Hämatologie - Onkologie
Zytokine in der Tumor-Wirt-Interaktion
D.N. Männel, R Orosz, B. Echtenacher, J . Rüschoff und W. Falk
Eine Reihe von Zytokinen besitzt direkte oder indirekte antitumorale Wirksamkeit. Insbeson- dere Interferone1 5 2 7 3 4 und Tumor-Nekrose- Faktor ( T N F )1 6 3 1 3 2 üben sowohl eine direkte tumorzytotoxische als auch eine indirekte i m - munmodulatorische Anti-Tumor-Wirkung aus.
Die indirekte Wirkungsweise über Aktivierung von T-Zellen, natürlichen Killerzellen, M o n o - zyten und Makrophagen, Granulozyten und an- deren Zelltypen wird auch den Zytokinen Inter- leukin ( I L ) - l2 4, I L - 27 1 2 I L - 41 9-3 3, IL-71* und dem Granulozyten-Kolonie-stimulierenden Faktors zugeschrieben. Die Anwendung dieser Substanzen gegen Tumoren wäre deshalb w ü n - schenswert. Aufgrund der breiten Wirkungs- spektren der Zytokine sind jedoch in vivo viele Nebenwirkungen zu erwarten. Beispiele dafür sind die inflammatorischen Zytokine T N F und I L - 1 . Viele verschiedene Zelltypen tragen Re- zeptoren für diese Zytokine, so d a ß eine V i e l - zahl von Effekten in vitro und in vivo beobach- tet werden kann5 " . S o ist z . B . die Endothelzelle eine sehr wichtige Zielzelle für T N F und I L - 1 . D a bei systemischer Applikation dieser Z y t o k i - ne alle Endothelien erreicht werden, sind dem- nach auch andere als nur antitumorale W i r k u n - gen zu erwarten.
Es sind sogar Effekte von T N F beschrieben worden, die Tumorwachstum und Metastasie- rung begünstigen k ö n n e n . Durch Aktivierung des Enzyms Kollagenase kann die Streuung von Tumorzellen gefördert werden9. Die Angioge- nese w i r d stimuliert1 4, und die A d h ä r e n z von Tumorzellen an Endothelzellen wird e r h ö h t4-1 0
2 9. Es wurde auch gezeigt, d a ß T N F invasives
Wachstum von Tumorzellen in der Bauchhöhle unterstützt und die Bildung von T u m o r k n ö t c h e n unter der Mesothelschicht fördert2 1 2 2.
Dazu kommen Beobachtungen, die auf eine vom Tumor verursachte, endogene T N F - P r o - duktion schließen lassen. Tumorinduzierte Pro- duktion von endogenem T N F wurde sowohl an Biopsiematerial von Tumorpatienten3 2 f > als auch im Serum2 2 5 und in Tiermodellen2 3 2 S ge- zeigt. Der Nachweis von T N F ist zwar am be- sten dokumentiert, aber die Beobachtung läßt sich mit großer Wahrscheinlichkeit auch auf I L -
1 und andere Zytokine, die bei E n t z ü n d u n g e n eine Rolle spielen, ausdehnen.
U m die Rolle von T N F in der Pathophysio- logie von Tumorwachstum und Metastasierung zu klären, haben wir in einem Metastasierungs- modell in Mäusen die Wirkung von endogenem und exogenem T N F untersucht. In Maustumor- modellen kann eine erhöhte Fähigkeit zur Pro- duktion von endogenem T N F , Interferon-y und IL-6 während des Tumorwachstums gezeigt werden2 8. U m zu klären, ob diese Produktion von E n t z ü n d u n g s m e d i a t o r e n nur zufällig mit dem Tumorwachstum korreliert oder ob dies ei- nen Ü b e r w a c h u n g s - und Abwehrmechanismus des Organismus gegen den Tumor darstellt, wurde endogenes T N F durch Antikörper gegen T N F in vivo neutralisiert. Mäusen wurden syn- gene Fibrosarkomzellen (106 Zellen) subkutan injiziert, die sich zu einem soliden Tumor ent- wickelten. Wurde während des Wachstums der Tumoren endogenes T N F in den Tieren durch A n t i - T N F - A n t i k ö r p e r neutralisiert, konnte kei- nerlei Unterschied in der G r ö ß e der sich ent-
wickelnden Tumoren gemessen werden2 3. Die- se Beobachtung spricht entweder dafür, d a ß das endogene T N F keine Bedeutung für Tumor- wachstum hat oder d a ß unter diesen Versuchs- bedingungen - wegen des zu großen Tumorzell- inokulats oder Unzugänglichkeit des endo- genen T N F für den neutralisierenden Antikör- per - eine potentielle Wirkung von endogenem tumorinduziertem T N F in diesem M o d e l l nicht nachweisbar war. A u s Versuchen mit metasta- sierenden Maustumoren ( L e w i s - L u n g - K a r z i - nomzellen und E s B - L e u k ä m i e z e l l e n ) gab es je- doch Hinweise dafür, d a ß die Metastasierung durch die Neutralisierung von endogenem T N F beeinflußt wurde. Tiere mit intramuskulär i n - okulierten Lewis-Lung-Karzinomzellen ent- wickelten in Gegenwart von A n t i - T N F - A n t i - körpern deutlich weniger Lungenmetastasen.
Entsprechend wurden im E s B - M o d e l l , wenn die E s B - Z e l l e n subkutan inokuliert worden waren, weniger Metastasen in M i l z und Leber gezählt.
Wieder zeigte sich an den Primärtumoren kein Effekt auf das Wachstum durch die A n t i - T N F - Behandlung.
U m diesen metastasenfördernden Effekt von T N F in einem reproduzierbaren, einfachen M e - tastasierungsmodell systematisch untersuchen zu k ö n n e n , wurde M ä u s e n die oben e r w ä h n t e n Fibrosarkomzellen (3 x 105 Zellen) intravenös injiziert und die A n z a h l der Metastasen in der Lunge nach 12 Tagen gezählt. Wurde gleichzei- tig mit der Tumorzellgabe endogenes T N F durch eine einmalige Gabe von A n t i - T N F - A n t i - körpern neutralisiert, entwickelten sich deutlich weniger Lungenmetastasen (Tab. 1). Die N e u - tralisierung von Interferon-y (IFN-y) dagegen hatte keinen Einfluß auf die Metastasenzahl.
Dieses Ergebnis läßt vermuten, d a ß I F N - y in diesem M o d e l l keine wesentliche Rolle spielt.
Einen weiteren Hinweis auf die metastasenför- dernde Wirkung von T N F liefern die in Tab. 2 beschriebenen Ergebnisse. Gleichzeitiges Ver- abreichen von rekombinantem M a u s - T N F ( r m T N F ) mit den Tumorzellen führte zu einer d o s i s a b h ä n g i g e n Vermehrung der Metastasen (Tab. 2). Für IL-1 wurde in einem anderen Mausmodell ein ähnlicher Einfluß auf die M e - tastasierung beschrieben1 7. Von einer anderen Arbeitsgruppe wurde zusätzlich gezeigt, d a ß m ö g l i c h e r w e i s e eine unmittelbare Wirkung von T N F auf die Tumorzellen die Metastasierung fördert, da Tumorzellen, wenn sie in vitro vor Inokulation T N F ausgesetzt worden waren, ebenfalls ein h ö h e r e s Metastasierungspotential
zeigten2 0. Entsprechende Vorinkubation der F i - brosarkomzellen mit T N F führten in unserem M o d e l l jedoch zu keiner stärkeren Metastasie- rung. A u c h war T N F in vitro weder direkt zyto- toxisch noch wachstumsfördernd für die F i - brosarkomzellen, wenn Einbau von radio- aktivem Thymidin als M a ß für die Proliferation bestimmt wurde.
Tabelle 1 Verringerung der Lungenmetastasenzahl durch Anti-TNF-Antikörper
Behandlung Metastasenzahl ± SEM
Kontrolle 58,5 ±7,9
Anti-TNF-Antikörper 9,6 ±5,6 Anti-lFN-y-Antikörper 48,7 ± 16,3
Ratten-IgG 66,9 ± 18,0
Die Tiere wurden mit den angegebenen Substanzen (Kontrolle: Puffer, Antikörper: 40 jug) 5 Stunden vor Tumorzellinokulation i.v. behandelt. Am Tag 11 wurden die Tiere getötet und die Anzahl der äußer- lich sichtbaren Lungenmetastasen bestimmt.
Tabelle 2 Erhöhung der Lungenmetastasenzahl durch rmTNF
Behandlung Lungenmetastasenzahl ± SEM
Kontrolle 44,8 ±9,6
0,08 jig rmTNF 46,5 ± 10,3 0,4 jag rmTNF 82,0 ±13,4 2,0 |Lig rmTNF 163,3 ±22,5 10,0 |ag rmTNF >220
Die Tiere wurden mit den angegebenen Substanzen wie in Tab. 1 behandelt und die Lungenmetastasen- zahl bestimmt.
Die Frage, zu welchem Zeitpunkt T N F seine metastasierungsfördernde Wirkung ausübt, wur- de durch die Gabe von r m T N F zu verschiedenen Zeiten vor oder nach Tumorinokulation unter- sucht. Eine Verstärkung der Metastasierung wur- de beobachtet, wenn T N F 5 Stunden vor oder
1 Stunde nach den Tumorzellen verabreicht wur- de (Tab. 3). Wenn Anti-TNF-Antikörper 24 Stun- den nach den Tumorzellen verabreicht wurden, konnte keine Änderung der Metastasenzahl ge- messen werden. Dies deutet darauf hin, daß das endogene T N F eine frühe Phase der Metastasie- rung von im Blut zirkulierenden Tumorzellen be- einflußt. Möglicherweise wird durch T N F die Anheftung der Tumorzellen an das Kapilla- rendothel in den Lungengefäßen verstärkt und dadurch die Diapedese und Extravasaten geför- dert. Expression von Adhäsionsmolekülen auf Endothelzellen durch T N F ist eine vielfach be- schriebene Funktion von T N F1 4.
118 Hämatologie - Onkologie
Tabelle 3 Zeitliche Abhängigkeit der Erhöhung der Metastasenzahl von der rmTNF-Behandlung Behandlung Zeitpunkt Metastasenzahl ± SEM Kontrolle - 5 Std. 46,2 ± 10,2 rmTNF -24 Std. 59,7 ± 16,9 rmTNF - 5 Std. 185,0 ±31,7 rmTNF +1 Std. 169,3 ±4,3 rmTNF +24 Std. 45,6 ± 1,9 rmTNF +48 Std. 30,5 ±8,8
Die Tiere wurden zu den angegebenen Zeitpunkten vor oder nach Tumorzellinokulation wie in Tab. 1 (rmTNF: 7,5 \ig) behandelt und die Lungenmetasta- senzahl bestimmt.
In histologischen Untersuchungen von L u n - genpräparaten der Versuchstiere konnten 5 Ta- ge nach Tumorzellgabe Mikrometastasen in den Septen des Lungenparenchyms gezählt werden.
A u c h zu diesem frühen Zeitpunkt war der ver- ringernde Effekt von A n t i - T N F - A n t i k ö r p e r n und der e r h ö h e n d e Effekt von r m T N F auf die Metastasenzahl deutlich. Eine Anfärbung dieser Mikrometastasen mit Silbernitrat zeigte deut- lich, daß die Behandlung der Tiere mit r m T N F zu mehr mit Silber anfärbbaren Proteinstruktu- ren in den N u k l e o l i führte. Dieser Befund stellt eine mit höherer Proliferationsaktivität der T u - morzellen zunehmende A n z a h l Nukleolus orga- nisierender Regionen ( A g N O R ) dar2 8 (Tab. 4).
Entsprechend führte Neutralisierung von endo- genem T N F zu einer Verringerung der Zahl der A g N O R . Dies spricht im Gegensatz zu unseren oben e r w ä h n t e n In-vitro-Befunden dafür, d a ß T N F das proliferative Potential der Tumorzellen in vivo positiv beeinflußte. Diese Beobachtung m u ß jedoch nicht auf einer direkten Wirkung von T N F auf die Tumorzellen beruhen, sondern kann einen indirekten Effekt, der durch Endo- thelzellen und andere beteiligte Blut- oder G e - webszellen vermittelt werden kann, darstellen.
D i e Beteiligung anderer Zytokine wie IL-1 oder IL-6 und die Rolle von anderen als Tumor-
und Endothelzellen bei der durch T N F geför- derten Metastasierung wird derzeit untersucht.
Die verstärkte Expression von A d h ä s i o n s m o - lekülen scheint dabei besonders wichtig zu sein.
D a diese Wirkung von T N F in unserem M e - tastasierungsmodell nur einen Ausschnitt aus dem Wirkungsspektrum von T N F widerspie- gelt, bleibt offen, ob eine solche Wirkung für das Problem der Metastasierung nach operativer Entfernung von P r i m ä r t u m o r e n von Bedeutung ist. Die Gefahr der verstärkten Metastasierung besteht jedoch, bis die antitumorale Wirkung von T N F oder anderen Zytokinen auf moleku- larer Ebene von weiteren, m ö g l i c h e r w e i s e schädlichen Wirkungen getrennt und separat be- einflußt werden kann. Wenn sich ein derartiger Befund, wie hier im Mausmodell beschrieben, in klinischen Untersuchungen bestätigen ließe, w ü r d e dies bedeuten, d a ß sich eine zusätzliche Immunstimulierung nach Entfernung eines P r i m ä r t u m o r s , die sich in einer erhöhten Frei- setzung von E n t z ü n d u n g s m e d i a t o r e n wie T N F äußert, für die Patienten m ö g l i c h e r w e i s e nach- teilig auswirkt.
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Tabelle 4 Erhöhung der proliferativen Aktivität der Tumorzellen durch rmTNF-Behandlung
Behandlung Mikrometastasen- Durchmesser AgNOR
flächenzahl ±SEM ±SEM
±SEM
Kontrolle 0,18 ± 0,11 96,67 ±15,63 1,80 ± 0,02
rmTNF 1,43 ±0,25 180,0 ±14,97 14,30 ±0,94
Die Tiere wurden 5 Stunden vor Tumorzellinokulation i.v. behandelt (Kontrolle: Puffer, rmTNF: 10 jug). Am Tag 5 wurden die Tiere getötet und die Flächenzahl (pro mm2) und der maximale Durchmesser (jum) der Mikro- metastasen nach Hämatoxylin-Eosin-Färbung bzw. die silberaffinen Nukleolistrukturen (AgNOR) nach Silber- nitratfärbung in Lungenpräparaten bestimmt.
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