Dünn- und Dickdarmmotilität des Pferdes

der Tierärztlichen Hochschule Hannover

Dünn- und Dickdarmmotilität des Pferdes

I N A U G U R A L – D I S S E R T A T I O N zur Erlangung des Grades eines

D O C T O R M E D I C I N A E V E T E R I N A R I A E durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von

Eva Köhn

Hannover 2000

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. M. Schemann 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Deegen

Tag der mündlichen Prüfung: 07.06.2000

1. EINLEITUNG ... 7

2. MATERIAL UND METHODEN ... 16

2.1 VERSUCHSTIERE... 16

2.2 ENTNAHME DER MUSKELSTREIFEN... 16

2.3 HERSTELLUNG DER ZIRKULÄR- UND LÄNGSMUSKELSTREIFEN... 17

2.4 MESSUNG DER MECHANISCHEN AKTIVITÄT DER MUSKELSTREIFEN... 17

2.4.1 Versuchsvorrichtung ... 17

2.4.2 Motilitätsparameter ... 21

2.4.3 Statistik... 26

2.5 GEWEBEDARSTELLUNG/ IMMUNHISTOCHEMIE... 27

2.5.1 Darstellung cholinerger, nitrerger und VIPerger Neurone im Plexus myentericus 28 2.5.3 Darstellung der Diaphorase-Aktivität von NO-synthetisierenden Neuronen ... 29

3. ERGEBNISSE ... 30

3.1 MOTILITÄTSMUSTER UNTER BASALEN BEDINGUNGEN... 30

3.2 MOTILITÄTSMUSTER WÄHREND ELEKTRISCHER FELDSTIMULATION (EFS) ... 34

3.3 IMMUNHISTOCHEMISCHER NACHWEIS VON NEUROTRANSMITTERN IM PLEXUS MYENTERICUS... 39

3.4 NEUROPHARMAKOLOGIE... 41

3.4.1 Wirkung von hemmenden und erregenden Neurotransmittern ... 41

3.4.2 Wirkung von Antagonisten auf die EFS-Antworten ... 53

3.4.2.1 Wirkung von L-NAME 54

3.4.2.2 Wirkung von Apamin 62

3.4.3 Wirkung von Antagonisten auf die exogene Transmitterapplikation ... 70

3.4.4 Wirkung von Suramin ... 77

3.4.5 Wirkung von Phentolamin ... 77

3.4.6 Wirkung von Atropin ... 85

3.5 IN VITRO MOTILITÄTSMESSUNGEN AN MUSKELSTREIFEN VON PFERDEN MIT EINER GASTROINTESTINALEN ERKRANKUNG (KOLIK) ... 86

3.5.1 Motilitätsmuster unter basalen Bedingungen ... 86

3.5.2 Verabreichung von Carbachol... 89

4. DISKUSSION ... 92

5. ZUSAMMENFASSUNG ... 107

6. SUMMARY... 110

7. LITERATURVERZEICHNIS ... 113

8. TABELLENANHANG ...124

AMCA 7-Amino-4- Methylcumarin-3-Acetat

ATP Adenosin 5'-Triphosphat

ChAT Cholinazetyl-Transferase

Cy 3 Carboxymethylindocyanin

DTAF Dichlortriazinyl-Aminofluorescein EFS Elektrische Feldstimulation

ENS Enterisches Nervensystem

L-NAME N-Nitro-L-Arginin Methylester NANC nicht adrenerg – nicht cholinerg

NADPH Nicotinamid Adenin Dinucleotid Hydrogen Phosphat

NADPH-d Nicotinamid Adenin Dinucleotid Hydrogen Phosphat-Diaphorase Nitroprussid Nitroprussid-Natrium-Dihydrat

NO Stickoxid

NOS Stickoxid-Synthase

PACAP Adenylatzyklase Aktivierendes Polypeptid der Hypophyse (1-27) („Pituitary Adenylat Cyclase Activating Polypeptide“)

PBS Phosphat-gepufferte Salzlösung („Phosphat Buffered Saline“) SNP Nitroprussid-Natrium-Dihydrat

TTX Tetrodotoxin

VIP Vasoaktives Intestinales Polypeptid

ZNS Zentrales Nervensystem

1. Einleitung

Alle Funktionen des Gastrointestinaltrakts unterliegen komplexen Kontrollmechanismen, die über ein eigenständiges, in der Wand des Gastrointestinaltrakts lokalisiertes Nervensystem, das enterische Nervensystem (ENS), reguliert werden (Wood, 1987). Die Existenz dieses Nervensystems ist seit weit über hundert Jahren bekannt. Die ersten Untersuchungen beschränkten sich damals auf die anatomisch-morphologischen Eigenschaften dieses

Nervensystems. Von Meissner und Auerbach wurden 1857 bzw. 1862 zwei in der Darmwand lokalisierte Nervengeflechte beschrieben; der zwischen Zirkulärmuskulatur und Mukosa liegende sumbmuköse Plexus (Meissner, 1857), welcher die Mukosafunktionen koordiniert, und der zwischen Zirkulär- und Längsmuskulatur gelegene myenterische Plexus

(Auerbach, 1862), der für die Muskelfunktionen verantwortlich ist. Beide Plexus bestehen aus Nervenzellen, die in Ganglien variabler Größe organisiert sind. Ein dichtes Netzwerk von Fasersträngen verbindet die enterischen Nervenzellen untereinander und mit den

Effektororganen bzw. mit anderen Teilen des autonomen Nervensystems. Bis zur

Jahrhundertwende wurde das ENS als ein diffuses parasympathisches Ganglion angesehen, in dem direkte synaptische Verbindungen zwischen präganglionären extrinsischen Nervenfasern und postganglionären Motorneuronen die Basis für die Kontrolle gastrointestinaler

Funktionen darstellten. Der eigentliche Begriff enterisches Nervensystem wurde erst von Langley 1921 eingeführt, um dieses in der Darmwand lokalisierte neuronale Netzwerk vom sympathischen und parasympathischen Nervensystem abzugrenzen (Langley, 1921). Langley verwendete diesen Begriff, da er überzeugt war, daß enterische Ganglien einzigartige und besondere funktionelle Charakteristika aufweisen, die sie von anderen autonomen Ganglien außerhalb des Gastrointestinaltrakts unterscheiden. Heute ist die Unterteilung des autonomen Nervensystems in drei unabhängige Teilsysteme, das sympathische, das parasympathische und enterische Nervensystem etabliert. Langley's konzeptioneller Ansatz basierte auf zwei Beobachtungen. Zum einen war ihm schon damals bekannt, daß die Anzahl enterischer Nervenzellen die Zahl der den Darm versorgenden extrinsischen sympathischen und parasympathischen Nervenfasern bei weitem übersteigt. Einige tausend extrinsische

Nervenfasern stehen mehreren 10 bis 100 Millionen enterischen Nervenzellen gegenüber. Das enterische Nervensystem ist damit die größte Ansammlung von Nerven außerhalb des Gehirns

und besitzt sogar mehr Nervenzellen als das Rückenmark. Zum anderen begründete Langley die Eigenständigkeit des ENS mit der Beobachtung, daß selbst in einem isolierten

Dünndarmsegment in vitro die gerichtete Propulsion eines intraluminalen Bolus zu

beobachten war (Langley & Magnus, 1905; Langley, 1921). Diese intestinale Propulsion wird verursacht durch eine Muskelkontraktion oral und eine Muskelrelaxation anal des Stimulus.

Dieser Reflex wurde aufgrund seiner grundlegenden Bedeutung für den Magen-Darmtrakt 1899 schon von Bayliss und Starling als ”law of the intestine” bezeichnet (Bayliss &

Starling, 1899). Der peristaltische Reflex kann sowohl durch mechanische Reizung der Muskulatur oder der Mukosa als auch durch chemische Stimuli im Darmlumen ausgelöst werden (Bayliss & Starling, 1899; Magnus, 1904). Der Darm ist damit das einzige Organ, bei dem lebenswichtige Funktionen auch außerhalb des Körpers aufrechterhalten werden können.

Die funktionelle Bedeutung des peristaltischen Reflexes liegt in der Gewährleistung eines anal gerichteten Transports des Chymus. Die heutigen Konzepte betrachten das ENS als ein unabhängiges, integratives System, welches strukturell und funktionell Ähnlichkeiten zum zentralen Nervensystem (ZNS), insbesondere zum Gehirn, aufweist (Wood, 1994). So enthält das ENS eigene sensorische Neurone, Interneurone und Motorneurone (Wood, 1994).

Sensorische Neurone kodieren als Chemo- oder Mechanorezeptoren verschiedene Stimuli, die auf die Magendarmwand einwirken, und leiten die Information innerhalb des ENS weiter.

Interneurone verarbeiten die Information und regulieren die Erregbarkeit der Motorneurone, die dann letztendlich die Aktivität der Muskulatur und der Mukosa modulieren (Wood, 1994).

Aufgrund seiner Komplexität und der funktionellen und strukturellen Ähnlichkeit zum Gehirn wird das ENS auch als ”little brain of the gut”, als ”Darmgehirn”, bezeichnet (Wood, 1994).

Das ENS ist durch verschiedene intrinsische Reflexe fähig, die zahlreichen Funktionen des Magen-Darmtrakts, wie motorische und sekretorische Vorgänge, Durchblutung und

Modulation von Immunvorgängen zu steuern (Costa et al. 1992a; Costa & Furness, 1976;

Furness et al. 1994a; Wood, 1994). Die Funktion extrinsischer sympathischer oder

parasympathischer Nervenfasern besteht primär darin, enterische Schaltkreise zu modulieren.

Dieses Konzept der permissiven Rolle des extrinsischen Nervensystems ermöglicht dem Sympathikus und Parasympathikus, die motorische und sekretorische Aktivität des Magen- Darmtrakts in beschränktem Umfang zu beeinflussen (Grundy & Schemann, 1992; Hillsley et al. 1992).

Erst in den 80er Jahren erfolgte durch den Einsatz elektrophysiologischer Techniken die neurophysiologische Charakterisierung des ENS (Nishi & North, 1973; Hirst et al. 1974).

Intrazelluläre Ableitungen enterischer Nervenzellen ermöglichten die Charakterisierung ihrer elektrischen und synaptischen Eigenschaften und bestätigten die Komplexität der

Verschaltungen innerhalb des ENS. Elektrophysiologisch unterschieden sich mehrere Zellpopulationen. Als besonders bemerkenswerter Befund zeigte sich, daß das ENS, ähnlich wie das ZNS, über das gesamte Repertoire an hemmenden und aktivierenden synaptischen Mechanismen verfügt, um interneuronale und neuromuskuläre Interaktionen

aufrechtzuerhalten. Im Laufe der letzten Jahre erfolgte durch die Anwendung und Kombination elektrophysiologischer, neurochemischer und neuropharmakologischer Techniken die Identifizierung und funktionelle Charakterisierung unterschiedlicher Nervenpopulationen im ENS. Bis heute sind über 20 Neurotransmitter und noch mehr Neuromodulatoren identifiziert, die an der Vermittlung der synaptischen Vorgänge im ENS beteiligt sind (McConalogue & Furness, 1994). Damit besitzt das ENS eine breite Palette von Neurotransmittern, die einzelne Effektorsysteme, wie die glatte Muskulatur, hemmen oder aktivieren können. Trotz der enormen Anzahl an Neurotransmittern, die theoretisch mehrere hundert Kolokalisationsmuster zulassen, existieren im ENS nur ca. 20 Populationen, die sich durch eine spezifische Kodierung auszeichnen. Dabei existiert jedoch eine

regionenspezifische Variabilität des Innervationsmusters und des neurochemischen Kodes, was darauf hinweist, daß sich das ENS auf spezifische Funktionen der verschiedenen Regionen des Magen-Darmtrakts adaptiert hat. Des weiteren existieren zum Teil erhebliche spezies-spezifische Unterschiede, obwohl die Funktionen der entsprechenden Regionen des Magen-Darmtrakts vergleichbar sind (Cornelissen et al. 1999). Die Kenntnisse über die Neurotransmitterkodierung der Nervenzellen basieren primär auf Untersuchungen am

Meerschweinchendarm (Costa et al. 1992a). Die wichtigsten exzitatorischen Transmitter, die zu einer Aktivierung der glatten Muskulatur führen, sind Azetylcholin und das Neuropeptid Substanz P. Die inhibitorischen Transmitter, die zu einer Hemmung der glatten Muskulatur führen, sind Stickoxid (NO), Adenosin 5'-Triphosphat (ATP), Vasoaktives Intestinales Peptid (VIP) und Adenylatzyklase Aktivierendes Polypeptid (PACAP ”Pituitary Adenylat Cyclase Activating Polypeptide”).

Beim Pferd konnten bisher im myenterischen Plexus des Dünn- und Dickdarms die Neurotransmitter Substanz P, Calcitonin-gene-related-peptide, Methionin-Enkephalin,

Galanin, Stickstoffmonoxid, VIP und Neuropeptid Y nachgewiesen werden (Pearson, 1994;

Rakestraw et al. 1996; Burns & Cummings, 1993). In der Region der Beckenflexur in der linken dorsalen Kolonlage sind VIP-Nervenzellen zahlenmäßig stärker vertreten als in den anderen Regionen des Magen-Darmtrakts des Pferdes. Ob dieser Befund, wie vermutet, die Hypothese unterstützt, daß diese Region eine Schrittmacherfunktion ausübt ist mehr als fraglich (Burns & Cummings, 1993). Erstens gibt es keinerlei Hinweise, daß die VIP Innervationsdichte einen funktionellen Marker für Schrittmacherfunktionen darstellt.

Zweitens existieren seit kurzem Befunde, die zeigen, daß weder Muskelzellen noch Nerven als Schrittmacher im Darm fungieren, sondern daß diese Funktion von spezialisierten Zellen, den Interstitial Cells of Cajal, ausgeübt wird (Sanders et al. 1999).

Die Voraussetzung einer funktionierenden Motilität im Magen-Darmtrakt ist ein optimal abgestimmtes Zusammenspiel von sowohl hemmend als auch erregend wirkenden nervalen Regulationsmechanismen. Als Hauptkomponente des erregenden Mechanismus ist

Azetylcholin bekannt. Das Azetylcholin wird hierbei nicht von parasympathischen Nervenfasern, sondern fast ausschließlich von Nervenzellen des ENS ausgeschüttet. Der hemmende Mechanismus wird durch Freisetzung von mehr als einem Neurotransmitter vermittelt (Costa et al. 1986; Crist et al. 1992; Maggi & Giuliani, 1993). Hierbei spielt der Sympathikus eine untergeordnete Rolle. Es konnte sehr früh gezeigt werden, daß weder Noradrenalin noch Azetylcholin als Überträgerstoff der Hemmung in Frage kommen. Die im Magen-Darmtrakt auftretende Hemmung der glatten Muskulatur wird daher als nicht

adrenerg, nicht cholinerg vermittelte Hemmung oder auch als NANC-Hemmung bezeichnet (Bennet, 1997). An dieser NANC-Hemmung sind mehrere Neurotransmitter in regionen- und auch spezies-spezifisch unterschiedlichem Ausmaß beteiligt. Zu den hemmend wirkenden Neurotransmittern gehören Stickoxid (NO), Adenosin 5'-Triphosphat (ATP),

Vasoaktives Intestinales Polypeptid (VIP) und Adenylatzyklase Aktivierendes Polypeptide der Hypophyse (PACAP ”Pituitary Adenylat Cyclase Activating Polypeptide”). Die Zirkulärmuskulatur wird bei allen bisher untersuchten Spezies sowohl von erregenden als auch von hemmenden Motorneuronen innerviert. Die Innervation der Längsmuskulatur erfolgt, zumindest im Dünndarm kleiner Haus- und Labortiere, primär durch erregende cholinerge Motorneurone des ENS (Brookes et al. 1992; Cheung & Daniel, 1980). Die

Längsmuskulatur enthält bei diesen Spezies keine direkte, hemmende Innervation (Brookes et al. 1992) sondern relaxiert passiv als Folge einer Kontraktion der Zirkulärmuskulatur (Wood

& Perkins, 1970). Im Gegensatz dazu gibt es Hinweise, daß die Längsmuskulatur im Kolon dieser Tiere durch hemmende Motorneurone des ENS reguliert wird und damit auch aktiv relaxieren kann (Stevens et al. 1999; Spencer et al. 1999; Smith & Robertson, 1998).

Die funktionelle Bedeutung und die Wirkungsweise der Neurotransmitter kann an isolierten Magen- bzw. Darmpräparaten untersucht werden. Im Vordergrund stehen hierbei

Fragestellungen nach den Überträgerstoffen, die erregende oder hemmende Muskelreflexe vermitteln. In isolierten Darmpräparaten können enterische Nerven selektiv elektrisch gereizt werden, um die Ausschüttung ihrer Transmitter zu stimulieren. Die elektrische

Feldstimulation führt in den meisten Fällen zu einer Mischantwort, die aus hemmenden und erregenden Komponenten besteht. Obwohl die zeitliche und räumliche Differenzierung durch diese Art der Stimulation verloren geht, spiegeln die Antworten die Vorgänge wieder, die auch bei der Initiierung des peristaltischen Reflexes ablaufen. Die Wirkungen der

verschiedenen Neurotransmitter auf die Aktivität der glatten Muskulatur kann dann registriert und neuropharmakologisch analysiert werden. Dabei untersucht man die Wirkung der

Agonisten bzw. verschiedener rezeptorspezifischer Antagonisten auf die durch elektrische Stimulation induzierte Muskelantworten bzw. deren Wirkung auf die durch exogene Applikation der Neurotransmitter hervorgerufenen Motilitätsänderungen. Solche

Untersuchungen erlauben die Differenzierung verschiedener Reflexkomponenten, da die durch elektrische Stimulation induzierte Antwort immer auf der Ausschüttung eines Transmittercocktails basiert.

Die erregenden und hemmenden Wirkmechanismen der Neurotransmitter werden im folgenden kurz zusammengefaßt. Im Magen-Darmtrakt führt die Freisetzung von Azetylcholin zu einer Kontraktion. Gershon konnte 1970 den Beweis dafür liefern, daß Azetylcholin ein Neurotransmitter im autonomen Nervensystem ist (Gershon, 1970). Als Neurotransmitter im ENS wirkt Azetylcholin auf die glatten Muskelzellen über muskarinerge Rezeptoren, die vermutlich zum M3-Rezeptorsubtyp gehören. Mit Hilfe von Antikörpern gegen die Cholin-Azetyltransferase (ChAT), ein Enzym der Azetylcholinsynthese, können Azetylcholin synthetisierende Nervenzellen im ENS dargestellt werden (Costa et al. 1986;

Schemann et al. 1993). Stickoxid wurde ursprünglich als relaxierender Faktor des Endothels von Blutgefäßen identifiziert, der eine Vasodilatation vermittelt (Lincoln et al. 1992).

Inzwischen ist bekannt, daß Stickoxid im Magen-Darmtrakt als hemmender Neurotransmitter wirkt (Sanders & Ward, 1992; Stark et al. 1993; Stark et al. 1991; Rand & Li, 1995,

Bult et al. 1990; Desai et al. 1991). Es konnte gezeigt werden, daß die nach Stimulation von hemmenden Nerven ausgeschütteten Transmitter zu einer Membranhyperpolarisation glatter Muskelzellen am Darm führen. (Stark et al. 1991; Stark et al. 1993). Dies bewirkt eine Relaxation und/oder eine Hemmung der Kontraktilität.

Stickoxid wird durch das Enzym Stickoxid-Synthase (NOS) produziert. Anhand des immunhistochemischen Nachweises dieses Enzyms konnten Populationen nitrerger enterischer Neurone im myenterischen und submukösen Plexus sowie in Nervenfasern

identifiziert werden (Costa et al. 1992b; Ward et al. 1994; Furness et al. 1994b). Des weiteren konnte eine direkte Beteiligung am peristaltischen Reflex nachgewiesen werden (Waterman

& Costa, 1994).

ATP ist, neben seiner Funktion als ein wichtiger Energieträger im Organismus, ein

Neurotransmitter. Burnstock stellte 1972 die sogenannte purinerge Hypothese auf, nach der ATP im autonomen Nervensystem als Neurotransmitter fungiert (Burnstock, 1972). Diese Hypothese ist inzwischen durch mehrere Studien erhärtet worden. So ist ATP als Transmitter an der Enstehung der schnellen erregenden postsynaptischen Potentiale im autonomen Nervensystem beteiligt (Evans et al. 1992; Lepard & Galligan, 1999; Hoyle, 1992). Des weiteren ist die Rolle von ATP als einer der Überträgerstoffe der NANC Hemmung der glatten Muskulatur des Magen-Darmtrakts etabliert. ATP aktiviert purinerge Rezeptoren und moduliert dadurch "small conductance" Ca²⁺abhängige K⁺-Kanäle (SK-channel), die selektiv durch das Bienengift Apamin blockiert werden. (Selemidis et al. 1997).

Das Neuropeptid Vasoaktives Intestinales Polypeptid (VIP) wird zu den Hauptkomponenten der nicht-adrenergen, nicht-cholinergen Transmitter, die eine Relaxation im Magen-Darmtrakt vermitteln, gezählt. VIP wird ferner eine wichtige Rolle als deszendierende inhibitorische Komponente im intestinalen peristaltischen Reflex zugesprochen (Dockray, 1992). Neben VIP ist auch das Adenylatzyklase Aktivierende Polypeptid der Hypophyse PACAP (”Pituitary Adenylat Cyclase Activating Polypeptide”) an der neuronalen hemmenden Übertragung beteiligt und beide scheinen zusammen mit Stickoxid die deszendierende Relaxation beim peristaltischen Reflex zu vermitteln (Grider, 1993; Grider et al. 1994). PACAP wurde

erstmalig 1989 aus dem Hypothalamus des Schafes isloliert und seither in Neuronen des ENS bei vielen Spezies nachgewiesen (Sundler et al. 1992). VIP wirkt über spezifische und

unspezifische VIP-Rezeptoren, die zum Teil auch durch PACAP aktiviert werden können und im weiteren Verlauf Tetraethylammonium-sensitive Kaliumkanäle aktivieren

(Schworer et al., 1993). PACAP aktiviert sowohl PACAP-spezifische als auch PACAP/VIP Rezeptoren, in deren Folge es zu einer Modulation von Apamin-sensitiven und/oder Apamin- insensitiven Kaliumkanälen kommt (Lauff et al., 1999).

Es ist bekannt, daß die Hemmung in einzelne zeitlich zu differenzierende Phasen unterteilt werden kann. Nach elektrischer Stimulation der hemmenden Nervenzellen im ENS tritt eine biphasische Hemmung auf (Baccari et al. 1991). Im Magen verschiedener Spezies vermittelt NO die initiale, transiente Hemmung, während VIP die länger anhaltende Hemmung

vermittelt. Dies hängt mit der frequenzabhängigen Freisetzung der Transmitter zusammen. Im Magen führt eine elektrische Stimulation mit geringer Frequenz primär zu einer NO-

Ausschüttung während hohe Stimulationsfrequenzen VIP freisetzen (D'Amato et al. 1992;

Grundy et al. 1993; Meulemans et al. 1995; De Beurme & Lefebvre, 1988). Die Beteiligung der hemmend wirkenden Transmitter ist region- und speziesabhängig. Zum Beispiel vermittelt im unteren Oesophagussphinkter des Opossums NO die schnelle Hemmung nach elektrischer Feldstimulation die lang anhaltende Hemmung ist in dieser Region nicht VIPerg vermittelt (Uc et al. 1999). Im Ileum des Hamster vermittelt NO sowohl die schnelle als auch die langsame Hemmung (Matsuyama et al. 1999). Im Zäkum des Meerschweinchens scheint NO nur an der langsamen Hemmung beteiligt zu sein (Shuttleworth et al. 1999). Im Kolon der Ratte vermittelt NO die lang anhaltende, ATP die schnelle Hemmung (Pluja et al. 1999).

Die NO-Wirkung erfolgt Rezeptor unabhängig über eine Erhöhung des intrazellulären cGMP- Spiegels und wahrscheinlich nachfolgender Aktivierung eines "large conductance"

calciumabhängigen Kalium-Kanals (BK-channel) (Watson et al. 1996). Die nach elektrischer Stimulation des ENS auftretenden NO vermittelten Hemmungen können durch substituierte Argininanaloga, wie N-Nitro-L-Arginin Methylester (L-NAME), welche die NO-Synthese blockieren, aufgehoben werden. Die unter diesen Bedingungen verbleibende Hemmung der Muskulatur kann zum Teil durch das Bienengift Apamin blockiert werden. Apamin ist ein Blocker calciumabhängiger Kalium-Kanäle und antagonisiert daher die Wirkungen aller Neurotransmitter, die durch Aktivierung dieser Kanäle eine Muskelrelaxation induzieren.

Lange Zeit wurde Apamin als selektiver Blocker der ATP-vermittelten Hemmung angesehen.

Inzwischen ist jedoch erwiesen, daß auch PACAP- oder VIP-induzierte Hemmungen Apamin- sensitiv sind (Shuttleworth & Keef, 1995; Rakestraw et al. 1996; Costa et al. 1986).

Mehrere in vitro Studien am Dünn- und Dickdarm des Pferdes weisen darauf hin, daß an der Hemmung der kontraktilen Aktivität NO, VIP und Neurotransmitter, deren Wirkung über

einen Apamin-sensitiven Mechanismus vermittelt werden, beteiligt sind (Rakestraw et al.

1996; Van Hoogmoed et al. 2000). Dabei scheint NO aber eher für die späte

Hemmkomponente der biphasischen Inhibition verantwortlich zu sein, wohingegen Apamin- sensitive Mechanismen sowohl an der frühen, als auch an der späten Komponente der

neuronal vermittelten Hemmung beteiligt sind (Rakestraw et al. 1996). Als Apamin-sensitive Substanzen beim Pferd werden ATP und PACAP diskutiert (Rakestraw et al. 1996). Auch in der Zirkulärmuskulatur des ventralen Kolons des Pferdes und in den Tänien wurde eine Beteiligung von NO und Apamin-sensitiven Mechanismen nachgewiesen

(Van Hoogmoed et al. 2000) . Diese Komponenten sind aber nicht an dem hemmenden Mechanismus in der Längsmuskulatur des ventralen Kolons beteiligt (Van Hoogmoed et al.

2000).

Der heutige Kenntnisstand über die Beeinflussung der Motilität durch das ENS basiert im wesentlichen auf Untersuchungen an isolierten Darmsegmenten kleinerer Labortiere. Bisher gibt es nur wenige Studien, die vergleichbare Untersuchungen am Pferdedarm durchgeführt haben. Diese Untersuchungen sind insofern relevant, als durch speziesbedingte Unterschiede Ergebnisse vom Meerschweinchen nicht ohne weiteres auf andere Spezies übertragen werden können. Die bisher vorliegenden Daten zeigen, daß der Pferdedarm ähnlich wie bei kleinen Labor- und Haustieren einer nervalen Kontrolle unterliegt. Elektrische Stimulation führt auch am Pferdedarm zu erregenden und hemmenden Antworten (Rakestraw et al. 1996;

Van Hoogmoed et al. 2000; Malone et al. 1999). Regionenspezifische Unterschiede der Antworten sind bisher jedoch nur unzureichend untersucht. Des weiteren fehlen Kenntnisse über die Wirkung verschiedener erregender und hemmender Transmitter und deren mögliche Beteiligung an nerval vermittelten Änderungen der Motorik. Eine Differenzierung zwischen Antworten der Längs- und Zirkulärmuskulatur wurde bisher nicht ausreichend untersucht, und es fehlen daher grundlegende Informationen über die Innervation der beiden Muskelschichten im Pferdedarm.

Das Ziel der vorliegenden Studie war die Identifizierung physiologischer

Bewegungsvorgänge von Kolon und Jejunum des Pferdes sowie die Differenzierung zwischen nerval und myogen vermittelter Aktivität mit Hilfe von in vitro Messungen an isolierten Zirkulär- und Längsmuskelpräparaten im Organbad. Die an der Motilität beteiligten

erregenden und hemmenden Neurotransmitter sollten identifiziert werden. Des weiteren sollte

die nerval und myogen vermittelte Motilität an pathologischem Gewebe von an Kolik erkrankten Pferden untersucht und mit der Motilität der gesunden Pferde verglichen werden.

2. Material und Methoden

2.1 Versuchstiere

Das Probematerial wurde aus 67 Schlachtpferden beiderlei Geschlechts im Alter

von 2 bis 27 Jahren aus den örtlichen Schlachthäusern (Pferdemetzgerei Werner Jausch, Pattensen und Schlachthof GmbH, Hannover) gewonnen. Diese Pferde litten vorberichtlich weder an einer gastrointestinalen Erkrankung noch an einer systemischen Erkrankung. Des weiteren wurden Untersuchungen an 6 an Kolik erkrankten Pferden aus der Pferdeklinik der Tierärztlichen Hochschule Hannover durchgeführt. Die Kolikursachen der verwendeten Pferde sind im Tabellenanhang aufgeführt.

2.2 Entnahme der Muskelstreifen

Die Schlachtpferde wurden mittels Bolzenschusses betäubt und durch nachfolgendes

Entbluten getötet. Nach Zerlegung, spätestens 40 Minuten nach Tötung, wurden ca. 3 x 3 cm große Muskelpräparate von den antimesenterialen Seiten der Beckenflexur, d. h. der

Umschlagstelle zwischen der linken ventralen und der linken dorsalen Kolonlage und des mittleren Jejunums, etwa 2 m proximal des Ileums, entnommen (Abb. 1). Die entnommenen Muskelpräparate umfaßten Serosa, Längs- und Zirkulärmuskulatur sowie den zwischen den Muskelschichten gelegenen myenterischen Plexus.

Abbildung 1: Entnahmeorte von Muskelpräparaten aus dem mittleren Jejunum und der Beckenflexur- Spitze des Kolons. Entnahmeorte = !!! (schematische Darstellung umgezeichnet nach!

NICKEL;SCHUMMER; SEIFERLE 1987).

mittleres Jejunum

Kolon

Beckenflexur-Spitze

Bei den an Kolik erkrankten Pferden wurden, den oben genannten Lokalisationen entsprechend, die Muskelpräparate unmittelbar nach der Euthanasie gewonnen oder es

wurden Muskelpräparate resezierter Darmbereiche des Jejunums verwendet. Es wurde nur der zumindest makroskopisch unauffällige Randbereich des Resektionsstücks verwendet.

Direkt nach Entnahme wurden die Muskelpräparate in gekühlter (4 °C) Krebslösung

(Zusammensetzung in mMol/l: NaCl: 117,0/ KCl 4,7/ MgCl2: 1,2/ NaH2PO4: 1,2/ CaCl2: 2,5/

NaHCO3 : 25,0/ Glucose: 11,0; pH-Wert 7,4 ) abgespült und aufbewahrt.

2.3 Herstellung der Zirkulär- und Längsmuskelstreifen

Die Herstellung der Zirkulär- und Längsmuskelstreifen erfolgte innerhalb einer Stunde nach Entnahme. Das Gewebe mit einer Größe von 3 x 3 cm wurde mit der Mukosa nach oben in einer mit Sylgard beschichteten Petrischale, die mit 25 ml Krebslösung gefüllt wurde, mit Präpariernadeln in in-situ-Größe aufgespannt. Es erfolgte zunächst die Entfernung von Mukosa und Submukosa mit Hilfe von Pinzette und Präparierschere. Anschließend wurde unter einem Mikroskop (SZ40, Olympus, Hamburg) bei 10facher Vergrößerung ein

0,7 x 1,0 cm großer Muskelstreifen parallel zur Zirkulär- bzw. Längsmuskulatur geschnitten und an den Enden mit Hilfe von Präpariernnadeln so fixiert, daß alle Muskelfasern möglichst die gleiche Spannung aufwiesen. Zur Befestigung an der Meßvorrichtung wurde an beiden Enden ein Baumwollfaden angeknotet.

2.4 Messung der mechanischen Aktivität der Muskelstreifen

2.4.1 Versuchsvorrichtung

Die Versuchsvorrichtung bestand aus einem Wasserbad, vier Organbädern, einem Vorratsbehälter, vier isometrischen Kraftaufnehmern (FSG-01, Experimetria, Budapest, Ungarn) und einer Meßbrücke (Mac Lab, AD Instruments, Australien), die an einem Analog- Digital-Wandler (MacLab 4, AD Instruments, Australien) und an ein computerunterstütztes Analysesystem (Apple Macintosh Performa 475 mit Software Chart 3.5.1 von

AD Instruments, Australien) angeschlossen waren (Abb. 2).

Abbildung 2: Vorrichtung zur Messung der mechanischen Aktivität von Muskelstreifen (weitere Erklärungen siehe Text).

Die vier Organbäder hatten verschließbare Zu- und Abläufe über die ein Austausch der Lösung erfolgen konnte. Durch das Wasserbad wurde die in den Organgefäßen und in den Zuläufen befindliche Krebslösung auf 37 °C erwärmt. Die Krebslösung in den Organgefäßen und die des Vorratsbehälters wurde fortwährend mit Carbogen (95% O2/ 5% CO2,

pH-Wert 7,4) begast (Abb. 2).

Zur Messung der mechanischen Aktivität wurden die Muskelstreifen von Jejunum und Kolon parallel zur Zirkulär- bzw. Längsmuskulatur in das Organbad mit einem Volumen von 50 ml gespannt. Dafür wurde der Muskelstreifen an einem Ende mit dem Baumwollfaden mit einem im Organbad befindlichen Haken verbunden und mit dem anderen Ende am Haken des isometrischen Kraftaufnehmers befestigt (Abb. 2). Zur Messung der kontraktilen Aktivität wurden die Muskelstreifen mit 20 mN (Jejunum) bzw. 50 mN (Kolon) vorgespannt. Bei in vitro Motilitätsmessungen ist eine Vordehnung der Präparate auf in-situ-Länge

Voraussetzung dafür, daß die Präparate spontane tonische und phasische Motilität zeigen. Die Kraftaufnehmer dienten zur Umwandlung der mechanischen Aktivität in elektrische Signale.

Die elektrischen Signale wurden über eine Meßbrücke, die an einem Analog-Digital-Wandler

Ablauf

Organbad

Muskelstreifen Platinelektroden Organgefäß Wasserbad

MacLab/4

Krebslösung Carbogen

37°C

Meßbrücke +

Analog-Digital-Wandler computerunterstütztes

Analysesystem

Elektrische

Feldstimulation (EFS)

Kraftaufnehmer

und an einen Computer angeschlossen war, verstärkt und auf einem Monitor dargestellt (Abb. 2). Die Aktivität der Muskelstreifen wurde kontinuierlich mit einer Rate von 20 Hz aufgezeichnet.

Zur Durchführung der elektrischen Feldstimulationen (EFS) wurden beiderseits parallel zur gesamten Länge des Gewebes bipolare Platinelektroden angeordnet, wobei die Elektroden die Muskelstreifen nicht berührten (Abb. 2). Die Elektroden konnten über einen Stimulator (A310 Accupulser, WPI, Berlin) und einem Stimulationsisolator (A 385, WPI, Berlin) angesteuert werden. Dabei wurden folgende Parameter eingestellt: Strom 100 mA, Einzelpulsbreite 0,5 msek, Frequenz 20 Hz, Dauer 10 sek. Die dadurch ausgelösten Antworten waren nerval vermittelt, sie ließen sich vollständig durch das Nervengift Tetrodotoxin (TTX), welches durch Blockierung von schnellen Natrium-Kanälen die Weiterleitung von Aktionspotentialen verhindert, blockieren.

Nach Einbringen der Gewebe in die Organbäder konnten sich die Muskelstreifen für einen Zeitraum von 120 bis 180 Minuten equilibrieren, ohne daß weitere Manipulationen

vorgenommen wurden. In dieser Zeit adaptierten sich die tonischen und phasischen

Aktivitäten der Muskelstreifen an die Versuchsbedingungen und erreichten einen konstanten Level. Nach der Equilibrierungsphase erfolgte alle 10 Minuten die elektrische

Feldstimulation, bis drei elektrische Feldstimulationen reproduzierbare Antworten induzierten. Als reproduzierbar galt, wenn drei aufeinanderfolgende Antworten in ihrer Amplitude um weniger als 10 % voneinander abwichen. Diese Phase der Aufzeichnung dauerte mindestens 60 Minuten. Während dieser Periode wurde die basale Muskelaktivität der Muskelstreifen analysiert. Die basale Aktivität entsprach der Motilität zwischen den

elektrischen Feldstimulationen. Anschließend wurden die Wirkungen verschiedener

Substanzen, die einzeln oder in verschiedenen Abfolgen verabreicht wurden, auf die basale Muskelaktivität, sowie auf die durch elektrische Feldstimulation induzierten Antworten untersucht. Die verabreichten Substanzen sind in Tabelle 1 zusammengefaßt.

Tabelle 1: Liste der für die Studie verwendeten Substanzen.

Substanz Stammlösung Endkonzentration im Organbad

Hersteller

Nitroprussid- Natrium-Dihydrat (Nitroprussid (SNP))

10 mM

in Aqua bidest.

0.001/ 0.005/ 0.01/

0.05/ 0.1 µM

Merck, Darmstadt, Deutschland

Adenosin 5‘- Triphosphat (ATP)

100 mM in Aqua bidest.

500 µM Sigma GmbH,

Steinheim,Deutschland Vasoaktives

Intestinales Peptid (VIP)

100 µM in Aqua bidest.

0.0001/ 0.001/ 0.01/

0.1/ 0.05/ 0.1 µM

BACHEM, Heidelberg, Deutschland

Adenylatzyklase Aktivierendes Polypeptide (1-27) (PACAP „Pituitary Adenylat Cyclase Activating Polypeptide“)

100 µM in Aqua bidest.

0.0001/ 0.001/ 0.01/

0.1 µM

BACHEM, Heidelberg, Deutschland

Carbachol 10 mM

in Aqua bidest.

0.001/ 0.01/ 0.1/ 1/

10 µM

Sigma GmbH,

Steinheim, Deutschland N-Nitro-L-Arginin

Methylester (L-NAME)

100 mM in Aqua bidest.

100 µM Sigma GmbH,

Steinheim, Deutschland

Apamin 100 mM

in Aqua bidest.

0.3 µM Sigma GmbH,

Steinheim, Deutschland

Suramin 100 mM

in Aqua bidest.

100 µM Sigma GmbH,

Steinheim, Deutschland

Phentolamin 10 mM

in Aqua bidest.

1 µM CIBA-GEIGY GmbH,

Wehr, Deutschland

Atropin 1 mM

in Aqua bidest.

1 µM Sigma GmbH,

Steinheim, Deutschland Tetrodotoxin

(TTX)

1 mM

in Aqua bidest.

0.5 µM Sigma GmbH,

Steinheim, Deutschland

2.4.2 Motilitätsparameter

Typisch für die basale spontane Muskelaktivität des Kolons war das Auftreten von

Kontraktionsgruppen, die von Phasen motorischer Pausen flankiert sein konnten und durch einen Anstieg des Muskeltonus während der Kontraktionsgruppen gekennzeichnet wurden (Abb. 5). Die spontane Muskelaktivität des Jejunums war im Vergleich dazu regelmäßiger (Abb. 5).

Für die Bestimmung der Motilitätsparameter der basalen Kontraktionsaktivität, die als Kontrolle für Substanzwirkungen bzw. EFS-induzierte Veränderungen der Motilität diente, wurde eine 10minütige Periode direkt vor Substanzapplikation bzw. vor EFS untersucht. Die Motilitätsparameter nach Substanzapplikation wurden in einer 10minütigen Periode nach Eintritt der Wirkung bestimmt. Substanzen wie Apamin und ATP, zeigten eine primär transiente Wirkung, so daß bei diesen Substanzen die Motilitätsparameter je nach Präparat in ihrer 0,5- bis 6minutigen Wirkperiode ausgewertet wurden.

Abbildung 3: Verwendete Parameter zur Bestimmung der basalen Muskelaktivität in einer

Kontraktionsgruppe. Die Muskeltonuserhöhung während der Kontraktionsgruppen wurden durch die Differenz zwischen Basaltonus und den durchschnittlichen Minima der Kontraktionen innerhalb der Kontraktionsgruppe bestimmt. Die Kontraktionsamplitude wurde durch die Differenz zwischen Minima und Maxima der einzelnen phasischen Kontraktion bestimmt. Exemplarisch sind hier Muskeltonuserhöhung und Amplitude einer Einzelkontraktion durch Pfeile markiert. Der Basaltonus entspricht der gestrichelten Linie.

Kontraktionsamplitude

Basaltonus Tonuserhöhung während

der Kontraktionsgruppen

Dauer

einer Kontraktionsgruppe

10s

5mN

Die folgenden Parameter wurden zur Analyse der Muskelaktivität herangezogen:

Basaltonus [mN] (Abb. 3): Der Basaltonus der Kolonpräparate entsprach dem Mittelwert des niedrigsten Grundtonus außerhalb einer Kontraktionsgruppe, d. h. dem Mittelwert der

absoluten Kontraktionsminima. Im Jejunum wurde der Basaltonus aus dem Mittelwert aller Kontraktionsminima in einem Zeitintervall von 10 Minuten ermittelt.

Kontraktionsamplituden [mN] (Abb. 3): Die Kontraktionsamplituden wurden durch die Differenz zwischen Minima und Maxima einzelner phasischer Kontraktionen bestimmt. Es wurden alle Kontraktionen während einer 10minütigen Periode ausgewertet und deren Amplituden als Mittelwert angegeben.

Kontraktionsfrequenz [1/min]: Die Kontraktionsfrequenz wurde als Anzahl der Kontraktionen pro Minute angegeben und in einem Zeitintervall von 10 Minuten bestimmt.

Kontraktionsaktivität [mN/min]: Die Kontraktionsaktivität wurde durch Multiplikation der durchschnittlichen Amplitude mit der durchschnittlichen Frequenz während eines

Zeitintervalls von 10 Minuten errechnet.

Motilitätsindex [mN/min]: Der Motilitätsindex während der basalen Aktivität, d. h. vor Zugabe von Substanzen, wurde durch die Fläche unter den Kontraktionsmaxima und -minima 5 Minuten vor Zugabe einer Substanz bestimmt. Bei Substanzen mit lang anhaltender

Wirkung wurde der Motilitätsindex nach Wirkungseintritt in einem Zeitabschnitt von 3 bis 10 Minuten bestimmt. Bei transienter Wirkung einer Substanz wurde der Motilitätsindex

während der stärksten Wirkung in einem Zeitabschnitt von 30 bis 90 Sekunden bestimmt.

Kontraktionsgruppen traten im Kolon auf (Abb. 3). Sie wurden von motorischen Pausen (siehe unten) umrahmt und durch eine Erhöhung des Muskeltonus gekennzeichnet. Folgende, für Kontraktionsgruppen typische Motilitätsparameter wurden bestimmt:

Dauer der Kontraktionsgruppen [sek] (Abb. 3): Die durchschnittliche Dauer von mindestens drei aufeinanderfolgenden Kontraktionsgruppen wurde ermittelt.

Dauer der motorischen Pausen [sek]: Motorische Pausen sind Phasen geringer bis fehlender motorischer Aktivität, die von Kontraktionsgruppen flankiert werden. Der Muskeltonus während dieser Pausen entspricht dem Basaltonus. Die Dauer von mindestens drei aufeinanderfolgenden motorischen Pausen wurde ermittelt.

Häufigkeit der Kontraktionsgruppen [1/10 min]: Zur Ermittlung dieses Parameters wurden die Kontraktionsgruppen im Kolon über einen Zeitraum von mindestens 10 Minuten ausgezählt und als Anzahl pro 10 Minuten angegeben. Konnten keine Kontraktionsgruppen differenziert werden, so konnten dennoch durch Glättung der Kurven die für die Kontraktionsgruppen typischen Muskeltonuserhöhungen ermittelt und ausgezählt werden. Dafür wurde ein Frequenzfilter verwendet, der phasische Aktivitäten über 0,05 Hz herausfilterte.

Tonuserhöhung während der Kontraktionsgruppen [∆mN] (Abb. 3): Die

Muskeltonuserhöhung während des Auftretens von Kontraktionsgruppen wurde durch die Differenz zwischen allen durchschnittlichen Minima außerhalb einer Kontraktionsgruppe (entspricht dem Basaltonus) und allen durchschnittlichen Minima innerhalb einer

Kontraktionsgruppe ermittelt.

Kontraktionsfrequenz innerhalb der Kontraktionsgruppen [1/min]: Die Frequenz wurde durch Auszählen aller Kontraktionen in einer Kontraktionsgruppe im herangezogenen Zeitabschnitt von mindestens 10 Minuten ermittelt und als Anzahl der Kontraktionen pro Minute

angegeben.

2.4.2.1 Elektrische Feldstimulation (EFS)

Die Parameter für die elektrische Feldstimulation wurden so gewählt, daß nur selektiv die nervalen Elemente in der Darmwand stimuliert wurden (Strom 100 mA, Einzelpulsbreite 0,5 msek, Frequenz 20 Hz, Dauer 10 sek). Die Aktivität der Muskelstreifen konnte als Antwort während elektrischer Feldstimulation sowohl zunehmen (Zunahme des Motilitätsindexes), als auch abnehmen (Abnahme des Motilitätsindexes). Folgende Motilitätsparameter wurden bestimmt:

Motilitätsindex: Die Fläche unter der Kurve pro Sekunde vor, in oder nach der elektrischen Feldstimulation kennzeichnet einen bestimmten Aktivitätslevel, welcher als Motilitätsindex [mN/sek] definiert wurde (Abb. 4). In einem Zeitintervall von 5 Minuten vor der elektrischen

Feldstimulation wurde die Fläche unter der Kurve pro Sekunde bestimmt (Abb. 4). Im Kolon wurde nur die Fläche unter der Kurve von mindestens drei Kontraktionsgruppen

herangezogen, da die elektrische Feldstimulation im Kolon immer während einer Kontraktionsgruppe vorgenommen wurde. Die elektrische Feldstimulation dauerte

10 Sekunden an. In diesem Zeitraum wurde die Fläche unter der Kurve pro Sekunde bestimmt (Abb. 4). Der Meßbereich wurde bei auftretender Hemmung entsprechend der Dauer dieser Hemmung, die ebenfalls ermittelt wurde, erweitert. Bei vollständiger Hemmung der Motorik erreichte die Fläche unter der Kurve pro Sekunde den Wert 0. Die Dauer der Hemmung wurde in Sekunden angegeben. Nach der elektrischen Feldstimulation wurde die Zeit bis zum Erreichen der ursprünglichen basalen Aktivität gemessen. In diesem Zeitintervall wurde ebenfalls die Fläche unter der Kurve pro Sekunde bestimmt (Abb. 4).

Abbildung 4: Verwendete Parameter für die Beurteilung einer Antwort während elektrischer Feldstimulation (EFS) bei erregender (A) und hemmender Antwort (B). Die Flächen unter der Kurve vor, während und nach EFS sind unterschiedlich schraffiert dargestellt. Diese Flächen wurden pro Sekunde bestimmt und als Motilitätsindex (MI) definiert. Die Trennung der herangezogenen

Meßbereiche vor, während und nach EFS zeigen die vertikalen Linien. Bei einer hemmenden Antwort wurde der Meßbereich entsprechend der Dauer der Hemmung erweitert.

Basaltonus EFS (10 sek)

MI nach EFS MI

vor EFS

MI während EFS

A

Basaltonus EFS (10 sek)

MI nach EFS MI

vor EFS

MI während EFS

B

Die Auswertung der Befunde der mechanischen Aktivität und der nach elektrischer

Feldstimulation nerval induzierten Antworten erfolgte für Zirkulär- und Längsmuskulatur von Kolon und Jejunum. Des weiteren wurden die basale Kontraktionsaktivität sowie die nerval induzierten Antworten von Zirkulär- und Längsmuskelstreifen von an Kolik erkrankten Pferden bestimmt und mit den entsprechenden Zirkulär- und Längsmuskelstreifen der Pferde, die vorberichtlich nicht an einer gastrointestinalen Erkrankung litten (Schlachthofmaterial), verglichen.

2.4.2.2 Konzentrations-Wirkungskurven

Der Verlauf der Konzentrations-Wirkungskurven nach Applikation der verschiedenen Substanzen erfolgte mit Hilfe einer Hillfunktion getrennt für jedes Präparat. Folgende Parameter wurden ermittelt:

1. pD₂-Wert: der negative dekadische Logarithmus des EC₅₀ (Konzentration, bei der die halbmaximale Wirkung erreicht wird). Der pD₂-Wert gibt den Wendepunkt der S-förmigen Konzentrations-Wirkungskurven an.

2. n: Steigung der Kurve

Die Mittelwerte dieser beiden Parameter wurden bestimmt. Es erfolgte der Vergleich von Zikulär- und Längsmuskelpräparaten (Kolon/ Jejunum) sowie ein Vergleich mit

Muskelgewebe der an Kolik erkrankten Pferde.

Wenn keine Anpassung mit Hilfe einer Hillfunktion möglich war, wurden die verschiedenen Konzentrationen untereinander und zur Kontrolle verglichen. Die Wirkungen der Substanzen in den verschiedenen Konzentrationen auf den Zirkulär- und Längsmuskel des Kolons und den Zirkulär- und Längsmuskel des Jejunums wurden miteinander verglichen.

2.4.3 Statistik

Die statistische Auswertung erfolgte unter Verwendung des Statistikprogrammes Sigma Stat (Version 1.01). Es wurden Mittelwert und Standardabweichung ermittelt. Dabei wurden die Motilitätsparameter für jedes Präparat bestimmt und der Mittelwert für alle Präparate

ermittelt. Die angegebenen „n-Zahlen" entsprechen der Anzahl der Präparate. Der Vergleich der Mittelwerte erfolgte mit Hilfe eines t-Tests, der, wenn möglich, gepaart durchgeführt wurde. Bei nicht normalverteilten Daten wurde ein Rangsummentest nach Mann-Whitney durchgeführt. Der Vergleich zwischen Zirkulär- und Längsmuskulatur bzw. zwischen Kolon und Jejunum erfolgte mit einer einfaktoriellen bzw. zweifaktoriellen Varianzanalyse. Alle Tests wurden auf einem Signifikanzniveau p < 0,05 durchgeführt. Alle Werte werden, soweit nicht anders erwähnt, als Mittelwert mit Standardabweichung angegeben.

2.5 Gewebedarstellung/ Immunhistochemie

Zur immunhistochemischen Darstellung von cholinergen und nitrergen Neuronen in den Geweben wurden ca. 3 x 3 cm große Gewebe von Kolon und Jejunum entnommen und fixiert.

Zur Fixation wurden die Gewebe auf den mit Sylgard beschichteten Boden einer Petrischale, die 25 ml Krebslösung (Zusammensetzung in mMol/l: NaCl: 117,0/ KCl: 4,7/ MgCl2: 1,2/

NaH2PO4: 1,2/ CaCl2: 2,5/ NaHCO3 : 25,0/ Glucose: 11,0; pH Wert 7,4 ) enthielt, mit feinen Präpariernadeln unter maximaler Dehnung aufgespannt. Anschließend wurden die Gewebe in Fixierlösung (4 % Paraformaldehyd und 0,2 % Pikrinsäure in Phosphatpuffer) 12 Stunden im Kühlschrank bei 4 °C fixiert. Danach wurde das fixierte Gewebe viermal je 10 Minuten in 0,1 M Phosphatpuffer (0,1 M, pH 7,4) gewaschen und bis zur weiteren Verarbeitung in einer phosphatgepufferten Lösung (PBS, 0,1 M Phosphatpuffer mit 0,88 % NaCl), welche

zusätzlich 0,1 % Natriumazid (NaN₃) enthielt, im Kühlschrank bei 4 °C aufbewahrt. Vor Färbung der Präparate wurden die Mukosa, der submuköse Plexus, die Serosa sowie Zirkulär- und Längsmuskulatur entfernt, so daß der myenterische Plexus erhalten blieb

(Häutchenpräparat). Zur Darstellung von Vasoaktiven-Intestinalen Polypeptid (VIP)- synthetisierenden Neuronen wurden die entnommenen Gewebe vor der Fixierung in steriler Krebslösung gespült und auf einen mit Sylgard beschichteten Boden einer Petrischale, die 25 ml Krebslösung enthielt, mit feinen Präpariernadeln aufgespannt. Die Mukosa wurde entfernt. Zur Aufbewahrung im Brutschrank wurde die Krebslösung gegen 25 ml Dulbeccos Modified Eagles Kulturmedium (DMEM F-12 Sigma, Deisenhofen, Deutschland), welches zusätzlich mit 40 µmol Colchizin inkubiert wurde, ausgetauscht. Colchizin hemmt den

axonalen Transport und führt zu einer Anreicherung von VIP im Soma. Dem Medium wurden 10 % hitzeinaktiviertes foetales Kälberserum, 100 IU/ml Penicillin, 100 µg/ml Streptomycin, 2,75 µg/ml Amphotericin B, 50 µg/ml Gentamycin, 2,1 mg/ml NaHCO3 und 1 µM Nifedipin (alle Chemikalien von Sigma, Deisenhofen, Deutschland) zugesetzt. Die Osmolarität betrug 300 mosmol/kg, und der pH-Wert lag bei 7,4. Das Medium wurde vor Benutzung für 2-3 h bei 37 °C in 5 % CO2-haltiger Luft im Brutschrank equilibriert. Die Petrischale wurde mit einem Glastrichter abgedeckt und das Gewebe in einem Brutschrank für 24 h bei 37 °C und 5

% CO2-haltiger Luft inkubiert. Im Anschluß an die Organkultur wurden die Gewebe, wie oben bereits erwähnt, fixiert und präpariert.

2.5.1 Darstellung cholinerger, nitrerger und VIPerger Neurone im Plexus myentericus Die Darstellung cholinerger Strukturen erfolgte mit Hilfe von Antikörpern gegen die Cholinazetyltranferase (ChAT). Die Darstellung von NO-synthetisierenden Neuronen erfolgte mit Hilfe von Antikörpern gegen die NOS-Synthase (NOS).

Für die Färbungen wurde folgendes Protokoll angewendet:

Präinkubation des Gewebes in 0,1 M PBS mit Zusatz von 4 % Pferdeserum (Sigma, Steinheim, Deutschland) und 0,5 % Triton X-100 (Sigma, Steinheim, Deutschland).

In dieser Lösung wurden auch alle Antikörper gelöst.

• Inkubation mit primärem Antikörper für 40 Stunden bei Raumtemperatur auf einem Taumelschüttler. Folgende primäre Antikörper wurden verwendet:

- Anti-Ziege Cholinazetyltransferase (Verdünnung 1:100; Chemicon, Temecula, USA)

- Anti-Kaninchen NOS (Verdünnung 1:3000; Alexis, Grünberg, Deutschland) - Anti-Maus VIP (Verdünnung 1:1000, East Acres Biologicals, Southbridge,

USA)

• Waschen in PBS (dreimal je 10 Minuten)

• Inkubation mit Fluorophor-gekoppelten sekundären Antikörpern.

Folgende sekundäre Antikörper wurden verwendet:

- Anti-Ziege IgG konjugiert mit einem Carbocyanin-Farbstoff (Cy3) (Verdünnung 1:500; Dianova, Hamburg, Deutschland)

- Anti-Kaninchen IgG konjugiert mit Biotin (Verdünnung 1:50; Dianova, Hamburg, Deutschland)

- Anti-Maus IgG konjugiert mit Dichlorotriazinyl-Aminofluoreszin (DTAF;

Verdünnung 1:200; Dianova, Hamburg, Deutschland)

• Waschen in Phosphatpuffer (dreimal je 10 Minuten)

• Markierung des Biotins mit Streptavidin-7-Amino-4-Methylcoumarin-3-Acetat (Strept AMCA; Verdünnung 1:50; Dianova, Hamburg, Deutschland)

• Waschen in PBS (dreimal je 10 Minuten)

• Eindeckeln auf Poly-l-Lysin beschichteten Objekträgern mit Citifluor AF 1

(Citifluor, Canterbury, England), welches ein rasches Ausbleichen der Fluoreszenz verhinderte.

Die gefärbten Präparate wurden mit Hilfe eines Epifluoreszenzmikroskops (IX 70, Olympus, Hamburg, Deutschland) analysiert. Die orange Fluoreszenz des CY3 wurde mit dem

modifizierten Filterblock UM 41007 (Anregungsfilter HQ 545/30x, dichroitischer Spiegel 565 DCL, Emissionsfilter HQ 610/75M) dargestellt. AMCA (blaue Fluoreszenz) wurde mit dem modifizierten Filterblock U-MWU (Anregungsfilter BP 303-385, dichroitischer Spiegel DM 400, Emissionsfilter BP 460-490) dargestellt. Die grüne Fluoreszenz des DTAF wurde mit dem Filterblock U-MNIBA (Anregungsfilter BP 470-490, dichroitischer Spiegel DM 505, Emissionsfilter D 520) dargestellt (die Angaben zu den Filtern stammen von der Firma

Olympus, Hamburg, Deutschland bzw. Chroma Technology, Brattelboro, USA). Die Filter erlaubten eine getrennte Darstellung der Fluorophor-gekoppelten Antikörper.

Fluoreszenzfärbungen konnten mit einer Schwarz-Weiß-Videokamera (Mod. 4910, Cohu Inc., San Diego, Californien, USA), die an einen Macintosh-Computer (Power Mac 8100/100) angeschlossen war, aufgenommen werden. Als Bildverarbeitungssoftware stand IPLab Spectrum 3.0 (Signal Analytics, Vienna, Virginia, USA) zur Verfügung.

2.5.3 Darstellung der Diaphorase-Aktivität von NO-synthetisierenden Neuronen Je ein Präparat von Kolon und Jejunum wurde nach der NADPH- (Nicotinamid Adenin Dinucleotid Hydrogen Phosphat) Diaphorase-Methode gefärbt.

Immunhistochemisch lassen sich NO-synthetisierende Neurone durch Antikörper gegen NOS und durch einen histochemischen Nachweis der NADPH-Diaphorase nachweisen (Hope et al. 1991). Die Präparate wurden nach Fixierung bei 37 °C in Phosphatpufferlösung (pH-Wert 8) inkubiert, die 1,2 mM NADPH, 0,3 mM Nitroblau- Tetrazolium und 0,5 % Triton-X 100 enthielt (alle Substanzen von Sigma, Steinheim, Deutschland). NADPH-positive Neurone färben sich dabei intensiv blau. Nach ca.

24 Stunden wurde die Reaktion durch Waschen mit Phosphatpuffer unterbrochen. Die Präparate wurden auf Poly-l-Lysin beschichteten Objektträgern mit Citifluor AF 1 (Citifluor, Canterbury, England) eingedeckelt und mit Hilfe des Mikroskops (IX 70, Olympus, Hamburg, Deutschland) im Durchlichtverfahren analysiert.

3. Ergebnisse

3.1 Motilitätsmuster unter basalen Bedingungen

Nach Aufspannen der Gewebe in das Organbad entwickelten alle 15 Zirkulär- und

12 Längsmuskelpräparate des Kolons sowie alle 13 Zirkulär-, 14 Längsmuskelpräparate des Jejunums während der Equilibrierungsphase von 120 bis 180 Minuten tonische Aktivität und phasische Kontraktionen. Die Gewebe ließen sich durch bestimmte Motilitätsmuster, die im folgenden näher beschrieben werden charakterisieren. Die unterschiedlichen Motilitätsmuster des Jejunums und Kolons zeigt beispielhaft Abbildung 5 und die einzelnen Parameter zur Bestimmung des Motilitätsmusters unter basalen Bedingungen sind in Tabelle 2

zusammengefaßt.

6 Präparate des Kolon-Zirkulär- und 9 Präparate des Kolon-Längsmuskels, sowie 9 Präparate des Jejunum-Zirkulär- und 4 Präparate des Jejunum-Längsmuskels entwickelten weder spontane Kontraktionen noch Antworten auf elektrische Feldstimulation. Dies ist ein eindeutiger Hinweis auf eine Schädigung der Gewebe dessen Ursache in der

Entnahmeprozedur, eines zu langen Transportes oder der Gewebepräparation liegen kann.

Diese Präparate wurden nicht mit in die Auswertung einbezogen.

Im Kolon-Zirkulär- und Längsmuskel traten Kontraktionsgruppen mit phasischer Aktivität auf, die von Phasen geringer oder fehlender Motilität (motorische Pausen) flankiert wurden (Abb. 5A). Die Dauer der motorischen Pausen und der Kontraktionsgruppen sowie die Häufigkeit der Kontraktionsgruppen waren zwischen Längs- und Zirkulärmuskelpräparaten nicht unterschiedlich (Tab. 2). Die Kontraktionsgruppen waren im Zirkulär- und Längsmuskel durch einen Anstieg des Muskeltonus um 15 % gekennzeichnet (Tab. 2). Die

Kontraktionsfrequenz innerhalb der Kontraktionsgruppen war vergleichbar (Tab. 2).

Die durchschnittliche Kontraktionsfrequenz während und außerhalb der Kontraktionsgruppen war im Zirkulärmuskel um 39 % signifikant höher als im Längsmuskel (Tab. 2). Allerdings war die Kontraktionsaktivität (Produkt aus Kontraktionsfrequenz und Kontraktionsamplitude) nicht signifkant unterschiedlich, da die Kontraktionsamplituden des Längsmuskels um 23,7 % höher waren als die des Zirkulärmuskels (Tab. 2).

In vier Präparaten des Kolon-Längsmuskels konnten die Kontraktionsgruppen nicht eindeutig differenziert werden (Abb. 5B). Für diese Präparate wurden nur die Parameter Muskeltonus, Kontraktionsamplituden, Kontraktionsfrequenz und Kontraktionsaktivität ausgewertet. Durch

Glättung der Kurven nach Herausfilterung der phasischen Aktivität (siehe 2.4.2, S. 23), wodurch die für die Kontraktionsgruppen typischen Muskeltonuserhöhungen erkennbar wurden, konnte zusätzlich auch die Häufigkeit der Kontraktionsgruppen ermittelt werden (Tab. 2).

Das Motilitätsmuster des Jejunums war, im Vergleich zum Motilitätsmuster des Kolons, regelmäßiger und zeigte keine Schwankungen im Muskeltonus (Abb. 5C und D). Durch die unterschiedliche Vorspannung der Jejunum- (20 mN) und Kolonpräparate (50 mN) befand sich der Muskeltonus auf einem signifikant niedrigerem Niveau als im Kolon (Tab.2).

Typisch für das Motilitätsmuster des Jejunum-Zirkulärmuskels waren regelmäßige phasische Kontraktionen mit unterschiedlicher Amplitude (Abb. 5C). Im Längsmuskel waren die

Amplituden der phasischen Kontraktionen weniger variabel als im Zirkulärmuskel (Abb. 5D).

Der Muskeltonus lag um 34 % niedriger als im Zirkulärmuskel (Tab. 2).

Zirkulär- und Längsmuskel des Jejunums kontrahierten mit gleicher Frequenz, jedoch waren die Kontraktionsamplituden im Längsmuskel um 35 % signifikant höher als die

Kontraktionsamplituden des Zirkulärmuskels (Tab. 2 und Abb. 5C und D). Dies erklärt die signifikant höhere Kontraktionsaktivität des Längsmuskels (Tab. 2). Im Vergleich zum Kolon zeigte der Jejunum-Längsmuskel ebenfalls eine um 96 % signifikant stärkere

Kontraktionsaktivität als der Kolon-Zirkulärmuskel und eine um 105 % signifikant stärkere Kontraktionsaktivität als der Kolon-Längsmuskel (Tab. 2). Dies war im wesentlichen durch die signifikant höheren Kontraktionsamplituden im Jejunum-Längsmuskel bedingt (Tab. 2).

Die Parameter des Jejunum-Zirkulärmuskels unterschieden sich von den Parametern des Kolons, mit Ausnahme des signifikant geringeren Muskeltonus (siehe oben), nur

unwesentlich (Tab.2).

Die Verabreichung des Nervengiftes Tetrodotoxin (TTX) führte zu keinen Veränderungen des basalen Aktivitätsmusters. Tetrodotoxin blockiert schnelle Natriumkanäle und unterbindet die Ausbreitung von Aktionspotentialen in Nerven. Der fehlende Effekt von Tetrodotoxin auf das basale Aktivitätsmuster zeigte, daß die basale Motilität von Kolon und Jejunum primär myogen vermittelt war und auf den endogenen Eigenschaften der Muskulatur beruhte.

Tabelle 2: Kolon und Jejunum: Motilitätsparameter unter basalen Bedingungen.

Kolon Jejunum

Motilitätsparameter Zirkulär- muskulatur n=15

Längs- muskulatur n=12

Zirkulär- muskulatur n=13

Längs- muskulatur n=14

Basaltonus [mN] 33.9±^4.6 31.0±^5.6 17.0±^9.4

† ♦ 11.3±^9.1

† ♦ Kontraktionsamplituden [mN] 7.4±^4.1 9.7±^3.1 9.5±^8.0 14.7±^5.4

"

"

"

" † ♦ Kontraktionsfrequenz [1/min] 10.0±^3.9 7.2±^2.7 """" 8.8±^1.5 9.8±^0.9 Kontraktionsaktivität [mN/min] 73.4±^51.7 70.2±^31.8 83.1±^66.6 143.8±^52.4

"

""

" † ♦ Motilitätsparameter der

Kontraktionsgruppen (im Kolon):

n=15 n=8

Dauer motorischer Pausen [sek] 48.2±^25.0 59.9±^35.5 Dauer der Kontraktionsgruppen

[sek]

72.2±^42.2 56.7±^29.0

Häufigkeit der

Kontraktionsgruppen [1/10min]

7.0±^3.0 11.0±^5.0

Tonuserhöhung während der Kontraktionsgruppen [∆mN]

4.9±^4.1 4.6±^2.8

Kontraktionsfrequenz innerhalb der Kontraktionsgruppen

[1/min]

14.0±^3.2 12.6±^3.0

Signifikante Änderungen (p < 0,05) zwischen Zirkulär und Längsmuskel sind mit ("""") gekennzeichnet. (†) markiert signifikante Änderungen zwischen Kolon-Zirkulärmuskel und Jejunum und signifikante Änderungen zwischen Kolon-Längsmuskel und Jejunum

markiert (♦).

Die Ergebnisse der basalen Motilität zeigten, daß Jejunum und Kolon unterschiedliche Motilitätsmuster aufwiesen, die primär myogen vermittelt wurden. Im Kolon wechselten sich Phasen starker mit Phasen geringer Motorik ab, während die Motilität im Jejunum durch regelmäßigere Kontraktionen charakterisiert war.

Abbildung 5: Beispiele für Motilitätsmuster unter basalen Bedingungen. A: Im Kolon-Zirkulärmuskel sind Kontraktionsgruppen und motorische Pausen zu sehen. Die Kontraktionsgruppen sind durch einen Anstieg im Muskeltonus gekennzeichnet.B: Im Kolon-Längsmuskel sind ebenfalls Oszillationen im Muskeltonus zu erkennen. Aufgrund der fehlenden motorischen Pausen existieren jedoch keine abgrenzbaren Kontraktionsgruppen. C: Der Jejunum Zirkulärmuskel weist phasische Kontraktionen auf, die regelmäßig aber mit unterschiedlichen Amplituden auftreten.D: In der Längsmuskulatur des Jejunums sind regelmäßig auftretende phasische Kontraktionen erkennbar.

D Jejunum-Längsmuskel

A Kolon-Zirkulärmuskel B Kolon-Längsmuskel C Jejunum-Zirkulärmuskel 100s

20mN

3.2 Motilitätsmuster während elektrischer Feldstimulation (EFS)

Die 10 Sekunden andauernde elektrische Feldstimulation (EFS) induzierte sowohl hemmende als auch kontraktile Antworten. In Abbildung 8 sind repräsentative Antworten auf elektrische Feldstimulation dargestellt. Als hemmende Antwort wird eine Verminderung des

Motiliätsindexes während der elektrischen Feldstimulation bezeichnet. Als kontraktile

Antwort wird eine Steigerung des Motilitätsindexes während der elektrischen Feldstimulation bezeichnet. Der entsprechende Motilitätsindex vor, während oder nach der elektrischen Feldstimulation wird in mN/sek angegeben.

Neben den bereits während der EFS einsetzenden Antworten konnten auch "off-Antworten"

ausgelöst werden. Eine "off-Antwort" stellt eine Steigerung der Kontraktionsamplitude dar, die sofort nach Ende der elektrischen Feldstimulation auftreten kann. Sie trat bei wenigen Präparaten des Jejunums auf (Abb. 7; Zirkulärmuskel: n=3, Längsmuskel: n=2). Diese

"off-Antworten" wurden aufgrund ihres unregelmäßigen Auftretens nicht näher analysiert.

Nach Applikation des Nervengiftes Tetrodotoxin konnten alle EFS-induzierten kontraktilen und hemmenden Antworten vollständig blockiert werden. Damit waren die beschriebenen Antworten auf elektrische Feldstimulation ausschließlich nerval vermittelt (Abb. 6).

Abbildung 6: Darstellung des Motilitätsmusters während elektrischer Feldstimulation (EFS) vor (Kontrolle) und nach Verabreichung von 0,5 µM Tetrodotoxin (TTX) am Beispiel des Kolon-Zirkulär- und Jejunum-Längsmuskels. Der Balken kennzeichnet die Dauer der EFS.

Tetrodotoxin blockiert die kontraktilen und hemmenden Antworten während elektrischer Feldstimulation.

Kolon- Zirkulär- muskel

Kontrolle In TTX

Jejunum- Längs- muskel

10s 20mN

EFS EFS

EFS EFS

Für die Untersuchung des Motilitätsmusters während der elektrischen Feldstimulation (EFS) wurden 15 Zirkulär- und 11 Längsmuskelpräparate des Kolons sowie 13 Zirkulär- und 14 Längsmuskelpräparate des Jejunums einbezogen. Die Werte der EFS-induzierten Motilitätsparameter sind in Tabelle 3 zusammengefaßt.

Zirkulär- und Längsmuskel des Kolons des Pferdes antworteten während elektrischer

Feldstimulation fast ausschließlich mit einer Hemmung (Abb. 8). Gegenüber der vor der EFS vorhandenen Motilität wurde während der EFS der Motilitätsindex des Zirkulärmuskels um 92 % und der Motilitätsindex des Längsmuskels um 94 % signifikant verringert (Tab. 3). Nur ein Kolon-Längsmuskelpräparat zeigte eine kontraktile Antwort und wurde nicht mit in die statistische Auswertung einbezogen. Die Dauer der hemmenden Antwort betrug

11,8±1,3 Sekunden im Zirkulärmuskel und 11,4±0,5 Sekunden im Längsmuskel (Tab. 3) und war damit nur geringfügig länger als die Feldstimulation selbst (10 sek). Die primäre Wirkung trat also während der elektrischen Feldstimulation auf. Zirkulär- und Längsmuskel des Kolons unterschieden sich in ihrer Antwort auf elektrische Feldstimulation nicht (Tab. 3). Die

Motilitätsparameter erreichten nach 48,6±35,8 Sekunden im Zirkulär- und nach 30,8±13,9 Sekunden im Längsmuskel wieder prä-Stimulus-Kontrollwerte. In diesem Zeitintervall nach der elektrischen Feldstimulation konnte sich der Motilitätsindex im Vergleich zur Kontrolle vor elektrischer Feldstimulation wie folgt verändern: Im Zirkulärmuskel wurde der

Motilitätsindex in 9 Präparaten um 193 % erhöht. In 4 Präparaten verringerte sich der Motilitätsindex um 12 % und in 2 Präparaten blieb der Motilitätsindex nach der elektrischen Feldstimulation unverändert. Im Längsmuskel kam es in 9 Präparaten zu einer Erhöhung des Motilitätsindex um 87 % und in 2 Präparaten zu einer Verringerung des Motilitätsindexes um 13 %.

Abbildung 3: Beispiel einer

„off-Antwort“ nach elektrischer Feldstimulation (EFS) des Jejunum- Zirkulärmuskels. Der Balken

markiert die Dauer und die vertikale gestrichelte Linie kennzeichnet das Ende der EFS. Die „off-Antwort“ ist die Steigerung der Kontraktions- amplitude sofort nach Ende der elektrischen Feldstimulation ( ).

EFS (10 sek)

„off-Antwort“