Aus der Abteilung Kardiologie und Angiologie
dem Zentrum Innere Medizin der Medizinischen Hochschule Hannover (Ärztlicher Direktor: Univ.-Prof. Dr. med. H. Drexler)
Growth-Differentiation Factor-15
Ein neuer Biomarker beim akuten Koronarsyndrom und bei Herzinsuffizienz
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin an der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Timo Peter aus Leer
Hannover 2007
Angenommen vom Senat der
Medizinischen Hochschule Hannover am: 19.02.2008
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover.
Präsident: Prof. Dr. Dieter Bitter-Suermann Betreuer der Arbeit: Prof. Dr. med. Kai Wollert Referent: Prof. Dr. med. Marius Höper
Koreferent: Prof. Dr. med Armin Wessel Tag der mündlichen Prüfung: 19.02.2008
Promotionsausschussmitglieder: Prof. Dr. med. Michael Peter Manns Prof. Dr. med. Arnold Ganser Prof. Dr. med. Marion Haubitz
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ... 8
1.1 Growth-Differentation Factor 15 ... 8
1.2 Akute Koronarsyndrom ... 14
1.3 Chronische Herzinsuffizienz... 22
1.4 Zielsetzung der Arbeit ... 28
2 Material und Methoden ... 29
2.1 Material... 29
2.1.1 Chemikalien und Reagenzien ... 29
2.1.2 Pufferlösungen ... 31
2.1.3 Geräte und Zubehör ... 33
2.2 Methoden ... 34
2.2.1 Iodogen!... 34
2.2.2 Tracerherstellung ... 34
2.2.3 Immunoradiometrischer Assay ... 37
2.2.4 Chemilumineszenz ... 43
2.2.5 Radioiodmarkierung von Amylin ... 44
2.2.6 Säulenchromatographie... 45
2.2.7 Immunochemiluminometrischer Assay ... 48
2.2.8 Studien-Populationen ... 51
2.2.9 Statistische Methodik ... 55
3 Ergebnisse ... 56
3.1 Etablierung... 56
3.1.1 Nachweisgrenze (Detection Limit) ... 56
3.1.2 Präzision (Intra-Assay-Varianz) ... 57
3.1.3 Reproduzierbarkeit (Inter-Assay-Varianz)... 58
3.1.4 Spezifität (Cross Reactivity)... 60
3.1.5 Bestimmung der Linearität... 62
3.1.6 GDF-15 in verschiedenen Medien ... 63
3.1.7 Einfluß der Lagerung auf GDF-15... 66
3.1.8 Stabilität von GDF-15 ... 67
3.2 GDF-15 bei Gesunden ... 69
3.3 Prognostischer Wert von GDF-15 bei Patienten mit NSTE-ACS ... 74
3.3.1 GDF-15 bei Aufnahme... 74
3.3.2 Relation von GDF-15 zu anderen Markern... 77
3.3.3 Zeitlicher Verlauf der GDF-15–Spiegel... 78
3.3.4 GDF-15 und Mortalität ... 79
3.3.5 Kombination von GDF-15 mit anderen Prognosemarkern ... 84
3.4 Prognostischer Wert von GDF-15 bei Patienten mit Herzinsuffizienz ... 86
3.4.1 Resultate der Pilot-Studie... 86
3.4.2 GDF-15 und Mortalität ... 88
3.4.3 Relation von GDF-15 zu anderen Markern... 95
3.4.4 GDF-15 im Kontext mit anderen Markern für Mortalität ... 97
4 Diskussion ... 98
4.1 Diskussion der Methode ... 98
4.2 Diskussion der Ergebnisse ... 99
5 Zusammenfassung ... 110
6 Literaturverzeichnis ... 112
7 Anhang ... 135
7.1 Lebenslauf... 135
7.2 Danksagung... 136
7.3 Erklärung nach § 2 Abs. 2 Nrn. 5 und 6 ... 137
Verzeichnis aller verwendeten Abkürzungen:
125Jod, 125I radioaktives Jodisotop
ACC American College of Cardiology
ACS Akutes Koronarsyndrom
Ak Antikörper
B0 Nullbindung
BNP Brain Natriuretic Peptide
Bq Becquerel (SI-Einheit für radioaktiven Zerfall)
BSA Bovines Serumalbumin
cDNA Complementary Desoxyribonukleinsäure
CK Kreatinkinase
CPM Counts per minute
CRP C-reaktives Protein
ESC European Society of Cardiology
et al. und Mitarbeiter
GDF-15 Growth-Differentiation Factor-15
HWZ Halbwertszeit
I/R Ischämie/Reperfusion
IRMA Immunoradiometric assay
KHK Koronare Herzkrankheit
L Liter
LDH Laktatdehydrogenase
LPS Lipopolysaccarid
LVEF Linksventrikuläre Ejektionsfraktion
M Molar (molare Konzentration, mol/L)
M-CSF Macrophage-Colony Stimulating Factor
MIC-1 Makrophage-Inhibitory Cytokine-1
NAG-1 Nonsteroidal Anti-Inflammatory Drug-Activated Gene-1
ng Nanogramm
NSTE-ACS Non-ST-segment-elevation acute coronar syndrom NSTEMI Non-ST-segment-elevation myocardial infarction
NYHA New York Heart Association
PCI Perkutane Koronarintervention
PDF Prostate-Derived Factor
pH Potencia hydrogenii (negativer dekadischer
Logarhythmus der Wasserstoffionenkonzentration)
PLAB Placental Bone Morphogenetic Protein
PTGF-ß Placental Transforming Growth Factor-ß
RLU Relights per unit
STEMI ST-segment-elevation myocardial infarction
TGF-" Transforming-Growth Factor-"
WHO World Health Organization
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1 Einleitung
1.1 Growth-Differentation Factor 15
GDF-15 und die TGF-ß-Familie
Growth-Differentation Factor 15 (GDF-15) ist ein Mitglied der Transforming-Growth Factor-"
(TGF-ß) Zytokin-Superfamilie und wurde erstmals 1997 als Makrophage-Inhibitory Cytokine-1 (MIC-1) beschrieben. Die Zugehörigkeit zur TGF-ß Familie zeigt sich in der typischen Dimer- Struktur, bestehend aus sieben Cysteinresten. Die Aminosäuresequenz-Homologie von GDF-15 zu anderen TGF-ß Zytokinen ist aber trotz der strukturellen Ähnlichkeit eher gering. Sie beträgt zwischen 15 und 29 % und verdeutlicht damit, dass GDF-15 möglicherweise ein erstes Mitglied einer neuen Subfamilie repräsentiert (Bootcov et al. 1997). Insgesamt umfasst die TGF-ß-Familie mehr als 40 Mitglieder. Sie wird in folgende Subfamilien unterteilt:
• TGF-ß Proteine,
• Activin Proteine,
• Bone Morphogenetic Proteine,
• Müllerrian Inhibiting Substance Proteine,
• Growth and Differentation Factor Proteine.
Die Mitglieder der TGF-ß-Familie wurden als wichtige Proteine für Regulations- und Entwicklungsvorgänge, Differenzierung und Gewebe-Reperatur in verschiedenen Organen identifiziert (Shi and Massague 2003).
Weitere Bezeichnungen für GDF-15
GDF-15 ist auch bekannt unter dem Namen:
• PL74 (Morrish et al. 1996),
• Macrophage-Inhibitory Cytokine-1 (MIC-1) (Bootcov et al. 1997),
• HT-1080 (Yokoyama-Kobayashi et al. 1997),
• Placental Bone Morphogenetic Protein (PLAB) (Hromas et al. 1997),
• Prostate-Derived Factor (PDF) (Paralkar et al. 1998),
• Placental Transforming Growth Factor-" (PTGF-") (Tan et al. 2000),
• Nonsteroidal Anti-Inflammatory Drug-Activated Gene-1 (NAG-1) (Baek et al. 2001 a).
Eigenschaften von GDF-15
GDF-15 wurde initial nach Stimulation mit verschiedenen Zytokinen (TNF-#, Interleukin 1ß, 2, 6; M-CSF, nicht aber Interferon $ und Lipopolysaccarid) aus der cDNA aktivierter Makrophagen isoliert. Aufgrund der Tatsache, dass durch Vorstimulation von Makrophagen mit MIC-1 die Lipopolysaccharid-induzierte TNF-#-Freisetzung gehemmt werden konnte, wurde GDF-15 zunächst als MIC-1 bezeichnet (Bootcov et al. 1997).
GDF-15 ist im humanen Genom auf dem Chromosom 19 lokalisiert. Es besteht aus zwei Exons, aus der eine 1239 Basenpaare (bp) lange mRNA transkribiert wird (Fairlie et al. 1999). Ähnlich wie andere Mitglieder der TGF-ß-Familie wird GDF-15 als aus 308 Aminosäuren bestehendes sog. „Precursor-Protein“ synthetisiert. Dieser Vorläufer besteht aus einem 29 Aminosäuren umspannenden Signalpeptid, einem 167 Aminosäuren großen Pro-Peptid sowie dem 112 Aminosäuren großen, reifen GDF-15 selbst. Die charakteristische Sieben-Cystein-Domäne - die auch andere Mitglieder der TGF-"-Familie identifiziert - besteht bei GDF-15 aus 80 Aminosäuren. GDF-15 wird als 40 Kilodalton (kDa) großes Propeptid gebildet und liegt in seiner aktiven Form als 30 kDa großes Dimer-Protein vor (Bootcov et al. 1997). Die Expression von GDF-15 wird durch IL-1, TNF-# und TGF-ß in Makrophagen induziert.
Nicht-kardiale Effekte von GDF-15
In der Plazenta, Prostata und der Leber finden sich auch im Normalzustand hohe GDF-15-Spiegel (Bootcov et al. 1997) (Tan et al. 2000). Bei Verletzungen, Hypoxie und Stimulation durch bestimmte Zytokine und Wachstumshormone zeigen auch andere Gewebe einen starken Anstieg der GDF-15-Expression (Hsiao et al. 2000) (Albertoni et al. 2002) (Schober et al. 2001) (Koniaris 2003) (Schlittenhardt et al. 2004).
Weitere Studien fanden eine erhöhte GDF-15-Expression in:
• nekrotischen Arealen nach Leberschäden (Hsiao et al. 2000) sowie nach
• Strahlenschäden (Li et al. 2000),
• Intoxikationen (Strelau et al. 2000),
• Kryoschädigungen in Neuronen (Strelau et al. 2000),
• Anoxie und Behandlung mit Inhibitoren der Cyclooxygenase, wie Acetylsalicylsäure und Indomethacin (Baek et al. 2001 a) (Baek et al. 2001 b).
Es konnte gezeigt werden, dass GDF-15 in embryonales und osteogenisches Wachstum involviert ist (Paralkar et al. 1998). Zudem konnten Effekte in der hämatopoetischen Entwicklung nachgewiesen werden (Detmer et al. 1999). Hromas et al. wiesen eine proliferationshemmende Wirkung von GDF-15 auf primitive hämatopoetische Progenitoren nach. Außerdem besitzt GDF-15 eine Knorpelbildung-induzierende Funktionen während der Knochenbildung (Hromas et al. 1997).
Auch bei verschiedenen Tumoren wurden die Funktionen von GDF-15 untersucht und nachgewiesen. So wurde GDF-15 in Prostatakarzinomen (Liu et al. 2003), Bronchialkarzinomen (Tan et al. 2000), Mammakarzinomen, Pankreaskarzinomen (Li et al. 2000) (Koopmann et al.
2004; Koopmann et al. 2006) sowie in Karzinomen des Gastrointestinaltrakts (Brown et al.
2003) (Welsh et al. 2003) überexprimiert gefunden. Beim kolorektalen Karzinom konnte gezeigt werden, dass GDF-15 mit dem Ausmaß der Krankheit korreliert. Hohe GDF-15-Serumspiegel wurden bei Patienten mit hohem Tumor-Nodi-Metastase (TNM)-Score gefunden (Brown et al.
2003).
Kürzlich wurde GDF-15 als neuer, unabhängiger Diagnosemarker für Prostatakrebs entdeckt.
Die Kombination aus GDF-15 und PSA zeigte eine bessere Spezifität als die alleinige Bestimmung von freien PSA (Brown et al. 2006).
Das Tumor-Suppressor-Protein p53 induziert die Expression von GDF-15 und wirkt damit als Inhibitor auf Tumorzellen (Tan et al. 2000) (Yang et al. 2003). Diese Wirkung von GDF-15 ist mit anderen Zielstrukturen von p53 vergleichbar, wie z.B. p21/Waf-1. Weitere Studien konnten zeigen, dass GDF-15 Apoptose in einigen Krebszellen induzieren kann (Liu et al. 2003).
Gegensätzlich konnte in Experimenten mit Zellkultur gezeigt werden, dass GDF-15 eine Rolle als neuronaler Überlebensfaktor durch Schutz vor Apoptose spielt (Subramaniam et al. 2003).
GDF-15 wird im Zentralnervensystem (ZNS) hauptsächlich in den Epithelien des Plexus choroideus gebildet und in den Liquor sezerniert. Strelau et al. konnten nachweisen, dass GDF-15 sowohl intoxikierte dopaminerge Mittelhirnneurone schützen kann, wie auch die Transmitteraufnahme in serotonergen Rapheneuronen steigert (Strelau et al. 2000). Die gleiche Arbeitsgruppe konnte zeigen, dass die Stimulation mit GDF-15 Kleinhirnneurone vor dem apop- totischen Zelltod schützen kann (Subramaniam et al. 2003). Baek et al. zeigten, dass Nichtsteroidale Antirheumatika (NSAR’s) neben der Hemmung der Cyclooxigenase, auch die Expression von GDF-15 erhöhen (Baek et al. 2005). Eine weitere Studie beschrieb die Induktion der GDF-15 Genexpression - parallel zu der von VEGF - in Glioblastomzellen durch anhaltende Anoxie (Albertoni et al. 2002).
In der Schwangerschaft kommt es zu einem starkem Anstieg des GDF-15 Spiegels in Abhängig- keit zur Schwangerschaftswoche (Moore et al. 2000). Außerdem konnten hohe GDF-15- Konzentrationen in der Amnionflüssigkeit und in der Plazenta gemessen werden (Keelan et al.
2003). Die genaue Rolle von GDF-15 während der Schwangerschaft ist unklar. Es wird aber vermutet, dass GDF-15 durch Unterdrückung proinflammatorischer Zytokine fetales Überleben im Uterus vermittelt (Moore et al. 2000). Zudem ist GDF-15 bei Präeklampsie überexpremiert und vermittelt die Apoptose der Zytotrophoblasten auf Kosten der Differenzierung (Li et al.
2005).
Kardiale Effekte von GDF-15
Unter „Normalbedingungen“ findet sich eine hohe Expression von GDF-15 in der Plazenta und in der Prostata. Im Herzmuskel und in vielen anderen Organen konnte in diesem Zustand aber keine hohe Expression nachgewiesen werden (Bootcov et al. 1997) (Tan et al. 2000).
Kürzlich konnte allerdings gezeigt werden, dass GDF-15 von Herzmuskelzellen synthetisiert und sezerniert wird, sobald diese einer simulierten Ischämie, einer simulierten Ischämie mit Reperfusion (I/R), oxidativem Stress oder bestimmten Zytokinen (IL-1", IFN-$) ausgesetzt werden (Kempf et al. 2006). Ebenso wird GDF-15 bei experimenteller Herzinsuffizienz und experimenteller Aortenstenose (Xu et al. 2006) exprimiert. GDF-15-defiziente Mäuse bilden beim simulierten akuten Koronarsyndrom mit I/R größere Infarktareale sowie mehr Apoptose in der Infarktzone aus. Transgene GDF-15-überexprimierte Mäuse sind resistenter gegen druckinduzierte Hypertrophie und gegen Wandbewegungsstörungen (Xu et al. 2006). Diese Resultate lassen vermuten, dass GDF-15 protektiv auf das Herz wirkt. Im Herzmuskel von Mäusen konnte nach transienter Koronarligatur (simuliertes ACS mit Reperfusionstherapie) und nach permanenter Koronarligatur (simuliertes ACS ohne Reperfusionstherapie) gezeigt werden, dass GDF-15 stark induziert wird. Auch bei Patienten, die an einem akuten Koronarsyndrom verstarben, konnten im Herzmuskel (Autopsiematerial) erhöhte GDF-15 Level gemessen werden (Kempf et al. 2006).
Klinische Daten zu GDF-15
Zum Zeitpunkt des experimentellen Teils dieser Arbeit gab es keinen kommerziell erhältlichen Assay zur Bestimmung von humanen GDF-15 im Serum. Einzig eine australische Arbeitsgruppe konnte mit Hilfe eines Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) GDF-15 im Serum nachweisen (Moore et al. 2000) (Koopmann et al. 2006) (Bauskin et al. 2006).
Brown et al. konnten mit der „Women’s Health Study“ zeigen, dass sich bei erhöhten GDF-15-Spiegeln das Risiko für Myokardinfarkt, thrombembolischer Apoplex und plötzlicher Herztod um nahezu das Dreifache erhöht (Brown et al. 2002). Diese Daten weisen darauf hin, dass GDF-15 ein unabhängiger Risikoindikator für kardiovaskuläre Krankheiten bei älteren gesunden Frauen ist (Brown et al. 2002). Es besteht eine lineare Beziehung zwischen dem GDF-15-Wert bei Aufnahme und dem Auftreten vaskulärer Erkrankungen.
Frauen mit stark erhöhten GDF-15-Werten zum Zeitpunkt der Aufnahme haben demnach ein dreifach höheres Risiko für einen zukünftigen Myokardinfarkt, Schlaganfall oder sonstige kardiovaskuläre Erkrankungen, als Frauen mit niedrigen GDF-15 Spiegeln.
In der Schwangerschaft korrelieren niedrige GDF-15-Serumspiegel mit der Schwanger- schaftsabbruchwahrscheinlichkeit im ersten Trimester. Dies unterstreicht die Wichtigkeit von GDF-15 in physiologischen Entwicklungs- und Differentierungsvorgängen (Tong et al. 2004).
Untersuchungen des humanen GDF-15-Serumspiegels bei Patienten mit akuten Koronarsyndrom und bei Herzinsuffizienz gab es bislang nicht.
Die o.g. Einteilung hat vor allem prognostische und therapeutische Bedeutung.
Bei Patieten mit STEMI sollte unmittelbar eine perkutane Koronarintervention (PCI), ggf. Lyse- therapie erfolgen. Patienten mit NSTEMI werden zuerst mit Glykoprotein-IIb/IIIa-Antagonisten behandelt und innerhalb von 48 Stunden einer PCI unterzogen. Bei Patienten mit instabiler Angina pectoris sollte eine Risikostratifizierung mit Belastungsuntersuchung (Stressechokardio- graphie, Szintigraphie) durchgeführt werden.
Epidemiologie
Herzkreislauferkrankungen stellen die häufigsten Todesursachen in Deutschland dar (Statistisches Bundesamt). Im Jahr 2004 starben 152.468 Männer und 216.004 Frauen durch Erkrankungen des Herzkreislaufsystems. Über 90 % der Verstorbenen waren über 65 Jahre alt.
In Deutschland erleiden jedes Jahr etwa 250.000 Menschen einem Myokardinfarkt. Daran verstarben 2004 67.149 Personen (36.803 Männer und 30.346 Frauen).
Pathogenese
Zum Myokardinfarkt kommt es aufgrund einer ischämischen Myokardnekrose, meist auf dem Boden einer koronaren Herzkrankheit (KHK). Es entwickelt sich eine atherosklerotische Plaqueruptur mit nachfolgender Koronarthrombose (Libby 2001). Dies führt zu einer hochgradigen Stenose der Koronararterien. Fällt der Blutdurchfluss in einem Koronargefäß unter 25 % der Norm, treten irreversible Schäden an den Herzmuskelzellen auf. Das Myokardgewebe besitzt nur eine relativ kurze Ischämietoleranz. Bereits 20 bis 30 Minuten nach einem kompletten Koronarverschluss beginnen die nicht mehr mit Blut versorgten Myokardareale irreversibel abzusterben. Das primäre therapeutische Ziel ist die Auflösung der Koronarstenose. Hierbei kommen Medikamente und die perkutane Koronarintervention (PCI) zum Einsatz (Hamm 2004 a) (Hamm 2004 b).
Durch die so erzielte Reperfusion des Myokardgewebes kann zwar vitales Gewebe gerettet werden, nicht aber Gewebe mit bereits eingetretener Nekrose (Eefting et al. 2004). Durch den Verlust an kontraktilen Substanzen kommt es in der Folge - vermittelt durch Wachstumsfaktoren und Zytokinen - zur Aktivierung von Anpassungsvorgängen (Nian et al. 2004).
Diagnostik
Die Diagnostik des akuten Myokardinfarktes besteht aus den folgenden drei Säulen:
• Anamnese,
• Elektrokardiogramm (EKG) und
• Biomarker.
Anamnese
Der Myokardinfarkt entsteht durch anhaltende Ischämie des Myokardgewebes, die zur Nekrose der Herzmuskelzellen führt. Typisches ischämisches Symptom ist der vernichtende Brustschmerz, der auch ins Epigastrium, den Arm oder Unterkiefer ausstrahlen kann. Oft leiden die Patienten zusätzlich unter Dyspnoe und vegetativer Begleitsymptomatik (Schwitzen, Übelkeit, Erbrechen). Diese Symptome können jedoch auch völlig fehlen, zum Beispiel bei Patienten mit diabetischer Neuropathie. Man spricht von einem stummen Infarkt, der meist erst im EKG erkannt wird.
Elektrokardiogramm (EKG)
Folgende EKG-Veränderungen deuten auf eine myokardiale Ischämie hin, die zu einem Infarkt führen können:
1. Patienten mit ST-Strecken-Elevation:
• Neue oder vermutete ST-Elevation über dem J-Punkt in mindestens zwei Ableitungen (% 0,2 mV in V1, V2 oder V3 und % 0,1 mV in den anderen Ableitungen).
2. Patienten ohne ST-Strecken-Elevation:
• ST-Strecken-Senkung,
• T-Wellen Abnormität.
Ein neu aufgetretener Linksschenkelblock ist ebenfalls als ein Indiz für eine myokardiale Ischämie zu werten.
Allein die elektrokardiographischen Kriterien beweisen per se nicht einen Myokardinfarkt. Sie sind nur Ausdruck einer Ischämie des Myokards. Eine endgültige Diagnose hängt vom Nachweis erhöhter Biomarker ab.
Klinische Biomarker
Neben klinischen Parametern und dem EKG spielen Biomarker eine wichtige Rolle bei der Risikostratifizierung des ACS.
Biomarker unterstützen die Diagnosestellung bei unklarem klinischem Bild. Zudem erlauben sie eine Einschätzung des Risikos und der Prognose. Biomarker ermöglichen individuelle Therapieentscheidungen und helfen beim klinischen Management. Zur Zeit gibt es mehrere klinisch etablierte Biomarker beim akuten Koronarsyndrom (Giugliano and Braunwald 2005).
Die kardialen Troponine T und I sind Regulationsproteine der Herzmuskelkontraktion und als myokardialer Nekrosemarker bei Verdacht auf Myokardinfarkt etabliert. Troponin zeichnet sich durch eine hohe Sensitivität für geringe Schäden des Myokards und eine fast 100 %ige Spezifität aus (Jaffe et al. 2000). Außerdem ermöglicht es die Differenzierung zwischen Schädigung des Herzmuskelgewebes und Schädigung der Skelettmuskulatur, auch wenn die Kreatin-Kinase MB (CK-MB) normal oder nur leicht erhöht ist (Maisel et al. 2006). Derzeitige labordiagnostische Möglichkeiten erlauben die Identifizierung von nekrotischen Arealen < 1,0 g. Troponin wird nicht von der Skelettmuskulatur freigesetzt und ist bei Gesunden im Blut nicht nachweisbar (Bodor et al. 1995). Erhöhte Werte finden sich aber z.B. bei Myokarditis, kardialer Amyloidose, Herzkontusion, dilatativer Kardiomyopathie, Kardioversion und nach supraventrikulären Tachykardien. Auch extrakardiale Ursachen für eine Troponinerhöhung sind beschrieben (Sepsis, Lungenembolie, Nierenversagen, Subarachnoidalblutungen und Hochleistungssport).
Troponin besitzt eine langsame Freisetzungkinetik und wird erst ca. drei Stunden nach dem Infarkt im Blut nachweisbar. Für 7 bis 10 Tage nach dem Infarkt ist es erhöht. Daraus resultiert eine relativ lange Zeitspanne zwischen Schmerzbeginn und Zeitpunkt einer hohen diagnostischen Sicherheit. Diese kann bis zu 12 Stunden betragen (de Winter et al. 2000).
Das Mortalitätsrisiko steigt mit der Konzentration der gemessenen Troponin-Werte zum Zeitpunkt der stationären Aufnahme an (Newby et al. 1998). Patienten mit NSTEMI und
erhöhten Troponin-Werten haben ein fast 4fach erhöhtes Risiko für einen Re-Infarkt im Vergleich zu Patienten ohne Troponinerhöhung (James et al. 2003).
Aufgrund ihrer langen Halbwertszeit sind die Troponine zur Diagnose eines Re-Infarktes allerdings weniger geeignet. Biomarker mit kürzerer Halbwertszeit, wie Myoglobin (sehr gute Sensitivität, aber schlechte Spezifität) oder der CK-MB werden zur zeitlichen Bestimmung des Re-Infarktes empfohlen.
Die ESC empfiehlt bei Patienten mit Verdacht auf ACS die Bestimmung von Troponin I oder T zum Aufnahmezeitpunkt. Bei initial normalen Troponin sollte 6 bis 12 Stunden nach Aufnahme sowie nach erneutem Auftreten von Angina pectoris eine weitere Bestimmung von Troponin erfolgen. Lag die letzte Episode von Angina pectoris länger als 12 Stunden vor der ersten Bestimmung von Troponin zurück, kann auf eine zweite Messung von Troponin verzichtet werden (Bertrand et al. 2002).
Wenn Troponin nicht bestimmt werden kann sollte die Bestimmung der CK und deren Isoenzym der CK-MB erfolgen. Die CK ist ein intrazelluläres Enzym, das die ATP-abhängige Phosphorylierung von Kreatin reversibel katalysiert. Durch ihr Vorkommen im Plasma von Gesunden, sowie nach Skelettmuskeltrauma ist die CK zur Diagnostik beim Myokardinfarkt allerdings limitiert. Alleinige Messungen der Gesamt-CK zur primären Diagnose eines Myokardinfarktes werden deshalb heute nicht mehr empfohlen.
Das C-reaktive Protein (CRP) als Akute-Phase-Protein ist ein wichtiger Mediator in der humoralen Entzündungsreaktion. Zunehmend spielt es auch bei der Risikostratifizierung des ACS eine Rolle (Ridker 2003), da Inflammation eine wesentliche Rolle in der Pathogenese der Atherosklerose spielt (Ross 1999). Bei Patienten mit akuten Koronarsyndrom ist eine CRP-Erhöhung unabhängig von einem Anstieg des Troponins (Rebuzzi et al. 1998). Deshalb könnte dem CRP besonders in der Frühphase des akuten Koronarsyndroms eine Bedeutung zukommen. In einer früheren Studie wurde festgestellt, dass erhöhte CRP-Werte bei Patienten mit schwerer instabiler Angina pectoris ein Prädiktor für ein erhöhtes Mortalitäts- und Infarktrisiko darstellen (Liuzzo et al. 1994). Im Gegensazt dazu konnte aber kürzlich in der Heart Outcomes Prevention Evalution Studie (HOPE) nur eine moderate Korrelation von CRP und dem Risiko für zukünftige kardiovaskuläre Ereignisse gezeigt werden (Blankenberg et al. 2006).
Bei Patienten mit stabiler Angina pectoris wurde festgestellt, dass CRP nicht unabhängig mit rezidivierenden kardiovaskulären Ereignissen korreliert (Schnabel et al. 2005).
Neben dem CRP konnten auch weitere Akute-Phase-Marker als Prognoseindikatoren beim ACS nachgewiesen werden:
• Interleukin-6 (IL-6) (Lindmark et al. 2001),
• Fibrinogen (Toss et al. 1997),
• Monocyte Chemoattractand Protein-1 (MCP-1) (de Lemos et al. 2003),
• CD40L (Varo et al. 2003),
• Myeloperoxidase (Brennan et al. 2003),
• Pregnancyassociated Plasma Protein A (Heeschen et al. 2005),
• Placental Growth Factor (Heeschen et al. 2004).
Für die Diagnostik bei Patienten mit typisch akuten Brustschmerzen, aber normalem EKG sowie negativem Troponin zeigte sich Ischämie-modifiziertes Albumin als potentieller Biomarker (Roy et al. 2004).
Das B-Typ Natriuretische Peptid (BNP) wird von den Herzmuskelzellen synthetisiert und ist ein Marker für ventrikuläre Wandspannung (Valli et al. 1999). Als Neurohormon reguliert BNP den Blutdruck durch Vasodilatation (de Lemos and Morrow 2002). Seine Effekte vermittelt BNP über die Hemmung der Renin-Angiotensin-Aldosteron-Achse und der Aktivierung von sympathischen Nerven (Levin et al. 1998). Mittlerweile ist auch BNP in der Klinik des ACS etabliert und stellt einen Marker für Mortalität dar (Jernberg et al. 2004) (Omland et al. 2002).
Die prognostische Beziehung zwischen BNP und Mortalität ist unabhängig von anderen Risikofaktoren wie Alter, Niereninsuffizienz und linksventrikulärer Dysfunktion, aber komplementär zu Troponin (Omland et al. 2002). In der Notfalldiagnostik zeigte sich, dass BNP ein zusätzlicher Marker bei Patienten mit Angia pectoris und ohne ST-Hebungen im EKG sein kann. Ein Relevanz konnte besonders dann nachgewiesen werden, wenn initial die CK-MB und Troponin noch nicht nachweisbar sind (Bassan et al. 2005).
Weitere Risikomarker beim ACS sind gestörte Glukosetoleranz (Bartnik et al. 2004) und eine renale Dysfunktion (Kreatinin und Cystatin C) (Jernberg et al. 2004). Die Transaminasen und die Laktatdehydrogenase (LDH) haben, aufgrund der großen Verbreitung im extrakardialen Gewebe, ihre Bedeutung in der Diagnostik des Myokardinfarktes verloren.
Bislang gibt es allerdings keinen Biomarker für myokardiale Ischämie, d. h. einen Marker, der schon vor Nekrose des Myokardgewebes nachweisbar ist.
Um beim akuten Koronarsyndrom eine bessere Diagnostik und Risikostratifizierung zu erhalten, scheint die Kombination mehrerer einzelner Marker sinnvoll (Multimarker-Strategie) (Morrow and Braunwald 2003). Dabei wird die Information mehrerer Biomarker unterschiedlicher Gruppen (Nekrose, Inflammation, Wandspannung) kombiniert (James et al. 2003). Besonders bedeutend könnte die Multimarker-Strategie bei Frauen mit ACS sein. So konnte gezeigt werden, dass es Unterschiede in der Expression der Biomarker zwischen den Geschlechtern gibt.
So haben Frauen im Allgemeinen höhere CRP- und BNP-Spiegel, aber niedrigere Troponin- Werte als Männer (Wiviott et al. 2004).
1.3 Chronische Herzinsuffizienz
Definition
Die ESC definiert Herzinsuffizienz nach folgenden Kriterien (Swedberg et al. 2005):
I. Typische Symptome der Herzinsuffizienz (in Ruhe oder unter Belastung) und
II. objektiver Nachweis (vorzugsweise durch Echokardiographie) einer kardialen Dysfunktion (systolisch und/oder diastolisch) in Ruhe
und ggf.
III. Ansprechen auf die direkte Behandlung der Herzinsuffizienz.
Die Kriterien I und II müssen für die Diagnose einer Herzinsuffizeinz erfüllt sein.
Bei der Herzinsuffizienz ist das Herz nicht mehr in der Lage, die Gewebe mit genügend Blut und damit auch Sauerstoff zu versorgen. Damit kann der Gewebestoffwechsel in Ruhe oder unter Belastung nicht sichergestellt werden (Hoppe et al. 2005).
Epidemiologie
Nach Schätzungen der ESC gibt es in Europa mehr als 10 Millionen Patienten mit Herzinsuffizienz (Swedberg et al. 2005). In Deutschland sind es ca. 1,6 Millionen Menschen (entsprechen 2 % der Gesamtbevölkerung). Nach der NYHA-Stadieneinteilung (siehe Abschnitt
„Klassifikation“) liegt folgende Verteilung vor:
& 50 % der Patienten haben NYHA Stadium I, 35 % NHYA Stadium II, 10 % NYHA Stadium III und 5 % NYHA Stadium IV.
Die Prävalenz und Inzidenz sind altersabhängig. Im Alter zwischen 45 und 55 Jahren leiden ca. 1 % der Bevölkerung an einer Herzinsuffizienz, zwischen dem 65. und 75. Lebensjahr bereits 2 bis 5 % und bei über 80-Jährigen fast 10 % (McMurray and Stewart 2000). Männer sind häufiger (1,5:1) als gleichaltrige Frauen betroffen. Im höheren Lebensalter nimmt besonders bei Frauen der Anteil einer diastolischen Herzinsuffizienz zu. Insgesamt beträgt dieser bei älteren Patienten mehr als 30 %. Bei Frauen sind es mehr als 40 % (Hogg et al. 2004).
Bleibt die Ursache der Herzinsuffizienz unbehandelt, so ist die Prognose schlecht. Die Hälfte der Patienten mit Herzinsuffizienz stirbt innerhalb von vier Jahren (Aurigemma 2006). Bei schweren Formen der Herzinsuffizienz ist die Überlebensrate noch schlechter. Mehr als 50 % dieser Patienten versterben innerhalb eines Jahres (McMurray et al. 1993) (Cleland et al. 1999).
Die chronische Herzinsuffizienz ist neben einer erhöhten Mortalität durch eine hohe Morbidität mit Einschränkung der körperlichen Leistungsfähigkeit, rezidivierenden Dekompensationen, ischämischen Komplikationen und Herzrhythmusstörungen bis hin zum plötzlichen Herztod, charakterisiert.
Ätiologie und Pathophysiologie
Der überlebte akute Herzinfarkt ist inzwischen die häufigste Ursache der chronischen Herzinsuffizienz (Gheorghiade and Bonow 1998). Meistens ist die Herzinsuffizienz mit einer linksventrikulären systolischen Dysfunktion assoziiert. Besteht bei der Herzinsuffizienz eine normale linksventrikuläre Ejektionsfraktion, ist meistens eine arterielle Hypertonie und Herzhypertrophie mit Fibrose die zugrundeliegende Ursache (Cleland et al. 2003) (Hogg et al.
2004). Weitere häufige Ursachen der chronischen Herzinsuffizienz sind Kardiomyopathien, angeborene und erworbene Vitien, Perikarderkrankungen, entzündliche Erkrankungen oder Stoffwechselstörungen (z.B. Hyperthyreose).
Bei der Herzinsuffizienz besteht eine unzureichende Förderleistung des Herzens. Der gesamte Organismus kann nicht mehr seinen Bedürfnissen entsprechend mit Blut versorgt werden. Durch kardiale Mechanismen – Frank-Starling-Mechanismus, Katecholamine und myokardiale Hypertrophie versucht der Organismus die Perfusion der Organe aufrecht zu erhalten. In der Peripherie kommt es zur Vasokonstriktion, insbesondere durch Aktivierung des Renin- Angiotensin-Systems. Somit wird zwar der Perfusionsdruck in den Organen aufrecht erhalten,
die daraus resultierende erhöhte Nachlast führt aber zur weiteren Progression der Herzinsuffizienz (Riede 2004).
Der Ursprung der bekannten typischen Symptome der Herzinsuffizienz ist noch nicht vollständig aufgeklärt. Zweifellos ist ein erhöhter Druck in den Lungenkapillaren für das Lungenödem verantwortlich. In mehreren Studien konnte aber gezeigt werden, dass es nur eine geringe Korrelation zwischen dem kapillären Druck in den Lungen und der körperlichen Beeinträchtigung gibt (Lipkin et al. 1986) (Puri et al. 1994). Somit scheint klar, dass dieser Faktor nicht alleine für die Dyspnoe verantwortlich ist oder bisherige Messtechniken des kapillären Drucks in den Lungen ungenügend sind.
Klassifikation
Für die Herzinsuffizienz existieren verschiedene Einteilungen:
1. „Low-Output-Failure“ vs „High-Output-Failure”, 2. Links-, Rechts-, und Globalherzinsuffizienz, 3. Systolische vs diastolische Herzinsuffizienz, 4. Leichte, mäßige und schwere Herzinsuffizienz.
Außerdem wird die Herzinsuffizienz in „akut“ und „chronisch“ unterteilt. Letztere wird zudem noch in „kompensiert“ und „dekompensiert“ unterschieden. Im weiteren Verlauf wird nur auf die chronische Herzinsuffizienz eingegangen.
Nach der Leistungsfähigkeit der Patienten erfolgt die Klassifikation nach der New York Heart Association (NYHA). Diese Stadieneinteilung dient zur Klassifizierung der Schwere der Herzinsuffizienz und um die Effekte einer Therapie zu monitoren. Ein Patient im NYHA- Stadium I hat demensprechend eine objektive kardiale Dysfunktion, ist jedoch unter Therapie asymptomatisch (Hoppe et al. 2005).
NYHA-Stadium Subjektive Beschwerden bei Herzinsuffizienz I Beschwerdefreiheit, normale körperliche Belastbarkeit II Beschwerden bei stärkerer körperlicher Belastung III Beschwerden schon bei leichter körperlicher Belastung IV Beschwerden in Ruhe
Tabelle 1: Stadieneinteilung der Herzinsuffizienz nach subjektiven Beschwerden.
(NYHA-Stadien der New York Heart Association).
Klinik
Typische Symptome der Herzinsuffizienz sind Dyspnoe, Orthopnoe, „Asthma cardiale“, Leistungsminderung und Schwächegefühl, Venenstauung und Ödeme. Die Symptome und die Schwere der kardialen Dysfunktion korrelieren oft nur schlecht miteinander (Cleland et al. 2003) (Marantz et al. 1988).
Bei Patienten mit asymptomatischer, linksventrikulärer systolischer Dysfunktion sollte beachtet werden, dass sich daraus auch eine chronische Herzinsuffizienz entwickeln kann. Für diese Patienten konnte eine hohe Mortalität nachgewiesen werden (Wang et al. 2003).
Biomarker
In der Herzinsuffizienz gibt es, ähnlich wie beim ACS, mehrere Gruppen von Biomarkern, die eine Aussage über die Diagnose und Prognose erlauben (Lee and Vasan 2005). Das natriuretische Peptid BNP und dessen Vorläufer N-terminale pro-B-Typ Natriuretische Peptid (NT-pro-BNP) sind die wichtigsten verfügbaren Biomarker der Herzinsuffizienz in der Klinik.
Zur Synthese und Sekretion von BNP kommt es durch erhöhte Wandspannung der Herzkammern (Valli et al. 1999) und einer gesteigerten neurohumeralen Stimulation. Zur Diagnosefindung (Rodeheffer 2004) und als Prognoseindikator der Herzinsuffizienz ist BNP in der Klinik etabliert (Hartmann et al. 2004) (Latini et al. 2004). Die ESC empfiehlt in ihren Leitlinien die Bestimmung von BNP/NT-proBNP bei der Diagnostik der Herzinsuffizienz.
Die natriuretischen Peptide können allerdings auch bei linksventrikulärer Hypertrophie, Vitien, akuter oder chronischer Ischämie, arterieller Hypertonie (Tsutamoto et al. 1997) und Lungenembolie (Kruger et al. 2004) erhöht sein. Darüber hinaus führen renale Funktionsstörungen zu erhöhten BNP-Werten. Außerdem konnten starke intraindividuelle Unterschiede nachgewiesen werden, die ihre Rolle im Monitoring von Patienten mit Herzinsuffizienz einschränkt (Bruins et al. 2004). Bei der Beurteilung von Grenzwerten ist zu beachten, dass Frauen und ältere Patienten physiologisch höhere Werte aufweisen (Packer 2003) (de Lemos et al. 2003).
Beim Leitsymptom „Dyspnoe“ in der Notfallmedizin besitzt BNP/NT-proBNP einen Stellenwert zum Ausschluss einer relevanten kardialen Dysfunktion (Mueller et al. 2004). Bei normalen Konzentratonen ist eine kardiale Ursache unwahrscheinlich und damit eine Echokardiographie nicht erforderlich (Maisel et al. 2002). Bei der frühen Diagnose einer asymptomatischen, kardialen Dysfunktion hat die Bestimmung von BNP/pro-BNP noch keine Bedeutung (Rodeheffer 2004).
Weitere Biomarker (noch nicht in den Leitlinien empfohlen) mit prognostischer Bedeutung bei Herzinsuffizienz sind:
• Marker die eine Herzschädigung anzeigen:
Myosin Light Chain-1 (MLC-1) (Hansen et al. 2002), Troponin (Horwich et al. 2003) und Fettsäuren bindende-Proteine (Arimoto et al. 2005).
• Proteinen für myokardiales Remodeling:
Matrix Metalloproteinasen (MMP’s) (Sundstrom et al. 2004) und Tissue Inhibitors of Metelloproteinasen (TIMP’s) (Sundstrom et al. 2004).
• Inflammationsmarker:
Interleukin-6 (IL-6), C-reaktives Protein (CRP), Tumor Nekrose Faktor-# (TNF-#) (Vasan et al.
2003), Interleukin-2-Rezeptoren (Limas et al. 2003) und CD40-CD154.
• Adhäsionsmoleküle:
Intercellular Adhesion Molecule-1 (ICAM-1), Vascular Cell Adhesion Molecule (VCAM-1) und P-Selektin (Yin et al. 2003).
Ähnlich wie beim ACS könnte die Kombination aus mehreren Biomarkern das Management und die Risikostratifizierung in der Herzinsuffizienz zukünftig verbessern.
1.4 Zielsetzung der Arbeit
In experimentellen Befunden konnte gezeigt werde, dass GDF-15 nach einem Myokardinfarkt durch nitrosativen Stress im Herzen induziert wird. Zudem reguliert GDF-15 Apoptose und Zelltod nach einem Myokardinfarkt (Kempf et al. 2006). Xu et al. konnten zeigen, dass GDF-15 bei experimenteller Herzinsuffizienz induziert wird, sowie Hypertrophie und die kontraktile Funktion im Herzen reguliert (Xu et al. 2006).
Basierend auf diesen tierexperimentellen Daten wurde die Hypothese entwickelt, dass sich möglicherweise bei Patienten mit ACS und/oder Herzinsuffizienz erhöhte GDF-15 Werte im Serum nachweisen lassen. Außerdem wurde postuliert, dass der Nachweis von GDF-15 prognostische Informationen liefern könnte und damit ein neuer Biomarker beim ACS und bei Herzinsuffizienz entwickelt werden kann.
Zum Zeitpunkt des experimentellen Teils dieser Arbeit gab es keinen kommerziell erhältlichen Assay zur Bestimmung von GDF-15 im Serum. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, ein immunanalytisches Testverfahren aufzubauen, das die Messung von GDF-15 im humanem Serum ermöglicht. Dieser Assay sollte nach geltenden Gütekriterien wie Spezifität, Sensitivität, Präzision und Reproduzierbarkeit etabliert werden, um klinischen Assays vergleichbar zu sein.
Im Anschluss an die Etablierung und Validierung des entwickelten GDF-15 Assays sollte zunächst Normwerte anhand eines Kollektives von älteren gesunden Patienten definiert werden.
Ziel des Hauptteils dieser Arbeit war es, den GDF-15-Wert in großen Studien-Kohorten bei Patienten mit ACS und bei Patienten mit Herzinsuffizienz zu untersuchen. Auf Grundlage dieser Ergnisse sollte dann die mögliche Bedeutung von GDF-15 als neuer Biomarker erforscht werden.
2 Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Chemikalien und Reagenzien
125Jod Hartmann, Braunschweig
Acetonitril Merck, Darmstadt
Acridinium C2NHS-Ester Assay Designs, USA
Blue Dextran Pharmacia Biotech, Uppsala
Dichlormethan (CH2Cl2) Merck, Darmstadt Dimethylsulfoxid (DMSO; C2H6OS) Sigma, München Dinatriumcarbonat (Na2CO3) Merck, Darmstadt
IgG-Antikörper (Rind) Calbiochem, USA
Iodogen! Sigma, München
Monoklonaler GDF-15 Antikörper (Maus) R&D Systems, Wiesbaden
Natriumazid (NaN3) Merck, Darmstadt
Natriumchlorid (NaCl) J.T. Baker, USA
Natriumdihydrogenphosphat (NaH2PO4) Merck, Darmstadt Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3) Merck, Darmstadt
Natriumhydroxid (NaOH) Merck, Darmstadt
Natriumphosphat (Na2PO4) J.T. Baker, USA
Polyklonaler GDF-15 Antikörper (Ziege) R&D Systems, Wiesbaden Rekombinantes humanes GDF-15 R&D Systems, Wiesbaden Rinder Serum Albumin Fraktion V Serva, Heidelberg
Salzsäure (HCl) Merck, Darmstadt
Sephadex G10, G75, G100 Pharmacia Biotech, Uppsala
Thimerosal (C9H9HgO2SNa) Sigma, München Trifluoressigsäure (C2HF3O2) Sigma, München Trishydroxymethylaminomethan (C4H11NO3) Merck, Darmstadt
Tween 20 Bio-Rad, München
Wasserstoffperoxid (H2O2) Merck, Darmstadt
Ziegen Serum PAN, USA
Zitronensäure (C6H8O7) Merck, Darmstadt
2.1.2 Pufferlösungen
Waschpuffer: 0,04 M Na2PO4
0,15 M NaCl 0,1 % Tween 20
mit 1 M HCl auf pH 7,4 einstellen.
Beschichtungspuffer: 0,1 M Na2CO3
0,1 M NaHCO3
NaHCO3 wird mit Na2CO3 auf pH 9,0 titriert.
Inkubationspuffer: 0,04 M Na2PO4
1 M NaCl
3 g/100 mL BSA 1 g/100 mL IgG 1 % Ziegen Serum 0,1 % NaN3
mit 1 M HCl auf pH 7,4 titrieren.
TRIS-Puffer: 0,02 M C4H11NO3
0,15 M NaCl 0,5 % BSA 0,1 % NaN3
mit 1 M HCl auf pH 7,4 titrieren.
Phosphatpuffer 1: 0,1 M Na2PO4
mit 1 M HCl auf pH 7,6 titrieren.
Phosphatpuffer 2: 0,04 M Na2PO4
mit 1 M HCl auf pH 7,6 titrieren.
Trigger 1: 0,1 M HNO3
0,5 % H2O2
Trigger 2: 0,25 M NaOH
1 % Hexadecyltrimethylammoniumchlorid
2.1.3 Geräte und Zubehör
13mL Röhrchen Sarstedt, Nümbrecht
5mL Röhrchen Sarstedt, Nümbrecht
50mL Röhrchen Greiner bio-one, Frickenhausen
Accu-Jet Brand, Wertheim
Analytische Waage Sartorius, Göttingen
Chromatographiesäule Pharmacia Biotech, Uppsala
Dispensette Brand, Wertheim
Eppendorf-Hütchen Eppendorf, Hamburg
Fraktionssammler LKB Wallac, USA
Gammacounter LKB Wallac, USA
Glaspipetten Brand, Wertheim
Kalibrator Capintec, Australien
Magnetic-Assist-Pipette Rainin, Gießen
Magnetrührer Jürgens, Hannover
Maxisorp Startubes Nunc, Wiesbaden
Mono-Mixer Sarstedt, Nümbrecht
Multipette mit Aufsätzen Eppendorf, Hamburg
pH-Meter Knick, Berlin
Pipettenspitzen Sarstedt, Nümbrecht
Präzisionspipetten Eppendorf, Hamburg
Rüttler Bühler, Tübingen
Sep-Pack-C18-Kartusche Waters, USA
System-Luminometer Nichols Institute, USA
Waage Sartorius, Göttingen
Zentrifuge Hettich, Tuttlingen
2.2 Methoden
2.2.1 Iodogen!
Um das Iodogen! (1,3,4,6-Tetrachloro-3#,6#-diphenylglucoluril) für die Tracerherstellung benutzen zu können, musste es zuerst aus einer Dichlormethanlösung eingedampft werden.
Benötigt wurden 5 !g Iodogen! und 50 !L Dichlormethan pro Eppendorfhütchen. Um 48 Eppendorfhütchen eindampfen zu können benötigte man also 240 !g Iodogen! und 2,4 mL Dichlormethan. Von dem Dichlormethan wurden 1 mL zum Auflösen des Iodogens! benutzt.
Der Rest des Dichlormethans wurde mit dem aufgelösten Iodogen! vermischt und mit der Multipette zu je 50 !L in einzelne Eppendorfhütchen pipettiert. Diese wurden unverschlossen ca.
30 Minuten unter einem Abzug stehengelassen, bis das Dichlormethan verdampft war.
Die Gefäßwand der Eppendorfhütchen war nun mit 5 !g Iodogen! beschichtet. Anschließend konnten die Eppendorfhütchen bei –20 °C gelagert oder sofort für die Radioiodmarkierung verwendet werden.
2.2.2 Tracerherstellung
Die Herstellung (Markierung) des GDF-15-Antikörper-Tracers erfolgte mit dem Isotop 125I unter dem Abzug im Heißlabor der Nuklearmedizin, da Na125I aus der Lösung austritt und eingeatmet werden kann (siehe Abbilding 3).
Für das Heißlabor wurden folgende Materialien benötigt (siehe nächste Seite):
• Iodogen!-beschichtetes Eppendorfgefäß,
• 20 !L GDF-15-Antikörper (entsprechen 20 !g),
• 8 mL Inkubationspuffer,
• 5mL Röhrchen,
• Phosphatpuffer 1+2,
• Verbrauchsmaterialien (Pipettenspitzen, Handschuhe).
Zuerst musste der Arbeitsplatz mit einer saugfähigen Unterlage ausgelegt werden. Zu den 20 !L GDF-15-Antikörper wurden 50 !L Phosphatpuffer 1 (0,1 M) zum Neutralisieren der alkalischen Na125Jodlösung pipettiert. Das Na125Jod wurde vorsichtig geöffnet, 6 !L (entsprechen 22,2 MBq) wurden mit der Pipette entnommen und zu dem GDF-15-Ak pipettiert. Der gesamte Inhalt des Eppendorfhütchens musste nun mit einer 50!L-Pipette in das Iodogen!-beschichtete Eppendorfhütchen überführt und anschließend fünf Minuten auf dem Rüttler inkubiert werden.
In der Zwischenzeit wurde die Sephadexsäule (G10) gespült, so dass kein Überstand mehr auf der Säule stand. Der Fraktionssammler wurde mit 5mL Röhrchen bestückt und das Puffer- Reservoir mit Phosphatpuffer 2 (0,04 M) aufgefüllt. Nach abgelaufener Inkubationszeit wurde das Reaktionsgemisch auf die Sephadexsäule aufgetragen. Anschließend wurden ca. zwei Zentimeter Überstand Phosphatpuffer 2 auf die Sephadexsäule gegeben. Das Puffer-Reservoir wurde an die Sephadexsäule angeschlossen. Der Fraktionssammler fängt 30 Tropfen pro Röhrchen auf. Die in jedem Röhrchen enthaltende Radioaktivität wurde im Kalibrator gemessen.
Die Sephadexsäule trennt freies Jod von markierten Antikörpern. Der erste Radioaktivitätspeak ist der markierte Antikörper, welcher in der dritten bis vierten Fraktion zu erwarten ist und selbst etwa zwei bis drei Fraktionen umfasst. Der zweite Peak ist freies Jod. Der markierte GDF-15-Ak wurde mit 8 mL Inkubationspuffer verdünnt und bei 4 °C im Heißlabor gelagert. Die Sephadexsäule musste weiter gespült werden, bis weniger als 30 kBq pro Fraktion gemessen wurden. Somit war die Säule für die nächste Markierung vorbereitet. Die gesammelten Fraktionen mit freiem Jod wurden mit einem Stopfen verschlossen und als radioaktiver Abfall im Heißlabor entsorgt.
Abbildung 3: Herstellung des GDF-15-Antikörper-Tracers durch Sephadex-Chromatographie.
Darstellung der gemessenen Radioaktivität in den einzelnen Fraktionen.
2.2.3 Immunoradiometrischer Assay
Allgemeines
Der Immunoradiometrische Assay (IRMA) ähnelt in seiner Methodik dem klassischen Radioimmuno Assay (RIA). Bei dieser Methode wird aber statt des Antigens der Antikörper mit
125Jod markiert. Zudem werden die Antikörper im Überschuss eingesetzt.
Die radioaktive Markierung von Antikörpern zur quantitativen Bestimmung von Antigenen wurde erstmals 1968 von Miles and Hales beschrieben (Miles and Hales 1968). Allerdings war die Trennung von gebundenem Antigen von freien Antikörpern sehr schwierig. Es wurde dazu ein Festphasenreagens, auf dem sich immobilisiertes Antigen befand (Immunoadsorbens), verwendet (Miles and Hales 1968). Die Entwicklung des „Two-Site-IRMA’s“ - auch „Sandwich- IRMA“ genannt - vereinfachte die Durchführung dieses Assays. Beim Two-Site-IRMA wird das zu bestimmende Antigen beidseitig von einem festkörpergebundenen und einem
125Jod-markierten Antikörper gebunden (Sokolowski/Wood 1981).
Der IRMA hat bestimmte theoretische und praktische Vorteile gegenüber anderen Radioimmuno-Assay-Techniken. Beim IRMA wird der Antikörper im Überschuß vewendet.
Dies führt dazu, dass ein Gleichgewicht schneller erreicht wird und somit Inkubationszeiten verkürzt werden können. Die Sensitivität dieses Systems kann sehr viel stärker als bei Radioimmuno-Assays sein (Hunter and Budd 1981). Zudem besitzt der IRMA einen weiteren Arbeitsbereich, weil die Bindung von gebundenem radioaktiv-markierten Antikörpers im
„Two-site“-Assay direkt proportional zur unbekannten Konzentration des Antigens ist. Die Nachweisgrenze ist allerdings hochempfindlich für Störungen durch nichtspezifische Bindung des Signalantikörpers am festkörpergebundenem Antikörper. Die unspezifische Bindung kann aber durch Waschung des gebundenen Antigens minimiert werden.
Eine Einschränkung des Verfahrens ist die Eignung nur für große Moleküle, da mindestens zwei Antikörper gleichzeitig an das Antigen binden müssen. Ein weiteres Problem ist der sog.
„High-Dose-Hook“-Effekt, der sich bei hohen Antigenkonzentrationen zeigt. (Rodbard et al.
1978). Dieser Effekt wird durch sog. sterische Hinderung erklärt (Sokolowski/Wood 1981). Alle zur Verfügung stehenden Bindungsstellen des festkörpergebundenen Antikörpers sind mit
Antigen besetzt. Dadurch kommt es zur sterischen Hinderung und nicht alle Antigene haben die Möglichkeit mit der maximalen Zahl von Signalantikörpern zu reagieren. Dies zeigt sich in einer abfallenden Standardkurve trotz hoher Antigenkonzentration, da sich weniger Antikörper- Antigen-Antikörper-Komplexe bilden können und somit weniger Impulse gemessen werden.
Prinzip (Two-Site-Assay)
Der festkörpergebundene Antikörper wird im Überschuss an die Röhrchenwand gebunden.
Serumproben und Standards werden in den Röhrchen inkubiert. Das Antigen in den Proben reagiert mit dem festkörpergebundenen Antikörper. Danach werden die Röhrchen gewaschen und der radioaktiv-markierte Antikörper im Überschuss zugegeben. Um den sog. Tracer (radioaktivmarkierter Antikörper) binden zu können, muss das zu bestimmende Antigen allerdings eine zweite Bindungsstelle für den Antikörper besitzen. Nach der Inkubation wird der Überschuss an Tracer entfernt. Die verbleibende Radioaktivität in den Röhrchen ist proportional zur Konzentration des Antigens in der Probe.
Im folgenden Schaubild ist das Prinzip des GDF-15-IRMA’s schematisch dargestellt.
A: Maxisorp-Startubes wurden mit polyklonalen GDF-15 Antikörper (= Capture-Ak) beschichtet.
Im nächsten Schritt wurden die Serumproben hinzugegeben.
B: Das in den Proben befindliche GDF-15 Antigen wurde von dem immobilisierten Antikörper gebunden. 125I-markierter Signalantikörper wurde im Überschuss hinzugegeben.
C: Der Signalantikörper wurde an ein zweites Epitop des GDF-15 Antigens gebunden.
Nichtgebundene Radioaktivität wurde abgewaschen und die verbleibende Radioaktivität im Gammacounter bestimmt.
Abbildung 4: Schematische Darstellung des GDF-15-Immunoradiometrischen Assays
Vorbereitung
Der polyklonale GDF-15-Antikörper musste aufgetaut und mit 100 !L 1 % Natrium-Azid (NaN3) als Bakterizid versetzt werden, um es haltbar zu machen. Für die weitere Verarbeitung konnte der GDF-15-Antikörper á 50 !L (entsprechen 50 !g) in Eppendorfgefäßen bei 4 °C gelagert werden. Die Maxisorp-Startubes wurden beschriftet. Die Ansetzung aller Proben, inklusive Kontrollen und Standards, erfolgte in Doppelbestimmung.
Beschichtung
Für die Beschichtung der Maxisorp-Startubes mit polyklonalen GDF-15-Antikörper wurde ein Carbonat-Puffer verwendet. Dazu wurden Dinatriumcarbonat (Na2CO3, 0,1 M) und Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3, 0,1 M) in Wasser gelöst. Natriumhydrogencarbonat-Puffer wurde mit Hilfe von Dinatriumcarbonat-Puffer auf einen pH von 9,0 eingestellt. Die Maxisorp- Startubes wurden mit 0,5 !g GDF-15-Antikörper pro Röhrchen beschichtet. Dazu wurde der GDF-15-Antikörper mit Carbonat-Puffer auf eine Konzentration von 2,5 !g/mL verdünnt.
Hiervon wurden 200 !L/Röhrchen mit der Multipette pipettiert. Alle Röhrchen mussten bei 2000 U/min kurz anzentrifugiert werden, um alle Flüssigkeit auf den Boden zu bringen. Die Beschichtung erfolgte über Nacht bei 4 °C.
Kaltinkubation
Für die Kaltinkubation mussten zunächst Standards angefertigt werden. Das rekombinante GDF-15 wurde mit Inkubationspuffer aufgelöst und anschließend in einer Konzentration von 250000 ng/L aliquotiert. Aus diesen Stocks wurden Standards mit einer Konzentration von 50000, 16667, 5556, 1852, 617 und 206 ng/L erstellt und á 250 !L aliquotiert. Diese Standards deckten den erwarteten Konzentrationsbereich ab.
Die Lagerung der Standards und Standard-Stocks erfolgte bei –20 °C.
Für die Kontrollen mussten Serumproben mit bekannten niedrigen, mittleren und hohen GDF-15-Serumspiegeln gepoolt werden. Das gepoolte Serum wurde für 10 Minuten bei
2000 g (= 3000 rpm) zentrifugiert, um Fibrinreste zu sedimentieren. Anschließend konnten die Kontrollen zu á 250 !L aliquotiert und ebenfalls bei –20 °C gelagert werden.
Die Maxisorp-Startubes wurden je zweimal mit 2 mL Waschpuffer gewaschen, dekantiert und ausgeklopft. Anschließend wurden 100 !L/pro Röhrchen Inkubationspuffer mit der Multipette pipettiert und 100 !L/pro Röhrchen von den Standards, Kontrollen und Proben aufgetragen. Der B0-Wert stellte den Leerwert da. Sein Wert musste als unspezifische Bindung (= Background) gewertet und später von den Proben abgezogen werden. Es wurden deshalb für den B0-Wert 100 !L Inkubationspuffer pipettiert. Die Inkubation erfolgte über Nacht bei 4 °C.
Heißinkubation
Nach dieser Inkubation wurden die Röhrchen wiederum zweimal mit 2 mL Waschpuffer gewaschen, dekantiert und ausgeklopft. Für die Heißinkubation wurden 50 ng/mL Tracer mit Inkubationspuffer verdünnt (spezifische Aktivität 0,74 MBq/!g). Davon wurden 200 !L/pro Röhrchen mit der Multipette pipettiert (entspricht 10 ng Tracer/Röhrchen). Zusätzlich wurde der sogenannte Total-Wert in einem 5mL-Röhrchen angesetzt. Dieser diente zur Kontrolle der eingesetzten Aktivität des Tracers. Die Inkubation der Proben erfolgte für vier Stunden bei Raumtemperatur auf dem Rüttler (150 rpm).
Auswertung
Nach dieser zweiten Inkubationsphase wurden die Röhrchen erneut dreimal mit 2 mL Waschpuffer gewaschen, dekantiert und ausgeklopft. Bei diesem Waschschritt musste streng darauf geachtet werden, dass die Röhrchen nicht kontaminiert werden. Der radioaktive Abfall wurde über die Nuklearmedizin der Medizinischen Hochschule Hannover entsorgt. Die in den Röhrchen verbleibende Aktivität wurde im Gammacounter für 120 Sekunden bestimmt (in counts per minute). Zuerst erfolgte die Messung von Total-Wert und B0-Wert sowie der Standardkurve. Anhand dieser konnte rechnerisch die Konzentrationen der nachfolgenden unbekannten Proben bestimmt werden (siehe Abbildung 5).
2.2.4 Chemilumineszenz
Für die Standardisierung einer Sephadexsäule werden Proteine mit bekanntem Molekulargewicht eingesetzt. In dieser Arbeit wurden rekombinantes GDF-15 (28 kDa), Albumin (66 kDa) und Amylin (3,9 kDa) verwendet.
Um den Größenstandard Albumin nachzuweisen, wurde es zunächst mit Acridinium C2NHS- Ester markiert. Zuerst musste das Acridinium C2NHS-Ester (gelagert bei –20 °C) auf Raumtemperatur gebracht werden, da es sonst sehr leicht hydrolysiert. Zudem ist es aufgrund seiner Statik schwierig abzuwiegen. Mit einem Spatel wurde vorsichtig etwas Acridinium C2NHS-Ester aus dem Fläschchen genommen und in ein Eppendorfhütchen eingewogen.
Anschließend wurde das Acridinium C2NHS-Ester in DMSO aufgelöst. Das Albumin wurde in 0,1 M Carbonatpuffer (pH 8,5) auf eine Konzentration von 1 mg/mL gebracht. Das Acridinium C2NHS-Ester sollte in einem dreifach-molaren Überschuss als das zu markierende Protein vorliegen.
Die entsprechende Menge Albumin wurde in ein Eppendorfhütchen gegeben und auf dem Rüttler 30 Minuten inkubiert. Das markierte Protein wurde für die Sephadexsäule im Verhältnis von 1:1000 mit TRIS-Puffer verdünnt. Auf die Säule wurde 1 mL des markierten Albumins pipettiert. Als Eluationspuffer diente TRIS-Puffer. Es wurden 95 Fraktionen á 60 Tropfen gesammelt. Zur Bestimmung der Chemilumineszenz in den Fraktionen wurde von jeder Fraktion 10 !L in ein 5mL-Röhrchen übertragen. Durch Zugabe von H202 im alkalischen Milieu wurde die Chemilumineszenz im Acridinium C2NHS-Ester freigesetzt und vom Luminometer in relative light units (rlu) ausgegeben.
2.2.5 Radioiodmarkierung von Amylin
Der Größenstandard Amylin wurde für die Standardisierung der Sephadexsäule mit Na125I markiert. In der Sephadexchromatographie wurden 95 Fraktionen gesammelt, die anschließend direkt im Gammacounter bestimmt werden konnten.
Vorbereitung
Die Trennung von freien und eingebauten Na125I erfolgte bei diesem Verfahren nicht über einer Sephadexsäule G10, sondern über eine Sep-Pack-C18-Kartusche. Zuerst wurde 50 % Acetonitril in 0,1 % Trifluoressigsäure gelöst. Die C18-Kartusche wurde mit dieser Lösung gespült und aktiviert. Anschließend musste eine wässrige Phase auf die C18-Kartusche gebracht werden.
Dies erfolgte durch Spülung der Kartusche mit 0,1 % Trifluoressigsäure Amylin wurde mit Phosphatpuffer 2 (0,04 M) gelöst.
Markierung
Im Heißlabor der Nuklearmedizin erfolgte unter dem Abzug die Markierung mit Na125I. Zu dem Amylin wurden 50 !L Phosphatpuffer 1 (0,1 M) pipettiert. Das Na125I musste vorsichtig geöffnet werden. 1 !L Na125I (entsprechen 100 !Ci) wurden mit der Pipette entnommen und zu dem Amylin pipettiert. Der gesamte Inhalt des Eppendorfhütchens wurde anschließend mit einer 50!L-Pipette in das Iodogen!-beschichtete Eppendorfhütchen überführt und fünf Minuten auf dem Rüttler inkubiert. Im Anschluss konnte das Reaktionsgemisch in den Luer-Conus der C18-Kartusche pipettiert werden. Diese musste nun mit 5 mL 0,1 % Trifluoressigsäure gespült werden. Das freie Jod in der wässrigen Lösung wird dabei herrausgespült. Das markierte Peptid bindet sich hingegen an die hydrophobe Phase. Im nächsten Schritt wurde das Peptid mit 50 % Acetonitril (gelöst in 0,1 % Trifluoressigsäure) eluiert und in Fraktionen je 0,5 mL in 5mL-Röhrchen aufgefangen. Die in den Röhrchen enthaltende Radioaktivität wurde im Kalibrator gemessen. Der Radioaktivitätspeak für das markierte Peptid kann in der zweiten Eluationsfraktion erwartet werden.
2.2.6 Säulenchromatographie
Zur Bestimmung der Größe des im Serum gemessenen GDF-15’s, sowie zur Reinigung des
125Jod-markierten Ak’s, wurde die Gelchromatographie verwendet. Dazu wurde Sephadexgel eingesetzt (siehe Abbildung 6). Sephadex besteht aus quervernetztem Dextran. Je nach Grad der Vernetzung können verschiedene Molekülgrößen chromatographiert werden. Das Prinzip der Gelchromatographie mit Sephadex beruht auf der unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeit der Moleküle, abhängig vom Molekulargewicht. Bei der Tracerherstellung wurde eine Sephadex G10-Säule verwendet, die das freie Jod zurückhält (maximale Molekülgröße 10 kDa). Zur Bestimmung der Größe des im Serum gemessenen GDF-15’s wurde eine Sephadex G100-Säule verwendet (maximale Molekülgröße 100 kDa).
Vorbereitung
Um eine 52 cm lange Glassäule mit einem Durchmesser von 2,5 cm mit Sephadex zu beschichten, werden 27,23 g Sephadex-Trockenmaterial benötigt. Die berechnete Menge musste mit TRIS-Puffer (ohne BSA) in einem Reagenzbehälter aufgelöst, abgedeckt und für zwei Stunden zum Aufquellen in ein Wasserbad bei 80 °C gestellt werden. Anschließend konnte das Gel in eine Säule gegossen und mit TRIS-Puffer (mit BSA) äquilibriert werden.
Eichung
Zur Eichung der neu gegossenen Sephadexsäule musste Blue Dextran in TRIS-Puffer gelöst werden. Zu beachten ist die Statik des Blue Dextrans, die das Abfüllen in Reagenzgefäße erschwert. 1 mL Blue Dextran wurden auf die Säule pipettiert und mit TRIS-Puffer eluiert. Unter der Säule wurde ein Fraktionssammler aufgestellt, der in 95 Röhrchen die Fraktionen zu je 60 Tropfen auffängt. Es wurde nun rein optisch die Fraktion ermittelt, in der die stärkste Blaufärbung zu erkennen ist. Diese wird als „Void volume“ (V0) bezeichnet und stellt die Fraktion dar, mit der die für die Chromatographie relevanten Fraktionen beginnt.
Serumchromatographie
Für die Bestimmung der GDF-15-Größe im humanen Serum wurden Standardgrößen benötigt.
Chemilumineszenzmarkiertes Albumin (66 kDa), radioiodmarkiertes Amylin (3,9 kDa) und rekombinantes GDF-15 (28 kDa) wurden dafür eingesetzt. In der Chromatographie wurden die Standardgrößen in 95 Fraktionen gesammelt. Anschließend wurden diese Fraktionen im Luminometer (Albumin) und im Gammcounter (Amylin und rekombinantes GDF-15) gemessen sowie ihr spezifischer Peak bestimmt.
Abbildung 6: Sephadex G100 Serumchromatographie zur Bestimmung der GDF-15-Größe.
Darstellung der gemessenen Aktivität in cpm (rekombinantes GDF-15, Amylin) und in rlu (Albumin) in den einzelnen Fraktionen.
2.2.7 Immunochemiluminometrischer Assay
In späteren Versuchen gelang es, zur Bestimmung von GDF-15 im Serum, einen Immunochemiluminometrischen Assay (ICMA) als Alternative zum IRMA zu entwickeln.
Bei diesem Assay wurde der Signalantikörper nicht mit 125Jod markiert, sondern mit einer lichtemittierenden Substanz. Es wurde Acridinium C2NHS-Ester benutzt, welches bereits für die Markierung von Albumin im Rahmen zur Standardisierung der Sephadexsule verwendet wurde.
Die spezifische Aktivität wird hierbei nicht in cpm am Gammacounter gemessen, sondern in rlu am Luminometer. Der ICMA bietet den Vorteil, dass kein radioaktiver Abfall erzeugt wird.
Zudem kann der ICMA in herkömmlichen Laboren angewendet werden. Dieser Assay ist in seiner Sensitivität mit einem IRMA vergleichbar. Auch in der Anwendung unterscheidet der ICMA sich nicht wesentlich vom zuerst etablierten IRMA.
Bereits in Vorversuchen mit dem IRMA zeigte sich, dass der monoklonale GDF-15-Antikörper eine höhere Affinität als der polyklonale GDF-15-Antikörper bot, die sich in einem steileren Verlauf der Standardkurve wiederspiegelte. In ersten Versuchen mit dem ICMA bestätigten sich diese Ergebnisse. Da der monoklonale GDF-15-Antikörper zudem wesentlich preiswerter und unbegrenzt verfügbar ist, wurde dieser für die Beschichtung des ICMA’s verwendet.
Vorbereitung
Der monoklonale GDF-15-Antikörper musste mit Natrium-Azid (NaN3) als Bakterizid versetzt werden, um ihn haltbar zu machen. Für die weitere Verarbeitung konnte der Antikörper á 50 !L (entsprechen 50 !g) in Eppendorfgefäßen bei 4 °C gelagert werden. Die Maxisorp-Startubes wurden beschriftet. Die Messung aller Proben, inklusive Kontrollen und Standards, erfolgte in Doppelbestimmung.
Beschichtung
Für die Beschichtung der Maxisorp-Startubes mit monoklonalen GDF-15-Antikörper wurde, analog zu dem IRMA, ein Carbonat-Puffer verwendet Die Maxisorp-Startubes wurden mit 0,5 !g GDF-15-Antikörper pro Röhrchen beschichtet. Dazu wurde der GDF-15-Antikörper mit Carbonat-Puffer auf eine Konzentration von 2,5 !g/mL verdünnt. Hiervon wurden 200 !L/Röhrchen mit der Multipette pipettiert. Alle Röhrchen mussten bei 2000 U/min kurz anzentrifugiert werden, um alle Flüssigkeit auf den Boden zu bringen. Die Beschichtung erfolgte über Nacht bei 4 °C.
Erste Inkubation
Für die erste Inkubation mussten, analog zum IRMA (siehe Kapitel „Immunometrischer Assay“), Standards und Kontrollen angefertigt werden. Die Maxisorp-Startubes wurden je zweimal mit 2 mL Waschpuffer gewaschen, dekantiert und ausgeklopft. Anschließend wurden 100 !L/pro Röhrchen Inkubationspuffer mit der Multipette pipettiert und 100 !L/pro Röhrchen der Standards, Kontrollen und Proben aufgetragen. Alle Werte wurden in Doppelbestimmung gemessen. Die Inkubation erfolgte über Nacht bei 4 °C.
Markierung
Vor der zweiten Inkubation musste der polyklonale GDF-15-Antikörper mit Acridinium C2NHS-Ester markiert werden. Es empfiehlt sich das Acridinium C2NHS-Ester (1 mg) komplett für die Markierung zu benutzen. Ein Abwiegen ist aufgrund der statischen Aufladung der Trockensubstanz schwierig. Die folgend beschriebene Markierung wurde mit 59 !g Acridinium C2NHS-Ester durchgeführt. Das eingewogene Acridinium C2NHS-Ester wurde mit 59 !L DMSO gelöst. Der polyklonale GDF-15-Antikörper (1 mg) musste aufgetaut werden.
100 !g des Antikörpers wurden mit 200 !L 0,1 M Carbonatpuffer (pH 8,5) verdünnt. Der alkalische pH ist für die kovalente Bindung der gebundenen NHS-Ester Gruppe an ein primäres Amin (z.B. Lysin) des Antikörpers wichtig. Von dem gelöstem Acridinium C2NHS-Ester wurden 4,6 !L (= 4,6 !g) zu dem Antikörper pipettiert. Es sollte ein 5-10fach molarer Überschuss vom Acridinium-C2NHS-Ester zu dem markierenden Protein vorliegen. Das
Reaktionsgemisch musste 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend auf eine Sephadex G75 Säule pipettiert werden. Die Eluation erfolgte mit TRIS-Puffer. Es wurden Fraktion á 60 Tropfen gesammelt. Zur Bestimmung der Chemilumineszenz in den Fraktionen wurden von jeder Fraktion 10 !L in ein 5mL-Röhrchen übertragen.
Durch Zugabe von H202 im alkalischen Milieu wurde die Chemilumineszenz als blaues Licht im Acridinium C2NHS-Ester freigesetzt und vom Luminometer bei 430 nm in rlu gemessen.
Anschließend wurden die Fraktionen, die den Peak bildeten, gepoolt. Aus diesen Fraktionen konnten Aliquots erstellt werden, die bei 4 °C gelagert wurden.
Zweite Inkubation
Die Maxisorp Startubes mussten zweimal mit 2 mL Waschpuffer gewaschen, dekantiert und ausgeklopft werden. Für die zweite Inkubation wurden 50 ng/mL chemilumineszenzmarkierter Antikörper mit Inkubationspuffer verdünnt. Davon wurden 200 !L/pro Röhrchen mit der Multipette pipettiert (entspricht 10 ng Tracer/Röhrchen). Die Inkubation der Proben erfolgte für vier Stunden bei Raumtemperatur auf dem Rüttler (150 rpm).
Auswertung
Nach der zweiten Inkubation mussten die Röhrchen erneut dreimal mit 2 mL Waschpuffer gewaschen, dekantiert und ausgeklopft werden. Die Röhrchen wurden in das Luminometer gestellt. Dieses injiziert 300 !L/Röhrchen Trigger 1, 0,5 Sekunden später das gleiche Volumen Trigger 2. Die Lichtemission startet sofort nachdem Trigger 2 injiziert ist und hält ca. zwei Sekunden an. Das Lumineszenzsignal wird vom Luminometer für zwei Sekunden gemessen und als rlu ausgegeben. Aus der Standardkurve wurden die Konzentrationen der nachfolgenden unbekannten Proben bestimmt.
2.2.8 Studien-Populationen
SWISCH Studie
Zur Bestimmung der GDF-15-Werte bei scheinbar gesunden Individuen wurden die Serumspiegel von Probanden aus der „Swedish women and men and ISCHemic heart disease“
(SWISCH) Studie (Lindahl et al. 2000) untersucht. Aus diesem Kollektiv konnten Serumproben von 429 scheinbar gesunden Personen, 288 Männern (67,1 %) und 141 Frauen (32,9 %), bestimmt werden. Das mittlere Alter der Studienteilnehmer betrug 65 Jahre (Interquartil- Bereich 59-71), 14,5 % der Probanden waren Raucher.
Diese Kontroll-Population musste folgende Kriterien erfüllen:
• Keine EKG-Auffälligkeiten,
• keine Einnahme von Herzkreislauf-Medikamenten,
• keine bekannten Herzkreislauferkrankungen,
• keine anderen bekannten chronischen oder akuten Erkrankungen.
Die Nierenfunktion wurde vorab durch Messungen von Cystatin C beurteilt. Als Entzündungsparameter wurde das C-reaktive Protein (CRP) bestimmt, sowie für myokardialer Wandsspannung das N-terminale pro-B-Typ Natriuretische Peptid (NT-proBNP).
Die Messung von Zytokinen in diesen Blutproben wurde von der Ethikkommission der Universität Uppsala genehmigt.
