Etablierung der bodyplethysmographischen Messung der Lungenfunktion im Asthmamodell der Maus
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Michaela Ziegert
aus Burgwedel
Hannover 2006
Inhaltsverzeichnis
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ... 6
1. EINLEITUNG ... 8
1.1 Asthma bronchiale ...8
1.2 Tiermodelle des allergischen Asthma bronchiale...10
1.3 Lungenfunktionsmessung im Mausmodell ...12
1.4 Asthma und Surfactant ...15
1.5 Fragestellungen der Doktorarbeit ...17
2. METHODIK... 20
2.1 Übersicht über das Design der Studien...20
2.2 Tiere...21
2.3 Sensibilisierungs- und Provokationsprotokolle...22
2.3.1 Studie 1: Allergenprovokation mit Ovalbumin versus Aspergillus ...22
2.3.2 Studie 2: Vergleich von invasiver und nichtinvasiver Lungenfunktionsmessung ...23
2.3.3 Studie 3: Inhalative versus intratracheale Allergenchallenge ...25
2.3.4 Studie 4: Einfluss von Surfactantprotein D auf die allergische Atemwegsreaktion ...26
2.4 Lungenfunktionsmessungen an der intubierten und der wachen Maus...28
2.4.1 Narkose ...29
2.4.2 Grundlagen der Lungenfunktionsmessung...30
2.4.3 Versuchsaufbau ...32
2.4.3.1 Ganzkörperplethysmograph mit Inhalationsanlage...32
2.4.3.2 Messprinzip Head-out-Plethysmograph...37
2.4.4 Durchführung der Messungen...39
2.4.5 Allergenchallenge und allergische Frühreaktion...40
2.4.6 Bestimmung der Atemwegshyperreaktivität ...42
2.5 Immunologische Untersuchung ...45
2.6 Statistische Auswertung ...45
3. ERGEBNISSE ... 47
3.1 Studie 1: Allergenprovokation mit Ovalbumin versus Aspergillus...47
3.2 Studie 2: Vergleich von invasiver und nichtinvasiver Lungenfunktionsmessung ....48
3.2.1 Invasive Hyperreaktivitätsmessung am intubierten Tier...48
3.2.2 Nichtinvasive Hyperreaktivitätsmessung am wachen Tier ...49
3.2.3 Immunologische Untersuchung...50
3.3 Studie 3: Inhalative versus intratracheale Allergenchallenge ...51
3.3.1 Allergische Frühreaktion...51
3.3.2 Hyperreaktivität...52
3.3.3 Immunologische Untersuchung...53
3.4 Studie 4: Einfluss von Surfactantprotein D auf die allergische Atemwegsreaktion ..55
3.4.1 Allergische Frühreaktion...55
3.4.2. Hyperreaktivität...56
3.4.3 Immunologische Untersuchung...58
4. DISKUSSION... 60
4.1 Allergenprovokation mit Aspergillus versus Ovalbumin...60
4.2 Messung einer deutlicheren Hyperreagibilität mit Goldstandardparametern durch die Ganzkörperplethysmographie...61
4.3 Messung der allergischen Frühreaktion bei inhalativer Allergenchallenge...64
4.4 Surfactantprotein D hemmt die allergische Atemwegsreaktion ...66
4.5 Kritik an Mausmodellen zum allergischen Asthma bronchiale...68
4.6 Ausblick...71
5. ZUSAMMENFASSUNG ... 73
6. LITERATURVERZEICHNIS... 75
7. ANHANG ... 94
A: Geräte...94
B: Substanzen ...96
Lebenslauf...98
Erklärung nach § 2 Abs. 2 Nr. 5 und 6 PromO...100
Danksagung ...101
Abkürzungsverzeichnis
Af/AF Aspergillus fumigatus
ANOVA Ananlysis of Variance between groups BAL bronchoalveoläre Lavage
Cdyn dynamische Compliance (Volumendehnbarkeit der Lunge)
%RL prozentualer Anstieg des Atemwegswiderstands, ausgehend von einem Basalwert
ED effektive Dosis (hier: µg MCh), die einen definierten Resistance-Anstieg bewirkt
ED100 ED einer Provokationssubstanz für einen 100%igen Anstieg des Atemwegs- widerstands
ED150 ED einer Provokationssubstanz für einen 150%igen Anstieg des Atemwegs- widerstands
ED200 ED einer Provokationssubstanz für einen 200%igen Anstieg des Atemwegs- widerstands
ED-50 ED einer Provokationssubstanz für eine 50%ige Verminderung des mittel- expiratorischen Flusses
EF50 mittelexpiratorischer Fluss
ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
F Atemfluss
f Atemfrequenz
GL Leitfähigkeit der Atemwege, Kehrwert des Atemwegswiderstands RL
HSE Hugo-Sachs-Elektronik/Harvard Apparatus GmbH i.n. intranasal
i.p. intraperitoneal i.tr. intratracheal
IFA Freund's Adjuvant Incomplete
ITEM Institut für Toxikologie und experimentelle Medizin der Fraunhofer- Gesellschaft
IRDS infant respiratory distress syndrome
MCh Methacholin (Acetyl-β-Methylcholine Chloride)
MFC Mass-Flow-Controller (Massendurchflussregler) MMAD Massenmedianer aerodynamischer Durchmesser MV (Atem)minutenvolumen
NaCl physiologische Kochsalzlösung (0,9%ige Natriumchloridlösung) NEG Negativkontrollgruppe (Gabe der Trägersubstanzen ohne repetitiven
Allergenkontakt) Ova Ovalbumin Penh enhanced pause
POS Positivkontrollgruppe (repetitive Allergengabe nach Schema;
Placebobehandlung)
RDS respiratory distress syndrome rfhSP-D/
rSP-D rekombinantes Fragment des humanen Surfactantproteins D PTP transpulmonaler Druck
RL Atemwegswiderstand s.c. subcutan
SEM Standardfehler des Mittelwerts, standard error of mean SP-D Surfactantprotein D
Th1 T-Helferzelle vom Typ 1 Th2 T-Helferzelle vom Typ 2
VT Atem(zug)volumen, tidal volume
1. Einleitung
1.1 Asthma bronchiale
Weltweit nimmt die Prävalenz von Allergien in starkem Maße zu. Besonders betroffen sind dabei die Industrieländer. Atopische Krankheiten haben inzwischen eine Prävalenz von bis zu 25 % und eine allergische Sensibilisierung ist bereits bei einem Drittel der deutschen Bevölkerung nachweisbar (Statistisches Bundesamt, 2000). Zum Formenkreis der Atopien gehört neben der allergischen Rhinitis und Neurodermitis auch das Asthma bronchiale, das von all diesen Erkrankungen die gefährlichste darstellt. Deutschland zählt z. Zt. noch zu den Ländern mit der höchsten Mortalitätsrate bei Asthma bronchiale (nach England, Australien und Neuseeland). Allein in Deutschland ist jährlich – bezogen auf alle Altersgruppen – mit mehr als viertausend Todesfällen durch Asthma zu rechnen bei einer geschätzten Zahl von 4 Mio. Asthmatikern im Jahr 1997. Davon sind ca. 200 000 mit schwerem Asthma in Behandlung. Während Patienten mit leichten und mittelschweren Formen so gut wie immer durch die empfohlenen therapeutischen Maßnahmen symptomfrei werden, gelingt dies bei den schweren Formen selbst durch die Anwendung systemischer Kortikosteroide nicht immer (Konietzko et al., 2000).
Bei ca. 15 % der erwachsenen Bevölkerung gelingt der Nachweis einer Überempfindlichkeit der Atemwege mittels unspezifischer Provokation (z. B. Histamin, Methacholin). Zahlreiche Befunde deuten darauf hin, dass die Hyperreaktivität der Atemwege eine Vorstufe des symptomatischen Asthma bronchiale sein kann (O’Connor et al., 1995; Burrows et al., 1995; Smith et al., 1995). Ca. 5 % der Erwachsenen und bis zu 10 % der Kinder weisen ein manifestes Asthma bronchiale auf, wobei die Zunahme des allergischen Asthmas bei Kindern besonders deutlich ist. Im Kindesalter stellt das Asthma bronchiale die häufigste chronische Erkrankung dar (Konietzko et al., 2000). Neben den direkten Behandlungsausgaben (ohne ambulante ärztliche Leistungen) sind auch indirekte Kosten durch Arbeitsunfähigkeit und Frühberentung für die volkswirtschaftlichen Gesamtkosten verantwortlich, die z. B. 1996 rund 6 Milliarden DM betrugen (Weißflog et al., 2001).
Asthma bronchiale ist eine chronische, entzündliche Erkrankung der Atemwege. Bei
prädisponierten Personen führt die Entzündung zu anfallsweiser Atemnot infolge Atemwegsverengung (Bronchialobstruktion). Die Atemwegsobstruktion ist spontan oder durch Behandlung reversibel. Durch die Entzündung nimmt die Empfindlichkeit der Atemwege auf eine Vielzahl von Reizen zu und es kommt zu einer bronchialen Hyperreaktivität.
Je nach Ätiologie kann man Asthma in allergisches Asthma (extrinsic asthma) durch allergisierende Stoffe in Umwelt und Arbeitswelt und in nichtallergisches Asthma (intrinsic asthma) einteilen, wobei auch Mischformen vorkommen. Mischformen sind bei Erwachsenen am häufigsten, bei Kindern überwiegt das rein allergische Asthma. Häufige ubiquitäre Allergene sind Pollen, Hausstaubmilbenkot, Tierhaare und –epithelien sowie Schimmelpilze. Die Prävalenz von Reaktionen auf Pilzallergene beträgt im Hauttest bei Atopikern bis zu 27 % und schwankt zwischen 1 und 10 % bei Personen mit Atemwegssymptomen (Gesundheitsberichterstattung des Bundes, 2000).
Eine wichtige Rolle bei der Pathogenese des allergischen Asthmas spielt die IgE-vermittelte Sofortreaktion vom Typ I. IgE löst in Wechselwirkung mit spezifischen Allergenen die Degranulation von Mastzellen mit Freisetzung von Mediatorstoffen aus.
Diese Mediatoren bewirken eine endobronchiale Obstruktion durch Bronchospasmus, Schleimhautödem und Hypersekretion eines zähen Schleims. Eine Möglichkeit zur Allergiediagnostik bietet hierbei ein inhalativer Allergenprovokationstest mit dem verdächtigen Allergen. Ist eine Obstruktion messbar, so ist ein allergisches Asthma nachgewiesen. Neben der IgE-vermittelten Frühreaktion nach Allergeninhalation kann es auch zu IgG-vermittelten Spätreaktionen nach 6-12 Stunden kommen (Herold et al., 2004).
Des Weiteren charakteristisch für das Asthma bronchiale ist eine durch Allergene oder Infekte ausgelöste Eosinophilen-dominierte Entzündung der Atemwege. Der asthmatischen Entzündung liegt eine komplexe Immunreaktion zugrunde, bei der eine ganze Reihe verschiedener Zelltypen eine Rolle spielen. Bei den T-Lymphozyten ist das Gleichgewicht zwischen den Helfer-Zellen vom Th1-Subtyp zugunsten der Th2-Zellen verschoben, denen eine besondere Bedeutung in der Pathogenese zukommt. Darüber hinaus wird bestimmten Subpopulationen von Makrophagen eine Funktion im Rahmen der Allergenpräsentation zugeschrieben. Beteiligt sind auch Thrombozyten, dendritische Zellen, Fibroblasten, Epithelzellen und Neutrophile (Kroegel et al., 2002). Die jeweilige relative Bedeutung ist allerdings noch nicht vollständig erforscht. Bei der Abklärung des genauen Pathomechanismus spielen Tiermodelle eine entscheidende Rolle.
1.2 Tiermodelle des allergischen Asthma bronchiale
Modelle allergischen Asthmas anhand von Primaten und Schafen werden zwar als die zuverlässigste Darstellung einer menschlichen Reaktion auf Therapeutika angesehen (Wegner et al., 1993), aber diese Auszuchttiere sind teuer. Zudem ist es schwierig sicherzustellen, dass die Tiere frei von subklinischen Infektionen sind. Schließlich fallen ethische Aspekte bei den besonders beliebten Tierarten zunehmend stärker ins Gewicht.
Die in experimentellen Studien vielfach untersuchten Meerschweinchen bringen sehr starke allergische Reaktionen hervor, die jedoch artspezifisch und eher IgG1- als IgE-vermittelt sind (Wegner et al., 1993). Da die glatte Muskulatur des Meerschweinchens im Vergleich zum Menschen viel stärker ausgeprägt ist, kommt es zu einer überdimensionierten Bronchokonstriktion (Wegner et al., 1993). Die asthmatische Frühreaktion ist im Gegensatz zum Menschen sehr stark Histamin-getriggert, so dass die Tiere im anaphylaktischen Schock sterben können (Hoymann et al., 2001). Ihre Relevanz als Modelltiere für das allergische Asthma des Menschen ist daher eingeschränkt (Karol, 1994). Die Ratte ist zwar ein toxikologisches Standard-Tiermodell, doch Wistar- und Sprague-Dawley-Ratten lassen sich nicht gut sensibilisieren. Die Situation änderte sich aber, als entdeckt wurde, dass der Brown-Norway (BN)-Stamm sich sehr gut sensibilisieren und zur IgE-Produktion stimulieren lässt. Am Tiermodell der Brown- Norway-Ratte lassen sich charakteristische Eigenschaften und Reaktionen für Asthma aufzeigen (Hoymann et al., 2000; Pauluhn, 1996).
In ähnlicher Weise wie das Rattenmodell werden zunehmend Mausmodelle zur Erforschung des allergischen Asthma bronchiale eingesetzt. Genetik und Immunologie der Maus sind in den letzten Jahren intensiv erforscht worden (Mouse Genome Sequencing Consortium, 2002). Auf beiden Gebieten sind die Reaktionswege bekannt und an verschiedenen Stellen manipulierbar. Die Bedingungen im Tierversuch lassen sich gut kontrollieren und standardisieren. Störende Umwelteinflüsse können weitgehend ausgeschaltet und Complianceprobleme vermieden werden. So können reproduzierbare Ergebnisse erzielt werden, die im Anfangsstadium einer Arzneimittelprüfung eine wichtige Rolle spielen. Der Stoffwechsel der Maus ähnelt dem des Menschen. Zahlreiche inflammatorische Prozesse des Asthma bronchiale können gut am Mausmodell studiert
werden. Setzt man sensibilisierte Mäuse einer Allergenprovokation aus, so stellt man eine komplexe Immunantwort fest, die für eine allergische Atemwegserkrankung beim Menschen charakteristisch ist. So steigt der Anteil der Interleukine IL-4, IL-5 und IL-13 an, während der IL-10-Spiegel abfällt (Gelfand, 2002; Lloyd et al., 2001). Ein Anstieg der Lymphozyten und der eosinophilen Granulozyten kann nachgewiesen werden, außerdem ist der IgE-Wert erhöht. Letzteres gilt besonders für BALB/c-Mäuse (Lloyd et al., 2001).
Begleitend zu einer Eosinophilen-dominierten Entzündung kann im Mausmodell auch eine Hyperreaktivität der Atemwege auf cholinerge Stimuli hervorgerufen werden. Die Überempfindlichkeit gegenüber dem klinisch relevanten Teststimulus Methacholin (MCh) repräsentiert ein typisches asthmatisches Symptom.
Obwohl vieles für eine Verwendung von Mäusen zur Erforschung des allergischen Asthma bronchiale spricht, gibt es auch kritische Stimmen. So weist Persson in (Persson, 2002) darauf hin, dass die Exsudation von Plasma, die zu den Charakteristika von Asthma gehört, im Mausmodell nur marginal vorkommt. Auch eine Degranulation eosinophiler Zellen sowie chronische Veränderungen des Epithels finden bei sensibilisierten Mäusen nicht statt. Befürworter von Mausmodellen lenken ein, dass Asthma eine chronische Krankheit ist, deren Verlauf beim Menschen nicht mit der Entstehung von Asthma im Mausmodell zu vergleichen sei. Allerdings stellt die Untersuchung eines Patienten zu einem bestimmten Zeitpunkt auch nur eine Momentaufnahme dar. Es ist schwierig, den langfristigen Allergenkontakt eines Menschen auf ein Tiermodell abzubilden (Gelfand, 2002), obwohl Versuche durchaus existieren (Hogaboam et al., 2000; Temelkovski et al., 1998). Inzwischen existiert eine Vielzahl unterschiedlicher Mausmodelle, die meist nur einzelne Aspekte des menschlichen Asthma widerspiegeln.
Der Einsatz von Mausmodellen in der Asthmaforschung wirft daher Fragen zur Optimierung auf. Von Bedeutung für ein geeignetes Modell ist bereits die Auswahl des Tierstamms. Wie schon oben erwähnt, ist besonders bei BALB/c-Mäusen nach einer Sensibilisierung und nachfolgender Allergenprovokation ein erhöhter IgE-Wert feststellbar.
Außerdem entwickelt sich bei diesen Mäusen eher eine Th2-abhängige Entzündung der Lunge. Nach (Lloyd et al., 2001) hat der BALB/c-Stamm gegenüber den sonst oft benutzten C57BL/6-Mäusen noch weitere Vorteile. So ist bei BALB/c-Mäusen eine stärkere Hyperreaktivität messbar, d. h. der Atemwegswiderstand steigt nach MCh- Provokation stärker an und die dynamische Compliance fällt stärker ab. Verglichen mit C57BL/6-Mäusen, steigen die IgE- und die Th2-Produktion in höherem Maße an, ebenso
die Werte der Interleukine IL-4 und IL-5.
Die Art der benutzten Allergene in den verschiedenen Mausmodellen ist vielfältig.
So werden neben industriellen Chemikalien Proteinallergene, aber auch komplexe Mikroorganismen wie Pilze und Parasiten verwendet (Lloyd et al., 2001). Lebende Organismen erzeugen jedoch keine reine allergische Reaktion, sondern eine Mischform aus Infektion und Allergie. Die Immunantwort auf Proteinallergene ist dagegen kontrollierter und besser reproduzierbar, folglich lassen sich mit Proteinen stabilere Modelle etablieren als bei der Verwendung komplexer Organismen. Eine besondere Rolle spielt schon seit längerer Zeit Ovalbumin, ein einfaches lösliches Protein, das sich zu einem etablierten Modellallergen entwickelt hat. Im Gegensatz dazu sind Pilze wie Aspergillus fumigatus komplexe Mikroorganismen, die eine viel höhere Anzahl von verfügbaren antigenen Epitopen aufweisen. Pilze verursachen also möglicherweise eine stärkere allergische Reaktion. Auch die Tatsache, dass Asthma beim Menschen in erster Linie nicht durch Ovalbumin, wohl aber durch andere Allergene verursacht wird, lässt die Frage nach alternativen Modellallergenen aufkommen.
Doch nicht nur die Art der Allergene, sondern auch die einzelnen Parameter der Sensibilisierungsprotokolle weisen in den verschiedenen Studien eine große Vielfalt auf.
Allergene werden subcutan (s.c.), intraperitoneal (i.p.), intranasal (i.n.), intratracheal (i.tr.) sowie inhalativ appliziert. Eine maximale und reproduzierbare Reaktion zeigt sich im Ovalbumin-Modell bei einer Kombination aus systemischer und lokaler Exposition (Zhang et al., 1997). Eine s.c. Sensibilisierung mit multiplen i.n. Ovalbumin-Dosen ist ebenfalls effektiv bezüglich Hyperreaktivität, Gesamt-IgE-Produktion und eosinophiler Entzündung des Lungenparenchyms (Eum et al., 1995). Eine besondere Bedeutung hat die inhalative Applikation eines Aerosols, da die inhalative Aufnahme beim Menschen die natürliche Form eines Allergenkontakts darstellt. Eine reine i.n. Applikation von Ovalbumin bewirkt weder eine lokale noch eine systemische Reaktion, bei einer Vernebelung von Ovalbumin jedoch steigen Hyperreaktivität und IgE-Wert an (Renz et al., 1992).
1.3 Lungenfunktionsmessung im Mausmodell
Im Gegensatz zu dem großen genetischen und immunologischen Datenpool zum allergischen Asthma bronchiale bei der Maus sind die Lungenfunktionstudien mit
validierten Verfahren noch nicht so zahlreich. Meist wird dabei eine Hyperreaktivitätsmessung mit einem unspezifischen Stimulus etwa 24 bis 48 Stunden nach Allergenchallenge durchgeführt. Dabei wird geprüft, inwieweit die Atemwege eine Überempfindlichkeit gegenüber cholinergen Stimuli, z. B. gegenüber inhaliertem MCh, aufweisen.
Zur Messung der Lungenfunktion an Mäusen gibt es vielfältige Methoden (Drazen et al., 1999). Wesentliche Nachteile sind dabei die indirekte systemische Gabe von Provokationslösungen anstelle einer direkten lokalen Applikation der Substanzen, aber auch invasive Verfahren, die wiederholte oder längere Messungen unmöglich machen. Bei den Endpunktmethoden wie der Tracheotomie (van Scott et al., 2000), der Untersuchung der Bronchokonstriktion an Lungenschnitten (Wohlsen et al., 2001) oder der Stimulation der glatten Trachealmuskulatur im elektrischen Feld (Herz et al., 1998 und 1999;
Hamelmann et al., 1996) müssen die Tiere getötet werden. Das verhindert jedoch Messungen der Früh- und Spätreaktion am gleichen Tier sowie Langzeitstudien, die gerade bei chronischen Erkrankungen bzw. Asthma wichtig sind. Außerdem ist der operative Aufwand nicht unerheblich. Weitere Nachteile bestehen in einer mechanischen Beatmung der Tiere, die die Lunge auf Dauer verletzt und sowohl die Compliance als auch die Entzündungsmediatoren und das Surfactantsystem im Mausmodell verändert (Veldhuizen et al., 2001). Eine von den meisten Untersuchern eingesetzte, nichtinvasive Methode an wachen Mäusen ist die Ganzkörperplethysmographie mit einem Parameter namens Penh (Enhanced Pause) (Goldsmith et al., 2002; Zeldin et al., 2001; Lin, 2001; Hamada et al., 2000; Hansen et al., 2000; Humbles et al., 2000; Hailé et al., 1999; Cieslewicz et al., 1999;
Dohi et al., 1999; Drazen et al., 1999). Diese einfach durchführbare Methode wurde in (Hamelmann et al., 1997) beschrieben. Dabei sitzt die Maus frei beweglich in einer Kammer, die mit einem Druckaufnehmer und einem Pneumotachographen verbunden ist.
Penh wird aus der Form der Druckkurve in der Kammer abgeleitet. Die Definition der dimensionslosen Größe Penh wird folgendermaßen festgelegt:
Penh = PEP PIP × Pause.
PEP ist dabei der maximale expiratorische Druck, PIP ist der maximale inspiratorische Druck. Pause wird berechnet als:
Pause = (Te − Tr) Tr.
Dabei ist Te die Expirationszeit und Tr die Relaxationszeit, welche definiert wird als die Zeit der Expiration bis zu einem Druckabfall auf 36 % des gesamten Drucks in der
Kammer. Diese Methode wird jedoch zunehmend kritisiert. Mitzner und Tankersley bemängelten bereits 1998 die mangelnde Interpretierbarkeit quantitativer Veränderungen.
Sie tadelten die „skurrile Berechnung“, die Nichtbeachtung von Druckveränderungen durch Temperatur- und Luftfeuchtigkeitsschwankungen bei der Atmung in der Kammer sowie die Validierung der Methode mit spontanatmenden Mäusen durch ein völlig anderes System mit künstlich beatmeten Tieren (Mitzner et al., 1998). Nicht immer konnte eine Korrelation des empirischen Parameters Penh mit dem Atemwegswiderstand beobachtet werden (Flandre et al., 2003; DeLorme et al., 2002; Albertine et al., 2002; Peták et al., 2001). Penh weist eine starke Variabilität auf und bezieht sich eher auf Veränderungen im Atemmuster bzw. auf eine reflektorische Kontrolle von Atemprozessen (Pauluhn, 2004). Adler et al.
fanden heraus, dass eine Korrelation mit der Resistance abhängig vom Mausstamm ist (Adler et al., 2004). Peták et al. zeigten, dass Penh Veränderungen der Lungenfunktion unter Hyperoxie nicht nur quantitativ, sondern auch qualitativ anders wiedergibt als die Standardparameter bei der Technik der niedrigfrequenten forcierten Oszillation (Petak et al., 2001). Mitzner et al. haben bewiesen, dass die Größe Penh, die aus den Drücken im Ganzkörperplethysmographen abgeleitet wird, zum größten Teil von Temperaturdifferenzen, unterschiedlichen Wasserdampfdrücken und der Komprimierbarkeit der Luft abhängt und nur zu einem kleinen Teil vom Atemwegswiderstand (Mitzner et al., 2003). Zuvor hatten Lundblad et al. errechnet, dass die Druckveränderungen im Ganzkörperplethysmographen um etwa zwei Drittel reduziert werden, wenn die Kammer auf Körpertemperatur erhitzt und angefeuchtet wird (Lundblad et al., 2002). Penh ist also kein Maß für die Lungenfunktion (Bates et al., 2004; Irvin et al., 2003), sondern hängt eher von Atmungszeiten ab. Penh misst nicht die absolute Atemwegsobstruktion (Epstein, 2004), sondern bestenfalls relative Werte einer Atemwegsirritation.
Eine andere Möglichkeit zur repetitiven Lungenfunktionsmessung an wachen Tieren bietet die Bestimmung des mittelexpiratorischen Flusses EF50 mit der Head-out- Plethysmographie (Glaab et al., 2005; 2002 und 2001; Neuhaus-Steinmetz et al., 2000;
Vijayaraghavan et al., 1993). Dieser Parameter korreliert eng mit der simultan gemessenen dynamischen Compliance Cdyn und der Conductance GL, dem Kehrwert des Atemwegswiderstands RL (Glaab et al., 2001). Zur Messung der „Goldstandardparameter“
RL und Cdyn an Mäusen (Glaab et al., 2002; Drazen et al., 1999; Martin et al., 1988) waren bisher jedoch immer invasive, operative Maßnahmen unter Anästhesie notwendig, die
wiederholte Messungen verhindert haben. Seit einiger Zeit ist jedoch eine quasi- nichtinvasive Lungenfunktionsmessung an intubierten Mäusen möglich geworden (Brown et al., 1999). Brown et al. beschrieben erstmalig im Detail eine Intubationsmethode mit anschließender Messung von Basalwerten des Atemwegswiderstands und der Compliance.
Die Mäuse wurden allerdings künstlich beatmet. Die Tiere wurden weder sensibilisiert noch allergenprovoziert und nur vereinzelt nach unpezifischer intravenöser Provokation untersucht. Genaue Tierzahlen wurden nicht genannt. Dennoch hat diese Methode neue Wege eröffnet, die Obstruktion der Atemwege beim allergischen Asthma bronchiale im Mausmodell mit den bestmöglichen Messparametern zu objektivieren.
Eine allergische Frühreaktion, die innerhalb weniger Minuten nach Allergenexposition zu einer ausgeprägten Bronchialverengung führt, wurde bisher im Mausmodell nicht valide gemessen und erforscht. In den Fällen, bei denen neben der Hyperreaktivität überhaupt eine allergische Frühreaktion gemessen wurde, wurde meist auf den oben beschriebenen Parameter Penh zurückgegriffen (Kasserra et al., 2004; Agrawal et al., 2004; Liu et al., 2003; Taube et al., 2002; Kraneveld et al., 2002; Crosby et al., 2002;
Hopfenspringer et al., 2002; Tifilieff et al., 2000; Wright et al., 1999; Cieslewicz et al., 1999). Anders als viele Forschergruppen benutzten Hailé et al. zwar bei der Messung der anaphylaktischen Bronchokonstriktion nicht den Parameter Penh, die Tiere wurden jedoch nach einer i. v. Injektion von Ovalbumin tracheotomiert und künstlich beatmet (Hailé et al., 1999).
Auch die asthmatische Spätreaktion, die bei der Maus mit 3 – 12 Stunden Verzögerung nach Antigenexposition auftreten kann (Crosby et al., 2002), ist in diesem Zusammenhang noch wenig mit validen Methoden untersucht.
1.4 Asthma und Surfactant
Die komplexe, alveoläre Substanzmischung Surfactant, die zum größten Teil aus Phospholipiden, aber auch aus verschiedenen Proteinen besteht, erhielt ihren Namen aufgrund der Eigenschaft, die Oberflächenspannung an der Grenze zwischen Luft und Flüssigkeit herabzusetzen („SURFace ACTive AgeNT“). Neben seiner Oberflächenaktivität hat Surfactant verschiedene biophysikalische Funktionen wie z. B.
eine Barrierefunktion gegenüber Allergenen (Hohlfeld, 2002, Hills, 1996), eine
antiödematöse Wirkung (Griese, 1999), das Offenhalten der Atemwege (Hohlfeld et al., 1997a; Enhorning et al., 1995; Liu et al., 1991) sowie die Verbesserung des mukoziliären Transports (Gehr et al., 2000; De Sanctis et al., 1994; Rubin et al., 1992; Kakuta et al., 1991).
Neben den biophysikalischen Funktionen sind seit Ende der Siebziger Jahre weitere Eigenschaften von Surfactant bekannt, z. B. seine hemmende Wirkung auf Teile des Immunsystems, insbesondere die allergische Immunreaktion. Dass Surfactantbestandteile die Proliferation, die Immunglobulinproduktion sowie die Zytotoxizität von Lymphozyten hemmen, wurde in vitro (Kremlev et al., 1994; Roth et al., 1993; Sitrin et al., 1985) und in vivo sowohl am Menschen (Wang et al., 1998; Borron et al., 1998; Borron et al., 1996;
Catanzaro et al., 1988; Ansfield et al., 1979b) als auch im Tiermodell gezeigt (Wang et al., 2001; Ansfield et al., 1979a). Gleichfalls haben Surfactantbestandteile einen hemmenden Einfluss auf die Eosinophilen wie auch auf Mastzellen (Madan et al., 2001; Haczku et al., 2001; Cheng et al., 1998). Sie modulieren die Funktion von Alveolarmakrophagen sowie die Freisetzung diverser Zytokine (Takeda et al., 2003; Hohlfeld, 2002; Wert et al., 2000;
Griese, 1999; Thomassen et al., 1994; Foldes-Filep et al., 1994) und erleichtern die Phagozytose (Griese, 1999; O’Neill et al., 1984a und 1984b).
Neben der Zulassung von Surfactant beim IRDS wird seine Wirkung auch bei anderen Lungenerkrankungen diskutiert (Baudouin, 2004; Spragg et al., 2004; Clark et al., 2003; Banerjee et al., 2000; Hohlfeld, 1999b; Griese, 1999), vor allem beim Asthma bronchiale (Hills et al., 2000; Kurashima et al., 1997a; Levtchenko et al., 1997; Anzueto et al., 1997).
Dass zwischen Asthma und Surfactant ein Zusammenhang besteht, ist schon länger bekannt (Lecks et al., 1967) und inzwischen in vielen Studien bestätigt worden. Eine veränderte Surfactantzusammensetzung wurde sowohl bei Asthmapatienten festgestellt (Wright et al., 2000; Heeley et al., 2000; Cheng et al., 2000b; Kurashima et al., 1997b; van de Graaf et al., 1992) als auch im Tiermodell nachgewiesen (Schmiedl et al., 2003; Kasper et al., 2002; Liu et al., 1995; Wang et al., 2001; Haczku et al., 2001). Gehemmt wird die Surfactantfunktion u. a. durch Proteine wie Fibrinogen oder CRP (McEachren et al., 1995;
Enhorning et al., 1993; Seeger et al., 1993; Fuchimukai et al., 1987; Seeger et al., 1985).
Durch eine initiale Entzündungsreaktion wie beim Asthma strömt proteinreiches Exsudat in die Atemwege ein. Daher kommt es beim Asthma zu einer Surfactantdysfunktion. Diese Dysfunktion konnte auch in Studien nach Allergenchallenge nachgewiesen werden.
(Haczku et al., 2001; Hohlfeld et al., 1999a; Hohlfeld, 1999b; Jarjour et al., 1999; Liu et al., 1997 und 1995). Des Weiteren hemmt Kälte sowohl die Surfactantfunktion (Enhorning et al., 2000) als auch die Surfactantsekretion (Dobbs et al., 1978). Angeregt wird die Sekretion von Surfactant bzw. von seinen Bestandteilen, den Phospholipiden und Surfactantproteinen, durch unterschiedliche Asthmamittel wie Terbutalin, Aminophyllin und Glukokortikoide (Wang et al., 1996a; Lizenko et al., 1995; Mariencheck et al., 1994;
Young et al., 1986; Ekelund et al., 1981; Dobbs et al., 1979; Torday et al., 1975). Zur Förderung der fetalen Surfactantproduktion gehört der Einsatz von Kortikosteroiden bei drohender Frühgeburt schon lange zum Standard.
Die Wirksamkeit beim RDS und anderen Lungenkrankheiten, die nachgewiesene Surfactantdysfunktion beim Asthma sowie die Freisetzung von Surfactant durch Glukokortikoide und andere Asthmatherapeutika legen die Idee nahe, die Substanz oder Bestandteile davon direkt in der Asthmatherapie einzusetzen. Möglichkeiten zur Anwendung von Surfactantbestandteilen beim Asthma bronchiale sind besonders in den letzten Jahren intensiver diskutiert worden (van Helden et al., 2004; Erpenbeck et al., 2004;
Erpenbeck et al., 2005; Baritussio, 2004; Babu et al., 2003; Meyer et al., 2002; Westhoff et al., 2001; Postle, 2000; Banerjee et al., 2000), allerdings mit unterschiedlichen Ergebnissen. Zunehmend gibt es Hinweise auf die positive Wirkung von Surfactantproteinen beim allergischen Asthma bronchiale (Erpenbeck et al., 2004a; Takeda et al., 2003; Singh et al., 2003; Strong et al., 2002; Madan et al., 2001; Cheng et al., 2000a, Cheng et al., 1998; Wang et al., 1998). Daher bedarf besonders die Wirkung der einzelnen Surfactantbestandteile auf die allergische Atemwegserkrankung weiterer Untersuchungen.
1.5 Fragestellungen der Doktorarbeit
Ziel dieser Arbeit war es, einen bodyplethysmographischen Lungenfunktionsmessplatz für das Asthmamodell der Maus zu etablieren. In der experimentellen Asthmaforschung werden Mausmodelle benötigt, die eine Messung der allergischen Frühreaktion als auch der Atemwegshyperreaktivität mit den Goldstandardparametern der Lungenfunktion Resistance (RL) und dynamische Compliance (Cdyn) ermöglichen. Wichtig ist weiterhin die Auswahl des Allergens, das idealerweise sowohl beim Menschen Relevanz haben als auch bei Mäusen eine messbare, dem Menschen ähnliche asthmatische Reaktion auslösen sollte.
Auf der Suche nach einem geeigneten Modellallergen bietet sich ein Allergen an, das bereits erfolgreich im Mausmodell eingesetzt wurde und auch bei Atopikern mit entsprechender Sensibilisierung häufig zu asthmatischen Reaktionen führt. Diese Bedingungen erfüllt ein Extrakt des Schimmelpilzes Aspergillus fumigatus. Es ist jedoch unklar, ob Aspergillus ebenso wie das seit langer Zeit etablierte Ovalbumin-Modellallergen eine signifikante Hyperreaktivität im Tiermodell auslösen kann. Deshalb wurde zunächst eine Studie mit der Fragestellung durchgeführt, ob Aspergillus als relevantes Modellallergen eine vergleichbare Hyperreaktivität wie Ovalbumin auslösen kann.
Nach Beantwortung der Frage zur Eignung von Aspergillus als Modellallergen blieb zu klären, welche Methodik der Lungenfunktionsmessung im weiteren Verlauf Verwendung finden soll. Zur Messung der Lungenfunktion mit Goldstandardparametern hatte sich bei der Ratte die ganzkörperplethysmographische Messung mit intubierten Tieren bewährt. Bei der Maus ist hingegen die nichtinvasive Lungenfunktionsmessung im Head-out-Plethysmographen als einfache und schnelle Methode etabliert. Die Standardparameter RL und Cdyn können mit der Head-out-Plethysmographie jedoch nicht bestimmt werden. Der Einsatz der Ganzkörperplethysmographie mit intubierten Mäusen würde die Messung dieser Größen möglich machen. Allerdings stellt sich die Frage, ob diese Art der Lungenfunktionsmessung zu vergleichbaren Ergebnissen im Hyperreaktivitätstest führt wie die nichtinvasive Methode der Head-out-Plethysmographie.
Daher sollte eine zweite Studie die Frage klären, ob die bronchiale Hyperreagibilität bei intubierten Tieren in der Ganzkörperplethysmographie vergleichbar ist mit der Hyperreagibilität wacher Tiere in der Head-out-Plethysmographie.
Da das allergische Asthma bronchiale nicht nur durch eine Hyperreagibilität der Atemwege gekennzeichnet ist, sondern vor allem durch eine bronchiale Obstruktion als Sofortreaktion auf die Reizung durch das spezifische Allergen, sollte auch die Messung der allergischen Frühreaktion im Mausmodell realisiert werden. Im Gegensatz zur Hyperreagilibität ist diese Sofortreaktion bisher nur schwer im Mausmodell darstellbar (Glaab et al., 2001). Bei einer trachealen oder nasalen Instillation ist dies schon aus technischen Gründen nicht möglich, da die Flüssigkeit die kleinen Atemwege der Maus verstopft und zu stockender Atmung sowie Artefakten führt. In vielen Modellansätzen wurden Aspergillusantigene in einer Flüssigkeit intratracheal oder intranasal instilliert. Das erleichtert zwar die kontrollierte Zufuhr und ist weniger aufwändig, eine allergische Frühreaktion kann hierbei jedoch nicht gemessen werden. Außerdem stellt diese
Applikationsart ebenso wie eine rein systemische Injektion eine unnatürliche Art der Allergenprovokation dar. Ein natürlicher Weg der Allergenexposition wäre die Inhalation von Allergenen aus der Umgebungsluft. Möglicherweise wäre nach einer inhalativen Challenge mit Aspergillus auch die Frühreaktion messbar. Dies wurde in einer dritten Studie untersucht. Dabei sollte zusätzlich die Atemwegshyperreagibilität bei intratrachealer und bei inhalativer Applikation miteinander verglichen werden.
In einer vierten Studie wurde überprüft, ob sich der neue Lungenfunktionsmessplatz auf eine aktuelle Fragestellung anwenden lässt. Deshalb wurde eine Studie mit therapeutischer Intervention durchgeführt, und zwar mit prophylaktischer Anwendung eines Surfactantproteins im Asthmamodell. Dass beim allergischen Asthma bronchiale ein gestörtes Surfactant-Gleichgewicht vorliegt, ist seit längerer Zeit bekannt (s. o.). Positive Wirkungen von Surfactant sind in diesem Zusammenhang in der Literatur zahlreich beschrieben worden. Unklar ist jedoch, in welcher Weise die einzelnen Bestandteile des Surfactant für diese Wirkung verantwortlich sind. Surfactantprotein A und D scheinen eine wichtige Rolle bei der Immunmodulation zu spielen (Hohlfeld, 2002; Griese, 1999). Die Hemmung der Atemwegsentzündung durch Surfactantprotein D wurde anhand immunologischer Parameter gezeigt (Madan et al., 2001; Takeda et al., 2003). Takeda et al.
fanden auch eine Hemmung der Atemwegshyperreaktivität nach unspezifischer Provokation (Takeda et al., 2003). In der vierten Studie wurde deshalb untersucht, ob Surfactantprotein D im Asthmamodell die allergische Atemwegsentzündung, die Atemwegshyperreagibilität und die pulmonale Frühreaktion unterdrücken kann.
Zusammenfassend sollen in dieser Doktorarbeit folgende Fragen beantwortet werden:
1. Kann Aspergillus als relevantes Modellallergen eine vergleichbare Hyperreaktivität wie Ovalbumin auslösen?
2. Unterscheidet sich die bronchiale Hyperreagibilität bei intubierten Mäusen in der Ganzkörperplethysmographie von der bei wachen Mäusen in der Head-out- Plethysmographie?
3. Ermöglicht die inhalative Allergenchallenge mit Aspergillus eine Messung der allergischen Frühreaktion und führt sie möglicherweise zu einer stärkeren Hyperreaktivität?
4. Ist in dem zu etablierenden Asthmamodell ein Einfluss von SP-D auf die allergische Atemwegsreaktion erkennbar?
2. Methodik
2.1 Übersicht über das Design der Studien
1. Studie: Nach der Aufstellung eines neuen Ganzkörperplethysmographen für die intubierte Maus wurde zunächst die Frage untersucht, ob Aspergillus im Mausmodell eine vergleichbare allergische Reaktion wie Ovalbumin auslösen kann. Dazu wurden die Versuchstiere in drei Gruppen eingeteilt: Eine Gruppe bekam Ovalbumin (Ova) als Allergen, die zweite Aspergillus fumigatus (Af). Eine dritte Gruppe wurde mit physiologischer Kochsalzlösung (NaCl) als Trägersubstanz behandelt und diente als Kontrollgruppe. In dieser Studie wurde die Atemwegshyperreaktivität untersucht. Dazu wurden aus dem Anstieg der Resistance (RL) unter Methacholin-Provokation in steigender Dosis die effektiven Dosen für den 100%igen, 150%igen und 200%igen Anstieg von RL
(ED100, ED150 und ED200 ) berechnet. Die allergischen Reaktionen von Ova und Af wurden in Bezug auf die Kontrollgruppe miteinander verglichen. Aufgrund der Versuchsergebnisse wurde in den folgenden Studien Af als Allergen benutzt.
2. Studie: In der zweiten Studie wurde untersucht, ob sich die Atemwegsyperreaktivität bei intubierten, narkotisierten Tieren im Ganzkörperplethysmographen von wachen Tieren im Head-out-Plethysmographen unterscheidet. Dazu wurde der Lungenfunktionsparameter EF50 sowohl bei narkotisierten als auch bei wachen Tieren nach inhalativer Methacholinprovokation bestimmt (aufbauend auf Glaab et al., 2001). Aus EF50 wurde sowohl für wache als auch für narkotisierte Tiere die ED-50 errechnet, die angibt, bei welcher inhalativen Dosis Methacholin der Wert von EF50 um 50 % abfällt. Sowohl bei den intubierten als auch bei den wachen Tieren wurde je eine Gruppe mit Af provoziert und eine andere Gruppe zur Kontrolle mit NaCl scheinprovoziert. Als Goldstandardparameter der Lungenfunktion wurde RL nur bei den intubierten Tiere im Ganzkörperplethysmographen bestimmt. Die immunologischen Parameter wie Gesamtzellzahl und Differenzial-Zellbild in der bronchoalveolären Lavage (BAL) sowie Serum-IgE-Spiegel wurden im Anschluss an die Lungenfunktionsmessungen bei allen Tieren gleichermaßen untersucht. Die Messmethodik an intubierten Mäusen wurde bei den folgenden zwei Studien beibehalten.
3. Studie: Bei der dritten Studie wurde untersucht, ob sich durch eine inhalative Allergenchallenge die allergische Frühreaktion darstellen lässt und ob diese Art der Allergenexposition ebenso zu einer messbaren Hyperreaktivität und Inflammation führt wie die herkömmliche intratracheale Provokation. Unter Verwendung der oben angeführten Methodik wurden die beiden Applikationsarten gegenüber einer Kontrollgruppe anhand von Lungenfunktions- und immunologischen Parametern miteinander verglichen.
4. Studie: Nach der Etablierung des Lungenfunktionsmessplatzes im Rahmen der ersten drei Studien wurde in einer Anwendungsstudie untersucht, ob Surfactantprotein D die allergische Frühreaktion und Hyperreagibilität sowie die immunologischen Parameter der allergischen Entzündung unterdrücken kann. Dabei wurden die Ergebnisse einer allergenprovozierten, SP-D-behandelten Gruppe mit einer allergenprovozierten, Placebo- behandelten Positivkontrollgruppe und einer scheinprovozierten, Placebo-behandelten Negativkontrollgruppe verglichen.
2.2 Tiere
Alle Studien wurden nach Genehmigung von der Bezirksregierung Niedersachsen gemäß dem Tierschutzgesetz durchgeführt. Die Untersuchungen erfolgten an spezifisch pathogenfreien weiblichen BALB/c-Mäusen (Züchter: Charles River Laboratories, Inc.), deren Gesundheitszustand täglich überwacht wurde. Das Gewicht der Tiere betrug im Mittel 20 g. Das Alter der Tiere zum Zeitpunkt der Sensibilisierung (s. Abschnitt 2.3) betrug bei der ersten Studie 8 Wochen. Da ein Alter ab etwa 15 Wochen sich bei Messungen der allergischen Lungenreaktionen als günstig erwiesen hatte, wurde bei den folgenden Studien mit älteren Tieren gearbeitet: bei der zweiten Studie betrug das Alter 13- 14 Wochen, bei der dritten 10-12 Wochen und bei der Anwendungsstudie mit prophylaktischer Surfactantgabe 14-18 Wochen.
Um eine natürliche Hormonregulierung zu gewährleisten, wurden sämtliche Tiere unter den folgenden Bedingungen gehalten: Die Käfiggröße betrug 377 mm × 215 mm × 150 mm. In jedem Käfig befanden sich mindestens 2 und höchstens 10 Tiere.
Ein Tag-Nacht-Rhythmus von jeweils 12 Stunden wurde sichergestellt. Die Tiere wurden bei einer Temperatur von 20 °C, einem Luftdruck von ca. 10 Pa und einer Luftfeuchtigkeit von 40-70 % gehalten. Der Luftwechsel war auf 15-20 pro Stunde eingestellt. Eine
Akklimatisierungszeit von mindestens einer Woche wurde gewährleistet. Die Tiere bekamen allergenfreies Futter („1324-N, spezial behandelt“, Fa. Altromin International, Lage) und Streu sowie Trinkwasser ad libitum. Jeweils vor Beginn der ersten Sensibilisierung wurden die Tiere gewichtsbezogen randomisiert, d. h. mit einer Software gleichmäßig nach Gewicht auf die verschiedenen Gruppen verteilt. Dabei betrug die Streuung der Körpergewichte zwischen den Gruppen und innerhalb einer Gruppe weniger als 10 % des mittleren Körpergewichts. Auch die Startzeiten der Hyperreaktivitätstests sowie die Messung der allergischen Frühreaktion erfolgte randomisiert zu verschiedenen Uhrzeiten, so dass jede Gruppe über den Tag verteilt gemessen wurde (Mittelwert pro Gruppe zwischen 12 und 13 Uhr).
2.3 Sensibilisierungs- und Provokationsprotokolle
In diesem Abschnitt werden die Sensibilisierungsprotokolle der 4 Studien und die einzelnen Gruppeneinteilungen dargestellt.
2.3.1 Studie 1: Allergenprovokation mit Ovalbumin versus Aspergillus
Die erste Studie basiert auf einem Sensibilisierungsprotokoll von Hansen et al. (Hansen et al., 2000). Zum Vergleich der allergischen Reaktionen auf Ova und auf Af wurde das gleiche Protokoll bei beiden Allergenen angewendet (vgl. Abbildung 2.1).
Die Tiere der Ova- bzw. Af-Gruppe bekamen 10 µg des entsprechenden Allergens i.p. in 0,2 ml NaCl-Lösung an den Tagen 0 und 14 und zusätzlich 10 µg i.n. in 50 µl 0,9%iger NaCl-Lösung an Tag 14. Zur Steigerung der immunogenen Wirkung durch einen Depoteffekt wurden bei der i.p. Allergenapplikation Adjuvanzien hinzugegeben: Ova wurde an 1 mg Aluminiumhydroxid adsorbiert und Af in NaCl-Lösung im Verhältnis von 2:1 mit unkomplettem Freunds Adjuvans (IFA: Freund’s Adjuvant Incomplete) gemischt und als Emulsion verabreicht. An den Tagen 26 und 27 wurden jeweils 20 µg Allergen in 25 µl physiologischer Kochsalzlösung i.tr. appliziert.
Die Tiere der Kontrollgruppe erhielten lediglich eine 0,9%ige NaCl-Lösung gleichen Volumens. Dazu wurden 0,2 ml NaCl-Lösung an den Tagen 0 und 14 i.p. appliziert sowie
50 µl i.n. an Tag 14 und 25 µl i.tr. an den Tagen 26 und 27.
Abbildung 2.1: Sensibilisierungsprotokoll der ersten Studie (Ova vs. Af). Bei gleicher Applikationsart bekamen die Tiere der ersten Gruppe Ova, die Tiere der zweiten Gruppe Af in derselben Dosierung und die Tiere der dritten Gruppe (Kontrollgruppe) gleiche Volumina einer physiologischen Kochsalzlösung. (i.p.:
intraperitoneal, i.n.: intranasal, i.tr.: intratracheal)
Die Hyperreaktivitätsmessung wurde an Tag 28 mit 5%iger MCh-Lösung an narkotisierten, intubierten Tieren im Ganzkörperplethysmographen durchgeführt. Die Provokations- substanz wurde dabei in ansteigender Dosierung vernebelt.
2.3.2 Studie 2: Vergleich von invasiver und nichtinvasiver Lungenfunktions- messung
Bei der zweiten Studie sollte die Messmethodik an der intubierten Maus durch Vergleich mit der bisher verfügbaren Head-out-Plethysmographie, bei der die Tiere sich im Wachzustand befinden, validiert werden. Dazu wurde das von Hogaboam et al. in (Hogaboam et al., 1999) publizierte Af-Protokoll verwendet. Das Sensibilisierungs-
Sensibilisierung Boosterung Challenge
Tag 0 14 26 27 28
i.p. i.p. + i.n. i.tr.
Ovalbumin: (n=12)
10 µg Ova 10 µg Ova 10 µg Ova 20 µg Ova Aspergillus: (n=12)
10 µg Af 10 µg Af 10 µg Af 20 µg Af
Kontrolle: (n=12)
0,2 ml NaCl 0,9 % 0,2 ml NaCl 0,9 % 50 µl NaCl 0,9 % 25 µl NaCl 0,9 % Hyper- reaktivität
protokoll ist in Abbildung 2.2 grafisch wiedergegeben.
Abbildung 2.2: Sensibilisierungsprotokoll der zweiten Studie (invasive vs. nichtinvasive Lungenfunktionsmessung). Die Tiere der Allergen-Gruppen bekamen Af in gleicher Dosierung bei identischer Art der Applikation, während die Tiere der jeweiligen Kontrollgruppe gleiche Volumina NaCl erhielten. Die Aufteilung in wache und intubierte Tiere erfolgte zur Lungenfunktionsmessung an Tag 23.
Das Af-Extrakt wurde in 0,9 % NaCl aufgenommen. Aus dieser Stammlösung à 2 mg/ml wurden Gebrauchslösungen von 0,075 mg/ml hergestellt. Davon wurden jeweils 4 ml mit 2 ml IFA gemischt. Die Tiere beider Gruppen wurden zunächst mit jeweils 5 µg Af i.p. und s.c. sensibilisiert. Dabei wurden jeweils Depots von 0,1 ml Emulsion aus Allergenlösung in Adjuvans gespritzt. 14 Tage später wurden 20 µg Af in 50 µl 0,9%iger NaCl-Lösung i.n.
appliziert; am 21. Tag nach der Sensibilisierung wurden dann noch einmal 20 µg Af in 50 µl NaCl-Lösung i.tr. gegeben.
Jeweils eine Kontrollgruppe mit wachen und mit intubierten Tieren bekam entsprechende Volumina physiologischer NaCl-Lösung. An Tag 0 wurden jeweils 0,1 ml i.p. und s.c. verabreicht, an Tag 14 wurden 50 µl i.n. appliziert und an Tag 21 schließlich
Sensibilisierung Boosterung Challenge
Tag 0 14 21 23 i.p. + s.c. i.n. i.tr.
Lungenfunktion Aspergillus intubiert: (n=13)
je 5 µg Af 20 µg Af 20 µg Af
intubiert Kontrolle intubiert: (n=11)
je 0,1 ml NaCl 0,9 % 50 µl NaCl 0,9 % 50 µl NaCl 0,9 % Aspergillus wach: (n=12) je 5 µg Af 20 µg Af 20 µg Af
wach Kontrolle wach: (n=11)
je 0,1 ml NaCl 0,9 % 50 µl NaCl 0,9 % 50 µl NaCl 0,9 % Hyper- reaktivität
IgE BAL
50 µl i.tr. Die Hyperreaktivitätsmessung wurde 48 h nach der letzten Challenge (Tag 23) durchgeführt. Im Anschluss an die Hyperreaktivitätsmessung wurden eine Blutentnahme zur IgE-Bestimmung und eine BAL zum Zweck der Zellzählung und -differenzierung durchgeführt.
2.3.3 Studie 3: Inhalative versus intratracheale Allergenchallenge
Bei der dritten Studie wurde untersucht, ob eine inhalative Boosterung und Allergenchallenge das Modell gegenüber der herkömmlichen i.tr. Challenge verbessern kann. Diese Studie wurde wiederum in Anlehnung an das Hogaboam-Protokoll durchgeführt (s. Abbildung 2.3).
Abbildung 2.3: Sensibilisierungsprotokoll der dritten Studie (Inhalative vs. i.tr. Allergenchallenge). Die Tiere der ersten Gruppe wurden i.tr. provoziert. Bei den Tieren der zweiten Gruppe wurde Af bei der Boosterung und bei der Challenge inhalativ appliziert. Eine entprechende Kontrollgruppe wurde in gleicher Weise mit NaCl behandelt.
Sensibilisierung Boosterung Challenge
Tag 0 14 21 23 i.p. + s.c. i.n. i.tr.
Aspergillus intratracheal: (n=9)
je 5 µg Af 20 µg Af 20 µg Af
i.p. + s.c. inhalativ inhalativ Aspergillus inhalativ: (n=9)
je 5 µg Af Af 1 %, 12 min Af 2 %, 10 min Kontrolle: (n=9)
je 5 µg Af NaCl 0,9 %, 12 min NaCl 0,9 %, 10 min Früh-
reaktion
Hyper- reaktivität
IgE BAL
Die Tiere wurden zunächst wie bei der vorherigen Studie mit jeweils 5 µg Af in 0,1 ml Emulsion i.p. und s.c. sensibilisiert. 14 Tage später wurde die erste Gruppe mit 20 µg Af in 50 µl 0,9%iger NaCl-Lösung i.n. geboostert, die zweite Gruppe dagegen durch 12-minütiges Vernebeln einer 1%igen Af-Lösung in einer Plexiglasbox mit Hilfe des Inhaliergeräts PariMaster® (LC-Star, MMAD 2,8 µm, Pari-Werke, Starnberg). Die inhalative Dosis wurde dabei anhand eines Gravimetriefilters abgeschätzt, der am Abfluss des Aerosolstroms eingebaut wurde, und betrug ca. 24 µg. Bei nasenatmenden Mäusen mit einem Depositionsfaktor von ca. 6 % betrug die deponierte Dosis hierbei etwa 1 µg. Die Challenge wurde an Tag 21 nach der Sensibilisierung durchgeführt: Bei der ersten Gruppe wurden 20 µg Af in 50 µl 0,9%iger NaCl-Lösung i.tr. appliziert. Bei den Tieren der zweiten Gruppe, die sich während der Challenge im Ganzkörperplethysmographen befanden, wurde eine 2%ige Af-Lösung 10 Minuten lang mit Hilfe des am Fraunhofer ITEM entwickelten Aerosolgenerationssystems „Bronchy III“ vernebelt (vgl. Abbildung 2.7). Die inhalative Dosis wurde mittels eines Dosiskontrollsystems konstant gehalten und betrug 8 µg. Daraus ergab sich eine deponierte Dosis von ca. 6 µg.
Die Kontrollgruppe wurde wie die Tiere der anderen beiden Gruppen i.p. und s.c.
sensibilisiert. An Tag 14 wurde den Tieren eine 0,9%ige NaCl-Lösung verabreicht, die 12 Minuten lang vernebelt wurde. An Tag 21 wurde die isotone NaCl-Lösung 10 Minuten lang vernebelt. Auch bei diesen Tieren wurde zeitgleich zur Inhalation die Lungenfunktion im Ganzkörperplethysmographen gemessen. Die Hyperreaktivitätsmessung (unspezifische Provokation mit MCh) fand wiederum an Tag 23 statt. Es folgten eine Blutentnahme und eine BAL zum Zweck der IgE-Bestimmung und der Zelldifferenzierung.
2.3.4 Studie 4: Einfluss von Surfactantprotein D auf die allergische Atemwegsreaktion
Im Rahmen der letzten Studie wurde der Einfluss von Surfactantprotein D (SP-D) auf die allergische Reaktion untersucht. Die Allergenchallenge mit Af erfolgte aufgrund der Vorergebnisse inhalativ. Abbildung 2.4 gibt einen Überblick über das Sensibilisierungs- protokoll.
Zunächst wurden alle Tiere mit jeweils 5 µg Af in 0,1 ml NaCl-IFA-Emulsion i.p.
und s.c. sensibilisiert. Bei der Boosterung am 14. Tag nach der Sensibilisierung wurde dann eine 0,54%ige Af-Lösung mit Hilfe des Inhaliergeräts PariMaster® 12 Minuten lang vernebelt. Die Lösungskonzentration war dem höheren Proteingehalt der Allergencharge im Vergleich zur vorherigen Studie angepasst worden. Die deponierte Dosis betrug ca.
2 µg bei einer gravimetrisch bestimmten inhalativen Dosis von ca. 30 µg. An den Tagen 19 und 20 erhielten die Tiere der Behandlungsgruppe prophylaktisch SP-D i.n., und zwar in einer Dosis von 0,15 mg pro kg Körpergewicht in einem Volumen von 50 µl mit isotoner NaCl-Lösung. Die Dosierung wurde in Anlehnung an (Takeda et al., 2003) und (Madan et al., 2001) gewählt. Bei dem Surfactantprotein handelte es sich um rekombinantes Fragment von humanem SP-D (rfhSP-D).
Abbildung 2.4: Sensibilisierungsprotokoll der vierten Studie (Prophylaktische Surfactantgabe). Die Tiere der Positivkontrollgruppe bekamen kein Surfactantprotein, während die Tiere der Negativkontrollgruppe lediglich bei der Sensibilisierung mit Af in Kontakt kamen. Die Mäuse der SP-D-Gruppe erhielten ein rekombinantes Fragment des humanen SP-D in einer Dosis von 0,15 mg/kg Körpergewicht.
Bei der Challenge (Tag 21) wurde Af 2 % in Wasser G (Chromasolv®) 10 Minuten lang vernebelt. Dazu wurde das am Fraunhofer ITEM entwickelte Aerosolgenerationssystem
Sensibilisierung Boosterung Behandlung Challenge
Tag 0 14 19 20 21 23 i.p. + s.c. inhalativ i.n. inhalativ Positivkontrolle: (n=16)
je 5 µg Af Af 0,54 %, 12 min 50 µl NaCl 0,9 % Af 2 %, 10 min SP-D: (n=17)
je 5 µg Af Af 0,54 %, 12 min rfhSP-D Af 2 %, 10 min 0,15 mg/kg
Negativkontrolle: (n=14)
je 5 µg Af NaCl 0,9 %, 12 min 50 µl NaCl 0,9 % Wasser G, 10 min Früh-
reaktion
Hyper- reaktivität
IgE BAL
„Bronchy III“ verwendet. Die inhalative Dosis betrug 8 µg, die deponierte Dosis ca. 6 µg.
Die Challenge wurde im Ganzkörperplethysmographen durchgeführt, um gleichzeitig die allergische Frühreaktion messen zu können.
Die Tiere der Positivkontrollgruppe wurden bei der Sensibilisierung, der Boosterung und der Challenge genauso wie die anderen Tiere behandelt. Anstelle einer Surfactantgabe wurden jedoch 50 µl einer isotonen NaCl-Lösung i.n. appliziert. Die Tiere der Negativkontrollgruppe kamen nur bei der Sensibilisierung mit dem Allergen in Berührung, und zwar genauso wie die Tiere der übrigen Gruppen. Bei der Boosterung wurde statt der wiederholten Gabe des Allergens eine 0,9%ige NaCl-Lösung 12 Minuten lang vernebelt.
Zum Zeitpunkt der prophylaktischen Surfactantgabe erhielten die Kontrolltiere 50 µl isotone NaCl-Lösung i.n. Für die Challenge wurde das Vehikel Wasser G, (-Chromasolv®) für eine Dauer von 10 Minuten inhaliert. Bei der Hyperreaktivitätsmessung (Tag 23) wurden alle Tiere mit einer 5%igen MCh-Lösung provoziert. Im Anschluss an die Hyperreaktivitätsmessung wurden wie bei den vorherigen Studien eine Blutentnahme und eine BAL durchgeführt.
2.4 Lungenfunktionsmessungen an der intubierten und der wachen Maus
In diesem Abschnitt wird die Messmethodik an der intubierten und an der wachen Maus im Ganzkörper- bzw. Head-out-Plethysmographen beschrieben. Zunächst wird auf die Narkose bei der intubierten Maus eingegangen. Anschließend werden die physikalischen Grundlagen der Messmethodik erläutert. Dann wird der Versuchsaufbau bei der intubierten und der wachen Maus beschrieben. Schließlich wird der tatsächliche Messvorgang dargestellt und die Auswertung der gemessenen Parameter beschrieben. Zunächst wird auf die Allergenchallenge und allergische Frühreaktion eingegangen und schließlich die Messung der Hyperreaktivität bei der intubierten und der wachen Maus beschrieben. Die Messmethodik der intubierten Maus wurde bei allen Studien benutzt. Die Head-out- Plethysmographie mit den wachen Tieren wurde lediglich in der 2. Studie verwendet.
2.4.1 Narkose
Im Rahmen der ersten Studie wurde eine volatile Methode der Narkotisierung mit einer injizierbaren Narkose verglichen. Dazu wurden die drei Versuchsgruppen jeweils in zwei Untergruppen aufgeteilt, bei denen die beiden unterschiedlichen Narkosearten angewandt wurden. Da die kostengünstigere und umweltschonendere Injektionsnarkose keinen signifikanten Einfluss auf die Hyperreaktivität hatte, wurde sie auf die weiteren Studien übertragen.
Bei der inhalativen Methode wurde zunächst eine Pränarkose angewandt. Dazu wurde eine 2%ige Propofol-Lösung mit Ringer-Laktat im Verhältnis 1:4 verdünnt. 0,15 ml dieser Lösung wurde den Tieren i.p. appliziert, d. h. 0,75 mg pro Tier. Anschließend wurden die Tiere in einer Narkose-Box einem 4%igen Halothan-Luft-Gemisch ausgesetzt.
Nach der Intubation wurden die Mäuse über den Tubus unter Narkose gehalten, wobei ein 1,5%iges Halothan-Luft-Gemisch verwendet wurde.
Als injizierbare Narkose wurde in Anlehnung an (Brown et al., 1999) und (Green et al., 1981) eine Kombination aus Metomidat und Fentanyl verwendet. Die initiale Dosierung von Metomidat betrug 60 mg/kg Körpergewicht, die von Fentanyl 0,06 mg/kg.
Das Gemisch wurde i.p. appliziert.
Mit den zunächst verwendeten Dosen Metomidat und Fentanyl waren die Tiere während der ersten Studie sehr lange in Narkose (etwa 60 Minuten), außerdem war die Atmung flach und langsam. Daher wurde die initiale Dosierung bei der zweiten Studie reduziert, und zwar auf 37,5 mg/kg Körpergewicht bei Metomidat und auf 0,038 mg/kg bei Fentanyl.
Da es vor allem durch das Fentanyl zu einer Atemdepression und damit zu einer geringeren Ausschöpfung des Allergenaerosols bei inhalativer Challenge kam, wurde vor Beginn der dritten Studie die Fentanyldosis nochmals um die Hälfte reduziert. Eine ausreichende Analgesie blieb aufgrund der quasi-nichtinvasiven Methode der Intubation gewährleistet. Bei der dritten und vierten Studie wurde Fentanyl daher in einer Anfangsdosis von 0,019 mg/kg Körpergewicht appliziert. Nachdosierungen erfolgten ggf.
zu ca. 50 % des initialen Bolus. Die Narkosetiefe wurde durch den Verlust des Zwischenzehenreflexes überprüft.
2.4.2 Grundlagen der Lungenfunktionsmessung
Die Messung der Lungenfunktionsparameter an der intubierten Maus basierte auf der Technik an intubierten Ratten (Hoymann et al., 1998), die wiederum auf Arbeiten von Mauderly und Mitarbeiter fußte (Likens et al., 1982). Unter Nutzung der in (Brown et al., 1999) beschriebenen Intubation wurde die Messtechnik für die Maus entprechend modifiziert. Außerdem wurde ein in Kooperation mit Hugo-Sachs-Elektronik/
Harvard Apparatus GmbH, March-Hugstetten entwickelter, neuartiger Plethysmograph verwendet (s. Abbildung 2.6).
Die relevanten Parameter wurden aus zwei gemessenen Primärsignalen berechnet:
Über einen Pneumotachometer, ein Plexiglasrohr mit 1 mm Innendurchmesser, der mit einem Trachealtubus verbunden war, wurden Druckdifferenzen aufgenommen. Die gemessene Druckdifferenz innerhalb des Pneumotachometers ist proportional zum Atemfluss F. Aus F konnte das Atemzugvolumen VT („tidal volume“) nach der Formel
VT = ∫t F
berechnet werden. Zusätzlich erhielt man durch computergestützte Analyse aus dem Flusssignal die Atemfrequenz f und den mittelexpiratorischen Fluss EF50. Dieser entspricht dem Atemfluss (in ml/s), der zu dem Zeitpunkt erreicht wird, wenn VT während der Expiration auf 50 % des Maximalwerts abgefallen ist (s. Abbildung 2.5) und kann nach (Glaab et al., 2002) als Index einer Bronchokonstriktion benutzt werden. Zusätzlich wurde das Atemminutenvolumen MV als Produkt von VT und f errechnet:
MV = VT × f
Zeitgleich zur Flussmessung wurde der transpulmonale Druck PTPindirekt über einen Ösophaguskatheter gemessen. Damit konnten die Lungenresistance RL, die den Atemwegs- widerstand wiedergibt, und die dynamische Compliance Cdyn bestimmt werden. RL ist definiert als Quotient aus Druckdifferenz und Flussdifferenz:
RL = ∆PTP ∆F
RL ist ein direktes Maß für eine Atemwegsverengung, z. B. durch Konstriktion der Bronchien, während EF50 ein indirektes Maß ist, weil hier die Druckkomponente des Widerstands feht. Die Cdyn ergibt sich aus der Änderung des Atemvolumens ∆VT bei Änderung des transpulmonalen Drucks ∆PTP. Sie beschreibt das Verhältnis von ∆VT zu
∆PTP über einem festen Zeitintervall:
Cdyn = ∆VT ∆PTP
Abbildung 2.5: Berechnung des mittelexpiratorischen Flusses EF50 (in ml/s). Positive Werte von F bedeuten Inspiration, negative Werte Expiration. VT wurde durch Integration aus F berechnet. EF50 ist der expiratorische Atemfluss, wenn 50 % von VT ausgeatmet ist. a) Die linke Seite zeigt den typischen spontanen Atemfluss einer BALB/c-Maus mit sinusoidalem Muster. b) Die Inhalation von MCh verändert das normale Atemmuster in eine eher rechteckige Kurvenform, so dass EF50 reduziert wird (rechte Seite).
Die Compliance ist ein Maß für die Dehnbarkeit der Lunge und setzt sich aus einer elastischen Komponente und einer strömungsabhängigen Widerstandskomponente zusammen. Die bei spontaner Atmung gemessene Cdyn ist im Gegensatz zur statischen Compliance Cstat wesentlich mehr durch den Atemwegswiderstand beeinflusst als durch die Elastizität des Lungengewebes. Cdyn spiegelt im Gegensatz zu RL mehr das Geschehen in den kleinen Atemwegen wider. Besonders bei der Hyperreaktivitätsmessung mit MCh an Mäusen hat sich Cdyn gegenüber RL als weniger sensitiv erwiesen (vgl. Glaab et al. 2001;
Martin et al., 1988). Daher wurde in dieser Arbeit nur RL dargestellt.
Die Aufnahme der Messwerte und die Berechnung der nicht direkt messbaren Parameter erfolgte mit Hilfe der Software HEM® (Version 3.4, Firma Notocord®, Croissy, Frankreich). Im Gegensatz zur isovolumetrischen Methode nach (Amdur et al., 1958) verwendet Notocord jedoch eine Integrationsmethode über Fluss-, Druck- und Volumen- veränderungen, basierend auf der Methode der Kovarianzverhältnisse nach (Roy et al., 1974), um die Streuung der Rohdaten weiter zu reduzieren. RL und Cdyn wurden über einen ganzen Atemzyklus gemittelt. Die daraus resultierenden Kurven wurden mit Hilfe von HEM® aufgezeichnet. Die Software verfügt über eine Schnittstelle zu Microsoft Excel®.
Mit Hilfe von Excel® wurden alle Rohdaten tabellarisch festgehalten. Von den RL-Werten wurde der Widerstand des Trachealtubus (0,63 cm H2O/(ml/s)) subtrahiert. Die weiteren Schritte der Auswertung waren bei der Frühreaktions- und bei der Hyperreaktionsmessung verschieden und werden weiter unten in den Abschnitten 2.4.5 und 2.4.6 beschrieben.
2.4.3 Versuchsaufbau
2.4.3.1 Ganzkörperplethysmograph mit Inhalationsanlage
Die intubierte Maus wurde auf dem Rücken liegend im Ganzkörperplethysmographen platziert. Sie lag dabei kopfwärts leicht ansteigend auf einer Korkplatte, um einer Flüssigkeitsakkumulation in der Kanüle vorzubeugen und den Druck der Abdominalorgane auf die Lunge zu vermindern. Der Plethysmograph wurde durch einen Warmwasserkreislauf zwischen Innen- und Außenwand erwärmt, wobei die Temperatur über einen Thermostat geregelt wurde. Die Körpertemperatur wurde rektal über ein Digitalthermometer mit Ni-Cr-Ni-Sensor gemessen, das mit Hilfe eines geeichten Quecksilberthermometers kalibriert worden war. Auf diese Weise konnte die Körpertemperatur der Maus auch unter Narkose konstant auf 36-38 °C gehalten werden.
Um die Gefahr des Atemstillstands zu minimieren, wurde die Atemluft mit Sauerstoff angereichert. Bei den Versuchen mit volatiler Narkose wurde außerdem ein Gemisch aus Halothan und gereinigter Druckluft zugemischt. Der Luftstrom wurde durch eine Leitung am Atemport, an dem die Maus angeschlossen war, vorbeigeführt, so dass sie frei und spontan daraus atmen konnte (Abb. 2.6).
Abbildung 2.6: Lungenfunktionsmessung im Ganzkörperplethysmographen
Ein konstanter Durchfluss von ca. 0,9 l/min wurde durch eine kritische Düse (Glaskapillare) erreicht, die an eine Vakuumquelle angeschlossen war. Zum Schutz der Glaskapillare vor Verstopfung wurde ein Abluftfilter vorgeschaltet. Der Druck am Tier wurde durch ein Druckmessgerät (Magnehelic) kontrolliert, das mit dem Atemadapter der Maus verbunden war. Der Druck durfte sich nicht mehr als 30 Pascal von der Nulllage wegbewegen, um die Atmung des Tieres nicht zu stören. Einen Überblick über den Aufbau des Messplatzes bei der intubierten Maus bietet die Abbildung2.7.
Die Zufuhr von Allergenen bzw. cholinergen Stimuli erfolgte in Form von Aerosolen
über eine Verneblerstrecke: Die Allergen- und Provokationslösungen sowie die ent- sprechenden Referenzsubstanzen wurden von einem Aerosolgenerationssystem (Flüssig- keitsvernebler „Bronchy Typ III“, entwickelt am Fraunhofer ITEM) vernebelt. Dazu wurde die entsprechende Lösung zunächst aus ihrem Vorratsbehälter in Richtung Verneblerdüse gepumpt. Die Pumpenfrequenz konnte dabei variabel eingestellt werden. Außerdem leitete der mit Druckluft betriebene Aerosolgenerator Zerstäuberluft und Verdünnungsluft zur Düse. Diese Luftflüsse wurden je nach Provokationssubstanz unterschiedlich eingestellt, um Substanzverluste durch Tröpfchenbildung oder Verdünnung zu minimieren. Die Mikrodüse erzeugte je nach Einstellung der Spaltgröße Teilchen mit verschiedenen aerodynamischen Massenmediandurchmessern (MMADs). Das an der Mikrodüse generierte Aerosol verteilte sich von dort in einer senkrecht hängenden Verneblerkammer.
Durch ein eingebautes Thermostat konnte die Manteltemperatur auf einen bestimmten Wert geregelt werden, um feuchte und hygroskopische Aerosole zu trocknen. Anschließend wurde das Aerosol zwecks Rückkühlung und Nachtrocknung der Partikel zusätzlich durch eine Trocknereinheit geleitet, die zwei druckluftumspülte Feuchtetauscher aus Röhrchen mit semipermeablen Membranen enthielt. Nach Durchtritt durch eine kleine Mischkammer wurde ein großer Teil des Aerosolstroms in Richtung Tier durch ein System von Mischkaskaden geleitet. Zum Ausgleich eines Über- oder Unterdrucks war in der Aerosolstrecke eine Überschussleitung angebracht. Sie hatte eine Öffnung nach außen, das Ende war an ein Vakuum angeschlossen. Eine kritische Düse mit vorgeschaltetem Abluftfilter und eine Drucküberwachung per Magnehelic sorgten für einen konstanten Sog in der Überschussleitung (-10 Pascal). Im weiteren Verlauf des Aerosolstroms durch die Edelstahl-Mischkaskaden wurde zuerst Verdünnungsluft vom Mass-Flow-Controller (Massendurchflussregler zur Steuerung der Aerosolkonzentration, vgl. S. 35) eingespeist.
In der zweiten Kaskadenstufe wurde Sauerstoff eingeleitet und bei der ersten Studie zusätzlich ein Narkosegas-Luftgemisch. Die dritte Stufe diente zur Probenentnahme für Messgeräte: Ein Teilstrom wurde zur Messung der Aerosolkonzentration zu einem Aerosolfotometer geleitet. Ein anderer Teil konnte zur Bestimmung des Sauerstoffgehalts und der Konzentration von Narkosegas zu einem filtergeschützten 5-Gas-Monitor (Oxyanga) abgezweigt werden. Die Durchlässigkeit der Fotometerfilter wurde mittels eines Messröhrchens am Luftausgang überprüft. Am Oxyanga ertönte bei Ausfall des Flusses ein Alarmsignal. In den geraden Rohrabschnitten der Mischkaskade unterhalb der Zufuhr von Verdünnungsluft, Sauerstoff und ggf. Narkosegasen befanden sich kleine Mischkammern,
