Schriftliche Prüfung BSc Herbst 2015 Musterlösung

Prüfungen Analytische Chemie Dienstag, 18. August 2015

Schriftliche Prüfung BSc Herbst 2015

D – CHAB/BIOL

Musterlösung

Vorname:... Name:...

♦ Jede Aufgabe wird separat bewertet. Die maximal erreichbare Punktzahl beträgt 36.

Die Maximalnote wird mit mindestens 30 Punkten erreicht.

♦ Zeit: 60 Minuten. Teilen Sie sich Ihre Zeit gut ein!

♦ Unleserliche Texte, unklare Formulierungen oder unsaubere Skizzen können nicht bewertet werden. Bitte bemühen Sie sich um eine saubere Darstellung.

♦ Schreiben Sie jedes abzugebende Blatt einzeln mit Ihrem Namen an.

♦ Dieses Deckblatt ist ausgefüllt abzugeben.

♦ Wir bitten Sie um Fairness: Disziplinarverordnung RSETH 361.1

♦ Viel Erfolg!

Aufgabe 1 12 Punkte

Neonicotinoid-Pestizide werden verdächtigt, am Bienensterben der letzten Jahre mitverant- wortlich zu sein. Für eine geplante Studie haben Sie die Aufgabe, eine Analysenmethode zu deren Quantifizierung zu entwickeln. Dabei sollen während kurzer Zeit in einem geographisch grossen Gebiet Löwenzahn-Blüten als Probe genommen und danach auf die Pestizid-

Rückstände untersucht werden. Es sollen ca. 3000 Proben verarbeitet werden.

Eine Internet-Recherche ergibt, dass ein Hersteller analytischer Geräte bereits eine Methode entwickelt hat:

Probenvorbereitung:

– Die Löwenzahn-Blüten werden getrocknet und danach pulverisiert.

– Von diesem Material werden 3 g in 10 ml Wasser aufgeschlämmt und 25 ml Acetonitril zugegeben.

– Dann wird der Inhalt eines "Extraktionsgefässes" (zu beziehen beim Hersteller) dazugegeben, 1 min geschüttelt und 5 min zentrifugiert.

– 1 ml der überstehenden Flüssigkeit wird in ein "Reinigungsgefäss" (zu beziehen beim Hersteller) gegeben, 1 min geschüttelt und 3 min zentrifugiert.

– 700 μl der überstehenden Lösung werden im Stickstoffstrom von der Flüssigkeit befreit, dann mit 200 μl einer 50:50-Mischung von Eluent A und B (siehe unten) aufgenommen.

Trennmethode Umkehrphasen-HPLC:

Säule: "Ascentis Express C18" (zu beziehen beim Hersteller), Länge 10 cm, innerer Durchmesser 3 mm, Partikeldurchmesser 2.7 μm

Mobile Phase: 0.1% Ameisensäure in Wasser (A), 0.1% Ameisensäure in Methanol (B) Flussrate: 0.5 ml/min

Gradient: 30% B für 5 min, auf 100% B innert 0.2 min, gehalten für 5.3 min, auf 30%

B innert 0.5 min, gehalten für 5 min. Totale Länge 16 min Detektor: komplexes Massenspektrometer (zu beziehen beim Hersteller)

Als Detektor werden hintereinander-geschaltete MS verwendet, wie sie in der Vorlesung nicht explizit behandelt wurden. Ein solcher Detektor kann sehr spezifisch auf Neonicotinoid- Pestizide getrimmt werden, unverzichtbar in dieser Situation.

Folgende Substanzen wurden getrennt:

O N H

N N H

NO₂ Cl N

N HN

NO₂

O N

N N

NO

S N

Cl

2

Cl N

N N

HN NO₂ N

S

H Cl N

N HN

NO₂

Cl N

N N

N

N

N S

N

N

Cl

Dinotefuran Nitenpyram

Thiamethoxam

Imidacloprid

Clothianidin

Acetamiprid Thiacloprid

Folgendes Chromatogramm wurde erhalten:

a) Was halten Sie grundsätzlich von diesem Analysenvorschlag? Spekulieren Sie über die Kosten der Studie, wenn der Vorschlag unverändert übernommen wird. Was ist der Zeitaufwand? Sehen Sie Verbesserungspotential? (3 Punkte)

Ich frage nach Ihrer Meinung. Sie sollen spekulieren. Daher können Sie irgendetwas Sinnvolles sagen, um die Punkte zu bekommen. Insbesondere kann das meiner eigenen Meinung völlig widersprechen.

Ich halte die Methode für eine Katastrophe. Wenn ich die Probenvorbereitung lese, wird mir nicht klar, was hier eigentlich gemacht wird. Was ist der Inhalt eines "Extraktionsgefässes" oder eines "Reinigungsgefässes"? Ich will wissen, was ich tue, tappe aber völlig im Dunkeln. Ich vermute, dass die "Gefässe" teuer sind. Schliesslich hat der Hersteller ein Monopol.

Für 3000 Proben, die nicht ohne weiteres aufbewahrt werden können, ist der Zeitaufwand prohibitiv. Wie sollen die Blüten getrocknet werden? Pulverisieren in der Kugelmühle? Wir brauchen 3 Gramm. Die Pflanzen blühen alle etwa zur gleichen Zeit. Es müsste massiv parallel gearbeitet werden. Die Aufarbeitung ist für einzelne Proben gedacht, nicht für 3000.

Verbesserungspotential:

Die Blüten können nicht getrocknet und pulverisiert werden. Nennen Sie irgend eine andere Methode, z.B. mit Acetonitril versetzen und mit dem Stabmixer 2 Minuten bearbeiten. Oder im flüssigen Stickstoff einfrieren und in einer Mühle zerkleinern. Die Blüten sind dann spröd wie Glas. Viele Gewürze mit flüchtigen Anteilen werden so gemahlen.

Wir müssen wissen, was in den "Gefässen" enthalten ist, sonst können wir nicht verstehen, was geschieht und wo allfällige Gefahren liegen.

700 μl Gemisch aus Wasser und Acetonitril im Stickstoffstrom zu trocknen dauert zu lange.

Entweder wird mit weniger Material gearbeitet oder das Acetonitril wird nicht entfernt. Man könnte Komponente B zusetzen, um das Verhältnis von Methanol zu Wasser dem Eluenten anzugleichen.

Die Substanzen 1 und 2 sind nicht getrennt. Das könnte man zweifellos verbessern. Siehe unten unter Frage d).

b) Der vorgeschlagene Konzentrations-Gradient des Elutionsmittels behält für fast die ganze Trennphase der Pestizide die gleiche Zusammensetzung. Warum wird überhaupt ein Eluent B eingesetzt? Könnte man nicht die Zusammensetzung konstant halten und nach 7 min die nächste Probe einspritzen? (3 Punkte)

Der Detektor kann so eingestellt werden, dass die gesuchten Substanzen ein Signal geben und andere Verbindungen nur wenig Signal zeigen. Wie das in Einzelnen geschieht, steht nicht in der Methodenbeschreibung und ist auch nicht Gegenstand der Vorlesung. Aber der Blütenextrakt enthält natürlich viele Bestandteile, die auf die Säule gelangen. Dieses Material muss am Schluss des Chromatogramms aus der Säule gespült werden, sonst verändert sie ihr Verhalten, auch wenn der Detektor die Substanzen nicht sieht. Nach 7.5 Minuten erscheint im Chromatogramm eine Gruppe von Peaks, die offensichtlich durch diese Substanzen verursacht werden. Die Trennung erfolgt isokratisch. 5 Minuten lang wird die Zusammensetzung konstant gehalten.

Nach dieser Zeit ist ausser Komponente 7 alles eluiert. Das Chromatogramm zeigt bei 0.7 Minuten den ersten Peak. Ich vermute, dass das die Durchlaufzeit des Eluenten ist. So lange braucht also der Eluent, um die Säule zu passieren. Wenn also nach 5 Minuten die

Zusammensetzung des Eluenten drastisch geändert wird, macht sich das im Chromatogramm für Komponente 7 nach 5.7 Minuten bemerkbar. Dann ist 7 aber noch nicht eluiert. Die

Komponente spürt also gerade noch, dass sich etwas geändert hat. Das ist inkonsequent. Der

Hersteller will nicht Neonicotinoid-Pestizide trennen, sondern Chromatographen und Verbrauchsmaterial verkaufen. Die Methode ist ein Pfusch.

c) Die Substanzen 6 und 7 sind sehr gut getrennt. Berechnen Sie die Auflösung. Beschreiben Sie kurz Ihre Vorgehensweise. (1 Punkt)

Zur Berechnung der Auflösung kann z.B. folgende Formel verwendet werden:

RS= 2

(

)

w_b1+ w_b2

Im Chromatogramm wurden die Wendetangenten eingezeichnet. Damit können die Retentionszeiten und Basisbreiten abgelesen werden. Diese Werte wurden erhalten:

t_R1 = 3.8 min t_R2 = 6.0 min w_b1 = 0.18 min w_b1 = 0.26 min R_S = 5.0

d) Die Substanzen 6 und 7 sind sehr gut getrennt. Zu gut? Wenn schon ein Gradient eingesetzt wird, wie würden Sie ihn anpassen, um zu Ungunsten der Auflösung Zeit zu gewinnen? (2 Punkte)

Die isokratische Trennung führt dazu, dass Substanzen 1 und 2 nicht getrennt sind, 5, 6 und 7 aber zu gut. Der Hersteller hat sich nicht die Mühe genommen, die Methode zu optimieren.

Nachdem ohnehin ein Gradient gefahren werden muss, um die Säule zu reinigen, müsste das unbedingt geschehen. Die Strukturen von 1 und 2 sind genügend unterschiedlich, dass sich durch die Änderung der Polarität und/oder Acidität des Eluenten eine Trennung erreichen lässt.

Dies ist aber nicht Teil der Aufgabe d). Es wird nur der Vollständigkeit halber erwähnt. Man könnte die Zusammensetzung des Eluenten etwa nach 2.5 Minuten in Richtung grösserer Elutionskraft verändern, also den Anteil an B erhöhen. Komponenten 4 und 5 spüren das noch nicht, 5, 6 und 7 rücken aber näher zusammen.

e) Der Hersteller publiziert zwar ein Chromatogramm, aber es ist nicht beschrieben, wie quantifiziert wird. Schlagen Sie eine Kalibrationsmethode vor. (3 Punkte)

Grundsätzlich kann die Kalibration mit externem oder internem Standard stattfinden, oder man kann mittels Standardaddition kalibrieren. Sie können jede Methode vorschlagen, die vollständig beschrieben ist, um alle Punkte zu bekommen.

Eine Kalibration mit externem Standard ist bei dieser komplexen Matrix eher nicht zu empfehlen. Keinesfalls dürfte man einfach Kalibrationslösungen herstellen und damit die Messungen durchführen. Die ganze Aufarbeitung muss mit den Standards durchgeführt werden. Das bedingt, dass Blüten ohne Pestizide zur Verfügung stehen müssen. Allenfalls sind diese durch Zucht im Labor herzustellen. Die Standards sind ganz am Anfang der Aufarbeitung zuzugeben. Es werden typischerweise fünf Lösungen unterschiedlicher Konzentration

hergestellt, eine davon eine Blindlösung ohne Standards. Nachdem sehr viele Proben zu

untersuchen sind, wird das Chromatogramm nur einmal aufgenommen. Dies wird also auch bei der Kalibration so. gehandhabt.

Eine Kalibration mit internem Standard ist wohl die Methode der Wahl. Es muss aber ein Standard gefunden werden, der einen basislinien-getrennten Peak ergibt. Dies ist Teil der

Methodenoptimierung. Der Standard wird ganz am Anfang der Aufarbeitung zugegeben. Die Kalibration wird so wie bei externem Standard durchgeführt. Als Messsignal dient der Quotient der Peakflächen (oder -höhen) von Pestizid und internem Standard.

Für Freaks: Der Detektor erlaubt die Trennung und Detektion von Isotopen. Als interner Standard könnte daher eines der Pestizide dienen, aber isotopisch verändert, z.B. an einer Stelle deuteriert. Der Chromatograph könnte die Substanzen nicht trennen. Der Detektor müsste je ein Signal für beide Substanzen liefern.

Standardaddition ist die aufwendigste Methode. Man müsste dabei den Standard ganz am Anfang der Aufarbeitung zusetzen. Also müssten für jede der 3000 Proben mehrere

Aufarbeitungen durchgeführt werden. Das ist nicht praktikabel. Es scheint auch nicht nötig, weil zwar die Matrix komplex ist, aber im Wesentlichen unveränderlich. Das Ansprechverhalten des Systems dürfte also gleich bleiben. (Die Steigung der Kalibrationsgeraden bleibt gleich.)

Aufgabe 2 6 Punkte

Die Trennung von Enantiomeren (Bild und Spiegelbild) ist aufwendig.

a) Wo liegen die Schwierigkeiten? (1 Punkt)

Fast alle chemischen und physikalischen Eigenschaften von Enantiomeren sind gleich.

b) Welche Möglichkeiten haben Sie grundsätzlich, um chromatographisch Enantiomere zu trennen? Welche Methoden sind in der GC, welche in der HPLC, welche in beiden anwendbar? (4 Punkte)

1. Verwendung einer Säule mit chiraler stationärer Phase. Für GC und HPLC geeignet.

2. Verwendung eines chiralen Lösungsmittels als mobile Phase. Für HPLC geeignet.

3. Zugabe einer chiralen Substanz, die mit den Enantiomeren diastereomere Komplexe bildet, die dann mit herkömmlichen Methoden getrennt werden. Für HPLC geeignet.

4. Derivatisierung mit einer chiralen Substanz. Die entstandenen Diastereomere können mit herkömmlichen Methoden getrennt werden. Für GC und HPLC anwendbar.

c) Nennen Sie eine Methode, um D- und L-Milchsäure zu trennen, ohne zu sehr ins Detail zu gehen. (1 Punkt)

Veresterung mit irgend einem chiralen Alkohol. Die beiden entstehenden Ester sind diastereomer.

Aufgabe 3 18 Punkte

Auf den folgenden Seiten finden Sie das IR-, Massen-, ¹H-NMR- und ¹³C-NMR-Spektrum der Verbindung A29. Sie hat folgende Konstitution:

O

O

Si

Die Verbindung hat die relative Molmasse M_r = 304.

Die Verbindung enthält ein Silicium-Atom. Hinweise zu Si:

– Die vier Einfachbindungen, die von Si ausgehen, sind wie bei aliphatischen C-Atomen tetraedrisch angeordnet.

– Die Elektronegativität von Heteroatomen ist im Allgemeinen grösser als jene von C und H.

Hingegen ist die Elektronegativität von Si sehr klein.

a) Ordnen Sie die Signale unterhalb von 5 ppm im ¹H-NMR-Spektrum den entsprechenden Protonen von A29 zu. Eine Begründung ist nicht nötig. (3 Punkte)

Siehe Spektrum

b) Erklären Sie das Kopplungsmuster des Signals bei 2.5 ppm im ¹H-NMR-Spektrum.

Identifizieren Sie die Kopplungspartner in der Struktur von A29. Finden Sie alle Signale im Spektrum, die durch diese Kopplungspartner verursacht werden, und erklären Sie deren Kopplungsmuster. (4 Punkte)

Es handelt sich um ein Quartett mit Integral 2 im aliphatischen Bereich des Spektrums (< 5 ppm). Es gibt nur eine Umgebung, die darauf passt: 6. Die drei Nachbarn sind 7 und die beiden 5 der CH₂-Gruppe neben dem Sauerstoff. Letztere hat zwei Nachbarn (6) und erscheint deshalb als Triplett mit Integral 2. Die Nachbarschaft des O-Atoms führt zu einer hohen chemischen Verschiebung von 3.5 ppm. 7 hat ein Integral von 1 und ausser der CH₂-Gruppe 6 keine weiteren Nachbarn. Daher erscheint das Signal als Triplett im Bereich oberhalb von 5 ppm. Es gibt nur ein einziges Triplett in diesem Bereich bei 5.2 ppm.

Die anderen Zuordnungen im aliphatischen Bereich:

1 als Singlett mit Integral 3 bei 3.8 ppm (wegen der Nachbarschaft des O-Atoms)

4 als Singlett mit Integral 2 bei 4.5 ppm (wegen der Nachbarschaft des O-Atoms und des Arylrings)

11 als Singlett mit Integral 3 bei 1.7 ppm. Die Nachbarschaft des Si-Atoms führt zu einer kleinen chemischen Verschiebung, jene der Doppelbindung zu einer Erhöhung. Die Effekte heben sich auf.

12 als Singlett mit Integral 9 bei 0 ppm (wegen der Nachbarschaft des Si-Atoms)

Die Zuordnungen im Bereich der Doppelbindungen ist grundsätzlich schwieriger, da π-Effekte und ungewöhnliche Kopplungskonstanten dazukommen. Darum werden dazu in dieser Prüfung keine Fragen gestellt.

2 und 3 bilden ein System höherer Ordnung, da die 2 bzw. 3 jeweils isochron aber nicht magnetisch äquivalent sind. Das wäre an sich noch kein Grund zu höherer Ordnung, aber die beiden 2 bzw. 3 koppeln miteinander über 4 Bindungen mit einer Kopplungskonstante von 2-3 Hz. Diese Kopplungen führen zu höherer Ordnung. Das Bild ist typisch für ein para-

substituiertes Benzen: kompliziert (24 Linien) aber symmetrisch. Die 2 haben die kleinere chemische Verschiebung, weil das benachbarte O-Atom mit seinen voll besetzten p-Orbitalen zu einer negativen Polarisierung der Position 2 führt. (Zeichnen Sie eine Grenzstruktur mit einer negativen Ladung an der Position 2 und einer positiven auf dem O-Atom. Das gelingt bei Position 3 nicht.)

7 führt zu einem Triplett, wie schon beschrieben. Die Linien sind aber klar verbreitert. Die Verbreiterung stammt von einer Long-Range-Kopplung zwischen 7 und 10, die nicht zu einer Dublettierung führt, weil die Kopplungskonstante zu klein ist. Es reicht nur für eine

Verbreiterung.

8 hat zwei Nachbarn in unterschiedlichen Positionen (9 und 10). Die Kopplung von 8 zu 9 (trans) gehört zu den stärksten bekannten (typischerweise 18 Hz). Die Kopplung von 8 zu 10 (cis) ist nicht ganz so stark aber ebenfalls erhöht (ca. 12 Hz). Das ganze Kopplungsmuster ist Dublett von Dublett zwischen 6.7 und 6.8 ppm.

9 hat zwei Nachbarn (8 und 10) die sehr unterschiedlich stark koppeln. Die trans-Kopplung zu 8 ist sehr stark, wie schon beschrieben. Die geminale Kopplung über zwei Bindungen ist erstaunlich klein. Sie führt nicht einmal mehr zu einer Dublettierung. Es resultiert nur eine Linienverbreiterung. Kopplungskonstanten haben ein Vorzeichen, das sich bei Systemen erster Ordnung nicht im Spektrum bemerkbar macht. Die Kopplungskonstanten geminaler Protonen an Doppelbindungen haben einen Bereich von –4 bis 4 Hz. Null liegt genau in der Mitte und wird entsprechend oft eingestellt.

10 zeigt eine starke cis-Kopplung zu 8, wie schon beschrieben. Die Kopplung zu 9 ist die winzige geminale, wie schon beschrieben. Die Signalgruppe ist aber kein Dublett mit

verbreiterten Linien, wie bei 9. Was man hier zusätzlich sieht, ist die Long-Range-Kopplung zu 7 (schon beschrieben). Diese und die geminale Kopplung sind etwa gleich gross und führen zu klar erkennbaren Tripletts der beiden Hauptlinien.

c) Im ¹H-NMR-Spektrum finden Sie ein Signal mit Integral 9. Erklären Sie, warum sämtliche 9 Protonen isochron sind. Identifizieren Sie im ¹³C-NMR-Spektrum die Signale der C- Atome, an die diese 9 Protonen gebunden sind. Wieviele Signale sind es? Erklären Sie. (3 Punkte)

Die zweite Frage zum ¹³C-Spektrum ist als Hilfe gedacht. Symmetrie als Erklärung für Isochronie fällt aus. Das Molekül hat keine dreizählige Drehachse oder etwas Äquivalentes.

Daher kommt nur Austausch in Frage. Die Methylgruppen können um die Einfachbindung Si–

CH₂ frei drehen und somit die Positionen der beiden anderen C-Atome in den Methylgruppen einnehmen. Daher sind die C-Atome isochron. Die Umgebung der Methylgruppen ähnelt stark der Referenzsubstanz TMS mit vier Methylgruppen am Si. Daher ist die chemische

Verschiebung nahe bei null. Es ist das Signal bei –1.1 ppm, also ein einziges Signal. Die drei Protonen einer Methylgruppe sind grundsätzlich isochron, weil sie um die C–H-Bindung drehen

können. Das führt zu Isochronie. Letztlich können also alle neun Protonen durch entsprechende Drehungen die Position der anderen acht einnehmen. Das führt zur Isochronie aller Protonen.

d) Erklären Sie die Entstehung der Signale bei m/z 73 und 121 im Massenspektrum. Durch welche Fragmentierungsregeln können Sie die Signale rationalisieren? Wenden Sie die Regeln erschöpfend an. (5 Punkte)

Fragmentierungen siehe Spektrum

73: Regel III. Steuernde Einheit: untere Doppelbindung. Si ist nicht ein elektronegatives Heteroatom. Darum kann Regel V nicht angewandt werden

121: Regel III. Steuernde Einheit: Arylring 121: Regel V.

e) Erklären Sie das Signal bei m/z 306 im Massenspektrum. (1 Punkt)

Es handelt sich um das Isotopensignal von Si-30. Häufigkeit 3.35 % von Si-28 (100 %).

f) Die scharfe Bande bei 1520 cm^–1 im IR-Spektrum stammt von einer Gerüstschwingung des aromatischen Rings. Erklären Sie die kleine Breite der Bande. (2 Punkte)

Der planare Arylring ist sehr stabil. Eine Auslenkung aus der Ruhelage führt immer wieder zur gleichen lokalen Teilstruktur. Der Ring lässt sich auch nicht durch die Bildung von Wasser- stoffbrücken oder dergleichen stören. Um die Schwingung anzuregen, muss also die Eigen- frequenz genau getroffen werden. Das führt zu schmalen Banden.

IR:

A29

MS:

A29

100 80 60 40 20 0 [% ]

4000 3600 3200 2800 2400 2000

[cm ^-1 ]

1800 1600 1400 1200 1000 800 600

100 80 60 40 20 0 [% ]

350 300

250 200

150 100

50

121 121

183

213

73

73

170 94 157 209

45 77

134 304

300 305

304

O O

Si

0 1

2 3

4 5

6 7

8 9

2H 2H

2H 2H 2H 2H

9H

9H 2H

2H 2H

2H 2H

2H

1H 1H 1H 1H

3H

1H 3H

1H1H 1H

ppm 5.3

6.9 7.2

7.3 6.7 5.1 ppm

4.5 3.9 3.8 3.5 3.4 2.5 1.7 1.6 0.0ppm

H-NMR:

1 600 MHz, aufgenommen in CDCl₃

A29

O O

1 2 Si

2 3

3

4

5

6 7 8

11

12 12

9 12

10

0 20

40 60

80 100

120 140

160 180

200 220

-1.089

22.40628.115

55.201

70.02272.505

113.701114.091124.258129.195130.572133.407135.679

159.080

0 55

70 115

125 130

135 160

-1.089

22.406

28.115

55.201

70.022

72.505

113.701114.091

124.258

129.195130.572

133.407

135.679

159.080

ppm

ppm

C-NMR:

13 150 MHz, aufgenommen in CDCl

A29

Protonen-breitbandentkoppelt

3

O O

Si

CH₃ CH₃ CH₂ CH₂

CH₂ CH₂ CH₂ CH CH

CH

Lösungsmittel CH C

C C