Chromatographie-Aufgaben: Vorgehen Aufgabe erfassen:
• GC oder LC?
• Eigenschaften zu trennenden Substanzen:
o Polar/apolar (sind Elektronen ungleichmässig verteilt? Nicht
symmetrisch, hohe Unterschiede in Elektronegativität), wenn nur eine polare funkt. Gruppe in grossem sonst apolaren Molekül → apolar
• Probenaufarbeitung
• Kalibrierungsart
• Welcher Detektor + durch welche Eigenschaften werden Analyten getrennt?
Fragestellungen:
• Probenaufarbeitung: Probenart & Methode
• Kalibrierungsart&Quantifizierung
• Rechnungsaufgaben (Bodenhöhe, Peakauflösung etc
• Auflösung Chromatogramm
• Detektor (welchen benutzen, Gradient,
Allgemeines Messung:
• Qualitativ/identifizieren: Spektroskopie & Spektrometrie
• Chromatographie quantitativ & qualitativ
• Häufig Kombinationen (z.B. HPLC und MS)
Gründe für Abweichung von idealer Peakform:
Vielzahl von Gründen:
1) Abweichung wegen Sättigungseffekten:
o Überladung (zu viel) der stationären Phase o Überladung (zu viel) der mobilen Phase
➔ Reduzieren durch:
o Betroffene Phase ändern (andere LöMi-Zusammensetzung, Gradienten, stationäre Phase)
o Säule mit grösserem Durchmesser (teuer & zeitaufwändig!) o Menge Analyt reduzieren/Analytlösung verdünnen
2) Peaküberlagerung wegen unvollständiger Trennung
➔ Auflösung ändern
3) Koelution (gleiche Retentionszeit) zweier Substanzen
➔ Andere Trennungsbedingung schaffen (z.B. andere Selektivität oder mobile Phase ändern)
➔ Verschiedene Detektoren verwenden, die spezifisch oder verschieden empfindlich sind (UV/VIS oder LC/GC mit MS)
4) Instrumentelle Probleme o Hohlraum in Säule
o Misslungene Probenaufgabe
o Verstärkung der Effekte durch z.B. Chemisorption o Säulenbluten, teilweise Verlust mobiler Phase
Effizienz einer Trennung verbessern (Theorie):
Je mehr theoretische Böden (N), desto effizientere Trennung und schmalere Peaks, (Bodenhöhe (H) ist Säulenlängen unabhängig und allgemeiner)
- Schmalere Peaks durch Verkleinerung von H (van Deemter-Geichung) o In LC: A und C verringern
o In GC: B und C verringern
Massnahmen zur Verbesserung Trennung/Effizienz
- Kleinere Bodenhöhe H → effizientere Trennung - Längere Säule benutzen
- In LC
o Tiefe Lineargeschwindigkeit am besten - In GC
o Mittlere Lineargeschwindigkeit am besten Gradientenelution kann zu besserer Trennung führen
Auflösung einer Trennung verbessern
Idealfall: basisliniengetrennt (keine Peaküberschneidungen) (Rs > 1.5, ΔtR = 6σ) Zur Optimierung:
(Achtung, α und k oft nicht unabhängig voneinander, also beobachten und anpassen) 1) Kapazitätsfaktor k erhöhen:
o Indem man die Wechselwirkungen der beiden Phasen verändert
▪ LC: mobile Phase ändern
▪ GC: Temperaturänderung oder stationäre Phase wechseln o Nachteil: Erhöht Retentionszeiten → längere Analysezeiten und evtl.
Peakverbreiterung
o Bei schon hohem k-Wert (>10) kaum mehr Verbesserung o
2) Trennungsfaktor α erhöhen:
o Bewirkt grösseren Abstand der Peaks im Chromatogramm
o Von vielen Parameter beeinflusst (Zusammensetzung mobiler oder stationärer Phase (z.B. pH-Wert), Temperatur), z.B. stationäre Phase wechseln, um für Komponenten selektiver zu sein
o Besonders grosse Verbesserung durch kleine Veränderung, wenn α <
1.1 ist
o Manchmal sind Optimierungen für vers. Peaks gegenläufig → mit Gradientenelution nachhelfen (LC: LöMi, GC:Temp.)
3) Anzahl theoretischer Böden N erhöhen:
o Erst machen, wenn Veränderung α und k nicht möglich o Abhängig von Säulenlänge L und Bodenhöhe H
• Säulenwechsel (länger) teuer und zeitaufwändig
• Lieber Lineargeschwindigkeit u verbessern (Verringerung H in GC&LC (Siehe Effizienz Trennung verbessern) o Besser getrennt an gleicher Stelle im Chromatogramm
o Durch Vervierfachung N nur Verdoppelung der Auflösung -
Fehlerquellen bei Chromatographie
- Statistische Fehler unvermeidlich (Gaussverteilung)
- Systematische Fehler (Verschiebung der Gaussverteilung, falsche Messergebnisse, Verschiebung Mittelwert)
o Falsche Kalibrierung o Verdünnungsfehler o Berechnungsfehler
o Verluste bei Extraktion oder Filtration o Instrumentenhandhabung
Kalibrierung (3 Möglichkeiten)
Masslösungen mit verschiedenen bekannten Konzentrationen einer Substanz → Kalibrierfunktion mit linearer Regression anhand Peakflächenzunahme →
Bestimmung unbekannter Konzentration der Substanz möglich mithilfe der Regresssion
1) Kalibrierung mit externem Standard
o Kalibrierungsgerade wird unabhängig von Probenlösung vorbereitet o Einfachster & häufigster Fall
o Verwendet, wenn:
• Viele Proben mit ähnlicher Matrix (Zusammensetzung) vorhanden
• Standardmischung mit ähnlichen Eigenschaften wie Probe vorhanden
• Systematische Fehler vernachlässigbar 2) Kalibrierung mit internem Standard
o Wird verwendet, wenn mit Verlust des Analyts oder anderen
systematischen Fehlern bei der Probenaufarbeitung zu rechnen ist o Substanz wird der Probenlösung zugesetzt und bei Auswertung mit
Analyt verglichen o Voraussetzungen:
• Ähnliche physikalisch-chem. Eigenschaften wie Analyt → ähnliches Verhalten bei Probenaufarbeitung
• Gleiche Stabilität
• Ähnliche Empfindlichkeit & mit gleicher Methode bestimmbar
• Nicht im ursprünglichen Probegemisch enthalten o Meist verwendet:
▪ Chem. Verwandte (unterscheiden sich in Methylgruppe
▪ Stabile Isotope (durch MS detektierbar)
o Wenn kein interner Standard vorhanden → Standardadditionsverfahren
3) Standardadditionsverfahren
o Kalibrierung mit Probe selbst → Probe in Teile (Aliquote) aufgeteilt und vers. Konzentration des Analyten selbst zugefügt →
Konzentrationsermittlung der reinen Probe durch Peakflächenzunahme
Probenaufarbeitung: Probenart & Methode Ziele:
- Analyten in Lösung bringen
- Abtrennen von festen oder gelösten Substanzen - Aufreinigen und Anreichern der Analyten
- Einstellen einer für Messung geeignete Konzentration in geeignetem LöMi
Gradientenmethoden/-elution
(≠ isokratische Bedingungen)
In LC: Änderung der mobilen Phase (Lösungsmittel, z.B. von apolar zu polar) In GC: Änderung der Temperatur (meist Erhöhung für Verringerung Retentionszeit) Ziel:
- Bessere Trennung von Peaks, die bei isokratischen (gleichbleibenden)
Bedingungen durch vers. Eigenschaften vieler Substanzen nicht möglich wäre - Lange Retentions- (und Analyse)zeiten von Substanzen mit vers.
Eigenschaften verringern
Verwendet in: HPLC, Ionenchromatographie (mithilfe von Suppressoren), allgemein in GC, in TLC vergleichbares Verfahren
Inkompatibel mit Detektoren: Brechungsindex (RID), elektrochem. Detektoren
Trennkriterien:
Polarität:
• Adsorptionschromatographie (NPLC, stat. Phase polar)
• Verteilungschromatographie (RPLC, stat. Phase apolar) Molekülgrösse:
- Grössenausschlusschromatographie (SEC), grosse Moleküle schneller o Gelpermeationschromatographie (GPC)
o Gelfiltration
Ionische Wechselwirkungen (zw. Analyten und stat. Phase) - Ionenchromatographie (IC)
Spezifische biochemische, nicht-kovalente Wechselwirkungen - Affinitätschromatographie
Unterschiedlich schnelle Komplexbildung zw. Metallionen und org. Liganden - Komplexierungschromatographie
Siedepunkt - G
Was für Moleküle wollen wir trennen:
Grundsätzlich: für LC: in mobiler Phase löslich, für GC: gasförmig gemacht werden - Enantiomere → Diastereomere bilden und dann trennen
- Thermolabile & schwerflüchtige Substanzen: LC, nicht GC → HPLC - Biopolymere (z.B. Proteine, Fettsäuren) → HPLC (vers. Polarität),
Grössenausschusschromatographie
- Apolare Moleküle → NPLC (polarere schneller) - Polare Moleküle → RPLC (polarere schneller) - Ionen → Ionenchromatographie
- Oligomere → Grössenausschusschromatographie
- Spezielle biochem. Wechselwirkungen → Affinitätschromatographie
Wie bestimmte Moleküle detektieren:
- Aromatische Ringe → UV/VIS - Carbonylgruppen (C=O) → UV/VIS - Chinone → Elektrochemische Detektoren - Doppel- und Mehrfachbindungen → UV/VIS - Ferrocenderivate → Elektrochemische Detektoren - Fettsäuren → RID
- Gesättigte Alkane und deren Alkohole → RID - Gesättigte Polymere → RID
- Heteroatome (-Br, -I, -S, -N) → UV/VIS
- Hydrochinone → Elektrochemische Detektoren - Ionen → Leitfähigkeitsdetektor
- Konjugierte Doppelbindungen → UV/VIS
- Mit funktionellen Gruppen (polar) → Elektrosprayionsation (ESI) - Nitroverbindungen → Elektrochemische Detektoren
- Phenolische Verbindungen → Elektrochemische Detektoren - Polyzyklische Aromaten → Fluoreszenz
- Stickstoff-Heterozyklen → Elektrochemische Detektoren - Thiole → Elektrochemische Detektoren
- Zucker, Kohlenhydrate → RID -
Detektion der Moleküle bei bestimmter Trennungsmethode:
HPLC:
- Universell:
1) UV/VIS (Festwellenlängen-/variable Geräte, Diodenarrydetekt. (DAD))
▪ Nachteile: Analyt muss eine Wellenlänge absorbieren und bei anderen Wellenlängen als LöMi
▪ Verwendet für aromatische Ringe/konjugierte Doppelbindungen (hauptsätzlich), Doppel- und Mehrfachbindungen,
Carbonylgruppen, -Br, -I, (-S, -N)
▪ Auch sehr selektiv (polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe)
2) Wenn nicht mit UV/VIS detektierbar: Brechungsindex (RID)
▪ jede gelöste Substanz detektierbar
▪ Nachteile: geringere Nachweisstärke als UV/VIS, inkompatibel mit Temperaturgradient (→ dann ELSD)
▪ Verwendet für Zucker, Kohlenhydrate, Fettsäuren, gesättigte Alkane und deren Alkohole, gesättigte Polymere
3) Wenn noch Temperaturgradient: Verdampfungslichtstreudetektor (ELSD)
▪ Nachteile: Analyt muss deutlich weniger flüchtig sein als LöMi, inkompatibel mit salzhaltigen Pufferlösungen
- Selektiv (gut für Entfernen von Störsignale anderer Substanzen):
1) Fluoreszenzdetektor
▪ Für fluoreszierende Substanzen (z.B. polyzyklische Aromaten)
▪ Nachweissstark
▪ Kompatibel mit Gradientenelution
▪ Nachteile: Salzgehalt/pH/Temp. des Eluenten können zu Quenchen führen
▪ Derivatisierung von Substanzen mit Flurophoren möglich 2) Leitfähigkeitsdetektor
▪ Für Ionen v.a. in Ionenchromatographie
▪ Hauptschwierigkeit: hohe Grundleitfähigkeit von Pufferlösungen als LöMi → Suppressoren einsetzen
3) Elektrochemische Detektoren
▪ Für oxidier- und reduzierbare Substanzen
▪ Inkompatibel mit Gradientenelution - Massenspektrometer als HPLC-Detektoren
o Ermöglicht qualitative Identifizierung & massenselektive Detektion o Koeluierende Substanzen erfassbar
o Einfache Interpretation der Spektren
o Am einfachsten: Quadrupol-MS (auch 3 geschaltet) 1) Elektrosprayionsation (ESI)
▪ Universell, v.a. polar Moleküle, insbesondere mit funkt. Gruppen
▪ Bei apolaren Molekülen vorher Derivatisierung nötig 2) Chem. Ionisation bei Atmoshäredruck (APCI)
▪ Auch für apolare Moleküle - Seltener verwendete Detektoren
1) IR-Detektor
▪ Hilfreich bei Strukturaufklärung
▪ Nachteile: LöMi hat auch Absorptionsbande (sorgfältige Wahl), eher geringe Nachweisstärke
2) NMR-Detektor
▪ Hervorragend für Strukturaufklärung
▪ Nachteile: nicht sehr empfindlich wegen langer Messungsdauer, teuer wegen nötigem deuterierten LöMi
4 andere Varianten der LC (auf bestimmten Anwendungsbereich zugeschnitten)
Ionenchromatographie
- Universaldetektor:
o Leitfähigkeitsdetektor
▪ Suppressor benutzen (Verringerung Grundleitfähigkeit und bei Gradientenbetrieb
- Selektiv:
1) Fluoreszenzdetektor
▪ Den Eluenten fluoreszierende Hilfsreagenzien zufügen, die bei Anwesenheit von Analytionen ändern
Dünnschichtchromatographie (TLC)
- Detektion ist hier räumlich statt zeitlich!
- Farbige Moleküle detektierbar
- Fluoreszierende Moleküle oder Fluoreszierende Platte mit absorbierenden Analyten
- Restliche Substanzen mit chem. Färbemethoden sichtbar machen
Grössenausschusschromatographie (siehe Kurzspick bzw. Skript)
- Gelpermeationschromatographie - Gelfiltration
Affinitätschromatographie (Siehe Skript)
Worauf achten/welche Punkte abhaken bei eigener Trennungs- /Analysemethode
1) Qualitativer oder quantitativer Nachweis?
2) Ist GC möglich (Molekül flüchtig)?
a. Siede-/Schmelzpunkt darf nicht zu hoch sein (Schmelzpkt. von 200 °C zu hoch)
3) Nach welcher Eigenschaft wird getrennt ODER was für ein Molekül will man nachweisen (Siehe Listen)
4) Detektionsmethode (entweder nach Molekül oder was für Trennungsmethode möglich)
