Mechanismus und physiologische Bedeutung der MalK-vermittelten Repression des
Escherichia coli Maltose Regulons
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)
im Fachbereich Biologie der mathematischnaturwissenschaftlichen Sektion der Universität Konstanz
vorgelegt von:
Alexander Böhm
Tag der mündlichen Prüfung: 8. November 2002 1. Referent: Prof. Dr. Winfried Boos
2. Referent: Prof. Dr. Michael Ehrmann 3. Referent: Prof. Dr. Erhard Bremer
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Das Escherichia coli Maltosesystem besteht aus 10 Proteinen, die der Aufnahme und der Verwertung von Maltodextrinen dienen. Die Gene des Maltosesystems stehen unter Kontrolle des zentralen Aktivators MalT, der für die Transkription aller mal Gene essenziell ist. Durch Bindung des Induktors Maltotriose wird MalT von einer inaktiven in eine aktive Form überführt und stimuliert die Transkription des mal Regulons. Dem entgegen wirken eine Reihe von Proteinen, die die Expression der Maltosegene inhibieren.
Eines dieser Proteine, MalK, ist die ATPase-Untereinheit des Maltodextrin-ABC- Transporters und selbst Teil des Maltosesystems. In dieser Arbeit wurden Studien zum Mechanismus und zur physiologischen Bedeutung der MalK-vermittelten Regulation des mal Regulons durchgeführt. Es wurde gezeigt, dass die MalK-vermittelte Repression auf einer Inhibition der MalT-Aktivität beruht. Darauf basierend wurden zwei Modelle zur Regulation des Maltosesystems gegenübergestellt. Darüber hinaus wurden Aspekte der Inducer Exclusion, des Transportmechanismus von ABC-Transportern und der Quartärstruktur von ABC-Transportern behandelt:
Eine Reihe von MalK Punktmutanten wurden isoliert, die spezifisch in ihrer Fähigkeit MalT zu inhibieren, gestört sind. Es wird postuliert, dass diese Mutanten eine verminderte Affinität von MalK zu MalT aufweisen. An Hand eines 3D-Modell des E. coli MalK Proteins wurde gezeigt, dass die Reste, die in diesen MalK Mutanten verändert sind, die MalT-Interaktionsstelle auf der Oberfläche der sogenannten regulatorischen Domäne von MalK definieren. Das 3D-Modell wurde weiterhin benutzt um bereits beschriebene Mutanten in einen strukturellen Kontext zu setzen. Dadurch wurden wichtige Beiträge zum Verständnis des Mechanismus der Inducer Exclusion und der Assemblierung von ABC- Transportern geleistet. Weiterhin wurden konservierte Sequenzmotive in der regulatorischen Domäne von ABC-Transportern entdeckt. Punktmutationen in diesen sogenannten "Regulatory Domain Motifs" von MalK führen zu einem transportnegativen Phänotyp der betroffenen Mutanten, der auf einer starken Verminderung der ATPase Aktivität beruht. Das ist ein Hinweis darauf, dass die regulatorische Domäne eine Rolle für die ATPase-Aktivität von MalK spielt. Dies ist bemerkenswert, da die regulatorische Domäne nur in einer Untergruppe aller prokaryotischen ABC-Transporter vorkommt und bisher angenommen wurde, dass alle ABC-Transporter den gleichen ATP-Hydrolyse- Mechanismus aufweisen.
In einer Reihe von in vitro Studien konnte bestätigt werden, dass MalK in Anwesenheit von ATP die MalT-Aktivität durch direkte Wechselwirkung inhibiert. Es wurden Hinweise gefunden, dass MalK in Anwesenheit von ADP zu einer Stimulation der MalT-Aktivität führt und dass MalT nicht nur mit cytoplasmatisch lokalisiertem MalK, sondern auch mit MalK im assemblierten Maltodextrin-ABC-Transporter interagiert. Dies ist konsistent mit einem neuen Modell der mal Genregulation: Dieses Modell besagt, dass die Bindung von Maltotriose zwar eine Vorraussetzung für MalT-Aktivität ist, die eigentliche Stimulation von MalT und damit die mal Genregulation aber durch die Transportrate des Maltodextrin- ABC-Transporters gesteuert wird.
Danksagung
Danksagung
Besonders herzlich danken möchten ich meinem Betreuer Winfried Boos. Er stand immer für Diskussionen zur Verfügung, wie abwegig die Themen auch gewesen sein mögen.
Wenn dabei einmal mehr eine "brillante" Idee herauskam, konnte er auf Grund seiner eigenen Neugier auch sehr motivierend wirken, was sich darin äußerte, das er sich bereits am nächsten Tag nach ersten Ergebnissen erkundigte.
Besonderer Dank gilt auch den Koautoren des "MalK Papers" (Böhm et al., 2002):
Wolfram Welte, mit dem ich unzählige neue Ideen zum Themenkomplex "ABC- Transporter" diskutieren konnte, Kay Diederichs, ohne den das 3D-Modell von E. coli MalK nie Zustande gekommen wäre, und Joachim Diez, ohne den die Abbildungen des E. coli MalK Modells nie Zustande gekommen wären. Andre Schiefner (AG Welte) möchte ich für das BtuD-artige MalK Modell danken. Weiterer Dank gilt Howie Shuman, in dessen Labor an der Columbia University einige Experimente in dieser Arbeit, während eines Aufenthalts 1999 ihren Ursprung nahmen, und Evelyne Richet und ihren Mitarbeitern am Institut Pasteur, die einige in vitro Experimente zur MalT-MalK Interaktion durchgeführt und gereinigtes MalT Protein beigesteuert haben. Martin Bastmeyer danke ich sehr dafür, dass er mich in die Geheimnisse des Fluoreszenzmikroskops eingewheit hat.
Dank gilt auch allen ehemaligen und aktuellen Mitgliedern der AG Boos, deren Namen im einzelnen aufzuzählen diesen Rahmen sprengen würde. Hervorzuheben sind allerdings Pari, Ralf Peist, Michael Ehrmann und Christoph Mayer, die mich besonders unterstützt haben. Ein dickes Dankeschön auch an Vera, die trotz der Dauer dieser Dissertation immer an mich geglaubt hat und dafür gesorgt hat, dass diese Arbeit der deutschen Sprache gerecht wird.
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Deckblatt... 1
Zusammenfassung... 3
Danksagung ... 5
Inhaltsverzeichnis... 6
Abbildungen und Tabellen ... 9
1 Einleitung... 12
1.1 Genregulation in Bakterien ... 12
1.2 Die Proteine des Escherichia Coli Maltosesystems ... 15
1.3 Regulation des mal Regulons... 23
1.4 Das Ugp -System... 30
1.5 Fragestellung und Zielsetzung ... 31
2 Material und Methoden ... 32
2.1 Wachstumsbedingungen, Medien und ihre Zusätze ... 32
2.2 Konstruktion bakterieller Stämme... 33
2.3 Der malK-gfp Stamm AB813 und sein malF::Tn10 malTc Derivat AB822 ... 33
2.4 Der gfp-malT Stamm AB817 ... 34
2.5 Der ugpC Deletionsstamm AB25... 35
2.6 Der Teststamm für Ugp-System-abhängige G-3-P Aufnahme AB495 ... 35
2.7 Der Teststamm für die MalK-MalT Interaktion AB64... 36
2.8 Transformationen ... 38
2.9 Ungerichtete in vivo Mutagenese ... 38
2.10 Screening nach MalKReg-Mutanten... 38
2.11 Klonierungen und molekularbiologische Techniken... 39
2.12 PCR... 40
2.13 Fusions-PCR... 40
2.14 Gerichtete in vitro Mutagenese ... 41
2.15 Das malK Plasmid pMR11... 42
2.16 Das malK Plasmid pAB204 ... 42
2.17 Das malK Plasmid pAB201 ... 43
2.18 Das malT Plasmid pAB270 ... 44
2.19 Das ugpC::cat Plasmid pAB60... 44
2.20 Das malFG Plasmid pAB280... 45
2.21 Das malK-gfp Plasmid pAB78 ... 45
2.22 Das gfp-malT Plasmid pAB131... 46
2.23 Das ugpC´ ´malK Plasmid pAB101... 46
2.24 Die ugrK Plasmide pAB205 bis pAB209 ... 47
2.25 β-Galaktosidase Messungen... 50
2.26 SDS Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Western Blot ... 50
2.27 ATPase Assay... 51
2.28 Zellfraktionierungen ... 51
2.29 Überexpression des MalFGK2 Komplexes ... 52
2.30 Proteinbestimmung ... 53
Inhaltsverzeichnis
2.36 Modellierung der E. coli MalK Struktur ... 55
2.37 Graphische Darstellung von Proteinmodellen... 56
2.38 Mikroskopische Aufnahmen ... 56
3 Ergebnisse ... 58
3.1 Mutationen, die zu einem regulationsnegativen Phänotyp führen, fallen in vier verschiedene Regionen der MalK Sequenz... 58
3.2 Regulationsnegative Mutanten besitzen zwischen 10% und 50% der wt Repressoraktivität ... 59
3.3 Die C-terminalen 156 Aminosäuren von E. coli MalK tragen die Repressorfunktion ... 60
3.4 Ein in vivo Testsystem für die MalK-MalT Interaktion... 60
3.5 Die MalKReg Varianten scheinen in vivo eine verminderte Affinität für MalT aufzuweisen... 62
3.6 Homologie-Modell der Tertiärstruktur von E. coli MalK... 65
3.7 Ein multiples Sequenzalignment von 60 ABC Untereinheiten identifiziert konservierte Bereiche in der regulatorischen Domäne ... 65
3.8 Die Sekundärstrukturvorhersage für T. litoralis und E. coli MalK ist identisch... 66
3.9 E. coli MalK und T. litoralis MalK haben die gleiche Tertiärstruktur ... 68
3.10 Die MalT-Bindestelle ist auf der von der ATPase-Domäne abgewandten Seite der regulatorischen Untereinheit von MalK lokalisiert ... 70
3.11 Mutationen, die zu einem regulationsnegativen Phänotyp führen, können mit Hilfe des E. coli MalK Modells vorhergesagt werden. ... 72
3.12 Die EIIAGlc Interaktionsstelle ist auf einer Oberfläche der regulatorischen Untereinheit lokalisiert, die im rechten Winkel zur ATPase-Domäne liegt. ... 73
3.13 Die Regulatory Domain Motive stellen ein Kommunikationsmodul zwischen regulatorischer- und ATPase-Domäne dar und spielen eine Rolle beim Transportprozess. ... 74
3.14 Aminosäuren, die direkt mit MalF/G interagieren, formen eine tunnelartige Struktur und sind im T. litoralis MalK-artigen E. coli MalK Dimer nicht zugänglich... 76
3.15 MalK assoziiert MalF/G-abhängig und gleichmäßig verteilt mit der Membran ... 77
3.16 Die "MalK-cycle"-Hypothese ist falsch... 79
3.17 Die "MalT-cycle"-Hypothese lässt sich mit der GFP-Fusionstechnik weder bestätigen noch widerlegen ... 79
3.18 Die "MalT-cycle"-Hypothese lässt sich auch mit Zellfraktionierungen weder beweisen noch widerlegen ... 80
3.19 MalK lässt sich mit Hilfe von Ni2+-Affinitäts-Chromatographie in einem Schritt reinigen ... 80
3.20 Reines MalK bildet in vitro lösliche Proteinaggregate mit Molekulargewichten über 2000 kDa ... 81
3.21 Die MalK Aggregate besitzen volle ATPase Aktivität ... 81
3.22 MalT wird in vitro von ATP-MalK inhibiert und von ADP-MalK stimuliert ... 82
3.23 Die DNA-Bindung von MalT und MalTc wird durch Membranvesikel, die den MalFGK2 Komplex enthalten, verhindert. ... 84
3.24 Die Inhibition des Bandshifts lässt sich durch 100µM Maltotriose nicht überkommen... 85
3.25 Chimären zwischen UgpC und MalK (UgrK) transportieren kein G-3-P, sind aber als mal Gen Repressor aktiv... 86
4 Diskussion ... 92
4.1 3D-Modell der E. coli MalK Struktur... 92
Inhaltsverzeichnis
4.2 Regulatory Domain Motifs und die Rolle der regulatorischen Domäne ... 93
4.3 Mechanistik der transportgesteuerten Genregulation des E. coli mal Regulons... 96
4.4 Transportgesteuerte Genregulation des E. coli mal Systems: Warum?... 101
4.5 Transportgesteuerte Genregulation: Ein generelles Prinzip?... 102
4.6 Die MalT-Bindestelle und Signaltransduktion des MalFGK2-Komplexes... 103
4.7 MalT besitzt drei unterschiedliche Bindestellen für MalK, Aes und MalY. ... 105
4.8 Ein alternatives MalK Dimer: Interaktion mit MalF/G, Interaktion mit MalT und Inducer Exclusion... 105
4.9 EIIAGlc Bindestelle und Mechanismus der Inducer Exclusion... 109
5 Literaturverzeichnis... 111
Abkürzungen... 122
Abbildungsverzeichnis
Abbildungen und Tabellen
Abbildung 1.1... 14
PTS, Katabolitrepression und Inducer Exclusion... 14
Abbildung 1.2 Modell des Maltodextrintransports über die Cytoplasmamembran ... 18
Abbildung 1.3 Schema des Maltodextrin-Stoffwechsels... 22
Abbildung 1.4 Genetische Organisation des Maltose-regulons... 24
Tabelle 2.1 Medienzusätze und ihre Konzentrationen ... 32
Abbildung 2.1 Kointegration von pAB78 in Bre1162. ... 34
Abbildung 2.2 pAB60... 35
Tabelle 2.2 Benutzte Bakterienstämme ... 37
Abbildung 2.3 Fusions-PCR ... 41
Abbildung 2.4 pMR11 ... 42
Abbildung 2.5 pCJ30 und sein Derivat pAB204... 43
Abbildung 2.6 pAB270... 44
Tabelle 2.3 Plasmide und ihre relevanten Eigenschaften ... 48
Tabelle 2.4 Primer. ... 49
Tabelle 3.1 Mutationen in malK, die zu einem MalKReg Phänotyp führen. ... 59
Abbildung 3.1 Western Blot von MalKReg Mutanten im Vergleich zum Wt ... 59
Abbildung 3.2 Residuale Repressoraktivität der MalKReg-Mutanten im Vergleich zum WT. ... 60
Abbildung 3.3 Effekt verschiedener MalK Varianten auf eine malK-lacZY Fusion bei unterschiedlichen Induktorkonzentrationen. ... 62
Tabelle 3.2 Blaufärbung von AB64 malK Mutanten bei unterschiedlichem malT bzw. malK Expressionslevel. ... 64
Abbildung 3.4 Sequenzalignment zwischen E. coli und T. litoralis MalK. ... 67
Abbildung 3.5 Ribbondarstellung des E. coli MalK Dimers. ... 69
Abbildung 3.6 Ribbondarstellung der ATPase-Domäne des Theli_MalK-artigen E. coli MalK Dimers. ... 69
Tabelle 3.3 Zusammenfassung aller in dieser Arbeit beschriebenen malK Mutationen. .... 70
Abbildung 3.7 Die MalT-Bindestelle. ... 71
Abbildung 3.8 Residuale Repressoraktivität von MalKReg-Mutanten, die durch strukturgerichtete Mutagenese erzeugt wurden... 72
Abbildung 3.9 Western Blot von MalK Mutanten, die durch strukturgerichtete Mutagenese erzeugt wurden. ... 73
Abbildung 3.10 Die EIIAGlc-Bindestelle... 74
Abbildung 3.11 Die Regulatory Domain Motive... 75
Abbildung 3.13 Die Inter-aktionsstelle mit MalF/G im Theli_MalK-artigen Dimer... 77
Abbildung 3.14 Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von MalK-GFP produzierenden Stämmen... 78
Abbildung 3.15 Coomassie gefärbtes SDS-Gel einer typischen MalK-Reinigung. ... 80
Abbildung 3.16 Abortive Transcription Initiation Assay ... 83
Abbildung 3.17 Bandshift Assay mit 10µM Maltotriose. ... 85
Abbildung 3.18 Bandshift Assay mit 100µM Maltotriose. ... 86
Abbildung 3.19 MalK-UgpC-Alignment und Fusionspunkte der verschiedenen UgrK Chimären ... 88
Abbildung 3.20 Linearisierte Darstellung von pAB101... 89
Abbildung 3.21 Agarosegel von "gepoolten" pAB101 Deletionsmutanten. ... 90
Abbildunsgverzeichnis
Abbildung 4.1 Schematische Darstellung der "MalT" bzw. "DNA"-cycle Modelle ... 100 Abbildung 4.2 Das BtuD-artige Dimer von E. coli MalK und die Lokalisation der
verschiedenen Mutationen. ... 107
Einleitung
"Perhaps the most important principle to emerge out of the study of gene expression is that
general principles do not exist"
Aus Beckwith, J., und T. Silhavy. 1992.
"The Power of Bacterial Genetics".
Einleitung
1 Einleitung
1.1 Genregulation in Bakterien
Die Fähigkeit, Gene differenziell zu exprimieren und so die Proteinausstattung der Zelle wechselnden Umweltbedingungen optimal anpassen zu können, ist essenziell für alle Bakterienarten, die mit variablen Lebensräumen konfrontiert werden. Nur durch effektive Adaptation können sie im harten Wettbewerb um die oft knappen Ressourcen mithalten und ihren Platz in der jeweiligen Nische verteidigen. Einige Jahre nachdem Beadle und Tatum 1941 (Beadle und Tatum, 1941) ihre ein-Gen-ein-Enzym Hypothese aufgestellt und damit die erste molekulare Definition für das Gen geliefert hatten, konnten Monod und Torriani mit ihrer Arbeit an der E. coli Amylomaltase zeigen, dass Proteinaktivität induzierbar ist (Monod und Torriani, 1948). 1959 lieferten (Pardee et al., 1959) am Beispiel der β-Galaktosidase eine Erklärungsmöglichkeit für diese Induktion: Die Genregulation. 1961 schließlich stellten Jacob und Monod ihr berühmtes Operonmodell vor (Jacob und Monod, 1961), das noch heute als Paradigma der Genregulation gilt. Am Beispiel des E. coli lac-Operons definierten sie die Begriffe Promotor, Operator und Repressor und postulierten, dass ein Repressorprotein an die Operatorsequenz bindet und erst nach Interaktion mit einem Induktor die Transkription vom Promotor freigibt. Nach dieser Pionierarbeit erlebte das Feld der Genregulations-Forschung einen Boom, der bis heute andauert. Doch schon bald wurde klar, dass das einfache Modell von Jacob und Monod nur die Spitze des Eisbergs der molekularen Mechanismen ist, die differenzielle Genexpression ausmachen.
Eines der nächsten Modellsysteme, das für Aufsehen sorgte, war das E. coli Arabinosesystem, das im Gegensatz zum lac-Operon sowohl negativ als auch positiv reguliert wird (Englesberg und Wilcox, 1974; Schleif, 1996). Das erste System, von dem angenommen wurde, dass es unter rein positiver Kontrolle steht, war das E. coli Maltosesystem (Hofnung, 1974; Schwartz, 1967). In den 60er und 70er Jahren ging man noch davon aus, dass diese drei Paradigmen der Genregulation auf einer einfachen negativen oder positiven Rückkopplungsschleife beruhten und das Regulatorprotein zugleich der Sensor für die Präsenz des jeweiligen Zuckers war.
Einleitung
(Yanofsky, 2000) zusammensetzen. Diese Systeme messen die unterschiedlichsten Umweltparameter, verarbeiten und integrieren die Informationen über zum Teil mehrstufige Signaltransduktions-Kaskaden und ermöglichen dadurch eine optimale Adaptation der Zelle an die aktuellen Bedingungen (Hellingwerf et al., 1995; Hulett, 1996;
Smolen et al., 2000; Stock et al., 2000).
Eines der prominentesten und am besten untersuchten globalen Systeme ist das Netzwerk, das für das Phänomen der Katabolitrepression in E. coli verantwortlich ist. Bei der Katabolitrepression wird die Aufnahme einer bestimmten Kohlenstoffquelle (z.B. Xylose) und die Expression der dafür notwendigen Gene durch das Vorhandensein einer anderen, bevorzugten Kohlenstoffquelle (z.B. Glucose) solange unterdrückt, bis diese aufgebraucht ist. Die kurze "lag-phase" in der Wachstumskurve, die während der Änderung der enzymatischen Ausstattung auftritt, wenn die Konzentration des bevorzugten Zuckers unter einen bestimmten Schwellenwert sinkt, wurde bereits in den 40er Jahren von Monod während seiner Doktorarbeit beschrieben und von ihm diauxisches Wachstum oder kurz Diauxie genannt (Monod, 1942). Er hatte schon damals beobachtet, dass Diauxie nur bei bestimmten Kombinationen von Zuckern, wie z.B. Glucose und Xylose, nicht jedoch bei anderen, etwa Maltose und Xylose auftritt; erklären konnte er dieses Phänomen aber zunächst nicht.
Heute versteht man die molekularen Mechanismen, die der Diauxie zu Grunde liegen, besser. So ist inzwischen klar, dass Katabolitrepression von Zuckern ausgeübt wird, die über das Phosphoenolpyruvat-Phosphotransferase-System (PTS) aufgenommen werden.
Dieses System fungiert gleichzeitig als Zuckertransport- und Signaltransduktions-System.
Es setzt sich aus vielen verschiedenen substratspezifischen, innenmembranständigen Proteinen (die Enzyme II, oder EIIs) und einigen cytoplasmatischen, nur zum Teil substratspezifischen Proteinen (EnzymI oder EI, HPr und EIIAGlc) zusammen (Abb. 1.1).
Die zentralen cytoplasmatischen Proteine EI, HPr und EIIAGlc übertragen Phosphatgruppen von Phosphoenolpyruvat über eine Reihe von Phosphoryltransfer-Reaktionen auf die membranständigen Proteine. Diese Phosphorylierung ermöglicht den membranständigen EII Proteinen die Translokation eines Zuckermoleküls über die Innenmembran, wobei die Phosphatgruppe auf den transportierten Zucker übergeht (Roseman und Meadow, 1990).
Die Enzyme II bestehen aus den Domänen EIIA, EIIB und EIIC, die entweder Teile eines Polypeptids oder Untereinheiten eines heterodimeren bzw. heterotrimeren Komplexes sein können. Eine besondere Rolle für die Signaltransduktion durch das PTS spielt das lösliche
Einleitung
EIIAGlc. EIIAGlc ist für den Transfer von Pi-Gruppen auf eine Reihe von EIIs verantwortlich, darunter auch das glucosespezifische EIICBGlc. Wenn Phosphattransfer zur Glucose stattfindet, wird das Gleichgewicht zwischen unphosphoryliertem EIIAGlc und phosphoryliertem EIIAGlc (EIIAGlc-P) zu Gunsten der unphosphorylierten Form verschoben.
Diese Form des Proteins interagiert direkt mit vielen nicht-PTS-Transportern (z.B. ABC- Transportern, oder Protonensymportern) und inhibiert deren Aktivität. Dieser sogenannte Induktorausschluss (engl. Inducer Exclusion) verhindert, dass nicht-PTS Systeme induziert werden, solange genügend Glucose aufgenommen werden kann (Abb. 1.1).
Abbildung 1.1
PTS, Katabolitrepression und Inducer Exclusion.
Die Proteine des PTS, der Maltose- und Xylosetransporter, sowie die Adenylatcyclase (Cya) und das Catabolite activator protein (CAP) sind dargestellt. Pfeile mit "+" oder
"-" Zeichen symbolisieren einen aktivierenden, bzw. inhibierenden Einfluss. PEP=Phosphoenolpyruvat;
Pyr=Pyruvat; cAMP=cyclisches AMP; Mal=Maltose; Xyl=Xylose;
Glc=Glucose; "P" = Phosphat.
Doch EIIAGlc beeinflusst nicht nur die Transportaktivität der Nicht-PTS Systeme, sondern in vielen Fällen auch die Transkription ihrer jeweiligen Gene: Nimmt die Zelle keine PTS- Zucker auf, so stimuliert EIIAGlc-P die Adenylatcyclase (Cya), die aus ATP cyclisches AMP (cAMP) bildet. cAMP ist ein wichtiger Botenstoff, der durch den Transkriptionsfaktor CAP (Catabolite Activator Protein) gebunden wird und so die Transkription vieler Regulons ermöglicht, die der Aufnahme bzw. der Verstoffwechslung verschiedener Substrate dienen. Dazu gehören z.B. die mal, lac und xyl Regulons. Durch
Einleitung
cAMP/CAP stehen, werden nur schwach oder gar nicht transkribiert (Postma et al., 1996;
Roseman und Meadow, 1990) (siehe Abb. 1.1).
Gegenstand dieser Arbeit ist ein weiteres Paradigma der Genregulation: Das E. coli Maltosesystem. Trotz der über 40 Jahre währenden Forschung an diesem Regulon ist es bis heute nicht gelungen, alle regulatorischen Phänomene und ihre physiologische Bedeutung aufzuklären.
1.2 Die Proteine des Escherichia Coli Maltosesystems
Das E. coli Maltosesystem besteht aus 10 Proteinen, die der Aufnahme und dem Abbau von Maltodextrinen (α(1→4) verknüpften Glucoseoligomeren) dienen. Die Endprodukte des Maltodextrinstoffwechsels, Glucose (Glc) und Glucose-1-Phosphat (Glc-1-P), werden durch Glucokinase (Glk) bzw. Phosphoglucomutase (Pgm) in Glucose-6-Phosphat (Glc-6-P) überführt und anschließend in der Glycolyse weiter verstoffwechselt. Während kurze Maltodextrine (Maltose und Maltotriose), zumindest wenn sie in hohen Konzentrationen vorliegen, auch über generelle Porine in den periplasmatischen Raum gelangen können, ist die Aufnahme längerer Maltodextrine von Maltoporin abhängig.
Maltoporin wird vom lamB Gen kodiert - diese Nomenklatur hat historische Gründe, denn LamB ist gleichzeitig der Rezeptor für den Bakteriophagen λ. Die Kristallstruktur von Maltoporin zeigt ein in der Außenmembran residierendes, rotationssymmetrisches Homotrimer. Jedes Monomer besteht aus einem 18-strängigen antiparallelen β-Barrel (Schirmer et al., 1995). Nach der Substratbindung an einer extrazellulären Subdomäne, diffundieren Maltodextrine in einem oberflächenadsorbierten Zustand über eine sogenannte "greasy slide" durch Maltoporin. LamB bildet also keinen wassergefüllten Kanal: Vielmehr sorgt die "Auskleidung" der Pore mit aromatischen Aminosäureresten, die eine hydrophobe Wechselwirkung mit Maltodextrinen eingehen können, für das
"hineinrutschen" des Substrats (Dutzler et al., 1996; Klebba und Newton, 1998; Van Gelder et al., 2002).
Während die Translokation über die Außenmembran ein Diffusionsprozess ist, wird der Transport über die Innenmembran durch einen hochaffinen, bindeproteinabhängigen ABC-Transporter (ATP-Binding-Cassette-Transporter) unter Verbrauch von ATP katalysiert. ABC-Transporter sind molekulare Maschinen, die im Allgemeinen dem Im- oder Export verschiedenster Substratgruppen über biologische Membranen dienen. Sie kommen in allen Lebewesen vor und sind die größte bekannte Proteinsuperfamilie (Saurin
Einleitung
et al., 1999). Ihr Aufbau ist modular und sie bestehen immer aus zwei transmembranösen, Dimer-bildenden Domänen, deren Konservierungsgrad relativ gering ist; und zwei peripher assoziierten ATPasen, die zueinander homolog sind und deren Konservierungsgrad selbst zwischen wenig verwandten Organismen sehr hoch ist. Die verschiedenen Domänen können als einzelnes Polypeptid (häufig in Eukaryoten), oder in Form mehrerer komplexbildender Polypeptide vorliegen. In prokaryotischen Importern gibt es noch eine weitere Komponente: das Bindeprotein. Bindeproteine dienen der anfänglichen Substratbindung, sind während des Transportvorgangs nur vorübergehend mit den übrigen Komponenten assoziiert und liegen in großer Anzahl im extracytoplasmatischen Milieu vor. In grampositiven Bakterien und Archaeen, die keine Außenmembran besitzen, sind Bindeproteine häufig über Lipid-, oder Peptidanker in der Cytoplasmamembran verankert, während Bindeproteine in gramnegativen Bakterien frei im Periplasma vorliegen. (siehe auch Abb. 1.2)
Der Maltodextrin ABC-Transporter besteht aus 4 verschiedenen Polypeptiden, die zusammen den MalEFGK2 Komplex bilden: ein Heteropentamer aus jeweils einer Kopie der beiden porenbildenden Proteine MalF und MalG, zwei Kopien der ATPase- Untereinheit MalK und dem periplasmatischen Maltosebindeprotein MBP (auch MalE genannt, da es von malE kodiert wird). Während des Transportvorgangs werden Maltodextrine zunächst von MBP (43 kDa) im Periplasma gebunden. MBP hat eine hohe Affinität für Maltodextrine (Kd für Maltose ca. 1µM) und liegt, wenn das Maltosesystem voll induziert ist, in großer Kopienzahl (ca. 10 5 Moleküle/Zelle) im Periplasma vor. Diese beiden Eigenschaften des Maltosebindeproteins gewährleisten auch bei geringsten Maltodextrinkonzentrationen eine effiziente Aufnahme. Die Kristallstruktur von MBP ist typisch für periplasmatische Bindeproteine: Ein achsensymmetrischer Ellipsoid, der aus einer N-terminalen und einer C-terminalen globulären Domäne besteht. Beide Hälften sind aus drei zentralen β-Faltblättern und mehreren peripheren α-Helices aufgebaut. Zwischen den beiden Domänen liegt in einer zentralen Grube die Substratbindestelle, die vorwiegend aus aromatischen oder polaren Resten besteht. Hier können Maltodextrine sowohl über Van der Waals Kräfte als auch über Wasserstoffbrückenbindungen an das Protein binden (Spurlino et al., 1991). Kommt es zu solch einer Bindung, schnappt das zunächst in einer
Einleitung
interagieren und Maltosechemotaxis vermitteln (Bray, 2002; Gardina et al., 1997;
Hazelbauer, 1975), als auch mit den beiden transmembranösen Proteinen MalF und MalG.
MalF und MalG liegen als Heterodimer in der Innenmembran vor und bilden die Pore des Maltosetransporters. Die beiden Proteine sind zueinander homolog und bilden 8 (MalF) bzw. 6 (MalG) transmembranöse Helices aus, wobei die N- und C-Termini jeweils im Cytoplasma liegen. MalF bildet einen großen periplasmatischen Loop zwischen den membranspannenden Segmenten (MSS) 3 und 4, während MalG einen großen Loop zwischen MSS1 und 2 ausbildet (Ehrmann et al., 1998). Beim Andocken von substratbeladenem MBP an dieses Dimer interagiert die C-terminale Domäne von MBP mit MalF und die N-terminale Domäne mit MalG. Dadurch kommt es zu einer Konformationsänderung und die beiden Domänen von MBP öffnen sich wieder und entlassen das Substrat in den Kanal. Nach einem Modell wird die Energie für diese Konformationsänderung durch Bindung von ATP an MalK auf MalF/G übertragen und gespeichert bis es zur Interaktion mit substratbeladenem Bindeprotein kommt (Abb. 1.2) (Davidson, 2002; Diederichs et al., 2000). Jeweils eine MalK Untereinheit des MalFGK2- Komplexes ist über das hochkonservierte EAA Sequenzmotiv (Konsensussequenz: EAA- 3X-G-9X-I-X-LP), dass in einem großen cytoplasmatischen Loop zwischen MSS 6 und 7 (MalF), bzw. MSS 4 und 5 (MalG) liegt, an die membranspannenden Proteine assoziiert (Mourez et al., 1997).
MalK ist ein typischer Vertreter der ABC-Typ ATPasen (oder traffic ATPasen) und bindet ATP über die hochkonservierten Walker A (auch als P-loop bezeichnet) und Walker B Sequenzmotive. Während die Walker Motive in vielen verschiedenen ATP-bindenden Proteinen vorkommen, sind eine Reihe anderer Sequenzmotive, wie z.B. das Signature-, Lid-, oder das Switch Motiv (siehe auch Abb. 3.6) charakteristisch für ABC-Typ ATPasen und spielen vermutlich eine spezifische Rolle bei der ATP-Hydrolyse oder bei der Übertragung der ATP-Hydrolyse- bzw. ATP-Bindeenergie auf MalF/G (Hung et al., 1998;
Schneider und Hunke, 1998; Walker et al., 1982). Die ATP Hydrolyse durch die beiden MalK Untereinheiten zeigt positive Kooperativität (Hill Koeffizient n=1,7) (Davidson et al., 1996) und hängt vom Kofaktor Magnesium ab. Und es wird angenommen, dass MalK auch in Abwesenheit von MalF/G in vivo dimerisiert (Kennedy und Traxler, 1999).
Ein schematisches Modell des Maltodextrintransports über die Cytoplasmamembran ist in Abbildung 1.2 dargestellt.
Einleitung
1. Im nukleotidfreien Zustand liegt der Maltosetransporter in einer geschlossenen Konformation vor. Die transmembranösen Untereinheiten MalF und MalG verschließen den Kanal zum Periplasma hin. Die beiden MalK Untereinheiten sind nicht in direktem Kontakt. MBP ist ebenfalls in der offenen Konformation dargestellt.
2. Durch ATP-Bindung kommt es zu einer Konformationsänderung:
Die MalK Untereinheiten treten in direkten Kontakt. Der Kanal wird zum Periplasma hin geöffnet und gleichzeitig zum Cytoplasma verschlossen. Die ATP-Bindungs-Energie wird in Form von konformationeller Energie gespeichert. Der ABC-Transporter ist wie eine Feder gespannt.
MBP ist in der geschlossenen Konformation mit gebundenem Maltodextrin (hier Maltotriose) dargestellt.
3. Durch Andocken von Maltodextrin-beladenem MBP an die beiden periplasmatischen Domänen von MalF/G kommt es zur Freisetzung der gespeicherten Energie und der Kanal öffnet sich. Gleichzeitig verringert MBP seine Affinität für Maltodextrine, und eine Signaltransduktionskaskade triggert die langsame, kooperative ATP Hydrolyse durch die beiden MalK Untereinheiten .
4. Im Übergangszustand der ATP-Hydrolyse bleibt der Kanal geöffnet und das Maltodextrin kann durch den geöffneten, hydrophilen Kanal diffundieren. MBP ist stark an MalF/G gebunden und verschließt so die Pore gegen das Periplasma. Das verhindert die unspezifische Diffusion anderer hydrophiler Substanzen über die Cytoplasmamembran.
5. Das Maltodextrin ist im Cytoplasma angelangt. Die Energie, die durch die ATP-Hydrolyse frei wird, ermöglicht ein Schließen des Kanals an der periplasmatischen Seite. Die beiden MalK Untereinheiten verlieren ihren engen Kontakt. Die freigewordene γ- Phosphatgruppe des ATPs verlässt die nukleotidbindenden Domänen.
MBP wird wieder freigesetzt.
6. MBP ist abdissoziiert. Zum Periplasma ist der Kanal wieder vollständig verschlossen und nach dem Austausch von ADP gegen ATP kann ein neuer Transportzyklus beginnen.
Abbildung 1.2 Modell des Maltodextrintransports über die Cytoplasmamembran
Das hier vorgestellte Modell des Maltodextrintransports wurde in ähnlicher Form erstmals von (Diederichs et al., 2000) vorgeschlagen und konnte später durch Experimente von (Chen et al., 2001) mit Vanadat-inhibiertem Transporter bzw. Experimente mit MJ0769 (Moody et al., 2002)
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In den letzten Jahren wurden die Kristallstrukturen von einer Reihe prokaryotischer ABC- Typ ATPasen gelöst: Vom DNA-reparierenden Enzym Rad50 aus Pyrococcus furiosus (Hopfner et al., 2000), vom Lipidexporter MsbA aus Escherichia Coli (Chang und Roth, 2001), und von zwei Proteinen mit unbekannter Funktion (MJ0796 und MJ1267) aus Methanococcus Jannaschii (Karpowich et al., 2001; Yuan et al., 2001). Von zwei weiteren, zu E. coli MalK in ihrer Sequenz sehr ähnlichen traffic ATPasen gibt es ebenfalls Kristallstrukturen: HisP aus dem Histidintransporter von Salmonella typhimurium (Hung et al., 1998) und MalK aus dem Trehalose/Maltosetransporter des hyperthermophilen Archaeons Thermococcus litoralis (Theli_MalK) (Diederichs et al., 2000). Das relativ kurze HisP (259 Aminosäuren) entspricht der N-terminalen ATPase-Domäne des aus zwei Domänen bestehenden Theli_MalK Proteins (372 Aminosäuren). All diese bislang kristallisierten ABCs, sowie die ATPase-Domäne von Theli_MalK zeigen eine im wesentlichen identische Struktur, die man in drei Teile gliedern kann: Einen zentralen, aus 2 α-Helices und 5 (Theli_MalK) oder 6 (HisP) β-Faltblättern bestehenden Teil, an den sich ein 6-strängiges antiparalleles β-Faltblatt auf der einen Seite und ein rein α-helikaler Teil auf der anderen Seite anschließen. Die zusätzliche C-terminale Domäne von Theli_MalK, die sogenannte regulatorische Domäne, ist über eine kurze Verbindungshelix (Helix 8) mit der N-terminalen Domäne verbunden und gleicht einem hauptsächlich aus β-Faltblättern und einer α-Helix (Helix 9) aufgebauten Fass. HisP wurde mit einem gebundenen ATP- Molekül kristallisiert, und wie erwartet bindet ATP über die Walker A und B Motive, im sowohl aus α-Helices und β-Faltblättern bestehenden Teil.
Wie schon erwähnt liegen Transport-ATPasen generell als Dimere vor. Und tatsächlich wurde in den meisten Publikationen über ABC-Strukturen ein Dimer identifiziert und vorgeschlagen, dass dieses Dimer die in vivo Situation widerspiegelt. Allerdings findet die Dimerisierung der verschiedenen ABCs, trotz der strukturellen Übereinstimmung der jeweiligen Monomere über völlig unterschiedliche Oberflächen statt. HisP z.B. dimerisiert im Kristall über den ausschließlich aus β-Faltblätter bestehenden Teil (β-Faltblätter 1, 4 und 5), was dazu führt, dass die ATP- Bindungsstellen an gegenüberliegenden Seiten des Dimers sind und außerdem nur eine relativ kleine Oberfläche des Proteins dem Solvenz entzogen wird. Theli_MalK hingegen dimerisiert über den gemischten α-helikalen und β- Faltblatt Teil (α-Helices 2 und 4). Dadurch treten die beiden ATP-Bindestellen in Kontakt, was man auf Grund der Kooperativität der ATP-Hydrolyse erwarten würde. Außerdem ist die verborgene Proteinoberfläche ("burried surface area") im Theli_MalK Dimer mit
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2755Å2 fast dreimal größer als im HisP Dimer. Diese und eine Reihe indirekter Hinweise, die u.a. aus Crosslinking Experimenten mit dem MalK Protein aus Salmonella typhimurium stammen (Hunke et al., 2000b), sprechen dafür, dass das von (Diederichs et al., 2000) vorgeschlagene Theli_MalK Dimer, eine physiologisch relevante Situation reflektiert.
Nach der Translokation über die Cytoplasmamembran werden Maltodextrine von drei Enzymen verstoffwechselt, die Endprodukte sind Glucose und Glucose-1-P. Ein zentrales Enzym des Maltodextrinstoffwechsels ist die Amylomaltase MalQ. MalQ (78 kDa) ist eine monomere cytoplasmatische Dextrinyltransferase die Maltodextrine mit einer Kettenlänge von mindestens drei Glucoseeinheiten auf Glucose oder Maltodextrine überträgt. Bei der Reaktion wird zunächst eine glycosidische Bindung des Dextrins gespalten und der reduzierende Anteil (z.B. Glucose) entlassen. Der verbleibende Dextrinylrest bildet mit MalQ einen Dextrinyl-Enzym Übergangszustand, der nur durch den Transfer dieses Rests auf das nicht-reduzierende Ende eines Dextrinakzeptors wieder aufgelöst werden kann. Die Nettogleichung der MalQ-Reaktion lautet:
wobei D und A für Donor bzw. Akzeptor stehen und die Indizes die Anzahl der Glucoseeinheiten symbolisieren (z.B. D3=Maltotriose). Für die MalQ-Reaktion gilt, dass m ≥ 3 und n ≥ 1 sind (Palmer et al., 1976). Aus obiger Gleichung ergibt sich, dass die Anzahl der glycosidischen Bindungen konstant bleibt und das kleinste Substrat (Donor) Maltotriose ist. MalQ ist also ein disproportionierendes Enzym. Nur wenn Produkte dieser Umsetzung durch weitere Enzyme aus dem Gleichgewicht entfernt werden — wie etwa Glucose (m-x=1) durch Glucokinase (Glk) — entsteht ein Fluss von Glucoseeinheiten in Richtung Glycolyse (Abbildung 1.3.). Im strengen Sinn ist Maltose also kein Substrat von MalQ, sondern nur Akzeptor der Transferreaktion. Maltose kann nur deshalb verstoffwechselt werden, weil in der Zelle immer geringe Mengen von intern synthetisierter Maltotriose und evtl. auch längeren Maltodextrinen vorliegen, die als Donor fungieren können und somit Glucose und längere Dextrine aus der MalQ-Reaktion
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entscheidende Rolle bei der Synthese interner Maltodextrine spielen (Decker et al., 1993).
Ein weiteres wichtiges Enzym des Maltodextrinstoffwechsels ist die im Cytoplasma lokalisierte Maltodextrinphosphorylase MalP. MalP (90 kDa) bildet ein Homodimer und spaltet einen Glucoserest vom nicht-reduzierenden Ende der Maltodextrine durch Phosphorylierung. Dabei entsteht α-Glc-1-P. Substrate von MalP sind Maltopentaose oder längere Dextrine. Die Gleichung der MalP-Reaktion lautet:
wobei m ≥ 5 ist und Pi für inorganisches Phosphat steht (O'Reilly et al., 1997). Das entstandene Glc-1-P wird durch Phosphoglucomutase (Pgm) zu Glc-6-P umgewandelt (Lu und Kleckner, 1994), das anschließend in die Glycolyse fließt. MalP entfernt also ständig längere Dextrine aus dem Gleichgewicht der MalQ-Reaktion, gewährleistet durch sein Substratspektrum aber eine ausreichende Konzentration von kurzen Dextrinen, wie Maltotriose und Maltotetraose, die als Primer für die MalQ-Reaktion dienen. Die Kristallstruktur von MalP zeigt ein dimeres α/β Typ Enzym, wobei jedes Monomer zwei Domänen besitzt, die das katalytische Zentrum mit dem Kofaktor Pyridoxal-5´-Phosphat (PLP) umschließen (Watson et al., 1997).
Ein weiteres cytoplasmatisches Enzym, des Maltosesystems ist die Maltodextringlucosidase MalZ. In vitro entfernt MalZ (69 kDa) Glucose vom reduzierenden Ende von Maltotriose oder längeren Dextrinen durch Hydrolyse der glycosidischen Bindung (Tapio et al., 1991). Außerdem zeigt MalZ in vitro eine Cyclodextrinase-Aktivität und kann γ-Cyclodextrin spalten (Peist et al., 1996). Die Reaktionsgleichung für die MalZ-Reaktion lautet:
wobei gilt, dass 7 ≤ m ≥ 3.
Die physiologische Rolle von MalZ ist unklar. γ-Cyclodextrin ist kein Substrat von E. coli, malZ Mutanten zeigen keinen Maltodextrinphänotyp und malQ Mutanten sind nicht in der Lage, auf Maltotriose als alleiniger Kohlenstoffquelle zu wachsen, obwohl durch MalZ Glucose freigesetzt werden sollte. Es wird vermutet, dass dies auf einen toxischen Effekt der entstehenden Maltose, die nicht weiter verstoffwechselt werden kann, zurückzuführen ist (Boos et al., 1996).
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Das vierte katabolische Enzym des Maltosesystems ist die periplasmatische α-Amylase MalS. MalS (74 kDa, ohne Signalsequenz) ist ein monomeres, Ca2+-abhängiges Enzym mit zwei Disulfidbrücken (Spiess et al., 1997) und spaltet Maltodextrine mit einer minimalen Kettenlänge von drei Glucoseeinheiten hydrolytisch (Freundlieb und Boos, 1986). Die MalS-Reaktionsgleichung lautet:
wobei gilt, dass m ≥ 3.
Die physiologische Rolle von MalS ist die Spaltung langer Maltodextrine, die zu groß (> 8 Glucoseeinheiten) für den Transport über die Innenmembran sind, zu kürzeren Dextrinen die transportiert werden können. Wenn große Substrate von MalS umgesetzt werden entsteht bevorzugt Maltohexaose (Freundlieb et al., 1988).
Abbildung 1.3 Schema des Maltodextrin-Stoffwechsels Die Maltodextrinaufnahme und der Maltodextrinstoffwechsel sind schematisch dargestellt.
Details siehe Text.
Pgm=Phosphoglucomutase;
Glk=Glucokinase; F=MalF;
G=MalG; K=MalK.
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besitzen keinen bekannten Phänotyp (Gilson et al., 1986) und MalM zeigt keine signifikante Homologie zu bekannten, oder unbekannten Proteinen. Mit Ausnahme von Vibrio cholera, ist malM in allen bis heute komplett sequenzierten enterobakteriellen Genomen konserviert und kommt auch außerhalb der Enterobakterein vor.
Ein Schema des Maltodextrinstoffwechsels ist in Abbildung1.3 dargestellt.
1.3 Regulation des mal Regulons
Die Transkriptionsaktivierung der mal Gene und die zu Grunde liegenden molekularen Mechanismen stellt eines der am besten untersuchten Modellsysteme für prokaryotische Transkriptions-Initiation dar. Die Gene des mal Systems liegen auf vier verschiedenen loci:
die malA Region bei 76,5 min auf der E. coli Genkarte trägt das malPQ Operon und divergent dazu das Gen für den zentralen Transkriptionsaktivator MalT, der selbst nicht zum mal Regulon gehört, aber essenziell für die Transkription aller Maltosegene ist. In der malB Region bei 91,4 min liegen alle Gene, die für Transportproteine kodieren, in den beiden divergent transkribierten malEFG bzw. malK-lamB-malM Operonen. malZ und malS sind außerhalb der malA bzw. malB Region und liegen bei 9,2 bzw. 80 min. Die Organisation der mal Gene sowie einige Regulationsmechanismen sind in Abbildung 1.4 dargestellt.
Der zentrale Faktor für der Regulation des Maltosesystems ist das MalT Protein. MalT ist mit einem Molekulargewicht von 103 kDa ein für Prokaryoten ungewöhnlich großer Transkriptionsfaktor. Schon früh wurde postuliert, dass MalT in einem Gleichgewicht zwischen einer inaktiven und einer aktiven Form in der Zelle vorkommt, und dass die Bindung eines damals unbekannten Induktors zu einer Verschiebung dieses Gleichgewichts in Richtung der aktiven Form führt. Aktives MalT sollte dann an spezifische Operatoren binden und so die Transkription stimulieren (Schwartz, 1987).
Eine Klasse von Punktmutationen in malT, die zu einer Konstitutivität der mal Gene führt, war eines der stärksten Argumente für diese Modell. Von diesen sogenannten malTc Mutanten wurde angenommen, dass MalT entweder unabhängig vom Induktor aktiv wird oder eine erhöhte Affinität für den Induktor besitzt. Kurze Zeit später konnte gezeigt werden, dass Maltotriose dieser Induktor ist (Kd~ 20µM) und dass für volle Aktivität von MalT außerdem die Bindung, jedoch nicht die Hydrolyse von ATP (Kd~ 0,4 µM ) notwendig ist (Dardonville und Raibaud, 1990; Raibaud und Richet, 1987; Richet und Raibaud, 1987) (Abb. 1.4). In jüngster Zeit konnte gezeigt werden, dass mit der Bindung von Maltotriose eine Oligomerisierung von MalT einhergeht und dass diese oligomere
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Form die aktive ist (Schreiber und Richet, 1999). Oligomeres MalT bindet kooperativ an bestimmte asymmetrische Operatoren, sogenannte MalT-Boxen (Konsensussequenz 5´
GGGGA(G/T)GAGG 3´ (Vidal-Ingigliardi et al., 1991)), die sich statt der üblichen –35 Region von konstitutiv
Abbildung 1.4 Genetische Organisation des Maltose- regulons.
Der zentrale Aktivator MalT liegt zunächst in seiner inaktiven Form (gelb) vor. Nach Maltotriose und ATP-Bindung multimerisiert MalT (grün) und stimuliert die Transkription aller mal Gene. Für die Expression von malT und der Gene in der malB-Region ist außerdem die Aktivierung durch
den cAMP/CAP Komplex
notwendig. malT wird zusätzlich durch den Repressor Mlc reguliert, der bei Glucosetransport über das PTS von EIICBGlc gebunden wird und somit den malT P r o m o t o r f r e i g i b t . Transkriptionseinheiten sind als gestreifte Kästen dargestellt, Transkriptionsstart und Richtung sind durch Pfeile angedeutet;
Pfeile nach links bedeuten T r a n s k r i p t i o n g e g e n d e n Uhrzeigersinn auf der E. coli Genkarte. Einzelne Buchstaben stehen für das entsprechende mal Gen oder Mal Protein. Die Lokalisation der einzelnen Loci auf der E. coli Genkarte ist in Minuten angegeben. In der Vergrößerung sind die MalT- Boxen (grüne Pfeile), CAP-Boxen (grüne Kästen) und die –10 Regionen (lila Kästen) der malB Region gezeigt. Die MalT-Boxen 3 bis 5 und 3´ bis 5´ überlappen jeweils und sind um jeweils drei Nukleotide relativ zueinander verschoben. Die Lokalisation des Zentrums der einzelnen Operatoren ist in Bezug zum malK Transkriptionsstart (CAP-Boxen und MalT-Boxen 3-5 bzw. 3´-5´) bzw. malE Transkriptionsstart (MalT-Boxen 1 und 2) in Basenpaaren angegeben. Ganz unten sind die Konsensussequenzen der MalT-Box und der CAP Bindestelle dargestellt, Großbuchstaben bedeuten dabei hohen Konservierungsgrad, "n" steht für ein beliebiges Nukleotid.
exprimierten Genen im –37,5 oder –38,5 Bereich aller MalT-abhängigen Operone bzw.
Gene befinden. Außerdem haben alle mal-Promotoren zwei in Tandem orientierte MalT-
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und der beiden divergenten Promotoren in der malB Region ist außerdem das Catabolite Activator Protein (CAP) in seiner aktiven, cAMP-gebundenen Form notwendig, während die malPQ Expression CAP-unabhängig ist. Durch aufwendige und elegante Studien haben Raibaud, Richet und Mitarbeiter zeigen können, dass für die Aktivierung der beiden divergenten Promotoren in der malB Region die Bildung einer komplexen Nukleoprotein- Struktur notwendig ist (Raibaud et al., 1989). Die beiden Aktivatoren MalT und cAMP/CAP arbeiten hierbei synergetisch. Die Bindung des cAMP/CAP Komplexes an drei Bindungsstellen in der malE-malK intergenen Region führt zu einer Änderung der DNA Tertiärstruktur ("DNA-bending") und dadurch zu einer Repositionierung von MalT (Richet et al., 1991): Zunächst ist ein MalT-Oligomer an die drei MalT-Boxen 3, 4 und 5 gebunden, doch diese Boxen haben nicht den richtigen Abstand zum Transkriptionsstart und das MalT-Oligomer kann nicht transkriptionsaktivierend wirken. Erst durch die Bindung von drei cAMP/CAP Dimeren an die CAP-Bindestellen 1, 2 und 3, kommt es zur Repositionierung von MalT um drei Basenpaare in Richtung des malK Transkriptionsstarts und somit zur Bindung an die MalT-Boxen 3´- 5´, und die Transkription wird initiiert (Richet, 1996; Richet und Søgaard-Andersen, 1994).
Auf Grund der Existenz von drei Proteaseschnittstellen die durch "limitierte Proteolyse"- Experimente definiert wurden, wird angenommen, dass MalT aus mindestens vier Domänen besteht (DT1-DT4). Die N-terminale Domäne (DT1, bis aa 242) beinhaltet die Walker A und B Sequenzmotive zur ATP-Bindung. DT2 (bis aa 437) und DT3 (bis aa 807) sind vermutlich für die Maltotriosebindung und die Oligomerisierung verantwortlich. DT4 besteht aus den 94 C-terminalen Resten, die ein DNA-bindendes Helix-Turn-Helix Motiv vom LuxR-Typ bilden (Danot, 2001). Kürzlich ist die Kristallstruktur der 366 aa langen Domäne 3 gelöst worden; Sie zeigt eine rein α-helikale Struktur aus acht zwei-Helix- Bündeln, die wiederum in einer rechtshändigen Superhelix arrangiert sind. Diese Superhelix besitzt eine potenzielle Maltotriose-Bindestelle und eine große hydrophobe Oberfläche, die für Protein-Protein Wechselwirkungen geeignet ist (Steegborn et al., 2001). Diese Interaktionsstelle könnte der maltotrioseabhängigen Oligomerisierung, der Interaktion mit Effektorproteinen, oder Beidem dienen.
Wie eingangs erwähnt unterliegt die Regulation des malT Gens der Katabolitrepression.
Die CAP-Bindestelle befindet sich bei Position –70 relativ zum malT Transkriptionsstart.
Außerdem wird malT von dem kürzlich identifizierten globalen Repressor Mlc reguliert (Decker et al., 1998), dessen Bindestelle (Konsensussequenz 5´(A/T)7(n)7(A/T)73´) mit
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dem malT Transkriptionsstart überlappt. Der Effekt von Mlc auf die malT Expression ist relativ schwach (ca. Faktor 3), aber da auch MalT ein Regulator ist, wird dieser Effekt potenziert und führt zu einer signifikanten Modulation der MalT-abhängigen Gene. Mlc ist ein untypischer Repressor, denn seine Aktivität wird nicht über die Bindung eines niedermolekularen Effektormoleküls gesteuert, sondern über einen Titrationsmechanismus, der zu einer subzellulären Relokalisation des Proteins führt: Bei Glucose-Transport über das PTS wird Mlc von unphosphoryliertem EIICBGlc gebunden und dadurch austitriert; und die malT Transkription wird freigegeben (Lee et al., 2000). Dies führt zu der scheinbar paradoxen Situation, dass bei Glucosewachstum Katabolitrepression auf das mal Regulon ausgeübt wird, gleichzeitig aber die Expression von malT durch das Austitrieren von Mlc stimuliert wird. Neben malT werden noch einer ganze Reihe anderer Gene, bzw. Operone von Mlc reprimiert, etwa mlc selbst, ptsG (kodiert für EIICBGlc), manXYZ (kodiert für mannosespezifisches EII) und die Gene, die für die cytoplasmatischen Proteine des PTS kodieren (ptsHI) (Plumbridge, 1998a; Plumbridge, 1998b; Plumbridge, 1999). Der physiologische Grund für diese sogenannte Antikatabolitrepression, die Mlc auf das Maltosesystem ausübt, ist unklar. Aus der Gesamtheit der Systeme, die von Mlc reguliert werden, kann man allerdings ableiten, dass Mlc eine entscheidende Rolle bei der Feineinstellung des metabolischen Flusses spielt. Und es kann spekuliert werden, dass das Maltosesystem auf Grund seiner Verknüpfung mit dem Glycogenstoffwechsel ebenfalls eine Rolle im zentralen Stoffwechsel spielt.
Neben Mlc gibt es vermutlich noch mindestens einen weiteren, bisher unbekannten Repressor von malT. Es wurden eine Reihe von Mutanten isoliert, die im malT upstream- Bereich Deletionen, bzw. Transposon-Insertionen tragen. Diese Mutanten zeigen eine erhöhte malT Expression (Kolbus, 1997; Raibaud et al., 1991). Es scheint also bis dato unidentifizierte Repressoren zu geben, die in dieser Region binden können. Da es im malT Promotorbereich potenzielle OmpR Bindestellen gibt, könnte dieser an der Osmoregulation beteiligte Response Regulator (Itou und Tanaka, 2001) ein Kandidat für solch ein Repressorprotein sein. Studien, die in diese Richtung zielten, lieferten allerdings bisher unklare Ergebnisse (Boos und Shuman, 1998).
Die zelluläre MalT Konzentration wird nicht nur auf transkriptionaler Ebene, sondern auch
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ausgeübt wird. Die molekularen Mechanismen, die diesem Phänomen zugrunde liegen sind nur teilweise geklärt (Eppler und Boos, 1999).
Außer der malT Regulation auf transkriptioneller und translationaler Ebene und der Steuerung der MalT-Aktivität durch Induktorbindung wird die MalT Aktivität auch durch die Wechselwirkung mit mindestens drei verschiedenen Effektorproteinen reguliert: Aes, MalY und MalK. Diese drei Proteine und ihr Einfluss auf die mal Genregulation werden im folgenden beschrieben. Die hier verwendete Reihenfolge ihrer Aufzählung entspricht allerdings nicht der Chronologie ihrer Entdeckungen.
Das erste Protein, Aes (36 kDa), ist eine Acetylesterase von unbekannter physiologischer Funktion. Nullmutanten in a e s zeigen keinerlei Phänotyp, und es ist keine Umweltbedingung bekannt, die zur aes Induktion oder Repression führt. Aes Überexpression von Plasmidsystemen führt zu völligem Silencing des mal Regulons.
Dieser Effekt kann jedoch durch Einführen eines malTc Allels, oder durch Co- Überexpression von MalT überkommen werden (Peist et al., 1997). Diese Beobachtungen führten zu der Hypothese, dass Aes direkt mit MalT interagiert und das MalT- Gleichgewicht auf die inaktive Seite verschiebt. Das wurde in jüngster Zeit durch in vitro Studien bestätigt (Joly et al., 2002). Darüber hinaus konnte demonstriert werden, dass Aes mit der N-terminalen Domäne von MalT (DT1) interagiert und um die Maltotriosebindung konkurriert. Dieser Mechanismus erinnert an die Interaktion mit dem zweiten Effektorprotein MalY. MalY (43 kDa) ist entgegen seiner Nomenklatur kein Protein des Maltosesystems. Dieser etwas verwirrende Umstand hat historische Gründe und geht auf Versuche zurück, deren Ziel die Aufklärung der sogenannten internen Induktion des mal Regulons war:
Aus einer Reihe von Beobachtungen kann man schließen, dass es in E. coli auch in Abwesenheit von Maltodextrinen im Medium einen Basallevel von intrazellulärer Maltotriose gibt. So sind z.B. (i) malQ Nullmutanten konstitutiv für die Expression der mal Gene, was man darauf zurückführt, dass intern gebildete Maltotriose nicht von MalQ abgebaut wird (Decker et al., 1993); (ii) induziert Trehalose MalT-abhängig das Maltoseregulon, was auf einen trehalosevermittelten Anstieg der internen Maltotriosekonzentration schließen lässt (Klein und Boos, 1993) und (iii) weisen MalK Nullmutanten eine starke Konstitutivität aller mal Gene auf, obwohl die betroffenen Stämme Mal- sind (siehe auch S. 19ff) (Ehrmann und Boos, 1987; Hofnung et al., 1974).
Es wird vermutet, dass sowohl der Glycogenabbau als auch de novo Synthese unter
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Beteiligung von Glc-1-P eine Quelle für den internen Induktor sind (Decker et al., 1993).
Bei einer Transposonmutagenese auf der Suche nach einem Enzym, das für diese interne Maltotriosesynthese verantwortlich ist, wurde eine Insertion isoliert, die zu völliger Repression der Basalexpression aller MalT-abhängigen Gene in einem malK Hintergrund führt. Daraus wurde fälschlicherweise geschlossen, dass das betroffene Gen für ein Enzym kodiert, das an der Synthese des Induktors beteiligt ist; entsprechend wurde das Gen malI, für Maltoseinduktor getauft (Reidl et al. , 1989) . Später erkannte man, dass MalI ein typischer Repressor vom LacI-typ ist, dass die Transposoninsertion in malI zur Expression des divergent zu malI transkribierten malXY Operons führt und dass MalY für die Repression der MalT-abhängigen Gene verantwortlich ist (Reidl und Boos, 1991). Durch in vitro Studien konnte nachgewiesen werden, dass der von MalY vermittelte Effekt analog zu der durch Aes vermittelten Repression auf Wechselwirkung mit MalT beruht und zu einer Verschiebung des MalT-Gleichgewichts auf die inaktive, nicht multimere Form führt (Schreiber et al., 2000). Die physiologische Rolle von MalX und MalY ist völlig unklar. Es ist kein Induktor bekannt, der mit MalI interagiert und zur Induktion von malXY führt.
MalX gehört zur Klasse der EnzymeII des PTS. Und wenn MalX mit Hilfe eines Plasmidsystems überproduziert wird, erlaubt es die Diffusion von Glucose und Maltose, jedoch nicht die Phosphorylierung dieser Substrate (Erni, 2002). Deswegen wird angenommen, dass weder Glucose noch Maltose natürliche Substrate darstellen. MalY ist ein dimeres Enzym, das einen Pyridoxal-5´-Phosphat Kofaktor trägt und die Aktivität einer β-CS-Lyase (Cystathionase) hat (Zdych et al., 1995). In E. coli gibt es ein nicht-homologes Enzym, MetC, das die gleiche Reaktion wie MalY katalysiert, ebenfalls Pyridoxal-5´- Phosphat als Kofaktor trägt und an der Biosynthese von Methionin beteiligt ist. MalY kann eine metC Mutation komplementieren, wenn es z.B. durch eine Mutation in malI induziert wird. Obwohl die physiologische Rolle von MalY unbekannt ist, wurde seine Kristallstruktur gelöst. Sie zeigt ein Protein mit einer kleineren und einer größeren Domäne. Die kleinere Domäne besteht aus dem N- und C-Terminus des Proteins, währen die größere Domäne den PLP Kofaktor enthält. Beide Domänen sind vom α/β Typ, und die gesamte Struktur ist typisch für PLP bindende Enzyme aus der Klasse der Aminotransferasen (Clausen et al., 2000). Es gibt eine Reihe von malY Punktmutanten, die
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betroffenen Reste bilden ein gemeinsames Cluster auf der Oberfläche von MalY. Dieses Cluster liegt gegenüber des aktiven Zentrums und stellt mit großer Wahrscheinlichkeit die Interaktionsstelle mit MalT dar. Reziprok zu den regulationsnegativen Mutanten gibt es Mutanten, die enzymatisch inaktiv sind, aber ihre Repressorfunktion behalten haben. Es scheint also, dass die katalytische Funktion und die Repressorfunktion voneinander getrennte Eigenschaften von MalY sind. Erst kürzlich konnte gezeigt werden, dass sowohl Aes als auch MalY mit der N-terminalen Domäne von MalT interagieren, vermutlich aber unterschiedliche Bindungsstellen benutzen (Joly et al., 2002).
Wie schon kurz erwähnt gibt es einen weiteren phänotypischen Repressor der MalT- abhängigen Gene: Die ATPase-Untereinheit des Maltosetransporters, MalK. Schon früh wurde erkannt, dass bestimmte Mutationen in der malB Region zu einer konstitutiven Expression von malQ führen, obwohl die betreffenden Stämme Mal- sind (Hofnung et al., 1974). Später nahm man an, dass das betroffene malK Gen für ein Enzym kodiert, das am Abbau von Maltotriose beteiligt ist (Bukau et al., 1986). Diese These konnte allerdings widerlegt werden (Decker, 1997). Komplementär zur Konstitutivität von malK Mutanten führt die Überexpression von malK zu einer völligen Repression aller MalT-abhängigen Gene. Diese Repression kann durch gleichzeitige Überexpression von malT, oder durch die Präsenz eines malTc Allels überkommen werden (Reyes und Shuman, 1988). Das spricht dafür, dass MalK kein DNA-bindender Repressor im klassischen Sinne ist, sondern auf andere Weise wirkt. Vor einigen Jahren konnten H. Shuman und Mitarbeiter nachweisen, dass MalT und MalK in vitro interagieren (Panagiotidis et al., 1998), was stark dafür spricht, dass MalK analog zu den beiden Repressoren MalY und Aes funktioniert.
Allerdings scheint — anders als im Falle von MalY — die Repressorfunktion von MalK an die enzymatische Funktion gekoppelt zu sein. Darauf lassen zwei Mutantenklassen schließen: Die erste Klasse, sogenannte MalK-Superrepressoren, sind in der Lage, selbst in malTc Mutanten die MalT-abhängigen Gene zu reprimieren. Die MalK-Superrepressoren tragen einen Austausch im Signature Motiv, der dazu führt, dass das mutierte Protein ATP binden, aber nicht hydrolysieren kann (Kühnau et al., 1991; Schmees und Schneider, 1998b). Die nächste Klasse von Mutanten sind sogenannte MBP-unabhängige Mutanten, die Maltodextrine in Abwesenheit von MBP transportieren können — allerdings nur bei hohen Dextrinkonzentrationen im Medium. Alle bisher bekannten Mutationen, die zu diesem Phänotyp führen, sind in malF und malG. MBP-unabhängige Mutanten zeigen auch in Abwesenheit von Maltodextrinen eine konstitutive ATP-Hydrolyse der MalK
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Untereinheit und eine erhöhte Basalexpression des mal Regulons. Dies kann man als weiteren Hinweis auf eine Verknüpfung der ATPasen und Repressorfunktion von MalK interpretieren (Covitz et al., 1994). MalK ist außerdem der Angriffspunkt für die vom PTS ausgeübte Inducer Exclusion. Wie schon unter Abschnitt 1.1 erwähnt, führt Glucosetransport über das PTS zu einem intrazellulären Anstieg der unphosphorylierten Form des EIIAGlc Proteins. Dieses kann direkt mit MalK interagieren und so den Maltosetransporter inaktivieren (Dean et al., 1990; Kühnau et al., 1991).
1.4 Das Ugp -System
Das Ugp (Uptake of Glycerol-3-Phosphat) System dient, wie der Name schon andeutet, der Aufnahme von sn-Glycerin-3-P (G-3-P) (Schweizer und Boos, 1983; Schweizer und Boos, 1984). Die Aufnahme von G-3-P wird durch einen ABC-Transporter bewerkstelligt, der sehr starke Homologien zum Maltosetransporter aufweist. Speziell die ATPase- Untereinheit UgpC ist zu 50% identisch und zu 66% ähnlich zu MalK. Außerdem wurde gezeigt, dass MalK und UgpC sich gegenseitig ersetzen können, wenn sie überproduziert werden (Hekstra und Tommassen, 1993). Das Ugp-System wird hier eingeführt, weil UgpC in dieser Arbeit für Domänen-Austausch Experimente benutzt wurde. Das Ugp System dient ausschließlich der Aufnahme von G-3-P unter Phosphatmangelbedingungen.
G-3-P als Kohlenstoffquelle wird von einem Pi-Antiportersystem, dem Glp System aufgenommen. Das ugp Operon ist auf Grund seiner Funktion in der Phosphataufnahme Teil des pho Regulons und steht unter Kontrolle des Zweikomponentensystems PhoB/PhoR (Hulett, 1996). Alle ugp Gene liegen im ugpBAECQ Operon bei 77´ auf der E.
coli Genkarte (Schweizer und Boos, 1985). UgpB ist das periplasmatische Bindeprotein, UgpA/E sind die Innenmembranproteine und UgpC ist, wie erwähnt, die ATPase. Das letzte Gen im Operon, ugpQ kodiert für eine Glycerin-Phosphoryl-Diester Diesterase und spielt weder bei der G-3-P-Aufnahme, noch im G-3-P-Metabolismus eine Rolle (Brzoska und Boos, 1988).
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1.5 Fragestellung und Zielsetzung
Ziel dieser Arbeit war es, den Mechanismus und die physiologische Bedeutung der MalK- vermittelten Regulation des mal Regulons aufzuklären. Schon zu Beginn war klar, dass der MalK-MalT Interaktion bei der Mechanistik des MalK Effektes eine zentrale Rolle zukommt. Die Untersuchung dieser Interaktion hat daher einen großen Stellenwert in dieser Arbeit. Konkrete Fragen waren dabei: 1. Welche Teile von MalT bzw. MalK sind an der Interaktion der beiden Proteine beteiligt? 2. Wo in der Zelle findet diese Interaktion statt? 3. Ist nur freies, oder auch im Transporterkomplex assembliertes MalK, in der Lage, MalT zu binden?
Zur physiologischen Bedeutung der regulatorischen Funktion von MalK sollten insbesondere zwei Fragen beantwortet werden: 1. Welche Rolle spielt das MalK Phänomen im Kontext der "klassischen" mal Genregulation, bei der davon ausgegangen wird, dass Veränderungen der intrazellulären Induktorkonzentration die Expression der mal Gene steuert und 2. wird die Repressorfunktion von MalK durch die Maltosetransporter- Aktivität moduliert?
Ein interessanter Nebenaspekt dieser Arbeit bestand darin einen Beitrag zum Verständnis des Maltodextrin-Transportvorgangs und somit zum Verständnis der Funktionsweise von ABC-Transportern im Allgemeinen zu leisten.
Material und Methoden
2 Material und Methoden
2.1 Wachstumsbedingungen, Medien und ihre Zusätze
Bakterien-Anzuchten wurde unter aeroben Bedingungen und — wenn nicht anders vermerkt — bei 37°C durchgeführt. Medien wurden generell nach den Anweisungen in (Miller, 1972) hergestellt. Als Standardvollmedium wurde Luria-Bertani (LB) Medium verwendet. Bei Arbeiten mit Stämmen, die IPTG-induzierbare Allele tragen, wurde meist NZA Vollmedium verwendet. Als definiertes Medium wurde generell das phosphatgepufferte Minimal Medium A (MMA) verwendet. Für phänotypische Tests wurde häufig Difco McConkey Base Medium (40g/l) verwendet, das mit 1% des zu testenden Zuckers versehen war. Die Standardkonzentrationen der verwendeten Medienzusätze sind in Tabelle 2.1 aufgeführt.
Medienzusatz Abkürzung Konzentration
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-D-galactopyranosid X-Gal 40µg/ml
Aminosäuren aa 0,1–0,3 mM
Ampicillin Amp 100-200 µg/ml
Arabinose Ara 0,002-0,2%
Chloramphenicol Cam 15-30 µg/ml
Glucose Glc 0,2%
Glycerin Gly 0,4%
Glycerin-3-Phosphat G-3-P 2mM
Isopropyl-β-D-thiogalaktopyranosid IPTG 1µM-1mM
Kanamycin Kan 50µg/ml
Maltose Mal 0,2%
Natrium-Citrat Cit 20mM
Tetracyclin Tet 5-15µg/ml
Nalidixinsäure Nal 30µg/ml
Tabelle 2.1 Medienzusätze und ihre Konzentrationen
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2.2 Konstruktion bakterieller Stämme
Mit Ausnahme des Escherichia Coli B Stammes BL21 sind alle verwendeten Stämme Derivate von Escherichia Coli K-12 (Blattner et al., 1997) und wurden, wenn nicht anders vermerkt, durch generelle Transduktion mit einer obligat virulenten Variante des Phagen P1 (Miller, 1972) oder durch Transformation mit Plasmiden erzeugt. Alle verwendeten Stämme, ihre Genotypen und Herkunft sind in Tabelle 2.2 aufgelistet.
2.3 Der malK-gfp Stamm AB813 und sein malF::Tn10 malTc Derivat AB822
AB813 trägt eine funktionelle malK-gfp Fusion in einfacher Kopie unter dem wt malK Promotor im wt Locus. Das MalK-GFP Hybridprotein ist maltoseinduzierbar und verhält sich in allen durchgeführten Tests wie wt MalK.
AB813 wurde durch Transformation des konditional replikativen Plasmids pAB78 (siehe 2.21) in Bre1162 erzeugt. pAB78 trägt eine Amp-Resistenz Kassette und eine malK-gfp Fusion, die mit dem zweiten Codon von malK beginnt und weder Promotor noch Translationsstart besitzt. Bre1162 wurde elektroporiert und Transformanten auf Amp- Resistenz selektioniert. Die wahrscheinlichste Möglichkeit in dieser Situation stabile, AmpR Transformanten zu erhalten, ist die in Abbildung 2.1 dargestellte Integration des gesamten Plasmids in das malK-lacZ Allel in Bre1162 durch ein homologes Rekombinationsereignis ("single crossover"). 5 solcher Transformanten wurden erhalten und ihr Maltose Phänotyp getestet. Nur einer der 5 Klone war Mal+, denn nur solche Rekombinanten, bei denen das single crossover Ereignis vor dem malK-lacZY Fusionspunkt stattgefunden hat und somit die malK-gfp Fusion unter dem wt malK Promotor exprimiert wird, haben ein funktionelles malK Allel.
Der malK-gfp malF::Tn10 malTc Stamm AB822 wurde durch eine P1 Transduktion von RM10 (malF::Tn10 malTc) mit AB813 als Donor und mit Selektion auf Ampicillinresistenz, erzeugt. Da malF und malK in enger Nachbarschaft auf dem E. coli Chromosom liegen, und daher die Gefahr bestand die malF Insertion auszukreuzen, war es nach der Transduktion notwendig eine große Anzahl Kolonien auf Tetracyclinresistenz zu testen.
