A potential approach for tracheal reconstruction: biotissue engineering of a tracheal tubular graft

Aus der Klinik Department of General Thoracic Surgery, Hospital Clinic, University of Barcelona, Spain.

A Potential Approach For Tracheal Reconstruction - Biotissue Engineering Of A Tracheal Tubular

Graft

Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover

Vorgelegt von Philipp Jungebluth aus Hannover

Hannover 2010

Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 21.06.2010

Gedruckt mit Genehmigung de Medizinischen Hochschule Hannover Präsident: Prof. Dr. Dieter Bitter-Suermann

Betreuer: Prof. Dr. med. Paolo Macchiarini Referent: Prof. Dr. med. Marius Höper Korreferent: PD Dr. med. Christian Hagl Tag der mündlichen Prüfung: 21.06.2010

Promotionsausschussmitglieder:

Prof. Dr. Tobias Welte

Prof. Dr. Carlos Guzman

PD Dr. Frank Gossé

Abkürzungsverzeichnis

CRP DEM DNA HLA MHC

C-reactive protein

detergent-enzymatic method Deoxyribonucleic acid human leucocyte antigen

major histocompatibility complexes

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis Inhaltsverzeichnis

I. Generierung der trachealen Matrix 1. Einleitung

2. Hintergrund

3. Methodik und Ergebnisse 4. Zusammenfassung

5. Manuskript

II. Nachfolgende Studien 1. Bioreaktor

a) Studie b) Manuskript

2. Funktioneller trachealer Graft – in vivo a) Studie

b) Manuskript

3. From bench to bedside – erste Transplantation im Menschen

a) Studie b) Manuskript

III. Schlussfolgerung

IV. Anhang

1. Literaturverzeichnis 2. Lebenslauf

3. Publikationen

4. Erklärung nach § 2 Abs. 2 Nr. 5 und 6 Promotionsordnung

Danksagung

I.

II.

1 1-2 2-3 3-5 5 6-14

15 15 15-16 17-26 27 27 28-35 36

36-37 38-45

46

47 47-48 49 50-51 52

53

1

I. Generierung der trachealen Matrix

1. Einleitung

Die Behandlung von Erkrankungen im Bereich des Thorax unterliegt – wie auch andere Bereiche der Medizin – einem schnellen Wandel. Medikamente und Behandlungsmethoden, die noch vor einigen Jahren als Mittel der Wahl bezeichnet wurden, sind mittlerweile veraltet und überholt. Trotz intensiver Forschung in diesem Bereich sind sowohl viele angeborene als auch erworbene Erkrankungen derzeit nicht heilbar. Das Ziel muss demnach sein, einerseits bereits bestehende Therapien zu optimieren und andererseits neue Behandlungswege zu beschreiten. Im aktuellen Fokus der Wissenschaft stehen vor allem die regenerative Medizin, das Tissue Engineering und artifizielle Organe beziehungsweise Teilorgane. Der Einsatz künstlicher Organe ist in der Medizin seit einigen Jahrzehnten ein fester Bestandteil geworden, jedoch wurde deren Weiterentwicklung und Verbesserung erst in letzter Zeit stark gefördert. Vor allem an Funktionalität und Praktikabilität wurde für den klinischen Einsatz intensiv gearbeitet.

Trotz aller Fortschritte auf diesem Gebiet stellt das implantierte, künstliche Organ weiterhin einen Fremdkörper für den Empfänger-Organismus dar. Dadurch besteht das Risiko einer Abstoßungsreaktion oder auch einer Aktivierung der Gerinnungskaskade und einer damit verbundenen Thrombemboliebildung. Neben der Problematik der Interaktionen zwischen Empfänger und Organ, sind diese künstlichen Systeme einer progredienten Degeneration unterworfen. Dies bedeutet dann in den meisten Fällen eine erneute Operation, was Morbidität und Mortalität erhöht. Andere Bereiche wie die Regenerative Medizin, das sogenannte Tissue Engineering und die Zelltherapie stecken hingegen noch in ihren Anfängen. Doch auch hier sind ein schneller Wissenszuwachs und erste Therapieerfolge zu verzeichnen. Unterschiedliche Forschungsgruppen haben bereits das außergewöhnliche Potential dieser Wissenschaft entdeckt und beschrieben (1-5). Dennoch beruht das Wissen in diesem Gebiet häufig noch auf reiner Empirie und zufällig eingetretenen Ergebnissen. Die meisten Mechanismen sind unzureichend erforscht und nur unvollständig erklärbar. Für die Medizin ist das Tissue Engineering also ein weites, unerschlossenes Feld. Aufgrund der bisherigen Ergebnisse bestehen jedoch berechtigte Hoffnungen, dass Erkrankungen unterschiedlichster Art mit Hilfe dieser innovativen Verfahren behandelbar werden könnten. Die vorliegende Dissertation befasst sich mit dem Tissue Engineering, also dem Züchten und dem Verändern von Gewebe. Die Arbeit stellt den Herstellungsprozess und die Eigenschaften einer neuartigen trachealen Matrix dar. Diese

2 Matrix dient als Grund- beziehungsweise Trägersubstanz und kann mittels autologer Zellen re- besiedelt werden. Hierdurch wird schließlich die Rekonstruktion der Luftröhre realisierbar.

Im Juni 2008 führte unser Team in Barcelona unter der Leitung von Prof. Dr. med.

P. Macchiarini die weltweit erste klinische Anwendung einer – mit Hilfe von Stammzellen – gezüchteten Trachea durch (6). Hierbei verwendeten wir bereits das von uns entwickelte Verfahren zur Herstellung der Matrix. Im Anschluss an die Erläuterungen zum Herstellungsprozess der Matrix, was den zentralen Punkt dieser Dissertation darstellt, werden die sich anschließenden präklinischen Studien beschrieben, welche letzten Endes die erste erfolgreiche Transplantation im Menschen ermöglichten.

2. Hintergrund

Die kurative Therapie ist bei einer Vielzahl von benignen und malignen Erkrankungen der Luftröhre durch eine primäre Resektion und Anastomosierung der beiden Endstücke möglich (6-8). Unglücklicherweise ist die Länge des resezierbaren Teilstücks auf etwa 1/3 beim Kind und ca. 6 cm beim Erwachsenen beschränkt. Die Deckung größerer Defekte ist aufgrund eines Mangels an rekonstruktivem Gewebe nicht realisierbar. In den letzten Dekaden wurden mannigfaltige chirurgische Techniken und andere Ansätze angewandt, um dieses Fehlen zu beseitigen und eine geeignete tracheale „Prothese“ herzustellen.

Verwendung fanden hierbei biologisches Material wie dezellularisierte Speiseröhren- oder Darmsegmente und unterschiedlich synthetisch hergestellte Trägerstrukturen (9-13). Der Erfolg blieb jedoch aus. Eine mögliche tracheale Allotransplantation hingegen ist mit der Gabe hoher Mengen an Immunsuppressiva verbunden und außerdem technisch hoch anspruchsvoll (14,15).

Das Tissue engineering ist die Methode, der man heute die größten Erfolgsaussichten zuschreibt (6,7,12,16). Dieses Verfahren zielt darauf ab, Gewebe zu verändern, beziehungsweise zu züchten und dadurch schließlich die Funktionalität eines Organs teilweise oder vollständig wieder herzustellen. Ausgangspunkt ist eine geeignete Trägersubstanz, eine sogenannte Matrix, welche dann entweder außerhalb des Körpers mittels in vitro gezüchteter Zellen besiedelt, oder direkt in den Empfängerorganismus implantiert wird, wo eine autologe Besiedlung stattfindet. In der Theorie erscheint dies recht simpel, bei der Umsetzung in die Praxis ergibt sich jedoch eine Vielzahl von Problemen. Am Anfang steht selbstverständlich das Finden der optimalen Matrix. Geeignete Trägerstrukturen müssen auf das jeweilige Organsystem und deren Anforderungen angepasst sein. Überlegungen dazu und Lösungsansätze sind ebenfalls Thema dieser Dissertation. Eine Matrix, die der trachealen

3 Rekonstruktion dienen soll, muss unterschiedlichste Charakteristika aufweisen. Als tracheale Matrix sollte sie in allererster Linie immunogen unbedenklich sein, also für das Immunsystem des Empfängers als „nicht-fremd“ erscheinen. Der Erfolg einer Transplantation ist in erster Linie davon abhängig, ob der Empfängerorganismus das Spenderorgan oder das Implantat annimmt. Kommt es zur Abstoßung, egal ob akut oder chronisch, beruht diese auf immunologischen Prozessen zwischen Empfänger und Spender. Hauptverantwortlich dafür sind vor allem spezielle Abschnitt auf der DNA-Sequenz der Chromosomen, die sogenannten Haupthistokompatibilitätskomplexe I und II (MHC I, II). Neben dieser immunogenen Eigenschaft sollte die Matrix einerseits stabil genug sein, um beispielsweise bei der Expiration nicht zu kollabieren (6). Andererseits muss eine gewisse Flexibilität erhalten bleiben, um die Beugung und Streckung des Kopfes ohne Einschränkungen zu gewährleisten und sich zusätzlich an die anatomischen Umgebungsstrukturen anzupassen, ohne dabei als Fremdkörper oder etwas Störendes wahrgenommen zu werden. Weitere Anforderungen bestehen in Luft- und Flüssigkeitsimpermeabilität, um eine Emphysem- oder Ödembildung zu vermeiden, da diese mit Dysfunktionen verbunden wären. Das Ziel dieser Arbeit war es also primär eine Matrix zu entwickeln, die alle diese Eigenschaften in sich vereint, und das Herstellungsverfahren zu evaluieren, validieren und standardisieren. Unsere bisherigen Erfahrungen hatten gezeigt, dass die angewendeten Verfahren und Techniken teilweise zu einem Erfolg führen können, die Durchführung dieser jedoch mit einem immensen Kosten- und Arbeitsaufwand verbunden sind (12,14,15), so dass die Methoden keinesfalls als Standardtherapie klinisch einsetzbar wären. Studien über Transplantation nach Cryopreservation zur Reduktion der Antigenität zeigten bisher unterschiedliche Ergebnisse und werden kontrovers diskutiert, weshalb wir uns auch gegen diese Methode entschieden (17-21).

Basierend auf unseren bisherigen Ergebnissen und Erfahrungen war es also das Ziel dieser Arbeit ein neuartiges Verfahren zu entwickeln, mit welchem die optimale tracheale Matrix bei gleichzeitiger Reproduzierbarkeit einfach und sicher generiert werden kann.

3. Methodik und Ergebnisse

Für unsere Studie verwendeten wir 25 Yorkshire Schweine (42.4±3.3 kg) und 16 Mäuse (CD-1, Charles River Laboratorien). Die Versuchsreihe wurde von der Ethikkommission für Tierhaltung und Tierversuchskunde der Universität Barcelona, Spanien, geprüft und genehmigt. Bei 13 Schweinen wurde jeweils die gesamte Luftröhre (mit 12 cm Länge) explantiert. Sie wurde nach dem Entfernen und der Reinigung von anliegendem

4 Gewebe einem Verfahren unterzogen, welches sich aus einer Vielzahl von „Waschzyklen“

wechselnder Lösungen zusammensetzte. Ein Zyklus bestand aus einer jeweils 4-stündigen Inkubationszeit in Sodium Deoxycholate und DNase+NaCl. Es folgten mehrere Waschzyklen des Gewebes über 48h in speziell aufbereitetem Wasser (Aqua milliQ) bei 4° C. Nach jedem Zyklus wurden histologische und immunhistochemische Schnitte der Luftröhre angefertigt, um den Status der noch verbliebenen Antigen-präsentierenden Zellen zu bestimmen. Technisch wurde dies über die Bestimmung der Haupthistokompatibilitätskomplexe I und II (MHC I, II) mit Hilfe spezieller Antikörper realisiert. Die MHC I und II Abschnitte auf der DNA im Inneren einer Zelle kodieren für die Ausbildung von Antigenen und sind maßgeblich an Abstoßungsreaktionen des Körpers nach Transplantation beteiligt. Die Bestimmung der Zellzahl und deren Darstellung wurde mit Hilfe einer klassischen Hämatoxilin-Eosin Färbung durchgeführt. Nach 17 Zyklen unseres Dezellularisierungsprozesses konnten erstmals keine Antigene mehr nachgewiesen werden, auch wenn noch einige Chondrozyten in den Präparaten enthalten waren. Bei einer Erhöhung auf 20 Zyklen blieb das Gewebe weiterhin Antigen-frei, jedoch konnte auch so keine komplette Zellentfernung erreicht werden. Bevor wir die Matrix in vivo in einem Tiermodel testen konnten, wurde die Materialbeschaffenheit des Gewebes überprüft, da der Graft bei Instabilität ungeeignet gewesen wäre. Die behandelten Luftröhren wurden mit Hilfe einer Zugmaschine (Zwick und Roell), welche der Stabilitätstestung von Materialien dient, auf ihre Zug- und Reißfestigkeit hin geprüft und mit der nativen unbehandelten Trachea verglichen. Bei dieser Testung zeigte sich, dass die Luftröhren, welche höchstens 17mal den Waschvorgang durchlaufen hatten, zwar geringfügig veränderte Deformitätsparameter und niedrigere Zugmaxima erreichten, diese Werte jedoch statistisch nicht relevant von denen der nativen Luftröhren abwichen. Erhöhte man jedoch die Anzahl der Zyklen, verlor das Gewebe erheblich an Zugfestigkeit und zeigte statistisch signifikante Veränderungen. Nachdem sämtliche in vitro Tests abgeschlossen waren, wurde die Matrix sowohl in einem Xenotransplant- (in Mäusen; n=16), als auch in einem Allotranplant-Model (in Haupthistokompatibilitätsmerkmal- MHC - ungleichen Schweinen; n=12) getestet. In beiden Tiermodellen wurde auf die Gabe von immunsuppressiven Medikamenten verzichtet.

Die Empfängertiere wurden zufällig 2 Gruppen mit jeweils sechs Schweinen beziehungsweise 8 Mäusen zugeteilt. Nach Einleitung der Anästhesie und Intubation wurde den Tieren wahlweise ein Gewebestück der Matrix oder eines der nativen Trachea subkutan in die Leistenregion (bei Schweinen) oder auf den Rücken (bei Mäusen) implantiert und für 30 Tage dort belassen. Während dieses Zeitraums wurden wöchentliche Biopsien des implantierten Gewebes vorgenommen, dazu wurden die Tiere jedes Mal anästhesiert und intubiert. Bei den

5 Mäusen wurden jede Woche zwei Tiere aus beiden Versuchsgruppen zur Gewinnung der Proben verwendet. Die von den Tieren entnommenen Blutproben wurden auf die Ausbildung von Antikörpern oder erhöhten inflammatorischen Parametern hin untersucht. Anzeichen einer Gewebeabstoßung oder schwerer inflammatorischer Prozesse während der täglichen 24- stündigen Beobachtung hätten zur vorzeitigen Tötung der Tiere geführt. Die mikroskopische und makroskopische Analyse sämtlicher entnommener Proben und die postmortale Auswertung der verbliebenen Gewebestücke ergaben eine signifikante Verringerung bzw. geringere Ausprägung aller inflammatorischer Parameter (Leukozyten, Makrophagen, P-Selektin) bei Tieren mit implantierter gezüchteter Matrix im Vergleich zu denen, welche die native Trachea erhalten hatten.

4. Zusammenfassung

Das hier beschriebene Verfahren hat sich als einfache, sichere und leicht reproduzierbare Methode zur Herstellung einer trachealen tubulären Matrix erwiesen. Die so generierte Matrix erfüllt alle notwendigen Voraussetzung, die an einen trachealen Graft gestellt werden müssen, wie zum Beispiel Stabilität, Flexibilität sowie Impermeabilität und ähnelt daher in seiner Beschaffenheit der nativen Trachea. Die Tatsache, dass es sich hierbei um eine Matrix frei von Antigen-präsentierenden Zellen handelt, ermöglicht eine bedenkenlose Xeno- als auch Allotransplantation. Dabei kann auf die zusätzliche Gabe von Immunsuppressiva vollständig verzichtet werden, was für die klinische Anwendung einen erheblichen Vorteil bringen und die Lebensqualität möglicher Patienten maßgeblich verbessern würde.

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II. Nachfolgende Studien

1. Bioreaktor a) Studie

Nach der erfolgreichen Herstellung und der Evaluierung der Matrix folgten erste Versuche der zellulären Re-besiedlung. Hierbei ergaben sich aufgrund der Morphologie im Vergleich zur Besiedlung einer planen Struktur eine Reihe von Problemen. Die weiteren in vivo Studien wurden aufgrund der physiologisch-anatomischen Ähnlichkeiten dann nur noch an Schweinen durchgeführt und somit das Xenotransplantmodel verlassen.

Die von uns bei der Besiedlung eingesetzten Zellen wurden im Vorfeld isoliert und in vitro kultiviert. Für die externe Fläche der Matrix, also die Außenseite des trachealen Grafts, wurden Stammzellen mittels Knochenbiopsie aus der Crista iliaca der Schweine entnommen, welche dann, unter Einsatz von spezifischen Wachstumsfaktoren zu Knorpelzellen differenzierten und immunohistochemisch nachgewiesen wurden. Für die interne Fläche wurden Epithelzellen durch endotracheale Biopsieentnahmen aus denselben Tieren gewonnen.

Mehrere missglückte Versuche, die Zellen intern und extern über eine Pipette direkt auf die Matrix aufzubringen und diese im Anschluss daran in ein mit Medium gefülltes Gefäß zu überführen, verdeutlichten, dass diese Art der Besiedlung nicht zum Erfolg führen würde.

Einerseits gestaltete sich vor allem die interne Besiedlung der Matrix als äußerst schwierig, andererseits war es nicht möglich die beiden Zellarten mit unterschiedlichen Nährmedien zeitgleich zu versorgen. Hinzu kam das Problem einer unbefriedigenden Sterilität beim Auftragen der Zellen. Die damit verbundene Kontamination des Gewebes durch Pilze und Bakterien konnte trotz Zusatz von Antimykotika und –biotika nicht verhindert werden. Gelöst wurden diese Probleme schließlich mit dem Einsatz eines neuartigen Bioreaktors, den wir zusammen mit einer Forschungsgruppe für Bio-Techno-Engineering der Universität Mailands - Politecnico de Milano - entwickelten. Der Reaktor ermöglicht die Kultivierung der Zellen unter Verwendung getrennter Nährmedien, so dass sowohl den Chondrozyten, als auch den Epithelzellen, das optimale Medium zugeführt werden kann, ohne dass es zu einer Vermischungen beider kommt. Auch die Besiedlung der inneren Fläche der Matrix war nun mittels Reaktor ohne Probleme möglich. Während des gesamten Besiedlungs- und Kultivierungsvorgangs traten keinerlei Kontaminationen oder Verunreinigungen mehr auf.

Einen weiteren Vorteil, den der Reaktor gegenüber einer herkömmlichen Kultivierung besitzt, ist eine neuartige dynamische Vorgehensweise. Hierbei rotiert ein mit der Matrix bestückter Kolben bei vorgegebener Geschwindigkeit um die eigene Achse und wechselt zwischen

16 Flüssigkeits- und Gasphase. Die induzierte Bewegung stellt für die besiedelten Zellen eine Art

„Stress“ dar, welcher sich, auf unsere vorangegangene Versuche und Erfahrungen stützend, gegenüber einer statischen Kultivierung, als überaus günstig und vorteilhaft in Hinblick auf die Ausbildung des Phänotyps der Zellen erwiesen hat.

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2. Funktioneller trachealer Graft – in vivo a. Studie

Nachdem wir den Bioreaktor auf das Besiedeln und Kultivieren einer tubulären Struktur abgestimmt und dahingehend konstruiert hatten, konnten wir mit den in vivo Studien fortfahren. Hierzu verwendeten wir ein orthotopes Transplantationsmodel im Schwein. Unsere vorangegangenen Studien hatten gezeigt, dass für die nahezu vollständige Besiedlung einer 6 cm langen Matrix mittels Bioreaktors etwa 72h benötigt werden. Diese Erkenntnisse bildeten die Grundlage unseres weiteren Vorgehens. Während der 3-monatigen Überwachungs- und Beobachtungszeit der Versuchstiere ergaben sich einige wichtige Erkenntnisse für die spätere klinische Anwendung. Bei keinem der Versuchstiere konnte ein Anhalt für eine akute Abstoßungsreaktion festgestellt werden, obwohl auch bei dieser Studie auf jegliche Gabe von Immunsuppressiva verzichtet wurde. Die Langzeitergebnisse variierten zwischen den einzelnen Gruppen jedoch sehr stark. Schließlich konnten wir beweisen, dass nur diejenigen Tiere eine gute Langzeitprognose aufwiesen, bei denen eine beidseits besiedelte Matrix implantiert worden war. Die Tiere, welche nur mittels azellulärer, unbesiedelter oder einseitig besiedelter Matrix versorgt worden waren, entwickelten Dysfunktionen unterschiedlichster Art, welche zu einer signifikant kürzeren Lebensdauer und zu respiratorischen Funktionseinschränkungen führten.

Für die klinische Anwendung konnten wir zeigen, dass die Grafts aus immunologischer Sicht unbedenklich sind und daher auf eine Immunsuppression der Patienten vollständig verzichtet werden kann. Um die Funktionalität des Grafts zu gewährleisten ist dessen beidseitige zelluläre Besiedlung jedoch unbedingt notwendig.

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3. From bench to bedside – Erste Transplantation im Menschen a) Studie

Nach Auswertung aller vorheriger Studienergebnisse und der dadurch begründeten Genehmigung durch die Ethikkommission der Universität von Barcelona, entschieden wir uns, unser Verfahren erstmalig am Menschen anzuwenden. Die Patientin, eine 30-jährige junge Frau, litt seit Jahren an schwerer, nun stark progredienter Dyspnoe, welche aufgrund einer ausgeprägten Stenose, vor allem im Bereich des linken Hauptbronchus, aufgetreten war.

Vorherige Operationen und die Stentimplantation führten bisher nur zu kurzweiliger Besserung. Die durchweg schlechte Belüftung hatte persistierende Atemwegsinfekte zur Folge.

Ihre Lebensqualität beurteilte die Mutter zweier Kinder als sehr schlecht, da sie am „normalen“

gesellschaftlichen Leben nicht mehr teilnehmen könne. Als ultima Ratio stand nun nur noch die linksseitige Pneumonektomie mit eventueller Lungentransplantation zur Diskussion. Im November 2007 erfolgte bei einer 51-jährigen Organspenderin, nachdem diese aufgrund einer zerebralen Blutung verstorben war, die Explantation der Trachea und die, dem beschriebenen Verfahren folgende, Dezellularisierung des Gewebes. Am Ende dieses Prozesses stand eine immunologisch-unbedenkliche tracheale Matrix, ohne Nachweis von Haupthistokompatibilitätskomplexen (MHC) I und II. Anhand von Luftröhren anderer Organspender, konnten wir parallel dazu weitere Tests, bezüglich der Gewebestabilität und - Beschaffenheit durchführen.

Der Empfängerin unserer generierten Trachea wurden im Februar 2008 Epithelzellen mittels endotrachealer Biopsie und Stammzellen durch eine Knochenmarkaspiration entnommen. Aus dem Knochenmarkaspirat wurden nun die mesenchymalen Stammzellen isoliert und beide Zelllinien gesondert für einige Passagen kultiviert. Schließlich wurden die Stammzelle mit Hilfe von speziellen Wachstumsfaktoren zu Chondrozyten differenziert. Bei der Besiedlung der humanen Matrix benutzen wir eine modifizierte Version des vormals beschriebenen Bioreaktors. Vom Tag der Entnahme der Spendertrachea bis zur Transplantation, der von uns gezüchteten Trachea vergingen ca. 7 Monate. Bereits am 10. Tag postoperativ (p.o.) konnte die Patientin entlassen werden und erfreut sich seitdem bester Gesundheit. Die im September durchgeführten Belastungstests ergaben eine Gehstrecke von 500m und noch eingeschränktes Treppensteigen. Vor allem aber, war es der Patientin schon zu diesem Zeitpunkt möglich, ihre Kinder ohne Probleme zu versorgen. Der Zustand der Patientin hat sich seitdem weiter stabilisiert und verbessert. Die seit der Transplantation regelmäßig durchgeführten Untersuchungen ergaben weder Hinweise auf

37 eine Abstoßungsreaktion (kein Nachweis von HLA-Antikörper), noch auf ein Infektion (CRP, Leukozyten, etc). Weiterhin wurden 3 Monaten nach der Operation Lungenfunktionstests durchgeführt, deren Werte sich im Normbereich befanden (alters- und geschlechtsspezifisch).

Laserdoppler Untersuchungen zeigten erstmals am 4. Tag p.o. eine Mikrovaskularisation, welche sich in den darauffolgenden Kontrollen weiter ausbildete und durch leichte Blutung bei Biopsie-Entnahme bestätigt werden konnte . Einen Monat nach der Transplantation war kaum noch ein Unterschied zwischen dem Graft und der normalen Trachea der Patientin auszumachen.

Hervorzuheben ist, neben der erstmaligen Transplantation einer vollständig gezüchteten Luftröhre und der deutlichen Verbesserung der respiratorischen Funktion der linken Lunge, der erhebliche Zugewinn an subjektiv empfundener und objektiv beurteilbarer Lebensqualität der Patientin. Die Tatsache, dass die Patientin sich der Transplantation unterziehen konnte, ohne zukünftig auf die Einnahme von Immunsupressiva angewiesen zu sein, stellt einen ungeheuren Vorteil und ein Novum gegenüber bisheriger Organtransplantation dar. Das postoperative Risiko an banalen Infekten lebensbedrohlich zu erkranken wird dadurch sicherlich minimiert werden. Unsere andauernden Bemühungen zielen einerseits auf eine Standardisierung und schließlich auf eine Vereinfachung unseres Verfahrens ab, um die gezüchtete Trachea oder andere Gewebearten in naher Zukunft als allgemeingültiges Therapiekonzept anbieten und dadurch Patienten mit inoperablen Erkrankungen neue Hoffnung und Lebensqualität geben zu können. Ein weiterer Vorteil unseres Verfahrens ist außerdem, dass ethische Fragestellungen und Problemen bezüglich des Einsatzes embryonaler Stammzellen bei den von uns verwendeten adulten Stammzellen nicht auftreten und daher völlig vernachlässigt werden können.

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III. Schlussfolgerung

Versuche die Trachea bei langstreckigen pathologischen Veränderungen zu ersetzen schlugen bisher fehl. Es war das Ziel eine Methode zu entwickeln, durch welche die tracheale Rekonstruktion ermöglicht wird. Die vorgestellte Arbeit beschreibt die Generierung einer neuartigen trachealen Matrix. Es werden die Anforderungen an eine solche Matrix verdeutlicht und Schwierigkeiten in der Herstellung dargelegt. Außerdem erfolgte die Evaluation der Matrix in einem allo- und einem xenotransplant Tiermodel bei gleichzeitigem Verzicht auf Immunsuppressiva, wodurch die immunologische Unbedenklichkeit bewiesen werden konnte.

Die entwickelte Matrix stellt einen optimalen Graft bei der Rekonstruktion der humanen Luftröhre dar. Dies konnte in den nachfolgenden Studien und schließlich durch die erste Transplantation im Menschen gezeigt werden.

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IV. Anhang

1. Literaturverzeichnis

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11.Brown BN, Barnes CA, Kasick RT, Michel R, Gilbert TW, Beer-Stolz D, et al. Surface characterization of extracellular matrix scaffolds Biomaterials 2010;31:428-37.


12.Macchiarini P, Walles T, Biancosino C, Mertsching H. First human transplantation of a


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2. Lebenslauf

Name: Philipp Jungebluth

Geburtsdatum und –ort: 30.08.1980 in Hannover

Familienstand: ledig

Schulbildung: allgemeine Hochschulreife, St. Ursula Schule Hannover 2000

Dienst: Grundwehrdienst in der Sanitätseinheit

Studium Medizinische Hochschule Hannover 2001-2008

Seit Februar 2009 Assistenzarzt in der Abteilung für Thorax-Herz-Gefäßchirurgie im Klinikum Braunschweig bei Herrn PD Dr. W. Harringer

Hannover, den

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3. Publikationen

1. Go T*, Jungebluth P*, Baiguero S, Asnaghi A, Martorell J, Ostertag H, Mantero S, Birchall M, Bader A, Macchiarini P. Both epithelial cells and mesenchymal stem cell-derived chondrocytes contribute to the survival of tissue-engineered airway transplants in pigs. J Thorac Cardiovasc Surg 2010;139(2):437-43.

*Contributed equally to the work

2. Jungebluth P, Go T, Asnaghi A, Bellini S, Martorell J, Calore C, Urbani L, Ostertag H, Mantero S, Conconi MT, Macchiarini P. Structural and morphologic evaluation of a novel detergent-enzymatic tissue-engineered tracheal tubular matrix. J Thorac Cardiovasc Surg 2009;138(3):586-93; discussion 592-3.

3. Asnaghi MA, Jungebluth P, Raimondi MT, Dickinson SC, Rees LE, Go T, Cogan TA, Dodson A, Parnigotto PP, Hollander AP, Birchall MA, Conconi MT, Macchiarini P, Mantero S. A double-chamber rotating bioreactor for the development of tissue-engineered hollow organs: from concept to clinical trial. Biomaterials. 2009;30(29):5260-9.

4. Furlani D, Li W, Pittermann E, Klopsch C, Wang L, Knopp A, Jungebluth P, Thedinga E, Havenstein C, Westien I, Ugurlucan M, Li RK, Ma N, Steinhoff G. A transformed cell population derived from cultured mesenchymal stem cells has no functional effect after transplantation into the injured heart. Cell Transplant. 2009;18(3):319-31.

5. Macchiarini P, Jungebluth P, Go T, Asnaghi MA, Rees LE, Cogan TA, Dodson A, Martorell J, Bellini S, Parnigotto PP, Dickinson SC, Hollander AP, Mantero S, Conconi MT, Birchall MA. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. Lancet. 2008;372(9655):2023-30.

6. Jungebluth P, Iglesias M, Go T, Sibila O, Macchiarini P. Optimal positive end-expiratory pressure during pumpless extracorporeal lung membrane support. Artif Organs.

2008;32(11):885-90.

7. Iglesias M, Jungebluth P, Petit C, Matute MP, Rovira I, Martínez E, Catalan M, Ramirez J, Macchiarini P. Extracorporeal lung membrane provides better lung protection than

51 conventional treatment for severe postpneumonectomy noncardiogenic acute respiratory distress syndrome. J Thorac Cardiovasc Surg 2008;135(6):1362-71.

8. Jungebluth P, Ostertag H, Macchiarini P. An experimental animal model of postobstructive pulmonary hypertension. J Surg Res. 2008;147(1):75-8.

9. Iglesias M, Jungebluth P, Sibila O, Aldabo I, Matute MP, Petit C, Torres A, Macchiarini P.

Experimental safety and efficacy evaluation of an extracorporeal pumpless artificial lung in providing respiratory support through the axillary vessels. J Thorac Cardiovasc Surg 2007;133(2):339-45.

10. Sanchez-Lorente D, Go T, Jungebluth P, Rovira I, Mata M, Ayats M, Macchiarini P.

Single Double-Lumen Venousvenous Pump-Driven Extracorporeal Lung Membrane Support. J Thorac Cardiovasc Surg in press

11. Jungebluth P, Luedde M, Ferrer E, Luedde T, Peinado V, Go T, Schreiber C, von Richthofen M, Bader A, Haag J,Darsow K, BartelS, LangeH, Furlani D, Steinhoff G, Macchiarini P. Mesenchymal stem cells restore lung function by recruiting resident and non- resident proteins. Cell Transplantation in progress

12. Jungebluth P, Brouwer R, Richter M, Harringer W. Delayed occurrence of pulmonary artery stump thrombus after pneumonectomy, a call for attention. European Journal of Radiology in progress

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4. Erklärung nach § 2 Abs. 2 Nr. 5 und 6 Promotionsordnung

Ich erkläre, dass ich die der Medizinischen Hochschule Hannover zur Promotion eingereichte Dissertation mit dem Titel

A Potential Approach For Tracheal Reconstruction - Biotissue Engineering Of A Tracheal Tubular Graft

aus der Departments of General Thoracic Surgery, Hospital Clinic, University of Barcelona, Spain.

unter der Betreuung von Prof. Dr. med. Macchiarini

ohne sonstige Hilfe durchgeführt und bei der Abfassung der Dissertation keine anderen als die dort aufgeführten Hilfsmittel benutzt habe.

Die Gelegenheit zum vorliegenden Promotionsverfahren ist mir nicht kommerziell vermittelt worden. Insbesondere habe ich keine Organisation eingeschaltet, die gegen Entgelt Betreuerinnen und Betreuer für die Anfertigung von Dissertationen sucht oder die mir obliegenden Pflichten hinsichtlich der Prüfungsleistungen für mich ganz oder teilweise erledigt.

Ich habe diese Dissertation bisher an keiner in- oder ausländischen Hochschule zur Promotion eingereicht. Weiterhin versichere ich, dass ich den beantragten Titel bisher noch nicht erworben habe. Ergebnisse der Dissertation wurden/werden in folgendem Publikationsorgan veröffentlicht:

- Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery - Biomaterials

- The Lancet

Hannover, den

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(Unterschrift)

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Danksagung

gewidmet meiner Mama

Ich bedanke mich in besonderem Maße bei meinem „Chef“ und Doktorvater Herrn Prof. Dr.

Dr. med. P. Macchiarini für sein Vertrauen und die außergewöhnliche, weit über die rein wissenschaftlich hinausreichende, Betreuung während der gesamten Zeit. Des Weiteren möchte ich Frau Prof. Dr. Conconi, Herrn Prof. Dr. M. Birchall, Herrn Prof. Dr. H. Ostertag, Frau Prof.

S. Mantero, Herrn Prof. A. Hollander, ebenso Herrn Prof. Steinhoff, Herrn Prof. Bader und Herrn PD Dr. Harringer für die Möglichkeit bei Ihnen lernen und forschen zu dürfen danken.

Mein besonderer Dank gilt Frau Laura Morte für die Unterstützung bei sämtlichen organisatorischen Problemen. Ich danke den Labormitarbeitern und Freunden der Universitäten in Barcelona, dort vor allem Dr. Victor P und Elisabeth, in Padua Silvia und Luca, in Mailand Adelaide, in Bristol Tristan und Louisa, in Rostock Dario, Ralf und Dr. Ma, in Aachen PD Dr.

Tommey Lüdde und PD. Dr. Frank.

Nicht zuletzt bin ich all meinen Freunden, die mich in den letzten Jahren sowohl fachlich als auch menschlich unterstützt und immer wieder vorwärts gebracht haben, zu unendlichem Dank verpflichtet: der gesamten Familie Schreiber: Möppi, Bettina, Moja, Jacki und Anfön – Familie v. Richthofen: Maxi, Christiane, Tini und Großmutti – Felixius, Arndet, Andi – Prof. Henry und Dr. Mark Lüdde – Johle Laptop, Matze, Thilo und Passi – Edgar H. - Laurent, Lena – Monilein, Gevatter, Zirse, Saki und Uzi –Tash, Tzarie - Strudel, Tobi - Chrissi, Sonja, Olaf Son, Timmi – Becksy SM- Familie Schmitzen - Jost, Marc, Mañana - Karina, David, Tetsu, Oriol und die Thoraxchirurgie in Barcelona – der HTG-Braunschweig - Luise, Gesa – Leah - Wolfgang und die Piloten – Ulbrichs Kaffeehaus - die Arpker Jungs - Lisa F. und Floh H. - Agim - Chris, Diana, Annika und Andres – dem schönen Ingo – Moritz, Alex –Jürgen – Bibsen - Familie Lennartz ,der lieben Familie Röhl, und meinem aller liebsten Tzoer.

...und allen anderen, die ich leider vergessen habe...vielen Dank