Inhalt
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I
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungen ... IV
1 Einleitung ...1
1.1 Pflanzliche Resistenzmechanismen und Abwehrreaktionen ...1
1.2 Pathogenerkennung und Signaltransduktion in der pflanzlichen Pathogenabwehr ...3
1.2.1 Signalperzeption ...3
1.2.2 Signaltransduktion ...3
1.3 Der oxidative burst...5
1.3.1 Reaktionen zur Entstehung der ROS ...5
1.3.2 Der oxidative burst in der pflanzlichen Pathogenabwehr...6
1.3.3 Herkunft des oxidative burst...8
1.3.4 Die NADPH-Oxidase aus Phagozyten ...9
1.4 Das Modellsystem aus einer Petersiliezellsuspensionskultur und Peptidelicitoren....10
1.5 Zielsetzung der Arbeit...12
2 Material und Methoden...14
2.1 Chemikalien, Enzyme und Oligonukleotide...14
2.2 Kultivierung und Behandlung der Petersiliezellen ...14
2.2.1 Elicitorbehandlung der Petersiliezellen ...14
2.2.2 Bestimmung der Phytoalexinakkumulation im Kulturmedium ...15
2.2.3 Präparation von Proteinextrakten aus Petersilie...15
2.2.3.1 Gewinnung von Gesamtproteinextrakten ...15
2.2.3.2 Präparation von mikrosomaler Zellfraktion (nach Tschöpe, 1999) ...15
2.2.4 Stabile Transformation von Petersiliezellen (nach Feiner et al.,1992) ...15
2.3 Bestimmung der Konzentration reaktiver Sauerstoffspezies ...16
2.3.1 Luminol-Lumineszenz-Methode zur Bestimmung der H2O2-Konzentration (nach Warm und Laties, 1982) ...16
2.3.2 Lucigenin-Lumineszenz-Methode zur Bestimmung der O2- -Konzentration (nach Corbisier et al., 1987) ...17
2.3.3 Eine Methode zur Bestimmung der O2--Konzentration basierend auf der Reduktion des Tetrazoliumfarbstoffes XTT ...17
2.4 Molekularbiologische Arbeiten ...17
2.4.1 Bakterien- und Hefestämme, Phagen, Plasmide...18
2.4.2 PCR-Amplifikation von DNA...19
2.4.3 RT-PCR ...19
2.4.4 5‘RACE...20
2.4.5 Klonierung von PCR-Produkten ...20
2.4.6 Reinigung von Plasmid-DNA...20
2.4.7 Isolierung und Reinigung von DNA-Fragmenten ...20
2.4.8 Markierung von DNA-Fragmenten ...20
2.4.8.1 Radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten ...20
2.4.8.2 Markierung von DNA-Fragmenten mit Digoxygenin ...20
2.4.9 DNA-Sequenzierung ...20
2.4.10 Computerunterstützte Auswertung von Sequenzdaten ...21
2.4.11 Southernblots mit genomischer DNA ...21
2.4.12 Screening einer Petersilie-λ-ZAPTMII-cDNA-Bank ...21
Inhalt
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II
2.4.13 RNA-Isolierung ...22
2.4.13.1 Präparation von Gesamt-RNA...22
2.4.13.2 Präparation von Poly (A)+-RNA ...22
2.4.14 Northern-Blot-Analysen...22
2.4.15 Bakterielle Expression von RBOH1.1 und RBOH2.1...23
2.5. Proteinanalytische Methoden...23
2.5.1 Bestimmung der Proteinkonzentration ...23
2.5.2 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) ...23
2.5.3 Western-Blot-Analyse ...24
2.6 Hefe-Methoden...24
2.6.1 Das Hefe-Zwei-Hybrid-System...24
2.6.1.1 Hefestämme und Plasmide ...24
2.6.1.2 Medien und Wachstumsbedingungen für Hefen...25
2.6.1.3 Herstellung der Plasmide pBD-HA51, pBD-HA52 und pBD-HA42...26
2.6.1.4 Hefetransformation ...26
2.6.1.5 Screening mit pBD-HA51, pBD-HA52 und pBD-HA42...27
2.6.1.6 Plasmidpräparation aus Hefe ...27
2.6.1.7 Proteinextraktion aus Hefe ...27
2.6.2 Heterologe Expression in der Hefe Saccharamyces cerevisiae...28
2.6.2.1 Hefetransformation ...28
2.6.2.2 Induktion der Proteinbiosynthese ...28
2.6.2.3 Analyse der heterologen Proteinexpression ...28
2.6.2.4 Mikrosomenpräparation (Saccharomyces cerevisiea) ...28
2.7 Heterologe Expression in NIH-3T3 Zellen...29
2.7.1 Transfektion der NIH-3T3 Zellen ...29
2.7.2 Proteinextraktion aus NIH-3T3 Zellen und Analyse der heterologen Proteinexpression...29
3 Ergebnisse ...30
3.1 Klonierung und Charakterisierung von zwei cDNA-Klonen mit Homologien zur katalytischen Untereinheit der NADPH-Oxidase aus Phagozyten, gp91phox...30
3.1.1 Screening einer Petersilie-cDNA Bank mit einer heterologen Sonde aus Reis...30
3.1.2 Southern Blot-Analyse ...31
3.1.3 Weitere Analyse der Nukleinsäuresequenzen...32
3.1.3.1 5’RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) ...32
3.1.3.2 Analyse genomischer Klone...33
3.1.4 Analyse der erhaltenen Daten und Sequenzvergleiche...34
3.1.5 Expressionsanalyse von rboh1 und rboh2...37
3.2 Funktionelle Charakterisierung ...39
3.2.1 Expression von RBOH1 und RBOH2 in E.coli...39
3.2.2 Versuche zum Nachweis der korrespondierenden Proteine in Petersiliezellen ..40
3.2.3 Heterologe Expression von RBOH1 und RBOH2 in NIH-3T3 Zellen ...41
3.2.4 Heterologe Expression in der Hefe S. cerevisiae ...42
3.2.5 Enzymatische Charakterisierung der rekombinanten Enzyme RBOH1.10 und RBOH2.5 ...43
3.2.5.1 Enzymaktivitäten...43
3.2.5.2 KM-Werte für die Substrate NADPH und NADH...44
3.2.5.3 Hemmung der O2- -Produktion durch DPI / IDP ...45
3.2.5.4 Ca2+-Abhängigkeit der NAD(P)H-Oxidaseaktivität von RBOH1 ...46
3.2.6 Stabile Transformation von Petersiliezellen mit rboh2-Sense- und rboh2- Antisense-Konstrukten...48
3.2.6.1 Konstrukte für die stabile Transformation der Petersiliezellen ...49
3.2.6.2. Analyse und Charakterisierung der rboh2-Sense-Linien ...49
Inhalt
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III
3.2.6.3 Analyse und Charakterisierung der rboh2-Antisense-Linien ...50
3.2.7 Das Hefe-Zwei-Hybrid-System...51
3.2.7.1 Bedingungen...51
3.2.7.2 Testverfahren zur Eignung der Konstrukte ...52
3.2.7.3 Resultate der Zwei-Hybrid-Screens...53
3.3. Isolierung und Charakterisierung von cDNA-Klonen nach partieller Reinigung einer putativen NAD(P)H-Oxidase...54
3.3.1. Isolierung der korrespondierenden cDNA-Klone aoh1 und aoh2...54
3.3.2 Analyse der aoh-cDNAs und Sequenzvergleiche...56
3.3.3 Expressionsanalyse der aoh1-und aoh2-Transkripte ...58
3.3.4 Gewebespezifische Expressionsanalyse der AOH-Proteine ...59
3.3.5 Heterologe Expression von AOH1 in NIH-3T3 Zellen und in Zellen der Hefe Saccharomyces cerevisiae ...60
3.3.6 Stabile Transformation von Petersiliezellen mit aoh1-Antisense-Konstrukten ....61
4. Diskussion...63
4.1. Isolierung und Charakterisierung von rboh1 und rboh2...63
4.1.1. Sequenzvergleiche ...63
4.1.2 Ähnlichkeiten und Unterschiede zum NADPH-Oxidase-Komplex aus Phagozyten ...64
4.1.3 Neue humane GP91phox-Homologe ...65
4.2 Heterologe Expression von RBOH1 und RBOH2 in der Hefe Saccharomyces cerevisiae ...67
4.2.1 Nachweis der NAD(P)H-Oxidaseaktivität der rekombinanten Proteine RBOH1 und RBOH2 ...67
4.2.2 NAD(P)H-Oxidaseaktivität des rekombinanten RBOH1.10-Proteins ist Ca2+- abhängig...68
4.2.3 Enzymkinetische Eigenschaften ...69
4.3 Expressionsanalyse von rboh2 ...70
4.3.1 Rboh2 – Unterschiede zu anderen pflanzlichen gp91phox-Homologen ...70
4.3.2 Induktion der Transkriptakkumulation von rboh2 – einem elicitorresponsiven Gen ...71
4.3.3 Strukturelle Ähnlichkeiten mit Fe-Reduktasen...72
4.4 Untersuchungen zur Funktion der RBOH-Proteine ...73
4.4.1 Detektion der Proteine RBOH1 und RBOH2 in Petersilie...73
4.4.2 Identifizierung von cytosolischen Untereinheiten oder anderen Regulatoren durch das Hefe-Zwei-Hybrid-System ...73
4.4.3 Analyse von rboh2-Sense- und -Antisense-Linien...74
4.5 Ascorbat-Oxidase-Homologe (AOH) – neue Enzyme mit putativer NAD(P)H- Oxidaseaktivität ...76
4.5.1 Sequenzanalyse von AOH1 und AOH2 ...76
4.5.2 Funktionelle Charakterisierung der AOH-Proteine ...77
4.5.2.1 Expressionsanalyse ...77
4.5.2.2 Versuche zum Nachweis der Enzymaktivität des rekombinanten AOH1 ...78
4.5.2.3 Analyse von stabil transformierten aoh1-Antisense-Kulturen...78
4.6 Ausblick ...79
5 Zusammenfassung...81
6 Literatur...83 7 Anhang
Abkürzungen
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IV
Abkürzungen
% v. Max. Prozent vom Maximalwert 4-CL 4-Cumarat-CoA-Ligase
Abb. Abbildung
Ampr Ampicillinresistenz
AOH Ascorbate oxidase homolog APS Ammoniumperoxodisulfat avr-Gen Avirulenzgen
bp Basenpaare
BSA Rinderserumalbumin b-ZIP basischer “Leucin-Zipper“
Camr Chloramphenikolresistenz CaMV “cauliflower mosaik virus“
cAMP cyclisches Adenosinmonophosphat
cDNA komplementäre DNA
C-Terminus Carboxy-Terminus DDC Diethyldithiocarbamat DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure DPI Diphenyleniodonium DTT Dithiotreithol
ECL- enhanced chemiluminescence
E. coli Escherichia coli
EDTA Ethylenamintetraessigsäure
EGTA Ethylenglykol-bis-(2-aminoethylether)-N,N,N‘,N‘-tetraessigsäure EST expressed sequence tag
FAD Flavin-adenin-dinucleotid (oxidierte Form) Fe Eisen (Fe2+-Ionen)
G-Protein GTP-bindendes Protein GST Glutathion-S-Transferase GTP Guanosintriphosphat
h Stunden
HPLC high-performance-liquid-chromatoraphy HR hypersensitive Reaktion
IC50 Inhibitorkonzentration für eine 50%ige Inhibierung
IDP Diphenyliodonium
IPTG Isopropyl-D-thiogalactosid
JA Jasmonsäure
kb Kilobasen
kDa Kilodalton
KM Michaelis-Menten-Konstante LB-Medium Luria-Bertani-Medium
MAPK Mitogen-aktivierte Proteinkase MAPKKK MAPKK-Kinase
MES 2-(N-morpholino)ethansulfonsäure min Minuten
NADH ß-Nicotinamid-adenin-dinucleotid (reduzierte Form)
NADP+ ß-Nicotinamid-adenin-dinukleotid-phosphat (oxidierte Form)
Abkürzungen
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V
NADPH ß-Nicotinamid-adenin-dinukleotid-phosphat (reduzierte Form)
nkat Nanokatal
N-Terminus Amino-Terminus OD optische Dichte
PAL Phenylalanin-Ammonium-Lyase P.c. Petroselinum crispum L.
PCD programmed cell death PCR Polymerase-Kettenreaktion
pfu Plaque-bildende Einheiten PMSF Polyvinylpyrrolidon
PR-Protein “pathogenesis-related“-Protein pv. Pathovar
RBOH respiratory burst oxidase homolog R-Gen Resistenzgen
RLE relative Lichteinheiten RNA Ribonukleinsäure
ROS reaktive Sauerstoffspezies rpm Umdrehungen pro Minute RT Raumtemperatur
s Sekunden
SA Salicylsäure
SAR systemisch erworbene Resistenz SDS Natriumdodecylsulfat
SDS-PAGE SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese SOD Superoxiddismutase
SV40 Simian Virus 40
Tab. Tabelle
TEMED N,N,N‘,N‘-Tetramethalethylendiamin TMV Tabak-Mosaikvirus
Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan UV ultraviolettes Licht
v/v Volumen pro Volumen
vgl. vergleiche
WT Wildtyp
w/v Gewicht pro Volumen
X-Gal 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-ß-D-galactopyranosid
Tabelle 1: Abkürzungen für Aminosäuren
Abkürzungen Aminosäure Abkürzungen Aminosäure A Ala Alanin M Met Methionin C Cys Cystein N Asn Asparagin D Asp Asparaginsäure P Pro Prolin E Glu Glutaminsäure Q Glu Glutamat F Phe Phenylalanin R Arg Arginin G Gly Glycin S Ser Serin H His Histidin T Thr Threonin I Ile Isoleucin V Val Valin K Lys Lysin W Trp Tryptophan L Leu Leucin Y Tyr Tyrosin
