Schriftliche Prüfung BSc Herbst 2015 Musterlösung

Prüfungen Analytische Chemie Mittwoch, 4. Februar 2015

Schriftliche Prüfung BSc Herbst 2015

D – CHAB/BIOL

Musterlösung

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♦ Jede Aufgabe wird separat bewertet. Die maximal erreichbare Punktzahl beträgt 36.

Die Maximalnote wird mit mindestens 30 Punkten erreicht.

♦ Zeit: 60 Minuten. Teilen Sie sich Ihre Zeit gut ein!

♦ Unleserliche Texte, unklare Formulierungen oder unsaubere Skizzen können nicht bewertet werden. Bitte bemühen Sie sich um eine saubere Darstellung.

♦ Schreiben Sie jedes abzugebende Blatt einzeln mit Ihrem Namen an.

♦ Dieses Deckblatt ist ausgefüllt abzugeben.

♦ Wir bitten Sie um Fairness: Disziplinarverordnung RSETH 361.1

♦ Viel Erfolg!

Aufgabe 1 18 Punkte

Auf den folgenden Seiten finden Sie das IR-, Massen-, ¹H-NMR- und ¹³C-NMR-Spektrum der Verbindung B3. Sie hat folgende Konstitutionen, je nach Umgebung:

O

HO

NH

O

O

NH

+ –

Die Verbindung hat die relative Molmasse M_r = 89. B3 liegt als Festkörper und in wässriger Lösung hauptsächlich als Zwitterion vor. In der Gasphase liegt die linke Spezies vor.

Hinweis zu den ¹H-NMR-Spektren:

B3 wurde in zwei verschiedenen Lösungsmitteln aufgenommen.

D₂O: Protonen, die an O oder N gebunden sind, tauschen in Lösung aus, sie können also von einem Molekül zum nächsten springen. Das gilt auch für die Deuteronen des Lösungsmittels, die chemisch gleich reagieren wie Protonen. Da D₂O in einem grossen Überschuss vorliegt, findet man praktisch alle Protonen auf dem Lösungsmittel. D₂O ist nie vollständig deuteriert.

Das Lösungsmittel enthält also ebenfalls eine kleine, unbekannte Menge Protonen.

CF₃COOH: Trifluoressigsäure ist eine starke Säure, vergleichbar mit HCl. Protonen, die an O gebunden sind, tauschen in Lösung schnell aus. Die chemische Verschiebung ist für alle diese Protonen gleich. Es erscheint also nur ein einziges Signal. Protonen in der Ammoniumgruppe tauschen nur langsam aus. Das führt zu einer kleinen Linienverbreiterung und einer Reduktion der Kopplungskonstanten. Beachten Sie, dass CF₃COOH nicht deuteriert ist.

a) Ordnen Sie die Protonen von B3 den Signalen in den beiden ¹H-NMR-Spektren zu.

Zeichnen Sie die Struktur von B3, wie Sie sie für das Lösungsmittel CF₃COOH erwarten.

Begründen Sie die Zuordnung anhand der Aufspaltungsmuster. (4 Punkte) Zuordnung und Begründung siehe Spektrum.

Das Signal der CH-Gruppe im unteren Spektrum ist ein Multiplett mit nicht aufgelösten Linien.

Die Kopplungskonstante von CH zu NH₃ ist etwas kleiner als CH-CH₃, wie man den beiden Dubletten ansieht. Man erwartet also nicht ein Septett für 6 Nachbarn. Die 16 Linien des erwarteten Aufspaltungsmusters Quartett von Quartett sind nicht alle aufgelöst.

b) Im ¹³C-NMR-Spektrum erscheinen auch die Signale des Lösungsmittels CF₃COOH. Fluor besteht nur aus dem Isotop ¹⁹F, das wie das Proton ein magnetisches Dipolmoment hat.

Daher sind die Kopplungen von ¹⁹F zu ¹³C sichtbar. Die Kopplungskonstanten sind vergleichbar mit jenen von ¹H zu ¹³C. Zeichnen Sie die Struktur des Lösungsmittels.

Ordnen Sie die Signale den C-Atomen des Lösungsmittels zu. Erklären Sie die Auf- spaltungsmuster. Rationalisieren Sie die chemischen Verschiebungen der beiden C-Atome.

5 Punkte)

Zuordnung siehe Spektrum.

Signal bei 117 ppm: Quartett wegen 3 F-Nachbarn in einem Abstand von einer Bindung. Sehr grosse Kopplungskonstante von 290 Hz. Chemische Verschiebung: F gehört zu den stärksten entschirmenden Heteroatomen, stärker noch als O. Trotz aliphatischer Umgebung gerät durch die drei Nachbarn das Signal in den linken Teil des Spektrums oberhalb von 100 ppm.

Signal bei 164 ppm: Quartett wegen 3 F-Nachbarn in zwei Bindungen Abstand. Die

Kopplungskonstante ist etwa ein Zehntel jener über eine Bindung. Die chemische Verschiebung ist typisch für eine Carbonylgruppe. Grundsätzlich erwartet man die Signale von sp2-

hybridisierten C-Atomen oberhalb von 100 ppm.

c) Erklären Sie den Basispeak im Massenspektrum. Durch welche Fragmentierungsregeln können Sie das Signal rationalisieren? Wenden Sie die Regeln erschöpfend an. (4 Punkte) Fragmentierung siehe Spektrum. In der Gasphase liegt die linke Struktur vor. Es lässt sich die Regel IV dreimal anwenden. Alle drei Heteroatome steuern die Fragmentierung.

d) Nachdem Sie das ¹H-NMR-Spektrum von B3 in D₂O aufgenommen haben, verdunsten Sie das Lösungsmittel und nehmen vom Rückstand ein Massenspektrum auf. Was erwarten Sie für Veränderungen zum gewöhnlichen MS? Begründen Sie Ihre Ansicht. (3 Punkte) Durch das Lösungsmittel D₂O wurden die austauschbaren Protonen der NH₃-Gruppe durch D ersetzt. Nach dem Abdunsten des Lösungsmittels bleibt das so. In der Gasphase bildet sich die linke Struktur auf Seite 1, jetzt mit DO an der Carboxylgruppe und ND₂. Die Molmasse des neuen Moleküls ist 92.

Der Basispeak wird jetzt bei m/z 46 erscheinen.

Das Signal bei 74 entstent offensichtlich durch Abspaltung einer CH₃-Gruppe. Es wird also neu bei m/z 77 erscheinen.

Das Signal bei m/z 18 ist offensichtlich Wasser. Die OH-Gruppe der Säure bekommt also noch ein H irgendwo aus dem Molekül, vermutlich von der NH₂-Gruppe. Das Signal wird also neu bei 19 oder vermutlich 20 erscheinen, allenfalls sieht man beide Signale. 18 aber wird

verschwinden.

e) Spekulieren Sie, warum das IR-Spektrum als KBr-Pressling aufgenommen wurde. Warum hat man nicht eine wässrige Lösung verwendet? (2 Punkte)

B3 ist nicht löslich in CHCl₃, also braucht man eine andere Aufnahmetechnik. Wässrige Lösungen eignen sich grundsätzlich nicht. Das Lösungsmittel verursacht breite Sperrgebiete im Bereich der O–H-Streck- und O–H-Deformationsschwingungen. Zudem sind die Fenster- materialien Alkalihalogenide wasserlöslich.

2

IR:

B3

100 80 60 40 20 0 [%]

4000 3000 2000 1500 1000 [cm ]^–1 500

O

HO NH

O

O NH

–

MS:

B3

100%

0 50

z/

m 0 0 1 0

5 0

18 89

74 28

44

44

45

Lösungsmittel 3

Lösungsmittel 64x verkleinert

3 H

3 H 3 H

1 H

1 H

Dublett, weil 1 Nachbar

Singlett, keine Nachbarn

Dublett, 1 Nachbar Dublett, 1 Nachbar

erwartet: Quartett von Quartett

zweimal 3 Nachbarn, ähnliche Kopplungskonstanten Quartett, weil 3 Nachbarn

H-NMR:

1 600 MHz, aufgenommen in D O₂

H-NMR:

1 500 MHz, aufgenommen in CF COOH₃

B3

O

O ND

–

O

HO NH

4

13

C-NMR:

B3

protonen-breitbandentkoppelt

176.58 53.20

16.83 Lösungsmittel-Signale

CH₃ C CH

200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 ppm 0

O

HO CF

Aufgabe 2 11 Punkte

Orotsäure ist eine Substanz, die für die menschliche Ernährung wichtig ist. Obwohl unser Körper kleine Mengen synthetisieren kann, muss der grösste Teil mit der Nahrung

aufgenommen werden. Orotsäure kommt vor allem in Milchprodukten vor. Die Konzentration in Joghurt beträgt etwa 70 mg/l.

Struktur von Orotsäure:

N H

NH O

O O

OH

Orotsäure hat folgende pK-Werte:

2.4 9.45

> 13

Für die Quantifizierung von Orotsäure wird folgende HPLC-Methode empfohlen:

Säule: Hydrosphere C18 (Umkehrphase), Länge 150 mm, innerer Durchmesser 4.6 mm, Partikeldurchmesser 5 μm

Mobile Phase: 10 mM Natriumphosphat-Puffer von pH 2.6 Flussrate 1.0 ml/min

UV-Detektor bei 280 nm

Aufarbeitung der Probe: Ultrafiltration, dann 10-fache Verdünnung mit Wasser, Einspritzung.

Das Chromatogramm auf der nächsten Seite wurde von einem Joghurt-Drink aufgenommen.

a) Berechnen Sie den Retentionsfaktor (Kapazitätsfaktor) k für den Peak der Orotsäure. (1 Punkt)

Im Chromatogramm wurden die Wendetangenten angelegt und die Werte für die Aufgaben a) bis d) mit einem Massstab abgelesen. Sie können die Werte auch grob abschätzen. Wichtig ist, dass klar wird, wie Sie zu den Daten gekommen sind.

t_M = 1.65 min t_R3 = 6.48 min

k

t

t

t

6.48 min 1.65min

1.65 min 2.93

b) Berechnen Sie den Trennfaktor α für die Peaks 2 und 3. (1 Punkt) t_R2 = 5..27 min

t

t

t

t

6.48 min 1.65min

5.27 min 1.65min 1.33

c) Berechnen Sie die Auflösung R_S der Peaks 2 und 3. (2 Punkte) w_b2 = 0.27 min

w_b3 = 0.25 min

R

2 t

t

w

w

2 6.48 min 5.27min

0.27 min 0.25min 4.65

d) Berechnen Sie die theoretische Bodenzahl der Säule anhand des Peaks der Orotsäure. (1 Punkt)

N 16 t

w

2

16

2

10750

( ) ( ^{6.48 min} 0.25 min )

e) Jemand vermutet, dass es sich bei der unbekannten Substanz (Peak 2) um Milchsäure handelt. Was halten Sie von dieser Vermutung? (2 Punkte)

Struktur von Milchsäure:

O

OH OH

Milchsäure hat einen pK-Wert von 3.86

Bei der Trennmethode handelt es sich um Umkehrphase. Die stationäre Phase hält also apolare Substanzen besonders gut fest. Die mobile Phase hat einen pH von 2.6. Der erste pK-Wert der Orotsäure von 2.4 zeigt, dass ein substanzieller Anteil der Moleküle deprotoniert, also ein Anion ist. Milchsäure ist bei diesem pH prakrisch nicht deprotoniert. Die Milchsäure ist bei diesen Bedingungen also apolarer als Orotsäure. Daher würde Milchsäure von der stationären Phase besser festgehalten als Orotsäure und damit im Chromatogramm später erscheinen. Es ist aber genau umgekehrt. Also stammt der Peak nicht von Milchsäure.

Orotsäure verfügt über ein relativ grosses delokalisiertes π-System. Daher wird ein UV-Detektor bei 280 nm eingesetzt, der die Orotsäure sehr gut erkennen kann, im Gegensatz zu kleineren konjugierten Systemen, wie sie die Milchsäure darstellt. Trotz der grösseren Konzentration der Milchsäure könnte so weit vom Absorptionsmaximum (für unkonjugierte Carboxylgruppen wenig mehr als 200 nm) die Intensität des Milchsäurepeaks nicht grösser sein als jener von Orotsäure. Er wäre kaum zu sehen.

Jedes Argument ergibt alle Punkte.

f) Orotsäure ist sehr stark polar. Die Spezialsäule Hydrosphere C18 ist speziell dafür geeignet.

Welche alternative Methode schlagen Sie vor, um Orotsäure in Joghurt zu bestimmen?

Begründen Sie Ihre Wahl. Charakterisieren Sie die Methode möglichst präzis. Welche Nachteile würden Sie sich allenfalls einhandeln? (4 Punkte)

0 5 10 15 20 25 mAU

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 min

2

3

2: unbekannte Substanz 3: Orotsäure

1

1: Inertsubstanz

Der Hersteller der Spezialsäule will sein Produkt verkaufen, daher die entwickelte Methode.

Teilweise ionisierte Substanzen über Umkehrphase zu trennen, ist ungewöhnlich. Eine

Möglichkeit für eine andere Methode ist Anionenchromatographie, bei der man die Orotsäure über den pH der mobilen Phase (z.B. 3) praktisch vollständig ionisiert. Sie würde also von der stationären Phase gut zurückgehalten, im Gegensatz zu allen ungeladenen Spezies, darunter auch die Milchsäure, die bereits bei der Durchlaufzeit der mobilen Phase eluiert werden. Meist

werden in der Ionenchromatographie Leitfähigkeitsdetektoren eingesetzt. Das bedingt, dass die Grundleitfähigkeit der mobilen Phase vor der Detektion durch Supressoren stark vermindert wird. Dazu wird bei der Anionenchromatographie meist ein Bicarbonat-Puffer verwendet. Durch die Suppressorsäule (Kationenaustauscher) werden die Kationen (meist Na+) durch Protonen ersetzt. Die entstehende Kohlensäure zersetzt sich sofort zu CO2 und Wasser. Die Leitfähigkeit verschwindet. In diesem Fall wollen wir den pH aber bei ca. 3 halten. Das ist mit einem

Bicarbonat-Puffer nicht zu bewerkstelligen. Am besten wird der UV-Detektor (280 nm)

beibehalten. Dadurch wird er sehr spezifisch für Orotsäure. Wenn ein solcher Detektor nicht zur Verfügung steht (was typisch ist) bleibt ausser seiner Anschaffung nur die Möglichkeit, bei wesentlich höheren pH-Werten zu arbeiten. Das hat die Konsequenz, dass andere Säuren ebenfalls Anionen sind und dadurch retardiert werden. Der Leitfähigkeitsdetektor ist unspezifisch. Das kann zu Problemen führen.

Weitere Möglichkeiten zum Ersatz der Spezialsäule ist das Arbeiten mit gewöhnlichen Umkehrphasen-Säulen bei deht tiefem pH. Das ist sicher nicht die Methode der Wahl. Man könnte Kapillarzonen-Elektrophorese einsetzen, um die Anionen voneinander und von den Ungeladenen zu trennen. Letztere würden mit dem elektroosmotischen Fluss mitlaufen und alle gleichzeitig beim Detektor ankommen, wenn sie ihn überhaupt erreichen können. Als Detektor eignet sich auch hier ein UV-Spektrometer. Normalphasen-Chromatographie ist kaum

einzusetzen, da sich das Milchprodukt nicht im apolaren Lösungsmittel löst. Der Vorschlag wurde aber trotzdem akzeptiert.

Aufgabe 3 7 Punkte

Die Analyse von Pestizidrückständen gehört zu den wichtigen Aufgaben der Lebensmittel- kontrolle. Von den mehr als 200 eingesetzten Substanzen wurden 23 häufig gebrauchte Organo- chlorverbindungen gaschromatographisch untersucht. Das untenstehende GC stammt aus der Methodensammlung eines Herstellers analytischer Geräte. Die Aufnahmebedingungen waren:

Säule: CPsil-8 (apolar, unspezifisch, trennt im Wesentlichen nach Siedepunkten), Länge 9 m, innerer Durchmesser 0.1 mm, Filmdicke 0.1 μm

mobile Phase: H₂

Temperaturprogramm: 1 Minute bei 80° C, dann mit 60° C pro Minute bis 280° C Elektroneneinfang-Detektor (ECD)

Minutes

2.25 2.50 2.75 3.00 3.25 3.50 3.75 4.00

Obwohl die Trennung recht gut gelungen ist, sind gewisse Peaks nicht so weit getrennt, dass eine Quantifizierung zuverlässig möglich ist.

a) Welche Massnahmen könnten Sie ergreifen, um die Trennung zu verbessern? Was für Nachteile müssten Sie dafür allenfalls in Kauf nehmen? (3 Punkte)

Beachten Sie die unglaublich schnelle Trennung. Nach 4 Minuten ist die Trennung zu Ende und das bei sehr vielen Substanzen. Der Hersteller will sein Produkt verkaufen und hat die

Trennmethode mit allen verfügbaren Mitteln auf die Säule getrimmt. Das dürfte auch der Grund sein, warum auf die genügende Trennung einiger Substanzen verzichtet wurde. Wenn auf die schnelle Trennung verzichtet wird, gibt es also viel Verbesserungspotential. Der Hauptnachteil ist in jedem Fall eine Verlängerung der Analysenzeit.

– Anpassung des Temperaturprogrammes. Nicht so schnell aufheizen. Hohe Temperatur ist gleichbedeutend mit hoher Elutionskraft.

– Verlängerung der Säule. 9 Meter ist wenig. Typische Säulen sind 30 m lang.

– Die Filmdicke ist mit 0.1 μm sehr klein. Durch eine Vergrösserung wird eine bessere Trennung erreicht.

– Auch akzeptiert wurde ein Wechsel zu N2 als Trägergas. Das ist nicht zu empfehlen, aber im Prinzip machbar.

b) Ist der Detektor vernünftig gewählt für Organochlorverbindungen? (1 Punkt) Der Detektor ist sehr gut gewählt. Ein ECD ist gerade für Organochlor-Verbindungen besonders empfindlich. Geschlagen wird er nur von einem sehr guten (und teuren) Massenspektrometer, z.B. einem Time-Of-Flight-MS.

c) Wenn eine Trennung trotz allen Versuchen nicht gelingen will, könnte man allenfalls zwei Chromatogramme aufnehmen und mit der Wahl eines geeigneten Detektors dafür sorgen, dass von den nicht getrennten Substanzen jeweils nur eine detektiert wird. Für die andere Substanz wäre der Detektor dann "blind". Wie würden Sie das bewerkstelligen? Erklären Sie das Vorgehen. (3 Punkte)

Man könnte ein Massenspektrometer als Detektor einsetzen. Ein erstes Chromatogramm wird bei einem geschickt gewählten m/z-Wert aufgenommen (single ion mode), bei dem einige Substanzen einen Peak im MS aufweisen, andere aber nicht. So erscheinen also nicht alle Substanzen im Chromatogramm. Jene, die erscheinen, sind aber alle getrennt. Man wiederholt das Verfahren bei einem anderen m/z-Wert, bei dem nun jene Substanzen einen Peak im MS haben, die vorher nicht detektiert wurden. Dafür erscheinen einige Substanzen nicht mehr im Chromatogramm, die sonst stören würden.

Allenfalls muss man gar nicht zwei Chromatogramme aufnehmen, sondern das MS bei zwei m/z-Werten simultan bestimmen. Das hängt von den Anforderungen ab. Bei einem Quadrupol- Massenfilter erhöht sich die Nachweisgrenze, weil der Detektor nur eine Masse auf einmal bestimmen kann. Bei einem Time-Of-Flight-MS werden in jedem Fall alle Massen simultan erfasst.