kann eine Vielzahl verschiedener Antigene erkennen. Für jedes Antigen gibt es jedoch nur eine sehr geringe Anzahl spezifischer naïver CD8⁺T-Zellen. Eine T-Zelle erkennt mithilfe ihres TCRs das Antigen, für das sie spezifisch ist, wenn es auf der Oberfläche von DCs in Form von Peptid : MHC-Komplexen präsentiert wird.

Wenn die T-Zelle mit Hilfe von costimulatorischen Molekülen gleichzeitig aktiviert wird, dann wird die Expression des Zelladhäsionsmoleküls L-Selektin CD62L verringert, die T-Zelle verlässt den Lymphknoten und beginnt klonal zu expandieren (Berard and Tough, 2002; Waters et al., 2003). Dadurch entstehen sehr viele primäre (1°) CD8⁺T-Effektorzellen mit gleicher Spezifität, die sich im Blut und im Gewebe bewegen und dort infizierte Zellen aufspüren, welche die Antigene des Pathogens auf der Oberfläche präsentieren. Diese Zellen werden von den antigenspezifischen CD8⁺T-Effektorzellen erkannt und zytotoxisch oder durch die Expression von Zytokinen zerstört (Zinkernagel, 1996). Die Proliferationsphase der CD8⁺T-Zellen hält ungefähr 7-11 Tage nach Infektion oder Vakzinierung an, gefolgt von einer Kontraktionsphase, bei der etwa 90 % der Zellen dem programmierten Zelltod unterliegen. Am Ende der Kontraktionsphase existieren mehr spezifische 1° T-Gedächtniszellen als für das gleiche Antigen spezifische naïve T-Zellen vor der ersten Infektion (Badovinac et al., 2002). Sie können jahrelang im Körper zirkulieren (beim Menschen über 10 Jahre (Sallusto et al., 1999)) und schützen vor wiederholter Infektion. Die Qualität und Quantität der 1° T-Gedächtniszellen ist abhängig von einem komplexen Zusammenspiel aus Signalen, denen die Zellen während der gesamten Immunantwort seit der Erstinfektion ausgesetzt waren. Diese Signale umfassen Signal I (Antigenerkennung), Signal II (Costimulation) und Signal III (instruierende, inflammatorische Zytokine) (Bretscher and Cohn, 1970; Badovinac and Harty, 2007; Curtsinger et al., 1999).

T-Gedächtniszellen bieten einen optimalen Schutz gegen erneute Infektionen mit dem gleichen oder einem verwandten Pathogen, wobei die Menge der T-Gedächtniszellen im engen Zusammenhang mit der Effektivität der Protektivität steht (Harty and Badovinac, 2008). Bei erneuter Antigenstimulation sind T-Gedächtniszellen in der Lage, stärker und mit einer anderen Qualität als naïve T-Zellen auf das gleiche oder ein verwandtes Pathogen zu reagieren (Bruno et al., 1995). Auch die Qualität und Quantität der sekundären (2°) Immunantwort ist abhängig von dem Pathogen, der Dauer der Stimulation und den inflammatorischen Signalen (Wirth et al., 2011). T-Gedächtniszellen sind einfacher zu stimulieren als naïve T-Zellen, sie sind unabhängiger von costimulatorischen Signalen und reagieren schon auf geringere

Konzentrationen von Antigen bei einer kürzeren Stimulationsdauer (Bachmann et al., 1999). Die Stimulation naïver T-Zellen ist von DCs und aktivierten B-Zellen abhänging, wohingegen T-Gedächtniszellen von allen APCs einschließlich Makrophagen und ruhenden B-Zellen stimuliert werden können (Zammit et al., 2005; Croft et al., 1994). Darüber hinaus sind manche T-Gedächtniszellen in der Lage, in peripheres, nicht lymphatisches Gewebe einzuwandern und so auf lokale Infektionen unmittelbar zu reagieren. Während der 2° Immunantwort proliferieren die spezifischen 1° T-Gedächtniszellen stärker, zeigen früher Effektorfunktionen (mit Zytokinausschüttung und zytolytischer Aktivität) und führen in vivo zu höheren Frequenzen spezifischer 2° T-Effektorzellen verglichen mit der Anzahl an 1° T-Effektorzellen (Veiga- Fernandes et al., 2000). Dafür kontrahiert die Frequenz der 2° T-Effektorzellen langsamer als während der 1° Immunantwort. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass sich der Phänotyp der spezifischen T-Zellen mit jeder erneuten Antigenstimulation verändert. So weisen 2° T- Effektor- und Gedächtniszellen in der Regel eine höhere Expression an KLRG1 (engl. für: „Killer cell lectin-like receptor subfamily G member 1“) auf als bei der 1° Immunantwort, weswegen KLRG1 unter anderem ein Marker für wiederholte antigenabhängige Proliferation, aber auch für T-Zell-Seneszenz ist (Voehringer et al., 2001). Die Frequenz an T-Zellen, die CD27, ein costimulatorisches Molekül und Aktivierungsmarker, hoch exprimieren, nimmt hingegen nach wiederholter Infektion oder Vakzinierung ab (Wirth et al., 2011; Hendriks et al., 2000).

Zusammengefasst führt die wiederholte Stimulation antigenspezifischer CD8⁺T-Zellen zu wiederkehrenden Zyklen aus Effektorphase, Kontraktionsphase und Bildung eines stabilen T-Gedächtniszellpools, auf den nach erneuter Antigenstimulation wieder eine Effektorphase folgt. Maßgeblich hierbei ist, dass die auf die erste Antigenstimulation (= Priming) folgenden erneuten Antigenkontakte zu einer qualitativ und quantitativ verstärkten Immunantwort führen, weswegen die weiteren Stimulationen auch als Boostings bezeichnet werden. Dieser Umstand kommt in zahlreichen Priming-Boosting-Vakzinierungsstrategien zum Tragen.

3.1.3 Subpopulationen der CD8

T-Gedächtniszellen (T

und T

)

Es gibt zahlreiche Subtypen von CD8⁺T-Gedächtniszellen, wobei der Fokus in dieser Arbeit auf zirkulierenden, durch Infektion oder Vakzinierung aus Effektorzellen hervorgegangenen T-Gedächtniszellen liegen soll.

Etwa 40 Tage nach Infektion entstehen bei Mäusen CD8⁺T-Zellen mit typischem CD44^hi, CD127^hi, CD122^hi, CD43(1B11)^int, Ly6C^hi Gedächtnis-Phänotyp (Kaech et al., 2002a; Murali-Krishna and Ahmed, 2000). Die antigenabhängigen CD8⁺T-Gedächtniszellen lassen sich dabei in zwei Subpopulationen unterteilen, die unterschiedlich auf eine wiederholte Stimulation mit demselben Antigen reagieren (Harrington et al., 2000). Die sogenannten zentralen T- Gedächtniszellen (engl.: „central memory T cells“ = T^CM) sind positiv für den Chemokinrezeptor CCR7 sowie für das Selektin CD62L und in den sekundären lymphatischen Organen lokalisiert

(Sallusto et al., 1999). Sie weisen eine ähnliche Zirkulation wie naïve T-Zellen auf, sprechen jedoch auf zusätzliche Rezeptoren wie CCR4 und Zytokine an und interagieren stärker mit DCs.

Sie können schnell und effektiv durch DCs stimuliert werden, woraufhin sie aktiviert werden und verstärkt proliferieren. Sie können ihrerseits die DCs stimulieren, wodurch sie die Entstehung neuer T-Effektorzellen unterstützen.

Effektor-T-Gedächtniszellen (engl.: „effector memory T cells“ = T^EM) hingegen sind negativ für CCR7 und exprimieren geringere Mengen von CD62L. Sie können schnell in peripheres Gewebe einwandern und dort eine Entzündungsreaktion hervorrufen. Bei erneuter Antigenerkennung können TEM im Gegensatz zu TCM sofort als sekundäre Effektorzellen fungieren und durch Induktion von Inflammation und Zytotoxizität effektiv gegen Pathogene wirken, jedoch proliferieren sie deutlich schlechter als TCM (Sallusto et al., 1999; Bachmann et al., 2005). TEM

können schneller als TCM mit der Produktion von Interferon-γ (IFNγ) beginnen, einem Effektorzytokin, welches essentiell für protektive Immunantworten im Gewebe ist (Sallusto et al., 1999).

TCM überleben nach akuter Infektion in vivo länger als TEM und weisen eine stärkere Proliferationsfähigkeit auf (Wherry et al., 2003b). Diese beiden Populationen sind jedoch nicht unterschiedlicher Abstammung, denn nach Ende der Infektion können TEM in TCM konvertieren und stellen damit zwei unterschiedliche Stadien einer Differenzierungsabfolge von naïven Zellen und Effektorzellen über TEM nach TCM dar. Diese Differenzierung ist von der Anwesenheit bestimmter Zytokine und der Dauer und Stärke der Stimulation der T-Zellen abhängig. Aufgrund der Kurzlebigkeit der TEM und der geringen Expression von CD62L ist es phänotypisch mitunter schwierig, diese von Effektorzellen zu unterscheiden (Opata and Stephens, 2013). In Studien wurde beobachtet, dass eine Population von CD27-negativen TEM dem programmierten Zelltod unterliegt und dadurch nach einer gewissen Zeit nur noch langlebige CD62L^loCD27^- Zellen übrig bleiben, die entweder späte Effektor-T-Gedächtniszellen oder auch langlebige T-Effektorzellen darstellen könnten (Nolz et al., 2012; Opata and Stephens, 2013).

Frühe murine T-Gedächtniszellen besitzen allgemein eher einen CD62L^loCD27^loCD127^intKLRG1^hi -Phänotyp, sodass mithilfe dieser vier Marker prinzipiell zwischen Effektorphase und früher T-Gedächtnisphase unterschieden werden kann (Olson et al., 2013). Unter Einbeziehung der Subpopulationen und der Konvertierung von TEM in TCM im Laufe der Zeit lassen sich TEM als CD62L^loCD27^lo/intCD127^hiKLRG1^hi und TCM als CD62L^hiCD27^hiCD127^hiKLRG1^lo definieren (Wherry et al., 2003b; Rosenblum et al., 2016).

3.1.4 Coinhibitorische Moleküle

Die Aktivierung von T-Zellen ist von den oben genannten drei Signalen abhängig, von denen die Costimulation das Signal II darstellt. Diese erfolgt über costimulatorische Moleküle wie CD27

und CD28, welche auf T-Zellen exprimiert werden und an ihre Liganden CD70 oder CD80/CD86 binden (Hendriks et al., 2000; Linsley et al., 1991).

Auf der anderen Seite gibt es jedoch auch coinhibitorische Moleküle, die Immunantworten abschwächen. CTLA-4 (engl.: „Cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4“) ist in der Lage, an CD80 und CD86 mit höherer Affinität als CD28 zu binden und zu depletieren und kann daher die Costimulation durch CD28 inhibieren (Qureshi et al., 2011). PD-1 (engl.: „programmed cell death protein 1“) ist ein Transmembranprotein von NK-, T- und Pro-B-Zellen und wird nach Aktivierung hochreguliert (Ishida et al., 1992; Terme et al., 2011; Agata et al., 1996). Es bindet an seine Liganden PD-L1 und PD-L2, welche u.a. auf der Oberfläche von DCs, Makrophagen und B- Zellen, aber auch auf aktivierten T-Zellen exprimiert werden (Yamazaki et al., 2002). Durch diese Bindung wird einerseits die Aktivierung der Lymphozyten abgeschwächt, andererseits wird die Entwicklung von regulatorischen T-Zellen angeregt. Durch das Unterdrücken der TCR- vermittelten T-Zell-Proliferation und ihrer Zytokinausschüttung wird Autoimmunität reduziert und die Toleranz des Immunsystems unterstützt (Francisco et al., 2009; Latchman et al., 2001;

Ansari et al., 2003; Keir et al., 2006). Der Signalweg des Rezeptors TIM-3 (engl.: „T-cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3“), dessen Ligand Galectin 9 ist, verhindert ebenfalls die Entstehung von Autoimmunitätsreaktionen (Zhu et al., 2005; Monney et al., 2002).

Er wirkt bei der Proliferation und Zytokinausschüttung von spezifischen T-Zellen nach einmaliger oder wiederholter akuter Infektion mit (Gorman et al., 2014).

Viele humane Tumore machen sich diese sogenannten Checkpoint-Signalwege zunutze, indem die Liganden PD-L1 oder Galectin 9 verstärkt exprimiert werden und dadurch die tumorgerichtete Immunantwort gehemmt wird (Kang et al., 2015; Curiel et al., 2003). Durch die vermehrte Expression der Liganden wird auch die Expression von PD-1 bzw. TIM-3 auf den tumorinfiltrierenden Lymphozyten erhöht, wodurch eine funktionelle Erschöpfung der T-Zellen eintreten kann, die vorwiegend im immunsuppressiven Milieu eines Tumors auftritt (Taube et al., 2014; Kang et al., 2015). Durch die gleichzeitige Expression von PD-1 und TIM-3 auf tumorspezifischen CD8⁺T-Zellen verlieren diese ihre zytotoxische Kompetenz (Jin et al., 2010;

Fourcade et al., 2010). Außerdem wurde bei T-Zellen, die TIM-3 oder PD-1 exprimieren, vermehrt Apoptose beobachtet (Kang et al., 2015; Shi et al., 2011). Die hohe Expression von PD- L1 auf Tumorzellen des hepatozellulären Karzinoms steht im Zusammenhang mit aggressivem Tumorwachstum (Gao et al., 2009). Bei Tumorpatienten konnte mit dem Voranschreiten der Erkrankung eine erhöhte Expression von PD-1 auf den zirkulierenden T-Zellen beobachtet werden (Shi et al., 2011).

Moderne Immun- und Tumortherapien verwenden spezifische, monoklonale antagonistische Antikörper gegen coinhibitorische Moleküle (Immun-Checkpoint-Inhibitoren) zur Hemmung immunregulatorischer Signalwege, wodurch die antitumorale Immunantwort verstärkt wird.

Dies hat sich als besonders erfolgreich gegen mutationsreiche Tumorarten, darunter das

Melanom, Lungen- oder Blasenkarzinom erwiesen (Brahmer et al., 2012; Powles et al., 2014;

Snyder et al., 2014). Mithilfe dieser Antikörper kann die T-Zell-Erschöpfung reduziert werden, die Zellen proliferieren wieder verstärkt und können vermehrt Zytokine produzieren (Jin et al., 2010; Fourcade et al., 2010).

3.2 Etablierte Vakzinierungsvektoren

3.2.1 Lymphozytäre-Choriomeningitis-Virus (LCMV)

Das Lymphozytäre-Choriomeningitis-Virus (LCMV) ist ein Virus aus der Familie der Arenaviren, welche als Ursache verschiedener letaler hämorrhagischer Fieber, darunter das Lassa Fieber, bekannt sind. LCMV wurde 1933 in St. Louis (USA) entdeckt und damit als erster Vertreter der Familie isoliert und beschrieben (Armstrong and Lillie, 1934).

Das Genom von LCMV besteht aus zwei negativen Ribonukleinsäure-Einzelsträngen ((-)ssRNA) mit gegenläufiger Orientierung (engl: = "ambisense") (siehe Abbildung 1 auf Seite 15). Gene, die von 5‘ nach 3‘ abgelesen werden (positive Polarität) können direkt translatiert werden. Der negativ polarisierte RNA-Strang hingegen muss zunächst in einen komplementären RNA-Strang transkribiert werden (Nguyen and Haenni, 2003). Die beiden RNA-Segmente werden unterteilt in ein L- und ein S-Segment und kodieren jeweils für die offenen Leseraster (engl.: „open reading frames“ = ORFs) zweier Gene, zwischen denen eine intergenetische Region (engl.: „intergenic region“ = IGR) bestehend aus nichtkodierender DNA liegt. Auf dem 7,2 kb großen L-Segment liegt das Gen für das 200 kDa große L-Protein mit charakteristischen Motiven für virale RNA- Polymerasen. Des Weiteren liegt auf dem L-Segment noch das deutlich kleinere 11 kDa große Z-Protein, welches ein RING-Finger-Motiv trägt (Lee et al., 2000). Dessen Funktion ist bisher wenig verstanden, doch es gibt Studien, die zeigen, dass es einen Einfluss auf Transkription und Replikation hat (Cornu and de La Torre, 2001). Das kleinere S-Segment (3,4 kb) kodiert für das virale Nukleoprotein NP (63 kDa) von 3‘ nach 5‘ und für die beiden Glykoproteine GP-1 (40 bis 46 kDa) und GP-2 (35 kDa) in 5‘ nach 3‘ Leserichtung (Flatz et al., 2010).

Das natürliche Hauptreservoir für LCMV-Armstrong sind Nagetiere, allen voran die Hausmaus (Mus musculus), welche genauso wie das Virus weltweit vorkommt und akut oder persistierend infiziert sein kann. LCMV ist ein nicht-lytisches Virus und initiiert eine Immunsuppression, wobei es primär nicht-lymphatische Zellen, sowie T-und B-Lymphozyten und Monozyten infiziert (Skinner and Knight, 1971; McChesney and Oldstone, 1987; Thomsen et al., 1982).

Findet die Infektion intrauterin oder kurz nach der Geburt statt, verläuft die Infektion meist symptomlos (Cihak and Lehmann-Grube, 1974). Betroffene Tiere produzieren keine Antikörper und werden zu Dauerausscheidern des Pathogens. Wird jedoch eine adulte Maus mit LCMV- Armstrong infiziert, dann zeigt sie häufig Symptome einer Choriomeningitis und kann daran sterben. In Versuchen konnte gezeigt wurde, dass der Infektionsort dabei entscheidend ist.

Während die intracerebrale Infektion adulter Mäuse meistens zum Tod führt, sterben an einer intraperitonealen (i.p.) Injektion nur wenige Tiere. Obwohl sich nach einer Infektion neutralisierende Antikörper bilden, steht die vollständige Eliminierung des Virus eher im Zusammenhang mit zellulärer Immunität. Abhängig von der Dosis und der Route kann die Infektion zum Tod oder Erholung mit anschließender Protektion gegenüber dem Pathogen führen. Je nach Wirt kann es zu unterschiedlichen Symptomen kommen, was möglicherweise mit einer Störung der Translations-Maschinerie durch den negativ polarisierten RNA-Strang zusammen hängt (Nguyen and Haenni, 2003).

Menschen werden meist durch Mäuse oder Hamster, die als Haustier gehalten werden, infiziert.

Bei ihnen ist der Krankheitsverlauf selten klinisch relevant. Nur jeder dritte Infizierte zeigt leichte grippeähnliche Symptome, selten kommt es zu einer Choriomeningitis (Lehmann-Grube, 1972). Bei immunkompetenten Individuen heilt die Infektion komplett aus, während es bei Immunsupprimierten hingegen zu schweren Verläufen mit tödlichem Ausgang kommen kann.

Mensch-zu-Mensch-Übertragungen finden jedoch in der Regel nur bei Organtransplantationen statt. Eine Infektion während der Schwangerschaft kann bei Ungeborenen zu schweren Schäden und zum Tod durch das Virus führen (Meritet et al., 2009). Die Seroprävalenz in der Bevölkerung ist mit etwa 3 % gering, was eine wichtige Voraussetzung für Vakzinierungen ist, die eine zelluläre Immunantwort erzeugen sollen (de Lamballerie et al., 2007; Lledo et al., 2003).

Mit der Zeit wurden verschiedene Stämme isoliert, welche variable Tropismen zeigen (Ahmed et al., 1984). LCMV-Armstrong, das aus dem Gehirn isoliert wurde, hat einen Tropismus für das zentrale Nervensystem, führt zu akuten Infektionen und die infizierten Zellen werden in der Regel innerhalb von einer Woche durch zytotoxische T-Zellen eliminiert (Wherry et al., 2003a).

Dagegen ist LCMV-Klon-13 in der Lage, eher viszerale Organe zu infizieren. Es wurde aus der Milz von Mäusen isoliert, die seit der Geburt chronisch mit LCMV-Armstrong infiziert waren (Ahmed et al., 1984). LCMV-Klon-13 löst nur schwache Immunantworten aus, persistiert im Wirt und wird heute für die Untersuchung von chronischen Infektionen und Unterdrückung der spezifischen zytotoxischen T-Zell (CTL)-Immunantwort verwendet. Diese beiden Stämme, Armstrong und Klon 13, unterscheiden sich nur in fünf Nukleotiden voneinander, jedoch wird durch diese Änderungen der Tropismus (verstärkt zu Makrophagen), die Replikationsfähigkeit sowie die virale Persistenz beeinflusst (Bergthaler et al., 2010; Sullivan et al., 2011; Matloubian et al., 1993).

Mit Hilfe von LCMV wurden viele Schlüsselkomponenten des Immunsystems wie MHC- Restriktion oder T-Zell-Erschöpfung erforscht (Zinkernagel and Doherty, 1974; Moskophidis et al., 1993). Heutzutage liegt der Fokus eher auf der Untersuchung von chronischen Infektionen nach persistierender LCMV-Klon-13-Infektion und auf der Entwicklung von Vakzinen durch den Einsatz von LCMV-Armstrong, welches massive CD8⁺T-Zell-Immunantworten erzeugen kann (Zhou et al., 2012). Dadurch bieten sich interessante Möglichkeiten für die Immuntherapie.

al., 2010). Die genannten Eigenschaften machen rekombinante LCMV-Vektoren (rLCMV) zu einem vielversprechenden Werkzeug in der Immuntherapie für Vakzinierungen oder Behandlungen im Fall von schweren Infektions- oder Tumorerkrankungen.

3.2.3 Vacciniavirus

Vacciniavirus ist ein komplexes, behülltes Virus aus der Familie der Pockenviren mit linearer Doppelstrang-DNA von etwa 190 Kilobasenpaaren Länge (Johnson et al., 2006). Im Gegensatz zu den meisten anderen DNA-Viren repliziert es im Zytoplasma und nicht im Zellkern.

Pockenimpfstoffe basieren auf dem Vacciniavirus, dessen genauer Ursprung nach langer Zellkultur nicht mehr genau definiert werden kann. Der Begriff Vakzine oder Vakzinierung für einen Impfstoff bzw. eine Impfung wurde 1796 von Edward Jenner zuerst angewendet und leitet sich vom lateinischein Wort „vacca“ = Kuh ab. Die Impfung fand gegen Kuhpocken statt und wurde in primitiver Form bereits 1000 v. Chr. in Indien praktiziert (Henderson and Moss, 1999).

Durch die Tatsache, dass rekombinante Vaccina-Vektoren ohne Verlust der Infektiösität große Mengen fremder Gene exprimieren können, wurde Vacciniavirus für die medizinische Forschung interessant (Smith and Moss, 1983). Impfungen mit Vacciniavirus in Tierversuchen waren in der Lage, Protektivität gegen Infektionen mit Influenza, Herpes simplex, Hepatitis B, Tollwut oder Stomatitis vesicularis zu erzeugen (Chakrabarti et al., 1985).

Der in dieser Arbeit verwendete rekombinante Vaccinia-Vektor ist auf dem Hintergrund des Western Reserve Stammes kloniert worden und enthält das OVA-Epitop SIINFEKL (OVA257-264) (Wirth et al., 2010a; Restifo et al., 1995).

3.2.4 Adenovirus

Adenoviren zählen zu der Familie der Adenoviridae mit insgesamt fünf Gattungen (Agrawal et al., 2017). Es sind unbehüllte, lytische Viren mit linearer Doppelstrang-DNA und mit einem Genom zwischen 30 und 38 kb. Die am besten studierten humanen Adenoviren zählen zu der Gattung Mastadenovirus, welche in sieben Spezies (A-G) mit über 50 Serotypen unterteilt ist. Sie können eine Vielzahl verschiedener Zellen in unterschiedlichen Geweben infizieren, weshalb adenovirale Vektoren die am besten untersuchten viralen Vektoren für die Gentherapie sind (Niemann and Kuhnel, 2017). Die Ansteckung mit Adenoviren kann über direkten Kontakt, Wasser oder fäkal-oral stattfinden und die Infektion kann symptomlos verlaufen oder aber bei immunsupprimierten Patienten auch letal sein (Arnberg, 2012). Der am häufigsten für die Forschung verwendete Serotyp ist Adenovirus Typ 5 (Ad5) aus Spezies C. Adenoviren dieser Spezies haben einen bevorzugten Tropismus für humane Hepatozyten, aber auch für die Atemwege, Augen und in lymphatische Zellen. Ad5 infiziert natürlicherweise das Lungenepithel und gelangt über das Lymphgefäßsystem in den Blutkreislauf (Alemany et al., 2000). Die Seroprävalenz in der Bevölkerung mit 40-80 % ist relativ hoch, da die erste Infektion mit

Adenovirus oft schon in der Kindheit erfolgt (Arnberg, 2012; Rocholl et al., 2004). Ad5-Vektoren sind relativ gering pathogen, lassen sich technisch leicht in hohen Titern herstellen, können erhebliche Mengen heterologer DNA aufnehmen und sowohl sich teilende als auch ruhende Zellen transduzieren. Sie wurden bereits als klinische Vakzinen verwendet, u.a. gegen HIV oder Infektionen mit dem Epstein-Barr-Virus (Graham and Prevec, 1995; Arnberg, 2012). Mit Hilfe zweier Vektoren (pShuttleCMV und pAdEasy) wurde ein Ad5-Vektor mit Deletionen im E1- und E3-Bereich generiert, der als Basis für den in dieser Arbeit verwendeten Vektor diente (Luo et al., 2007). Die E3-Region verändert die Signale der Wirtszellen und hat einen Einfluss auf ihre Immunantworten (Horwitz, 2004). Das E1A Protein stimuliert die Expression anderer viraler Gene und induziert Mitose in der Wirtszelle. Durch die Deletion der E1-Region (engl.: „essential early region 1“) wird der Vektor in den meisten Zelllinien replikationsdefizient (Amalfitano and Parks, 2002; Engelhardt et al., 1994).

Mittels homologer Rekombination wurde das gesamte OVA-Protein in den Vektor integriert, wodurch der in dieser Arbeit verwendete replikationsdefiziente rAd-OVA-Vektor entstand.

3.2.5

Listeria monocytogenes ist ein gram-positives, stäbchenförmiges Bakterium aus der Gruppe der Lactobacillus-Bacillus-Brochotrix-Gruppe, welches bei 37°C unbegeißelt ist oder sich bei Raumtemperatur mit Flagellen fortbewegt. Es ist fakultativ-anaerob und bildet keine Sporen.

Der Name der Gattung verweist auf den Chirurgen Lord Lister, einen Pionier der Antiseptik. Der Artname deutet auf die häufig ausgeprägte Monozytose nach einer Infektion mit diesem Bakterium hin (Darai et al., 2012). L. monocytogenes ist ubiquitär verbreitet, führt jedoch selten und eher bei immunschwachen Menschen und Tieren zu einer Vielzahl von Symptomen mit beträchtlicher Mortalität, die als Listeriose zusammengefasst werden (Swaminathan and Gerner-Smidt, 2007). Es wird in der Regel über kontaminierte Lebensmittel aufgenommen und überwindet die intestinale Barriere (Lecuit et al., 2001). In tieferen Gewebeschichten kann L. monocytogenes in Zellen eindringen und sich intrazellulär vermehren (Gessain et al., 2015).

Der Virulenzfaktor ActA (engl.: „actin assembly-inducing protein”), ein Oberflächenprotein von Listerien, steht im Zusammenhang mit dem Zelleintritt in Epithelzellen (Suarez et al., 2001) und fördert unter Einfluss von Typ-I-Interferon die polare Deposition der Aktinmonomere, wodurch sich Listerien durch das Zytosol der Wirtszelle fortbewegen können (Osborne et al., 2017). Auf diesem Weg gelangen die Bakterien an die Zellmembran und können ohne das Zytoplasma zu verlassen direkt in nicht infizierte Nachbarzellen gelangen, wodurch sie dem extrazellulären Immunsystem entgehen (Domann et al., 1992; Kocks et al., 1992).

Der in dieser Arbeit verwendete bakterielle L. monocytogenes Vektor wurde durch die Ausschaltung von ActA attenuiert (Pope et al., 2001; Wirth et al., 2010b), wodurch er zwar noch Zellen infizieren, sich von dort aber nicht mehr ausbreiten kann. Gleichzeitig wurde die gesamte

Sequenz des Modellantigens Ovalbumin in den als attLM-OVA bezeichneten Vektor integriert, welches dadurch stabil exprimiert wird (Corbin and Harty, 2004; Wirth et al., 2010a).

3.3 Das hepatozelluläre Karzinom (HCC)

Leberkrebs, wovon eine Form das hepatozelluläre Karzinom (engl.: „hepatocellular carcinoma“ = HCC) ist, stellt die fünfthäufigste Krebsart weltweit dar und ist unter den Krebserkrankungen diejenige mit der zweithöchsten Sterblichkeitsrate (Torre et al., 2015). Das 1-Jahres-Überleben betrug in den USA im Jahr 2009 weniger als 50 % und sogar nur etwa 10 % nach 5 Jahren (Altekruse et al., 2009). Sehr häufig kann der Krebs aus zirrhotischem Lebergewebe entstehen.

Es gibt zahlreiche Risikofaktoren wie Schimmelpilztoxine in Lebensmitteln, parasitäre Trematoden oder Alkoholmissbrauch (Wang et al., 1996; Vatanasapt et al., 1990; Morgan et al., 2004). Auch eine langanhaltende hochkalorische Ernährung kann die Karzinogenese begünstigen, wobei jedoch chronische Infektionen mit Hepatitis B und C einen Großteil der Risikofaktoren ausmachen (Bugianesi et al., 2002; Marrero et al., 2002; Perz et al., 2006). Eine gesunde Lebensweise und Impfungen gegen Hepatitis sind präventive Maßnahmen gegen die Entstehung von Leberkrebs. In einem frühen Stadium der Erkrankung können außerdem operative Leberresektionen erfolgreich sein (Forner et al., 2012). In den letzten Jahrzehnten hat sich die Prognose der Patienten jedoch kaum verbessert, da die Diagnose meist in einem fortgeschrittenen Stadium erfolgt und die bisher verfügbaren Therapien nicht zu einem erhöhten Gesamtüberleben führen (Wirth and Manns, 2016). Der Multi-Tyrosinkinaseinhibitor Sorafenib konnte das Überleben der Patienten mit fortgeschrittenem HCC im Schnitt lediglich um 3 Monate verlängern (Sanoff et al., 2016). Eine Phase-I/II-Studie mit dem PD-1-Inhibitor Nivolumab zeigte in HCC-Patienten eine 19 %ige Ansprechrate und deutet damit auf das mögliche Potential von Immun-Checkpoint-Inhibitoren für die HCC-Therapie hin (Kan and Dong, 2015; El-Khoueiry et al., 2017).

Obwohl um den Tumor ein immunsuppressives Mikromilieu entsteht, konnte beobachtet werden, dass gegen HCC spontane adaptive Immunantworten auftreten und dass diese die konventionellen Therapien gegen HCC unterstützen können (Wada et al., 1998).

Immunantworten gegen sogenannte tumorassoziierte Antigene (TAAs) erhöhen die Überlebensdauer von Patienten mit HCC (Flecken et al., 2014). Aus diesem Grund stellen moderne Immuntherapien eine vielversprechende Therapie gegen HCC dar.

3.3.1 Das hepatozelluläre Karzinom als Tumormodell

Viele Tumormodelle basieren auf transplantierten Tumorzellen, die im Wirt ektopisch anwachsen. Dazu werden Tumorzellen aus der Zellkultur entsprechend der wissenschaftlichen Fragestellung in Versuchstieren subcutan injiziert, was ein geeignetes Tumormodell ist, um

3.4 Zielsetzung

Das Ziel von Vakzinierungen sind antigenspezifische, langlebige T-Gedächtniszellpopulationen, welche am ehesten durch die wiederholte Vakzinierung mit wenig inflammatorischen Vektoren erreicht werden (Badovinac et al., 2005). Viele Vakzinen erzeugen jedoch nach einmaliger Gabe starke vektorgerichtete humorale Immunantworten, was die Effektivität wiederholter Vazinierungen limitiert. Auch eine hohe Seroprävalenz viraler Antikörper verringert die Wirksamkeit solcher Vektoren. Daher ist es nach wie vor erforderlich, Vakzinierungsstrategien zu entwickeln, die hohe Zahlen an langlebigen und funktionellen spezifischen T-Zellen erzeugen, welche einen schnellen Schutz bei erneutem Antigenkontakt bieten. Der Einsatz rekombinanter rLCMV-Vektoren ist dabei vielversprechend, da sie hohe, spezifische CD8⁺T-Zell- Immunantworten, aber nur geringe humorale Immunantworten induzieren (Flatz et al., 2010).

Das Ziel dieser Arbeit war es, verschiedene homologe und heterologe Priming-Boosting- Strategien mit dem replikationsinkompetenten rLCMV-OVA-Vektor zu untersuchen. Dies geschah mit der Absicht, die Ergebnisse auf andere rLCMV-Vektoren übertragen zu können, die Neoepitope oder subdominante virale Epitope exprimieren. Es sollten die Vor- und Nachteile von LCMV-basierten Vakzinen herausgearbeitet und die Quantität und Qualität der zytotoxischen Immunantworten untersucht werden. Desweiteren sollte untersucht werden, wie sich die primären (1°) und sekundären (2°) adaptiven Immunantworten nach Vakzinierung mit rLCMV-OVA im direkten Vergleich mit anderen ovalbuminexprimierenden Vektoren verhalten und ob ein heterologes Boosting in Kombination mit rLCMV-OVA als primäre oder sekundäre Vakzine die Stärke und Qualität der 2° Immunantwort verbessern kann. Die dabei entstehenden spezifischen CD8⁺T-Zellen sollten sowohl phänotypisch analysiert, als auch ihre Zytotoxizität und Protektivität in und ex vivo untersucht werden. Abschließend sollte der Einsatz von LCMV- Vektoren bei verschiedenen Vakzinierungen im Tumormodell des hepatozellulären Karzinoms (HCC) auf die therapeutische Wirksamkeit untersucht werden.

4 Ergebnisse

4.1 Analyse der rLCMV-OVA-induzierten Immunantwort

Zu Beginn der funktionellen Untersuchung des rekombinanten, replikationsinkompetenten, Ovalbumin-exprimierenden rLCMV-OVA Vektors wurde die Stärke und Qualität der induzierten Immunantwort untersucht. Dazu gehörte die Etablierung einer optimalen Dosierung mit Analyse der induzierten Immunantwort gegen das Ovalbumin-Epitop SIINFEKL (OVA257-264), im Folgenden der direkte Vergleich der Immunantworten gegen rLCMV-OVA und LCMV-WT und die Untersuchung der Gewebeverteilung sowie der Funktionalität von SIINFEKL-spezifischen OT-I- Zellen nach rLCMV-OVA-Vakzinierung. Schließlich wurden in diesem Kapitel der Arbeit noch Immunantworten gegen dominante und subdominante SIV-Epitope und gegen Adpgkmut, die von weiteren rLCMV-Vektoren exprimiert wurden, analysiert.

4.1.1 Die optimale Dosierung von rLCMV-OVA

Es ist wichtig, für jede Vakzine diejenige Dosierung zu ermitteln, die eine verhältnismäßig hohe, gegen das Zielepitop gerichtete spezifische Immunantwort erzeugt. Ist die Dosis einer applizierten Vakzine zu gering, so kann sich keine wirksame antigenspezifische CD8⁺T-Zell- Immunantwort ausbilden. Ist die Dosis zu hoch, so kann dies zu T-Zell-Erschöpfung führen, wobei dysfunktionale antivirale zytotoxische T-Zellen entstehen, die nachfolgend deletiert werden (Zinkernagel and Hengartner, 2001; Krebs et al., 2005).

Im ersten Versuch wurden Mäuse daher mit vier unterschiedlichen Mengen infektiöser Viruspartikel zwischen 2x10⁴ und 2x10⁶ FFU rLCMV-OVA vakziniert (Abbildung 3A). Im peripheren Blut wurden an den Tagen 7, 21 und 39 nach Vakzinierung die. SIINFEKL- spezifischen CD8⁺T-Zellen mittels Tetramerfärbung in der Durchflusszytometrie bestimmt.

Bei allen vier Gruppen gab es gut detektierbare Populationen SIINFEKL-spezifischer CD8⁺T- Zellen mit Effektor- und Kontraktionsphase. Die Frequenz spezifischer CD8⁺T-Zellen unterschied sich an Tag 39 nicht signifikant. Während der Effektorphase konnte eine Dosisabhängigkeit der Immunantwort beobachtet werden, wobei eine höhere Dosierung zu einer stärkeren Immunantwort führte (Abbildung 3B und C). Das Maximum lag bei durchschnittlich etwa 1 % spezifischer Zellen innerhalb der Leukozyten (WBC), bzw. 10 % innerhalb aller CD8⁺T-Zellen (nicht gezeigt).

Zur Unterscheidung von Subpopulationen wurde der Phänotyp der spezifischen CD8⁺T-Zellen anhand bestimmter Oberflächenmarker definiert (Abbildung 4). Als Marker dienten die α-Kette des IL7-Rezeptors CD127, der coinhibitorische Lektin-ähnliche Killerzellenrezeptor KLRG1, das Leukozytenadhäsionsmolekül L-Selektin, bekannt als CD62L sowie die Cysteinprotease CD27, ein Immun-Checkpoint-Rezeptor mit CD70 als Liganden (Hendriks et al., 2000). Frühe T-Gedächtniszellen besitzen allgemein einen KLRG1^hi, CD127^int, CD27^lo, CD62L^lo Phänotyp (Olson et al., 2013) und innerhalb der Gedächtniszellen wird zwischen mindestens zwei Subpopulationen unterschieden: den langlebigen CD62L^hi zentralen T-Gedächtniszellen (TCM) und den bei erneutem Antigenkontakt schneller zu T-Effektorzellen differenzierenden CD62L^lo Effektor-T-Gedächtniszellen (TEM) (Sallusto et al., 1999).

Abbildung 3: Unterschiedlich stark dosierte Vakzinierungen mit rLCMV-OVA führten zu detektierbaren und langlebigen CD8⁺T-Zell-Immunantworten.

[A] Mäuse (n=5) wurden mit unterschiedlichen Dosierungen von 2x10⁴ - 2x10⁶ FFU rLCMV-OVA pro Maus immunsiert. [B] Kinetik der Immunantworten: 7, 21 und 39 Tage nach Immunisierung wurde innerhalb der Blut- Leukozyten („white blood cells“ = WBC) der prozentuale Anteil der SIINFEKL-spezifischen CD8⁺T-Zellen mittels Tetramerfärbung ermittelt und gegen die Zeit aufgetragen. [C] Hier ist der prozentuale Anteil der SIINFEKL- spezifischen CD8⁺T-Zellen innerhalb der Blut-Leukozyten individuell für jede Maus dargestellt. (Modifizierte Abbildung Wingerath et al., 2017)

0.0 0.5 1.0 1.5

39

7 21

2x10⁶ 1x10⁶ 2x10⁵ 2x10⁴ 0.0

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

2x10⁶ 1x10⁶ 2x10⁵ 2x10⁴ 0.0

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

2x10⁶ 1x10⁶ 2x10⁵ 2x10⁴ 0.0

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

Tetramer+CD8 / WBC [%] Tetramer+CD8 / WBC [%]

Tage nach Vakzinierung

Tag 7 Tag 21 Tag 39

A B

C

2x10⁶ 1x10⁶ 2x10⁵ 2x10⁴ rLCMV-OVA - 2x10⁶FFU

- 1x10⁶FFU - 2x10⁵FFU - 2x10⁴FFU

ns ns ns

ns ns ns

ns ns ns Tag 0

Um eine aussagekräftige Anzahl spezifischer Zellen für diese Analyse des Phänotyps an Tag 39 zu erhalten, wurde das Blut aller Tiere aus einer Gruppe zu nur einer Probe gepoolt. Zwischen den Gruppen gab es nur wenig Unterschiede (Abbildung 4).

Die Expression von KLRG1 war in allen Gruppen nicht höher als 60 %. Alle Gruppen zeigten einen überwiegenden CD27^lo/intCD62L^lo TEM-Phänotyp. Lediglich CD27, welches auch funktionelle T-Gedächtniszellen markiert (Hendriks et al., 2000), war in der Gruppe mit 2x10⁵ FFU auf einer größeren Anzahl spezifischer CD8⁺T-Zellen hoch exprimiert.

Für die weiteren Versuche wurden 2x10⁵ FFU rLCMV-OVA pro Maus eingesetzt, da die Varianz des prozentualen Anteils der spezifischen CD8⁺T-Zellen bei dieser Dosis über alle Zeitpunkte hinweg am niedrigsten ausfiel (vergleiche Abbildung 3B und C) und der Phänotyp auf einen höheren Anteil funktioneller T-Gedächtniszellen (CD27^hi) hinwies (Abbildung 4A), was vorteilhaft für Vakzinierungen mit dem Ziel protektiver Immunantworten sein könnte.

Außerdem wurde diese Dosierung bereits häufig für Infektionsstudien mit LCMV-WT verwendet (Ahmed et al., 1988; Martin et al., 2015). Darüber hinaus lassen sich höhere Konzentrationen an Viruspartikeln in injizierbarem Volumen technisch nur schwer herstellen.

2x10⁶ 1x10⁶ 2x10⁵ 2x10⁴ 0

20 40 60 80 100

2x10⁶ 1x10⁶ 2x10⁵ 2x10⁴ 0

20 40 60 80 100

2x10⁶ 1x10⁶ 2x10⁵ 2x10⁴ 0

20 40 60 80 100

2x10⁶ 1x10⁶ 2x10⁵ 2x10⁴ 0

20 40 60 80 100

Marker+CD8 [%] % von Max

CD127 KLRG1

Expression des Markers

CD62L CD27

A

B

45,33 44,09 9,27

27,83

Abbildung 4: Unterschiedliche Dosierungen der rLCMV-OVA Vakzinierung führten in der CD8⁺T- Gedächtnisphase zu nur minimalen Unterschieden im Phänotyp der SIINFEKL-spezifischen Zellen.

[A] Phänotyp der SIINFEKL-spezifischen CD8⁺T-Gedächtniszellen in gepoolten Blutproben an Tag 39 nach Vakzinierung mit rLCMV-OVA in unterschiedlichen Dosierungen von 2x10⁴– 2x10⁶ FFU pro Maus. Die Zahlen stehen für den prozentualen Anteil der markerpositiven CD8⁺T-Zellen innerhalb der SIINFEKL-spezifischen CD8⁺T-Zellen. [B] Beispielhaft sind hier aus der Gruppe mit der Dosierung von 2x10⁵ FFU die Histogramme zur Analyse des Phänotyps gezeigt. Die grau ausgefüllten Kurven zeigen dabei den Isotyp IgG2a. Jedes Histogramm ist dem darüber angeordneten Balkendiagramm aus A zugeordnet. (Modifizierte Abbildung Wingerath et al., 2017)