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Evaluation neuer Biomarker bei idiopathischer pulmonal arterieller Hypertonie

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Academic year: 2022

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Aus der Klinik für Pneumologie

angefertigt im Rahmen der strukturierten Doktorandenausbildung StrucMed Zentrum Innere Medizin der Medizinischen Hochschule Hannover

Direktor: Prof. Dr. med. Tobias Welte

Evaluation neuer Biomarker bei idiopathischer pulmonal arterieller Hypertonie

Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover

Vorgelegt von Nils Nickel aus Marburg

Hannover 2011

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Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 26.08.2011 Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover

Präsident: Prof. Dr. med. Dieter D. Bitter-Suermann Betreuer: Prof. Dr. med. M. Hoeper

Referent: Prof. Dr. med. Bernhard Schieffer Korreferent: Prof. Dr. med. Matthias Ochs

Tag der mündlichen Prüfung: 26.08.2011

Promotionsausschussmitglieder:

Prof. Dr. Hermann Haller

Prof. Dr. Klaus Otto

Prof. Dr. Martin Sauer

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Inhaltsverzeichnis

1. Kurzzusammenfassung 1

2. Einleitung 2

2.1. Idiopathische pulmonal arterielle Hypertonie 2

2.2 Biomarker bei IPAH 3

2.3 BNP und NT-pro-BNP 3

3. Neue Biomarker bei IPAH 4

3.1.2 Weiterführende Arbeiten zu GDF-15 bei IPAH 6

3.1.2.a Zellkulturexperimente 6

3.1.2.b Immunhistochemie und Laser-Mikrodissektion 8

3.2 Zirkulierende Angiopoietine in der IPAH (Orginalarbeit Nr. 2) 10

3.3 Osteopontin als Biomarker bei Patienten mit IPAH (Orginalarbeit Nr. 3) 12

4. Zusammenfassung und Ausblick 13

5. Abkürzungsverzeichnis 15

6. Reference List 16

7. Curriculum Vitae 21

8. Veröffentlichungen 22

8.1 Orginalarbeiten 22

8.2 Abstracts 22

8.3. Vorträge 23

8.4. Preise 24

9. Erklärung nach § 2 Abs. 2 Nr. 5 und 6 der Promotionsordnung 25

10. Danksagung 26

11. Orginalpublikationen 28

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1 Kurzzusammenfassung

Das Ziel dieser Arbeiten war es, zirkulierende Proteine als mögliche Biomarker für die idiopathische pulmonale Hypertonie (IPAH) zu evaluieren. Dabei wurden drei unterschiedliche Proteine untersucht: Growth-Differentiation- factor-15 (GDF-15), Angiopoietin-2 (Ang-2) und Osteopontin (OPN). In einem retrospektiven Ansatz wurden mittels Kaplan-Meier-Kurven und Cox-Regression Überlebensanalysen durchgeführt. In einem prospektiven Ansatz wurden Änderungen der Biomarker unter einer spezifischen Therapie untersucht. Darüber hinaus wurden diese neuen Biomarker mit bereits etablierten Biomarkern der IPAH verglichen. Es zeigte sich, dass erhöhte zirkulierende Spiegel von GDF-15, Ang-2 und Osteopontin mit einem schlechten Krankheitsverlauf assoziiert waren. Ang-2-Spiegel waren eng mit Änderungen der Hämodynamik und dem 6 Minuten Gehtest unter einer spezifischen Therapie des Lungenhochdrucks korreliert.

Die Ergebnisse dieser Arbeiten deuten darauf hin, dass GDF-15, Ang-2 und OPN vielversprechende Biomarker für die IPAH werden könnten. Weitere Untersuchungen auf molekularer sowie auf klinischer Ebene sollten weitere Erkenntnisse über diese Proteine bei Patienten mit pulmonaler Hypertonie liefern

(5)

2 2. Einleitung

2.1 Idiopathische pulmonal-arterielle Hypertonie

Die pulmonal arterielle Hypertonie (PAH) ist eine chronische Erkrankung, die durch einen zunehmenden Anstieg des Gefäßwiderstandes und einen Anstieg des Blutdrucks im Lungenkreislauf gekennzeichnet ist. Das Krankheitsbild der pulmonalen Hypertonie wurde erstmals 1891 durch Ernst von Romberg beschrieben.1 Eine pulmonale Hypertonie (PH) liegt vor, wenn der mittlere Druck in den Lungenarterien (mPAP) ≥25 mmHg in Ruhe beträgt.2 Nach der derzeit gültigen Klassifikation aus dem Jahre 2009 unterscheidet man 5 Gruppen der pulmonalen Hypertonie, die nach

pathogenetischen, klinischen und therapeutischen Kriterien eingeteilt werden.3

Die idiopathische pulmonale arterielle Hypertonie (IPAH) gehört in die Gruppe 1 der pulmonalen Hypertonien und bleibt eine Ausschlussdiagnose, d.h. die Diagnose einer IPAH kann nur gestellt werden, wenn andere Erkrankungen, die mit einer PH assoziiert sind, ausgeschlossen wurden.

Die Angaben über die Prävalenz der IPAH schwanken zwischen 5-50 Fällen pro 1 Million Einwohner.3-6

Die IPAH ist eine Erkrankung der präkapillären Pulmonalarterien, deren genaue Pathobiologie noch nicht vollständig geklärt ist. Man geht derzeit davon aus, dass der Krankheit ein multifaktorielles Geschehen zu Grunde liegt, bei dem verschiedene biochemische Stoffwechsel- und Signalwege, sowie unterschiedliche Zelltypen eine Rolle spielen. Neben einer überschießenden Vasokonstriktion kommt es zu einem Gefäßumbau vor allem der kleinen Arterienäste (<500 µm), welcher durch eine Intimaproliferation, Intima- und Mediafibrosierung sowie eine Verdickung der Adventitia

gekennzeichnet ist.7 Die sukzessive Verengung und Thrombosierung der Gefäße führt zu einer kontinuierlichen

Druckerhöhung im kleinen Kreislauf mit einer progressiven Nachlasterhöhung für das rechte Herz (Anstieg des pulmonal vaskulären Widerstandes.7 Unter physiologischen Bedingungen ist der kleine Kreislauf angelegt als ein Gefäßsystem mit hohen Flüssen, niedrigen Drücken und hoher Compliance. Pathologische Veränderungen der pulmonalen

Gefäßstrombahn mit chronischer Rechtsherzbelastung führen zunächst zu einer adaptiven Hypertrophie des rechten Ventrikels.9 Die Adaptationsfähigkeit des rechten Ventrikels an den Anstieg des pulmonal vaskulären Widerstandes ist mitentscheidend für den Krankheitsverlauf und das Rechtsherzversagen stellt die häufigste Todesursache bei Patienten mit IPAH dar.10 Unbehandelt beträgt die mittlere Lebenserwartung von Patienten mit IPAH 2-3 Jahre nach

Diagnosestellung.11

(6)

3 2.2 Biomarker bei IPAH

In den letzten Jahren wurde eine Vielzahl neuer Biomarker bei Patienten mit IPAH untersucht, mit denen in begrenztem Umfang Aussagen zur Funktion des rechten Ventrikels sowie zur Prognose der Erkrankung möglich sind.13-20 Dennoch ist der Goldstandard der Diagnostik und Therapieüberwachung nach wie vor der Pulmonalarterienkatheter

(Rechtsherzkatheter, Swan-Ganz-Katheter), der bisher durch keinen Biomarker zu ersetzen ist.

Der rapid progrediente Verlauf der IPAH erfordert eine engmaschige Überwachung der Patienten. Es besteht zudem ein großer Bedarf an zuverlässigen nicht-invasiven Verlaufsparametern. Das zunehmende Verständnis der

pathophysiologischen Vorgänge die im Lungengefäßsystem und am rechten Herzen bei der IPAH ablaufen, eröffnet die Möglichkeit neue Biomarker bei Patienten mit IPAH zu messen.

2.3. BNP und NT-pro-BNP

Das N-terminale- pro-BNP (brain-natriuretic-peptide) bzw. die aktive Form des Proteins (BNP) werden in den aktuellen Leitlinien als Biomarker zur initialen Risikostratifizierung und zum Therapiemonitoring empfohlen.21 NT-pro-BNP ist das biologisch inaktive N-terminale Segment des BNP-Vorläuferporteins und zeigt eine stabilere Kinetik als die biologisch aktive Form des BNP.22 NT-pro-BNP und BNP werden vornehmlich von Kardiomyozyten der Vorhöfe sowie der Ventrikel als Antwort auf gesteigerte mechanische Belastung gebildet. Sie induzieren neben einer peripheren Vasodilatation eine renale Natriurese und führen somit über die Senkung des Blutdrucks und des effektiv zirkulierenden Volumens zur Entlastung des Herzens. In mehreren Studien konnten NT-pro -BNP und BNP als wichtige Prognosemarker bei Patienten mit IPAH bestätigt werden22, 23 und sind derzeit die einzigen Biomarker, die Einzug in den klinischen Alltag gefunden haben.3

Der Vorteil dieser Marker liegt in der weitgehenden Myokardspezifität. Sowohl BNP als auch NT-pro-BNP sind geeignet, eine kardiale Belastung anzuzeigen. Zudem gibt es eine statistische Korrelation zwischen dem BNP/ NT-pro-BNP Wert, dem Druck im rechten Ventrikel, dem pulmonalvaskulären Widerstand, der WHO-Klasse und dem 6-Minuten-Gehtest.24 Nachteile von BNP/NT-pro-BNP sind die fehlende Spezifität für das rechte Herz, sowie die geringe Sensitivität für die Erkennung von Frühformen der pulmonalen Hypertonie. Außerdem korrelieren die beiden Proteine wenig mit den hämodynamischen Veränderungen bei Patienten mit PAH, so dass sie für Verlaufskontrollen nur bedingt geeignet sind.

Aufgrund der oben beschriebenen Limitierung von BNP und NT-pro-BNP in der Diagnostik und Therapieüberwachung der pulmonalen arteriellen Hypertonie haben wir uns im Rahmen der nachfolgend beschriebenen Arbeiten mit weiteren Proteinen beschäftigt, die in Zukunft eine Rolle als Biomarker bei Patienten mit IPAH spielen könnten.

(7)

4 3. Neue Biomarker bei IPAH

3.1 Growth-differentiation-factor-15 (GDF-15) bei IPAH (Orginalarbeit 1)25 Diese Arbeit ist im Rahmen des StrucMed-Programms entstanden.

Zusammenfassung

GDF-15 ist ein Mitglied der Transforming-growth-factor-β- (TGF-β) Superfamilie, welche mehr als 40 Proteine umfasst, die an der Regulation, Differenzierung und Reparatur verschiedener Zelltypen beteiligt sind. GDF-15 besitzt zwar das TGF-β-typische Strukturmerkmal der sieben Cystein-Domäne, hat beim Menschen aber nur 15-29% Sequenzhomologie der Aminosäuresequenz mit anderen Mitgliedern der TGF-β-Familie.26 GDF-15 wurde erstmalig 1997 aus aktivierten Makrophagen isoliert und ist daher auch unter dem Namen MIC-1 (macrophage inhibitory cytokine-1) bekannt. In nachfolgenden Arbeiten wurde GDF-15 in verschiedenen Zelltypen und Geweben nachgewiesen.28-33 Die

unterschiedliche Gewebeexpression hat dazu geführt, dass GDF-15 mit unterschiedlichen Namen bezeichnet wurde (PLAB, NAG-1 u.a.). Unter physiologischen Bedingungen ist GDF-15 in den meisten Körpergeweben nur schwach bis gar nicht expremiert.26 Untersuchungen im Zellkultur- und Tierexperiment haben gezeigt, dass GDF-15 in verschiedenen Zelltypen und Geweben auf unterschiedliche Stressoren (mechanisch, biochemisch, inflammatorisch u.a.) auf messenger-RNA- und Proteinebene hochreguliert und teilweise auch sezerniert wird.30-34

In humanen Studien konnte bestätigt werden, dass erhöhte zirkulierende GDF-15-Spiegel bei unterschiedlichen Krankheiten vorkommen. Als zirkulierender Biomarker wurde GDF-15 erstmals im Jahr 2000 beschrieben.35

Neben verschiedenen Neoplasien und hämatologischen Erkrankungen fanden sich erhöhte GDF-15 Serumwerte bei akuten sowie chronischen kardiovaskulären Erkrankungen.36-54 Dabei zeigte sich, dass GDF-15 ein unabhängiger

Prädiktor für eine schlechte Prognose bei Patienten mit akutem Koronarsyndrom, chronischer Linksherzinsuffizienz und akuter Lungenembolie war.46, 48, 49, 55

Wir haben daher die Frage untersucht, ob und inwieweit GDF-15 auch bei Patienten mit IPAH eine Rolle als Biomarker spielen könnte.

In einem retrospektiven Kollektiv von 76 Therapie-naiven Patienten mit IPAH haben wir mittels ELISA die GDF-15 Serumwerte gemessen. In einer zweiten Kohorte von 22 Patienten haben wir vor und nach Einleitung einer spezifischen Therapie die GDF-15-Werte ermittelt. Die GDF-15-Werte wurden mit den klinischen, biochemischen und

hämodynamischen Parametern der Patienten korreliert. In dem retrospektiven Kollektiv wurden darüber hinaus Überlebensanalysen berechnet. In der prospektiven Kohorte wurden die Veränderungen der GDF-15-Werte unter Therapie auf Korrelationen von Veränderungen in hämodynamischen und biochemischen Parametern untersucht.

Wir konnten zeigen, dass die GDF-15-Spiegel bei 55% der Patienten über dem oberen Referenzwert von gesunden Probanden lagen und dass erhöhte GDF-15-Werte ein unabhängiger Risikofaktor für einen Endpunkt (Tod,

Transplantation) waren. Darüber hinaus gab es signifikante Korrelationen zwischen zirkulierenden GDF-15-Spiegeln und wichtigen hämodynamischen und biochemischen Parametern (rechts-atrialer Druck, gemischtvenöse

Sauerstoffsättigung, Harnsäure und NT-pro-BNP). Diese Korrelationen ließen sich in der prospektiven Kohorte von 22 Patienten bestätigen.

Mit einer Kombination aus GDF-15- und NT-pro-BNP-Werten vor Therapiebeginn ließen sich Subgruppen von Patienten identifizieren, die eine gute Prognose (4-Jahresüberleben von 80 %) bzw. eine sehr schlechte Prognose (4-

Jahresüberleben von 30 %) hatten.

In Anbetracht der aktuellen Therapieempfehlungen für die IPAH, die sich an vordefinierten Zielparametern orientieren, könnte eine Kombination aus verschiedenen Biomarkern mit unterschiedlichem pathophysiologischem Hintergrund, die unterschiedliche Informationen über den Krankheitsverlauf geben, eine wichtige Rolle spielen und dabei helfen,

(8)

5

Therapieentscheidungen zu treffen. Der Vorteil von GDF-15 gegenüber NT-pro-BNP liegt darin, dass GDF-15 nicht nur im gestressten Myokard gebildet wird, sondern auch von einer Reihe anderer Zellen, die durch eine GDF-15 Sekretion wichtige Hinweise auf sekundäre Organdysfunktionen geben. GDF-15 erfasst als Biomarker bei der IPAH somit mehr als nur die rechtsventrikuläre Dysfunktion. Dies zeigte sich durch signifikante Korrelationen von GDF-15 mit dem Alter, der NYHA-Klasse, dem 6-Minuten-Gehtest, der Nierenfunktion (Harnsäure und Kreatinin), dem rechts-atrialen Druck, dem pulmonalen Wedge Druck und der gemischtvenösen Sauerstoffsättigung. Dadurch, dass GDF-15 verschiedene

Indikatoren eines fortgeschrittenen Krankheitsstadiums erfasst, liefert dieser Biomarker zusätzliche Informationen zur Krankheitsschwere, die durch NT-pro-BNP nicht erfasst werden können. Weitere Untersuchungen sollten klären, ob die Kombination einer Bestimmung von GDF-15 und BNP, bzw. NT-pro-BNP die Risikoeinschätzung von Patienten mit IPAH verbessern kann.

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6

2

5 dyn/cm

2

15dyn/cm 0

5 10

15 Scherkräfte

rel. mRNA Expression

3.1.2 Weiterführende Arbeiten zu GDF-15 bei IPAH (bisher unveröffentlichte Daten)

Die klinischen Ergebnisse unserer Arbeiten zu GDF-15 werfen die Frage auf, aus welchen Kompartimenten die erhöhten GDF-15 Serumwerte bei Patienten mit IPAH stammen. Neben einer möglichen Beteiligung des rechten Ventrikels als potentielle Quelle von zirkulierendem GDF-15, interessiert bei der IPAH vor allem die Gefäßstrombahn der Lunge, da diese eine wichtige Rolle in der Pathogenese der Erkrankung zu spielen scheint.56

3.1.2.a Zellkulturexperimente

Wir haben in Zellkulturexperimenten mit humanen mikrovaskulären Endothelzellen (HMVEC) nachgewiesen, dass GDF- 15 unter verschiedenen Stressbedingungen (Hypoxie, Scherstress) auf messenger RNA (mRNA) und Proteinebene hochreguliert und darüber hinaus auch in den Zellüberstand sezerniert wird (siehe Abbildung 1).

Abbildung 1. Humane mikrovaskuläre Endothelzellen der Lunge (HMVEC) reagieren auf verschiedene Stressoren mit einer zeit- bzw. dosisabhängigen GDF-15 Expression. A: Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Analyse der mRNA Expression von GDF-15 im Vergleich zu Zellen unter normoxischen Bedingungen. B: PCR-Analyse der mRNA Expression von GDF-15 unter Scherkräften im Vergleich zu Kontroll-Zellen. C: Western Blot Analyse der GDF-15 Proteinexpression Hypoxie-behandelter Zellen im Vergleich zur β-Aktin Expression. Statistisch signifikante Unterschiede sind mit einem * markiert. Jedes

Experiment besteht aus 5 unabhängigen Versuchen (n=5).

Neben den Untersuchungen der GDF-15 Expression in der Zellkultur haben wir in weiteren Experimenten die Funktion von GDF-15 in pulmonalen HMVECs untersucht. Mittels Proliferations- und Apoptoseassays57 konnten wir zeigen, dass rekombinantes GDF-15-Protein in einer Konzentration von 50 ng/ml antiproliferative und antiapoptotische Effekte in vitro zeigte. Dabei scheint der AKT-1- Signalweg aktiviert zu werden, der bei Endothelzellen das Wachstum hemmt und das Überleben fördert58 (Ergebnisse dieser Experimente sind in dieser Arbeit nicht gezeigt).

Da bei der IPAH und anderen Formen der pulmonalen arteriellen Hypertonie Mutationen verschiedener Rezeptoren der TGF-β-Familie eine kausale Rolle zu spielen scheinen59, haben wir durch silencing RNA-Experimente60 (siRNA) den TGF-β- Rezeptor-2 und den Bone Morphogenteic Protein Receptor 2 (BMP-Rezeptor-2) in HMVECs herunterreguliert und die

*

*

*

*

*p<0,01

2h 4h 6h 8h 10h

0 5 10

15 Hypoxie

A

rel. mRNA Expression

Con 2h 4h 6h 8h 10h C

GDF-15

ß-Aktin B

(10)

7

Auswirkung von rekombinantem GDF-15 auf Proliferation und Apoptose dieser „knock-down“ Zellen untersucht. Dabei zeigte sich, dass der wachstumshemmende und antiapoptotische Effekt von GDF-15 (50 ng/ml) bei einem „knock-down“

des TGF-β-Rezeptors-2 aufgehoben war.

Abbildung 3. Einfluss einer Herunterregulation von BMPR-II und TGF-ß-RII durch siRNA auf die Proliferation von HMVECs der Lunge durch GDF-15. Statistisch signifikante Unterschiede sind mit einem * markiert. Jedes Experiment besteht aus 5 unabhängigen Versuchen (n=5).

A: HMEC, die mit nicht-codierenden siRNAs transfiziert wurden (Kontrolle), zeigen nach Behandlung mit GDF-15 eine deutlich geringere Proliferationsrate.

B: Eine Herunterregulation des BMPR-II-Rezeptors durch siRNA hat keinen Einfluss auf den antiproliferativen Effekt von GDF-15 auf HMVECs.

C: Der antiproliferative Effekt von GDF-15 auf HMVEC ist aufgehoben, wenn zuvor der TGF-β-Rezeptor-2 durch siRNA herunterreguliert wurde.

Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die antiproliferative Wirkung von GDF-15 auf pulmonale Endothelzellen durch den TGF-ß-Rezeptor 2 vermittelt wird. Dieser Mechanismus könnte eine wichtige Rolle in den pulmonalen

Gefäßumbauprozessen bei Patienten mit IPAH spielen.

ohne GDF-15 mit GDF-15 0

50 100

150 *

Kontrolle

rel. Proliferation

ohne GDF-15 mit GDF-15 0

50 100

150 *

BMPR-II-knockout

rel. Proliferation

ohne GDF-15 mit GDF-15 0

50 100 150

TGF-β-R-II-knockout

rel. Proliferation

A B C

*p<0,01

(11)

8

P B

C

gesunde Kontrollarterie

normale Arterie, IPA H

Plexiforme sion, IPA H 0

5 10

15 Mikrodisseziertes Endothel

rel. mRNA Expression

3.1.2.b Immunhistochemie und Laser-Mikrodissektion

Die Expression von GDF-15 im humanen Lungengewebe wurde durch immunhistochemische Untersuchungen dargestellt. In der normalen Lunge fand sich eine schwache GDF-15-Protein-Expression (hier vor allem in

Alveolarmakrophagen und sehr schwach ausgeprägt in venösen, arteriellen und lymphatischen Lungengefäßen). Im Lungengewebe von Patienten mit IPAH ließ sich ein starkes Signal für GDF-15 in Gefäßendothelzellen nachweisen.

Dieses Signal war besonders ausgeprägt in sogenannten plexiformen Läsionen. Dieses Expressionsmuster konnte durch Laser-Mikrodissektionen von Endothelzellen in mikrovaskulären Läsionen (sogenannte Plexiforme Läsionen) von IPAH Patienten bestätigt werden. Die mRNA-Expression von GDF-15 wurde mittels quantitativer Real-Time-Polymerase- Kettenreaktion (RT-PCR) untersucht. Hier zeigte sich, dass die GDF-15-Expression im Zentrum der plexiformen Läsionen höher war, als in angrenzenden nicht veränderten Arterien und Arteriolen.

D A

P

*

*p<0,01

*

B

C

(12)

9

Abbildung 2. Immunhistochemische Färbung von GDF-15 Protein und relative mRNA Expression von GDF-15 in verschiedenen Gefäßkompartimenten von Patienten mit IPAH im Vergleich zu gesunden Kontrolllungen.

A: Immunhistochemische Untersuchung von GDF-15-Protein im normalen Lungengewebe. Einzelne

Gewebsmakrophagen (siehe Pfeil) zeigen ein positives Signal für GDF-15. Pulmonale Gefäße färben sich nur schwach an.

B: GDF-15-Protein zeigt sich in den Zellen plexiformer Läsionen (P). Die Vergrößerung zeigt eine prominente luminale Lokalisation von GDF-15 in den Zellen, die das Gefäßlumen ausfüllen (Pfeil). Auch Endothelzellen benachbarter Kapillaren zeigen eine GDF-15 Expression (Pfeilkopf).

C: GDF-15 positive Zellen finden sich vor allem im Lumen der plexiformen Läsion (P). Ein schwächeres Signal für GDF Protein findet sich um die plexiforme Läsion in der extrazellulären Matrix (Pfeil). Dieses Signal stammt wahrscheinlich von GDF-15-Protein, welches an Komponenten der extrazellulären Matrix gebunden ist.

D : Relative GDF-15 mRNA Expression aus laser-mikrodissezierten Zellen verschiedener vaskulärer Kompartimente bei Patienten mit IPAH und gesunden Kontrolllungen. Statistisch signifikante Unterschiede sind mit einem * markiert. Die präsentierten Daten sind repräsentativ für 5 unabhängige Experimente.

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10 3.2. Zirkulierende Angiopoietine in der IPAH (Orginalarbeit Nr. 2)61 Zusammenfassung

Neben dem VEGF (Vascular-Endothelial-Growth-Factor) und dem VEGF-Rezeptor System wurde 1996 das Angiopoietin- Tie-2 (Tyrosine kinase with immunoglobulin-like and EGF-like domains 2) -System als zweite Gruppe endothelialer Rezeptor-Tyrosinkinasen entdeckt.62, 63 Der Tie-2 Rezeptor ist vor allem auf Endothelzellen und hämatopoetischen Stammzellen exprimiert.64 Die bisher am besten charakterisierten Liganden dieses Rezeptors sind die Angiopoietine 1 und 2 (Ang-1, Ang-2). Ang-1 und Ang-2 haben eine kennzeichnende „alpha-helikale coiled-Coil Struktur“ in der N- terminalen Region und C-Terminal eine Fibrinogen-ähnliche Domäne.65 Beide Proteine zeigen ca. 55 % Homologie in ihrer Aminosäuresequenz.66 Ang-1 wird von perivaskulären Zellen (Perizyten, Fibroblasten, glatte Muskelzellen) sowie von Thrombozyten produziert.64, 66 Bindet Ang-1 an den Tie-2-Rezeptor auf Endothelzellen, werden über den

Phosphoinositide 3-kinase (PI3-K)/Akt Signalweg Entzündungsreaktionen gedämpft und über eine Inhibition des Rho-A- Kinase Signalwegs eine geringere proliferative und mechanische Aktivität des Endothels beobachtet.67, 68 Ang-1 scheint demnach zytoprotektive Funktion am Endothel zu entfalten und trägt dazu bei, die Zellen im nicht-aktivierten Zustand zu halten. Darüber hinaus spielt Ang-1 eine Rolle bei der Rekrutierung von glatten Muskelzellen in Richtung von Endothelzellen.69 Ang-2 hingegen wird in Weibel-Palade-Körpern von Endothelzellen gespeichert und auf Stimulation durch unterschiedliche Stimuli (Scherstress, Hypoxie, Thrombin u.a.) freigesetzt. Es wirkt vor allem auf auto- und parakrinem Weg.70 Bisher ging man davon aus, dass Ang-2 eine antagonistische Aktivität gegenüber Ang-1 ausübt, indem es den Tie-2 Rezeptoren deaktiviert und somit die zytoprotektiven und anti-aktivierenden Effekte von Ang-1 aufhebt. Neuere Untersuchungen geben aber Hinweise darauf, dass die Funktion von Ang-2 vor allem vom umgebenden Zytokinmilieu abhängt. So führt Ang-2 in der Gegenwart von VEGF zur Angiogenese, in Abwesenheit von VEGF jedoch zur Gefäßrückbildung.66

Das Zusammenspiel der Angiopoietin-Tie-2-Familie ist sehr komplex und noch nicht in allen Einzelheiten verstanden.

Dies zeigt sich besonders deutlich bei der pulmonalen Hypertonie. Derzeit existieren zwei konträre Erklärungsmodelle, welche die Funktion von Ang-1, Ang-2 und dem gemeinsamen Rezeptor Tie-2 zu erklären versuchen. Ein Model geht davon aus, dass Ang-1 eine Ursache der Entstehung des Lungenhochdrucks sein kann, in dem es das Wachstum von glatten Muskelzellen in den nur schwach oder gar nicht muskularisierten distalen Arterien und Arteriolen fördert.71, 72 Ein anderes Modell hingegen postuliert, dass Ang-1 durch seine endothelzell-protektiven Effekte die Entstehung der Erkrankung verhindert.73-75 Für beide Modelle gibt es zellbiologische und tierexperimentelle Daten. Die direkte Vergleichbarkeit der unterschiedlichen Arbeiten ist dadurch limitiert, dass verschiedene Ratten- bzw. Mausstämme in den Versuchen verwendet wurden. Ferner wurden unterschiedliche Modelle der Krankheitsinduktion angewendet und ungleiche Transfektionstechniken benutzt. Weitere Grundlagenforschung auf diesem Gebiet wird nötig sein, um diese Gegensätze aufzuklären.

Um die Rolle der Angiopoietine als potentielle Biomarker bei IPAH zu untersuchen, hat unsere Arbeitsgruppe bei 106 Patienten mit IPAH die Plasmawerte von Ang-1, Ang-2, sTie-2 (soluble Tie-2) und VEGF gemessen. Diese Werte wurden verglichen mit denen von 10 Patienten, die einer Rechtsherzkatheteruntersuchung unterzogen wurden, jedoch nicht unter Lungenhochdruck litten (Kontrollen). Die Serumwerte dieser Proteine wurden mit funktionellen, biochemischen und hämodynamischen Parametern korreliert. In einer retrospektiven Kohorte (n=79) haben wir Überlebensanalysen durchgeführt. In einer prospektiven Kohorte (n=25) wurden die vier Proteine auf Veränderungen während einer medikamentösen Therapie untersucht.

Patienten mit IPAH zeigten eine starke Erhöhung aller vier Proteine (Ang-1, Ang-2, sTie-2, VEGF). Von allen vier Markern fanden sich nur für Ang-2 Korrelationen mit der Hämodynamik, der gemischtvenösen Sauerstoffsättigung, der 6-

Minuten-Gehstrecke und der Prognose. Fünfundzwanzig Patienten wurden longitudinal vor und nach Initiierung einer gezielten Therapie der pulmonalen Hypertonie untersucht. Bei diesen fand sich eine Korrelation der Veränderungen der

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11

Ang-2-Werte mit Veränderungen der Hämodynamik unter Therapie. Patienten, die von einer spezifischen Therapie profitierten und sich funktionell und hämodynamisch verbesserten, hatten einen deutlichen Abfall der Ang-2-Werte im Vergleich zu Patienten, die keine Verbesserung zeigten.

Da Ang-2 vornehmlich in Endothelzellen exprimiert wird und Endothelzellen zentral mit der Krankheitsentstehung und Progression in Verbindung gebracht werden, wollten wir die Frage klären, ob Ang-2 in plexiformen Läsionen von IPAH Patienten verstärkt exprimiert ist. Mittels immunhistochemischer Untersuchungen und quantitativer RT-PCR konnten wir zeigen, dass Ang-2 auf Protein- und mRNA-Ebene in plexiformen Läsionen, nicht aber in normalen Arterien von IPAH Patienten hochreguliert ist. Insgesamt lassen diese Befunde die vorsichtige Schlussfolgerung zu, dass Ang-2

möglicherweise eine Rolle in der Pathogenese der IPAH spielt. Verglichen mit den anderen Biomarkern in der aktuellen Studie, zeigt Ang-2 die engste Korrelation mit der hämodynamischen Situation der IPAH Patienten. Zirkulierende Ang-2- Spiegel könnten daher ein vielversprechender Biomarker für ein Therapiemonitoring der IPAH werden.

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12

3.3 Osteopontin als Biomarker bei Patienten mit IPAH (Orginalarbeit Nr. 3)76 Zusammenfassung

Osteopontin (OPN), auch bekannt als None Sialoprotein 1 (BSP-1 oder BNSP), Early T-lymphocyte Activation (ETA-1) und Secreted Phosphoprotein 1 (SPP1), ist ein Protein aus der Familie der SIBLING (Small Integrin Binding Ligand N-linked Glycoprotein), mit deren Mitgliedern es genetische und biochemische Gemeinsamkeiten hat. Isoliert wurde das Protein erstmals 1986 aus Osteoblasten.77 OPN kann von einer Vielzahl von Geweben synthetisiert und sezerniert werden, darunter Makrophagen, glatte Muskelzellen, Endothelzellen, Nierenepithelzellen und andere mehr. Ein funktionelles Charakteristikum von OPN ist die Eigenschaft, über das sogenannte RGD-Motiv an Integrine zu binden.78

OPN stimuliert die Rekrutierung von Makrophagen und T-Zellen in Bereichen, in denen Entzündungsprozesse ablaufen.

Neben inflammatorischen Zytokinen (TNF-alpha, IL-1 β), wird OPN auch durch Angiotensin-II und TGF-β sowie durch Hypoxie und Hyperglykämie induziert.77, 79-83

Andere Arbeitsgruppen haben bereits gezeigt, dass OPN auch in Lungen von Patienten mit IPAH stark exprimiert wird.84 Daten aus Tiermodellen deuten darauf hin, dass OPN an der Proliferation glatter Muskelzellen, an der Entzündung in den pulmonalen Gefäßen sowie am pulmonal arteriellen Remodeling beteiligt sein könnte.85

Welche Rolle OPN in der Pathogenese der IPAH spielt, ist hingegen weitgehend unklar. Eine systematische Untersuchung der Bedeutung von OPN als Biomarker in der IPAH ist bisher nicht erfolgt.

Unsere Arbeitsgruppe hat die OPN-Plasmaspiegel bei 95 Patienten mit IPAH gemessen. In einem ersten retrospektiven Kollektiv (70 Patienten) wurden OPN-Werte vor Therapiebeginn gemessen und auf Zusammenhänge mit

hämodynamischen und biochemischen Variablen untersucht. Darüber hinaus wurden in diesem Kollektiv

Überlebensanalysen durchgeführt. Bei einer zweiten Gruppe von 25 Patienten wurden OPN-Werte vor und 3 Monate nach Therapiebeginn gemessen.

Patienten mit IPAH zeigten im Vergleich zu einem Kollektiv gesunder Probanden deutlich erhöhte OPN-Werte im Plasma. Diese korrelierten signifikant mit Alter, 6 Minuten Gehstrecke, NYHA-Klasse, mittlerem rechts-atrialen Druck und dem NT-pro-BNP Wert.

In Bezug auf die Überlebensanalysen zeigte sich ein deutlicher Unterschied zwischen der Prognose von Patienten mit einem niedrigen OPN Wert vor Therapiebeginn und dem von Patienten mit erhöhten OPN-Werten. Patienten mit einem OPN Wert >34,5ng/ml hatten ein signifikant höhere Sterblichkeit. In der multivariaten Cox-Regressions-Analyse mit dem 6 Minuten Gehtest, der Hämodynamik, der gemischtvenösen Sättigung, dem NT-pro-BNP und der Harnsäure, war OPN ein unabhängiger Prädiktor der Mortalität. OPN scheint bei Patientin mit IPAH in Bezug auf das Überleben

Informationen zu liefern, die über die hämodynamischen, biochemischen und funktionellen Variablen hinaus gehen.

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13 4. Zusammenfassung und Ausblick

In den letzten Jahren wurden große Fortschritte im Verständnis der Pathophysiologie der IPAH gemacht und es gab entscheidende Neuerungen in der medikamentösen Therapie. Es besteht deshalb ein großes Interesse an Biomarkern für diese Erkrankung, die sich zur Früherkennung eignen oder die für die klinische Einschätzung von Patienten und bei Therapieentscheidungen hilfreich sind. In den letzten Jahren wurde eine Vielzahl potentieller Biomarker für die IPAH beschrieben. Bisher haben aber lediglich BNP und NT-pro-BNP Einzug in die klinische Praxis gefunden. Hierbei eignen sich BNP und NT-pro-BNP allerdings nicht für die Frühdiagnose der Erkrankungen und korrelieren auch nur

eingeschränkt mit der Hämodynamik der pulmonalen arteriellen Hypertonie. Wir haben daher neue Biomarker für das Krankheitsbild der IPAH untersucht, darunter GDF-15, Angiopoietin-2 und Osteopontin.

GDF-15 ist ein stressresponsives Zytokin der TGF-β-Superfamilie und wurde bereits als Prognose-assoziierter Biomarker bei Patienten mit Lungenembolie und Linksherzinsuffizienz beschrieben. In der hier vorgestellten Arbeit wurde GDF-15 als Biomarker bei Patienten mit IPAH untersucht. Erhöhte GDF-15-Werte waren mit einem erhöhten rechts-atrialen Druck, einem erhöhten pulmonalen Wegde Druck und einer erniedrigten gemischtvenösen Sauerstoffsättigung assoziiert und korrelierten mit biochemischen Variablen (Harnsäure, NT-pro-BNP). Nach Adjustierung für hämodynamische und biochemische Variablen blieb GDF-15 ein unabhängiger Prädiktor für einen ungünstigen klinischen Verlauf. In einer prospektiven Kohorte korrelierten die Veränderungen der GDF-15-Spiegel positiv mit Veränderungen des NT-pro-BNP-Spiegels und negativ mit Veränderungen der gemischtvenösen Sauerstoffsättigung.

Diese Ergebnisse zeigen, dass GDF-15 ein neuer, aussichtsreicher Prognosemarker für Patienten mit IPAH sein könnte.

Angiopoietine, ihr zugehöriger Rezeptor Tie-2 und VEGF spielen eine wichtige Rolle in der Biologie des Gefäßwachstums und Gefäßumbaus. Die Grundlagenwissenschaften liefern derzeit noch widersprüchliche Angaben, welche Funktion die Angiopoietine und der Tie-2 Rezeptor in der Entstehung der pulmonalen arteriellen Hypertonie haben könnten. Die hier vorgelegte Arbeit hat die Nützlichkeit zirkulierender Spiegel von Ang-1, Ang-2, löslichem Tie-2 und VEGF als klinische Biomarker bei Patienten mit IPAH untersucht. Dabei hat sich gezeigt, dass alle vier Proteine bei Patienten mit IPAH im Vergleich zu Patienten mit normaler pulmonaler Hämodynamik erhöht waren. Von diesen vier Proteinen war Ang-2 am engsten mit der Hämodynamik, der gemischt-venösen Sauerstoffsättigung und dem klinischen Verlauf assoziiert.

Darüber hinaus korrelierten Veränderungen der zirkulierenden Ang-2-Spiegel nach Initiierung einer Therapie mit Veränderungen des rechts-atrialen Drucks, des pulmonalvaskulären Widerstandes sowie der gemischtvenösen Sauerstoffsättigung. Immunhistochemische und molekularbiologische Untersuchungen von Lungenmaterial von IPAH Patienten haben gezeigt, dass Ang-2 Protein und messenger-RNA von Ang-2 in plexiformen Läsionen stark hochreguliert waren.

Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, dass zirkulierende Ang-2-Spiegel wichtige Informationen zum Krankheitsverlauf und zum Ansprechen auf eine Therapie liefern könnten. Ferner könnte Ang-2 eine Rolle bei Gefäßumbauprozessen spielen und somit in die Pathogenese der IPAH involviert sein.

Osteopontin ist ein pleiotropes Zytokin, welches in experimentellen Studien mit der Pathogenese der pulmonalen arteriellen Hypertonie in Verbindung gebracht wurde. OPN-Plasma-Spiegel wurden bereits als vielversprechender Biomarker bei Patienten mit chronischer Linksherzinsuffizienz beschrieben. Ziel der aktuellen Arbeit war es, OPN als Biomarker bei Patienten mit IPAH zu untersuchen. Es zeigte sich, dass Patienten mit IPAH deutlich erhöhte OPN-Spiegel im Vergleich zu gesunden Kontrollen hatten und diese mit dem rechts-atrialen Druck, dem NT- pro-BNP und der NYHA- Klasse korrelierten. Multivariate Cox-Analysen zeigten, dass OPN ein unabhängiger Prognosemarker für einen Endpunkt (Tod oder Transplantation) war.

Die Resultate dieser Studie zeigen, dass erhöhte OPN-Spiegel mit einem ungünstigen Krankheitsverlauf einhergehen und OPN als Biomarker bei Patienten mit IPAH von Nutzen sein könnte.

(17)

14

Chronische Erkrankungen mit schwerem Verlauf, wie die IPAH stellen besondere Herausforderungen an Diagnostik und Therapie. Biomarkern gilt- mit den Fortschritten in der Grundlagenforschung und den erweiterten Möglichkeiten der Laboratoriumsmedizin- ein wachsendes Interesse. Bevor ein Biomarker Einzug in die klinische Praxis erfährt, muss er sorgfältig evaluiert werden. Die hier vorgestellten Arbeiten geben Hinweise auf neue potentielle Biomarker, die - nach eingehender Evaluation- in der Zukunft eine Rolle bei der Diagnostik und Therapie der IPAH spielen könnten.

(18)

15 5. Abkürzungsverzeichnis

AKT-1- Akt serine/threonine kinase (auch Protein Kinase B genannt) Ang-1 Angiopoietin-1

Ang-2 Angiopoeitin-2

BMP bone morphogenetic protein

BMPR-II bone morphogenetic protein receptor 2 BNP Brain-natriuretic-peptide

GDF-15 Growth differentiation factor 15 HMVEC Humane mikrovaskuläre Endothelzellen IL-1 β Interleukin-β-1

IPAH Idiopathische pulmonal arterielle Hypertonie mRNA Messenger Ribonukelinsäure

NT-pro-BNP N-terminales-pro-Brain-natriuretic-peptide NYHA New York Heart Association

OPN Osteopontin

PAH Pulmonal arterielle Hypertonie

PCR Polymerase Kettenreaktion

PI3-K Phosphoinositide 3-kinase

RGD-Motiv Aminosäuren: Arginin, Glycin, Aspartat Rho-A homolog gene family, member A RT-PCR Real Time Polymerase Kettenreaktion

SIBLING Small Integrin Binding Ligand N-linked Glycoprotein siRNA silencing Ribonukleinsäuren

s-Tie-2 solouble Tie-2

TGF-β Transforming growth factor β

TGF-β-RII Transforming growth factor β receptor

Tie-2 Tyrosine kinase with immunoglobulin-like and EGF-like domains 2 TNF-alpha Tumor necrosis factor alpha

VEGF Vascular-endothelial-growth-factor

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21 7. Curriculum vitae

Name Nils Nickel

Date of birth 11.01.1980

Address Kurt-Schumacher-Ring 18B

30627 Hannover

Citizenship German

Family status Single

_________________________________________________________________________________

School education 1986 -1990 primary school Lohfelden

1990 -1999 secondary school Engelsburg Kassel

Vocational training 2000- 2003 Education in physical therapy 2003 official recognized physical therapist

Tertiary education 2003- 2005 premedical education at Ludwig Maximilian Universität of munich 2005 first final university examination

2005 medical education, Medical School Hannover 2010 final state examination medicine

2010 United States Medical Licensing Examination Step 1

Medical Training 2010 Department of Respiratory Medicine, Medical School Hannover

(25)

22 8. Veröffentlichungen

8.1 Orginalarbeiten

Nickel N, Kempf T, Tapken H, Tongers J, Laenger F, Lehmann U, Golpon H, Olsson K, Wilkins MR, Gibbs JS, Hoeper MM, Wollert KC. Growth differentiation factor-15 in idiopathic pulmonary arterial hypertension. Am. J. Respir. Crit Care Med.

178, 534-541 (2008).

Hoeper MM, Gall H, Seyfarth HJ, Halank M, Ghofrani HA, Winkler J, Golpon H, Olsson KM, Nickel N, Opitz C, Ewert R.

Long-term outcome with intravenous iloprost in pulmonary arterial hypertension. Eur Respir J. 2009 Jul;34(1):132-7.

Epub 2009 Feb 27.

Kumpers P, Nickel N, Lukasz A et al. Circulating angiopoietins in idiopathic pulmonary arterial hypertension. Eur Heart J 2010 July 2.

Lorenzen JM, Nickel N, Kramer R et al. Osteopontin in patients with idiopathic pulmonary hypertension. Chest 2010 October 14.

8.2 Abstracts

American Thoracic Society, Toronto 2008

Authors: H. Golpon, M.D., L. Riu, M.D., S. Sauer, Ph.D., N. Nickel, M.D., M. Schael, B.S., M. Hoeper, M.D., T. Welte, M.D., Grenada Session Info: [**] Thematic Poster Session, [A61] LUNG VASCULAR ENDOTHELIAL FUNCTION, LUNG INJURY

AND PULMONARY EDEMA [Poster Board #A35] A Spheroid Cell

Culture Model To Study Cell Organization and Differentiation Processes of Pulmonary Endothelial Cells, [Publication Page: A176]

American Thoracic Society, San Diego 2009

[Poster Board #E44] Phagocytosis of Apoptotic Cells by Human Pulmonary Endothelial Cells Affects Angiogenesis, [Publication Page: A1836] Authors: H.A. Golpon, MD, C. Sauer, PhD, N. Nickel, MD, M. Schael, BA, T. Welte, MD, K.

Olsson, MD, M.M. Hoeper, MD, Hannover, Germany Session Info: [**] Thematic Poster Session, [A52] VASCULAR REMODELING AND ANGIOGENESIS

[Poster Board #210] Growth-Differentiation Factor-15 Is Triggered by Hypoxic Conditions in Endothelial Cells, [Publication Page: A2325] Authors: N. Nickel, T. Kempf, MD, H. Golpon, MD, K. Olsson, MD, C. deWall, MD, U. Maus, MD, K.C. Wollert, Prof, T. Welte, Prof, M.M. Hoeper, Prof, Hannover, Germany Session Info: [**] Poster Discussion Session, [A105] ENDOTHELIUM: FUNCTION AND REGULATION

[Poster Board #A9] GDF-15 in Follow up in Patients with Idiopathic Pulmonary Arterial Hypertension, [Publication Page:

A4869] Authors: N. Nickel, T. Kempf, MD, H. Golpon, MD, K.C. Wollert, Prof, K. Olsson, MD, C. deWall, MD, T. Welte, Prof, M.M. Hoeper, Prof, Hannover, Germany Session Info: [**] Thematic Poster Session, [C63] DETERMINANTS OF PULMONARY HYPERTENSION OUTCOMES

[Poster Board #C22] Growth Differentiation Factor-15 in Idiopathic Pulmonary Fibrosis (IPF), [Publication Page:

A3008] Authors: C. de Wall, MD, N. Nickel, MD, T. Kempf, MD, H. Golpon, MD, K. Olsson, MD, T. Fuehner, MD, K.C.

(26)

23

Wollert, MD, M.M. Hoeper, MD, Hannover, Germany Session Info: [**] Thematic Poster Session, [B40] INTERSTITIAL LUNG DISEASE: PATHOGENESIS

European Respiratory Society, Berlin 2008

Session 49: Pathophysiology of pulmonary hypertension - Sunday, 05.10.2008 - 08:30-10:30 - London 2

291: Growth-differentiation factor-15 as a prognostic indicator in idiopathic pulmonary arterial hypertension; N. Nickel, T. Kempf, H. Golpon, K. Wollert, M. Wilkins, S. Gibbs, M. Hoeper (Hannover, Lower Saxony, Germany; London, United Kingdom)

... 291: Growth-differentiation factor-15 as a prognostic indicator in idiopathic pulmonary arterial hypertension

American Thoracic Society, San Diego 2009

[Poster Board #E44] Phagocytosis of Apoptotic Cells by Human Pulmonary Endothelial Cells Affects Angiogenesis, [Publication Page: A1836] Authors: H.A. Golpon, MD, C. Sauer, PhD, N. Nickel, MD, M. Schael, BA, T. Welte, MD, K.

Olsson, MD, M.M. Hoeper, MD, Hannover, Germany Session Info: [**] Thematic Poster Session, [A52] VASCULAR REMODELING AND ANGIOGENESIS

[Poster Board #210] Growth-Differentiation Factor-15 Is Triggered by Hypoxic Conditions in Endothelial Cells,

[Publication Page: A2325] Authors: N. Nickel, T. Kempf, MD, H. Golpon, MD, K. Olsson, MD, C. deWall, MD, U. Maus, MD, K.C. Wollert, Prof, T. Welte, Prof, M.M. Hoeper, Prof, Hannover, Germany

[Poster Board #A9] GDF-15 in Follow up in Patients with Idiopathic Pulmonary Arterial Hypertension, [Publication Page:

A4869] Authors: N. Nickel, T. Kempf, MD, H. Golpon, MD, K.C. Wollert, Prof, K. Olsson, MD, C. deWall, MD, T. Welte, Prof, M.M. Hoeper, Prof, Hannover, Germany Session Info: [**] Thematic Poster Session, [C63] DETERMINANTS OF PULMONARY HYPERTENSION OUTCOMES

[Poster Board #C22] Growth Differentiation Factor-15 in Idiopathic Pulmonary Fibrosis (IPF), [Publication Page:

A3008] Authors: C. de Wall, MD, N. Nickel, MD, T. Kempf, MD, H. Golpon, MD, K. Olsson, MD, T. Fuehner, MD, K.C.

Wollert, MD, M.M. Hoeper, MD, Hannover, Germany Session Info: [**] Thematic Poster Session, [B40] INTERSTITIAL LUNG DISEASE: PATHOGENESIS

8.3 Vorträge American Thoracic Society, Toronto 2008

Mini-Symposium, [B16] PATHOGENIC MECHANISMS OF PULMONARY HYPERTENSION: NEW INSIGHTS GDF-15 as a prognostic Marker in Idiopathic pulmonary hypertension

European Respiratory Society, Berlin 2008

Pulmonary hypertension in connective tissue diseases" Symposium, Growth-differentiation factor-15 as a prognostic indicator in idiopathic pulmonary arterial hypertension.

StrucMed Symposium, Medizinische Hochschule Hannover, 2008 GDF-15 in mikrovaskulären Endothelzellen der Lunge

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24

Japanese Respiratory Society, at the 49th Annual Conference, Tokyo 2009

English Mini Symposium 7-4 Growth Differentiation Factor-15 as a prognostic indicator in Idiopathic Pulmonary Hypertension.

European Respiratory Society, Vienna 2009

Session 384: Pathobiology of pulmonary vascular diseases - Tuesday, 15.09.2009 - 14:45-16:45 - Room C9b 4336: Growth-differentiation factor-15 is triggered by hypoxic conditions in endothelial cells; N. Nickel, T. Kempf, K.

Wollert, U. Maus, K. Olsson, C. DeWall, T. Welte, M. Hoeper (Hannover, Germany)

8.4 Preise European Respiratory Society, Berlin 2008

ERS Clinical Physiology and Integrative Biology Assembly Pulmonary Arterial Hypertension Research Award 2008

Deutscher Pneumologen Kongress, Mannheim 2009

Rene Baumgart-Stiftung Forschungspreis 2009

(28)

25 9. Erklärung nach § 2 Abs. 2 Nr. 5 und 6 der Promotionsordnung

Ich erkläre, dass ich die an der Medizinischen Hochschule Hannover zur Promotion eingereichte Dissertation mit dem Titel „Evaluation neuer Biomarker bei idiopathischer pulmonal arterieller Hypertonie“ in der Abteilung Pneumologie unter der Betreuung von Prof. Dr. med. Marius Hoeper mit der Unterstützung von Dr. med. Heiko Golpon und PD Dr.

med. Jan Kielstein ohne sonstige Hilfen durchgeführt und bei der Abfassung der Dissertation keine anderen als die dort aufgeführten Hilfsmittel benutzt habe. Die Gelegenheit zum vorliegenden Promotionsverfahren ist mir nicht

kommerziell vermittelt worden. Insbesondere habe ich keine Organisation eingeschaltet, die gegen Entgelt

Betreuerinnen und Betreuer für die Anfertigung von Dissertationen sucht oder die mir obliegenden Pflichten hinsichtlich der Prüfungsleistungen für mich ganz oder teilweise erledigt. Ich habe diese Dissertation bisher an keiner in- oder ausländischen Hochschule zur Promotion eingereicht.

Weiterhin versichere ich, dass ich den beantragten Titel bisher noch nicht erworben habe. Ergebnisse dieser Dissertation wurden in folgenden Publikationsorganen veröffentlicht:

(1) Kumpers P, Nickel N, Lukasz A et al. Circulating angiopoietins in idiopathic pulmonary arterial hypertension. Eur Heart J 2010 July 2.

(2) Lorenzen JM, Nickel N, Kramer R et al. Osteopontin in patients with idiopathic pulmonary hypertension. Chest 2010 October 14.

(3) Nickel N, Kempf T, Tapken H et al. Growth differentiation factor-15 in idiopathic pulmonary arterial hypertension.

Am J Respir Crit Care Med 2008 September 1;178(5):534-41.

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26 10. Danksagung

Für die Entstehung dieser Arbeiten möchte ich den Leuten danken, ohne die diese Publikationen nicht möglich gewesen wären. Die Offenheit, Flexibilität, Kreativität und Motivation der vielzähligen Kooperationspartner haben geholfen Ideen schnell und mit viel Unterstützung umzusetzen.

Projekte GDF-15 bei pulmonaler Hypertonie

Bedanken möchte ich mich bei Kai Wollert, für die wissenschaftliche Betreuung, die unkomplizierte Bereitstellung eines Laborarbeitsplatzes und die konstruktive Beratung auch über das Projekt hinaus. Tibor Kempf danke ich für

Unterstützung im Labor, für Hilfestellungen bei statistischen Fragen und für die Korrektur und konstruktive Kritik meines StrucMed-Vortrags. Ulrich Lehmann und Florian Laenger danke ich für die intensive Unterstützung beim Messen von mRNA und für die Bereitstellung von Patientengewebe. Für Hilfe beim Messen der Patientenproben möchte ich mich bei Anja Quint, Jörn Tongers und Heike Tapken bedanken. Martin Wilkens und Simon Gibbs danke ich für die Bereitstellung von Serumproben, klinischer Daten und kritischer Anmerkungen und Korrekturen bei der Erstellung der Publikation. Jan Kielestein danke ich für die zuverlässige Betreuung und die gute Beratung während des gesamten Struc-Med-

Programms. Mortimer Korf danke ich für praktische Hilfe bei der Zellkultur, der PCR und dem Westernblot.

Angiopoietine

Das Angiopoietin-Projekt wäre ohne Phillip Kümpers nicht entstanden. Ich möchte mich bei Ihm für viele kreative und sehr produktive Stunden bedanken. Die Zusammenarbeit mit Ihm hat mein naturwissenschaftliches und klinisches Verständnis sehr befördert. Ich freue mich besonders darüber, dass sein Wechsel des Arbeitsplatzes unserem

wissenschaftlichen und persönlichen Austausch nicht geschadet hat. Alexander Lukasz danke ich für die Messung von Patienten Proben. Danny Jonigk, Lavinia Maegel und Clemens Bockmeyer bin ich sehr dankbar für die gute Kooperation zwischen Pathologie und Pneumologie. Durch das Angiopoietin-Projekt ist eine enge und produktive Zusammenarbeit entstanden, die unsere Arbeit auf ein ganz neues Niveau gehoben hat und für weitere Projekte unentbehrlich ist.

OPN

Ich möchte Johan Lorenzen für die inspirierende, motivierende und produktive Zusammenarbeit danken, die mit dem Osteopontin-Projekt begonnen hat und hoffentlich noch lange andauern wird. Seine Bereitschaft, jederzeit mit Rat und Tat beiseite zu stehen, hat mir oft geholfen.

Pneumologie

An erster Stelle möchte ich mich für den Einsatz von Tobias Welte bedanken, der diese StrucMed Arbeit überhaupt erst ermöglicht hat. Sein Engagement hat dazu geführt, dass das Projekt über Umwege doch noch realisiert werden konnte.

Für die angenehme und ausführliche klinische Ausbildung und für Hilfe bei der Erstellung der klinischen Datenbank möchte ich mich bei Karen Olsson und Volker Westerkamp bedanken. Clemens Sauer danke ich für die Unterstützung bei der praktischen Arbeit mit der Zellkultur. Ulrich Maus danke ich für die unkomplizierte Bereitstellung von

Labormaterial und der PCR-Maschine. Darüber hinaus danke ich Herrn Maus für die ausführliche und förderliche Korrektur der Doktorarbeit. Mrigank Srivastava danke ich für sein geduldiges Engagement und seine praktische Hilfe bei molekularbiologischen Experimenten. Seine Art, genau, strukturiert und sauber zu arbeiten, ist mir immer noch ein Vorbild bei der Laborarbeit. Heiko Golpon danke ich für Unterstützung bei meinen ersten wissenschaftlichen Gehversuchen. Sein umfassendes Verständnis der PAH-Grundlagenforschung, seine ideenreiche und gleichzeitig anschauliche Art, beeindruckt mich immer wieder aufs Neue und motiviert für kommende Projekte. Heiko Golpon hat meine Herangehensweise an wissenschaftliche Fragestellungen und „Weltbilder“ geprägt. Ich möchte mich bei Ihm für die vielen Brain-Storming-Sitzungen bedanken, die nicht nur sehr produktiv, sondern auch immer unterhaltsam waren.

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27

Mein abschließender Dank gilt Marius Hoeper. Ich kann mich noch gut an den 31.01.2007 erinnern, als ich das erste Mal in seinem Büro saß, um mich für eine Doktorarbeit zu bewerben. Ein Jahr darauf wurde bereits das erste GDF-15

Manuskript eingereicht. Seine Person hat es vom besagten ersten Treffen bis zum heutigen Tag an geschafft, auf eine ganz besondere Art und Weise zu motivieren. Seine Klarheit, Präzision und Strukturiertheit macht die Zusammenarbeit mit Ihm so produktiv und beugt zudem vorzeitiger Frustration vor. Ohne seine Zugeständnisse und seine Unterstützung wäre keines der Projekte zustande gekommen. Ich möchte Herrn Hoeper vor allem dafür danken, dass er mir an vielen Stellen der gemeinsamen Arbeit sein Vertrauen geschenkt hat. Er hat mir dadurch Möglichkeiten eröffnet, die meine wissenschaftlichen aber auch persönlichen Horizonte enorm erweitert haben und er hat Begegnung ermöglicht, die mich über die Erstellung dieser Arbeit hinaus bereichern. Dadurch, dass er zu jeder Tages- und Nachtzeit ansprechbar war, einerlei auf welchem Teil der Erde er sich gerade aufhielt, hatte ich niemals das Gefühl mit der Arbeit allein zu sein.

Alle genannten Kooperationspartner haben dazu beigetragen, dass diese Arbeit entstanden ist. Darüber hinaus hatten alle auf ihre Art und Weise Anteil daran, mein Interesse, meine Neugier und vor allem meinen Spaß am

wissenschaftlichen Arbeiten zu wecken und zu erhalten. Dafür noch einmal allen einen herzlichen Dank!

Am Ende danke ich meiner Familie für ihre liebevolle Erziehung, ihre Unterstützung während des Studiums und der Vorbereitung auf das Leben.

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28 11. Orginalpublikationen

Referenzen

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