Pilotstudie zur Bestimmung von exhaliertem Stickstoffmonoxid (NO) bei Patienten mit allergischer Rhinitis (Asthmatiker und Nichtasthmatiker) vor und nach inhalativer Allergenexposition in einem Pollenraum

Aus dem Zentrum für Innere Medizin

Abteilung Pneumologie (Leiter: Prof. Dr. T. Welte) der Medizinischen Hochschule Hannover und dem Fraunhofer Institut für Toxikologie und Experimentelle Medizin

Abteilung Klinische Atemwegsforschung (Leiter: Prof. Dr. N. Krug, Prof. Dr. J. Hohlfeld)

Pilotstudie zur Bestimmung von exhaliertem Stickstoffmonoxid (NO) bei Patienten mit allergischer Rhinitis (Asthmatiker und Nichtasthmatiker)

vor und nach inhalativer Allergenexposition in einem Pollenraum

Dissertation

zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover

vorgelegt von Erwin Schoolmann aus Aurich

Hannover 2009

Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 04.05.2010

Gedruckt mit der Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover Präsident: Prof. Dr. med. Dieter Bitter-Suermann

Betreuer der Arbeit: Prof. Dr. med. Jens Hohlfeld Referent: Prof.´in Dr. Bettina Wedi

Korreferent: Prof.´in Dr. med. Gesine Hansen Tag der mündlichen Prüfung: 04.05.2010 Prüfungsausschussmitglieder:

Prof. Dr. Alexander Kapp PD Dr. Lorenz Grigull Prof. Dr. Stefan Kubicka

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung 1

1.1. Allergische Erkrankungen 1

1.2. Stickstoffmonoxid (NO) 5

1.3. Klinische Bedeutung von exhaliertem NO bei allergischen 6

Atemwegserkrankungen 6

1.4. Pollenexpositionsraum 7

1.5. Fragestellung 8

2. Methodik 9

2.1. Studiendesign 9

2.2. Probanden 9

2.2.1. Ein- und Ausschlusskriterien 10

2.2.1.1. Einschlusskriterien 10

2.2.1.2. Ausschlusskriterien 10

2.2.2. Voruntersuchungen 11

2.2.2.1. Anamnese und körperliche Untersuchung 11

2.2.2.2. Pricktest 11

2.2.2.3. Lungenfunktionsmessung 12

2.3. Metacholinprovokation 12

2.4. NO - Messung 13

2.4.1. Messtechnik 13

2.4.2. Durchführung der Messungen 14

2.5. Allergenprovokation 14

2.5.1. Ablauf einer Pollenexposition 15

2.5.2. Dokumentation der Rhinitis-Symptome 15

2.5.3. Dokumentation der Peak-Flow-Werte 15

sowie der Asthma-Symptome 15

2.6. Statistik 16

2.7. Liste der verwendeten Materialien 16

3. Ergebnisse 18

3.1. Probandendaten und Voruntersuchungen 18

3.2. NO-Messungen 19

3.3. Peak-Flow-Werte und Symptomscores 22

Inhaltsverzeichnis

3.4. Korrelationen 22

3.4.1. eNO-Basiswert - Bronchiale Hyperreagibilität (PC20) 22 3.4.2. eNO-Basiswert - Total-Nasal-Symptomscore (TNSS) 23 3.4.3. eNO-Basiswert - Peak-Flow-Variabilität 24 3.4.4. eNO-Basiswert - Asthma-Symptomscore (ASSC) 25

4. Diskussion 27

5. Zusammenfassung 33

6. Literaturverzeichnis 35

7. Anhang 41

Danksagung 41

Lebenslauf 42

Erklärung nach § 2 Abs. 2 Nr. 5 und 6 Promotionsordnung 43

1. Einleitung 1

1. Einleitung

Der menschliche Organismus steht in ständigem Kontakt mit der Umwelt. In besonderem Maße gilt dies für die Schleimhäute und hier vor allem für die des Respirationstraktes, die täglich mit etwa 10 m³ Atemluft mit allen ihren Luftbestandteilen Kontakt haben. Die Schleimhaut bietet einen gewissen Teilschutz gegen toxische wie infektiöse Einflüsse durch unspezifische Neutralisation sowie auch durch unspezifische Abwehr von Krankheitserregern (Komplement, Lysozym, Phagozyten usw.). Zur gezielten Abwehr benötigt der menschliche Organismus das sogenannte erworbene Immunsystem, das mit seinem komplexen Zusammenspiel aus Lymphozyten und spezifischen Antikörpern den Schutz des Körpers entscheidend erweitert. Besteht ein genetischer Immundefekt mit einem selektiven Mangel in diesem Bereich, treten rezidivierende Infekte auf. Davon unterscheiden sich

„Fehlprogrammierungen“ des Immunsystems, sog. Allergien, welche durch überschießende Reaktionen gegen ansonsten harmlose Antigene – beispielsweise in der Atemluft - zu allergischen Erkrankungen führen.

1.1 Allergische Erkrankungen

Die wichtigsten allergischen Krankheitsmanifestationen stellen die atopische Dermatitis (Neurodermitis), die allergische Rhinokonjunktivitis (saisonal oder ganzjährig auftretender allergischer Schnupfen) sowie die allergisch geprägte Form des Asthma bronchiale dar.

Das Asthma bronchiale ist mit einer Prävalenz von etwa zehn Prozent in den Industrienationen die häufigste chronische Krankheit im Kinder- und Jugendlichenalter.

Auch im Erwachsenenalter gehört die Erkrankung zu den am häufigsten auftretenden, in einer Größenordnung mit dem Diabetes mellitus, der Hypertonie oder der Schlafapnoe (Schultze-Werninghaus 1997). Asthma bronchiale wird definiert als eine chronisch-entzündliche Erkrankung der Atemwege, die durch eine bronchiale Hyperreagibilität und eine variable Atemwegsobstruktion charakterisiert ist (Buhl et al.

2006). Schon 1992 wurde bei den Betroffenen eine erhöhte Empfindlichkeit der Atemwege gegenüber einer Vielzahl von Stimuli beschrieben, die auch im Lungenfunktionslabor quantitativ bestimmt werden kann (National Heart, Lung and Blood Institute 1992). An diese Atemwegsempfindlichkeit gekoppelt ist eine chronische Entzündung der Atemwege, bei der eosinophile Granulozyten eine dominierende Rolle spielen (Warner, Naspitz 1998).

1. Einleitung 2 Klinisch präsentiert sich das Asthma durch anfallsweise auftretende Luftnot, Husten, zähen Auswurf und thorakales Engegefühl. Lungenfunktionell zeigt sich neben einem erniedrigten forcierten exspiratorischen Volumen („Einsekundenkapazität“, FEV1) bei progredientem Krankheitsverlauf häufig ein erhöhtes Residualvolumen sowie eine verminderte Vitalkapazität. Gemäß der Deutschen Atemwegsliga (Deutsche Atemwegsliga 2005) lässt sich das Asthma anhand der Häufigkeit des Auftretens von Symptomen wie folgt in 4 Schweregrade aufteilen:

Bezeichnung Symptome FEV1 bzw. PEF

Tag Nacht % Sollwert

1 leicht intermittierend ≤ 1x/ Woche ≤ 2x/ Monat ≥ 80%

2 leicht persistierend < 1x/ Tag > 2x/ Monat ≥ 80%

3 mittelgradig persistierend täglich > 1x/ Woche 60-80%

4 schwer persistierend ständig häufig ≤ 60%

Tabelle 1: Klassifizierung der Asthmaschweregrade (Deutsche Atemwegsliga 2005) Abhängig von einer nachweisbaren allergischen Diathese unterscheidet man grundsätzlich zwischen allergischem bzw. extrinsischem Asthma und nicht-allergischem bzw. intrinsischem Asthma. Mischformen sind möglich, insbesondere kann auch bei einem initial allergischen Asthma im Verlauf die intrinsische Komponente klinisch in den Vordergrund treten (Buhl et al. 2006).

Der Klinik des Asthmas liegen pathophysiologische Mechanismen in den Bronchien zugrunde, die zu einer Trias aus Bronchospasmus, Dyskrinie und Ödem führen. Beim allergischen Asthma ist die erwähnte Trias als Folge einer IgE-vermittelten Immunreaktion zu werten. Dieser nach Gell und Coombs als Typ-I-Reaktion zu bezeichnende immunologische Vorgang besteht aus einer Früh- und Spätreaktion.

Während die Frühreaktion im Wesentlichen auf einer Freisetzung präformierter Mediatoren (u. a. Histamin, Tryptase) aus basophilen Granulozyten und Mastzellen beruht und ihre durch Spasmus der glatten Muskulatur, Hyperämie und Ödem sowie vermehrte bzw. veränderte Sekretion gekennzeichneten Auswirkungen innerhalb weniger Minuten zeigt, setzt die Spätreaktion erst nach 6 bis 12 Stunden ein. Hier kommt es zu einer zellulären Infiltration und entsprechenden Entzündungsreaktion.

Daran beteiligt sind wiederum basophile Granulozyten und Mastzellen, aber vor allem eosinophile Granulozyten, Makrophagen und T-Lymphozyten. Neben dem Auftreten ähnlicher Symptome wie bei der Frühreaktion (z. B. Bronchospasmus) durch verstärkte

1. Einleitung 3 Produktion und Freisetzung der erwähnten Mediatoren werden nun insbesondere durch die eosinophilen Granulozyten Entzündungsprozesse in Gang gesetzt, die sowohl die Atemwegsobstruktion aufrecht erhalten als auch zu einer Hyperreagibilität der Atemwege führen können. Eine dauerhaft bestehende Entzündung der Atemwege kann zu morphologischen Veränderungen des Lungenparenchyms führen, welche eine adäquate Behandlung erschweren kann.

Mit der Allergie und der Entzündung der Atemwege verknüpft ist die bereits erwähnte bronchiale Hyperreagibilität, die wahrscheinlich einen eigenen, von der Allergie unabhängigen Hintergrund hat, jedoch maßgeblich in ihrer Ausprägung durch die Allergenexposition beeinflusst wird. Unter bronchialer Hyperreagibilität versteht man die ererbte oder erworbene Bereitschaft der Atemwege, auf einen nichtspezifischen (nichtallergenen) Reiz mit einer Verengung zu reagieren, die bei nicht-reagiblen Personen nicht oder nicht in diesem Ausmaß auftritt. Sie ist eines der Kernmerkmale des Asthma bronchiale. Da sie aber auch bei anderen Atemwegserkrankungen zum Beispiel im Rahmen eines Infektes auftreten kann, beweist sie alleine nicht das Bestehen eines Asthma bronchiale (Schultz, Petro 1998). Für den Krankheitsverlauf spielt die Hyperreagibilität deshalb eine entscheidende Rolle, weil durch sie die Reaktionsbereitschaft gegen unspezifische Reize, wie Kaltluft oder körperliche Anstrengung, bestimmt wird (Schultze-Werninghaus 1997).

Wie beim allergischen Asthma kommt es bei der allergischen Rhinitis bzw. allergischen Rhinokonjunktivitis nach Allergenkontakt über eine IgE-vermittelte Immunreaktion zu den hier typischen Symptomen Tränenfluss, Juckreiz, Niesen, Fließschnupfen sowie zum Zuschwellen der betroffenen Luftwege. Auch hier sind eine Früh- und Spätreaktion zu unterscheiden. Entsprechend laufen in der Spätreaktion Entzündungsprozesse ab, die eine Hyperreagibilität der Schleimhäute hervorrufen und auf Dauer bei ihnen zu morphologischen Veränderungen führen können.

Zunehmend gewinnt die Tatsache an Bedeutung, dass viele Asthmatiker vor Erstmanifestation ihrer asthmatischen Beschwerden unter allergischer Rhinitis litten.

Bereits in den 60er Jahren konnte eine Studie, die mit amerikanischen Collegestudenten durchgeführt wurde, diesen Zusammenhang aufzeigen. Damals gaben 49 Prozent der befragten Asthmatiker an, vor Beginn des Asthmas unter allergischer Rhinitis gelitten zu haben (Maternowski 1962). Über 70 Prozent der Asthmatiker beschreiben in ihrer Anamnese nasale Symptome (Slavin, RG 1994). Die Deutsche Gesellschaft für Allergologie und klinische Immunologie (DGAI) geht davon

1. Einleitung 4 aus, dass etwa 30% der allergischen Rhinitiker im Laufe von 10 Jahren ein Asthma bronchiale entwickeln (DGAI, Weissbuch Allergie 2004). Wichtige Ergebnisse aktueller Studien bestätigten die enge Verknüpfung von Asthma und Rhinitis, so dass das Konzept „Ein Atemweg - eine Erkrankung“ postuliert wurde. Die Ergebnisse wurden beispielsweise in Übersichtsartikeln des „Global Allergy And Asthma European Network“ („GA²LEN“, Van Cauwenberge P et al. 2007) sowie des „Allergic Rhinitis And Its Impact on Asthma“ WHO-Workshop („ARIA“, Passalacqua G et al. 2007) vorgestellt.

Die allergische Rhinitis führt bei den Betroffenen neben dem Verlust an Lebensqualität zu teilweise erheblichen Einschränkungen der Leistungsfähigkeit in Schule und Beruf (Fineman 2002). Kommt ein Asthma bronchiale hinzu, kann dies für den Patienten zweifellos eine gravierende Verschlechterung seines Gesundheitszustandes mit den entsprechenden Konsequenzen für seine Lebensqualität und seine Leistungsfähigkeit darstellen. Nicht zuletzt spiegelt sich dies auch in den volkswirtschaftlichen Kosten wider, die durch Asthma bronchiale und allergische Rhinitis verursacht werden. Im Jahr 2000 beliefen sich diese Kosten auf 5064 Millionen DM, wovon 90 Prozent auf die asthmatischen Erkrankungen zurück zu führen waren (Statistisches Bundesamt 2000).

Wenn auch aktuelle Daten des Statistischen Bundesamtes noch nicht vorliegen, so ist vor dem Hintergrund steigender Erkankungszahlen von einer zunehmenden volkswirtschaftlichen Belastung auszugehen.

Es wird deutlich, dass die allergische Rhinitis nicht verharmlost werden sollte.

Insbesondere ist von Bedeutung, einen Etagenwechsel von den oberen zu den unteren Atemwegen und somit die Entstehung eines Asthma bronchiale rechtzeitig zu diagnostizieren, um eine adäquate Therapie einleiten zu können. Hierbei ist zu berücksichtigen, dass bereits entzündliche Prozesse in den Atemwegen ablaufen können, bevor diese symptomatisch bzw. in den Lungenfunktionsmessungen nachweisbar werden. (Sont JK et al. 1996). Zum jetzigen Zeitpunkt gibt es nur wenige Untersuchungsmethoden, mit denen eine solche asymptomatische Atemwegsentzündung detektiert werden kann. Diese müssen häufig unter hohem personellen Aufwand durchgeführt werden und sind zumeist als invasiv zu bezeichnen (z. B. bronchoalveoläre Lavage, Sputuminduktion).

Aus diesem Grund wird an der Entwicklung nicht-invasiver Methoden gearbeitet, die ohne hohen apparativen oder personellen Aufwand bereits frühzeitig Aufschluss über die Atemwegsentzündung und dem daraus resultierenden Asthma-Risiko geben können.

1. Einleitung 5 Zwei Methoden, die diesen Anforderungen entsprechen könnten, sind die Atemkondensatdiagnostik und die Bestimmung von Stickstoffmonoxid (NO) im Exhalat.

Letztere soll im Rahmen dieser Arbeit näher betrachtet werden.

1.2. Stickstoffmonoxid (NO)

Bereits 1991 wurde NO als Bestandteil der Ausatemluft von Tieren und Menschen beschrieben (Gustafsson LE et al. 1991). Die Autoren wiesen NO im Exhalat von Menschen sowie von anästhesierten Kaninchen und Meerschweinchen nach.

Verschiedene Studien zeigten später signifikant höhere NO-Werte im Exhalat von Asthmatikern im Vergleich zu Nicht-Asthmatikern (Kharitonov SA et al. 1995 und Alving K et al. 1993). Die nasale NO-Konzentration wurde als Marker für Entzündungsreaktionen gesehen, wie sie bei der allergischen Rhinitis ablaufen (Martin U et al. 1996 und Arnal JF et al. 1997). Es fanden sich immer mehr Beweise, dass NO eine Schlüsselrolle bei der physiologischen Regulation von Atemwegsentzündungen spielt und dass es an den pathophysiologischen Vorgängen verschiedener Erkrankungen der unteren Atemwege beteiligt ist (Barnes P et al. 1996). In einer Studie von Henriksen und Kollegen aus dem Jahre 1999 zeigte sich, dass exhaliertes NO als Marker dienen kann, diejenigen Patienten mit allergischer Rhinitis zu identifizieren, die ein erhöhtes Risiko haben, ein Asthma bronchiale zu entwickeln. Das exhalierte NO war bei diesen Patienten auch außerhalb der Pollensaison erhöht und es stieg während der Pollensaison nochmals erheblich an (Henriksen et al. 1999).

NO wird von verschiedenen Zellen gebildet, die über NO-Synthasen (NOS) verfügen.

Zu ihnen gehören u. a. Epithel- und Endothelzellen, Makrophagen sowie insbesondere eosinophile Granulozyten (Palmer R et al. 1987). Es gibt 3 unterschiedliche NO- Synthasen, 2 davon werden konstitutiv exprimiert und eine weitere ist induzierbar. In den Atemwegen liegen die konstitutiven Formen überwiegend in den Epithel- (eNOS) und Nervenzellen (nNOS) vor, während die induzierbare Form (iNOS) vermehrt in Epithel- und Entzündungszellen der geschädigten aber auch der gesunden Lunge gefunden wird (Kobitz et al. 1993). Durch inflammatorische Stimuli wie Zytokine oder bakterielle Stoffe wird die Produktion der iNOS durch die Epithel- und Entzündungszellen erhöht (Saleh et al. 1998).

Für den weitaus größten Teil des exhalierten NO ist die iNOS verantwortlich. Sie wird hauptsächlich in den Epithelzellen der Atemwege exprimiert und ist z. B. beim Asthma bronchiale deutlich heraufreguliert (Hamid Q et al. 1993, Redington AE et al. 2001).

Vor dem Hintergrund, dass in der Lunge für NO eine hohe Diffusionskapazität besteht, konnte in verschiedenen Studien nachgewiesen werden, dass das exhalierte NO

1. Einleitung 6 nahezu ausschließlich aus den Atemwegen und nicht aus dem Alveolarraum stammt (Jörres RA 2000). Hierbei wurden mathematische Modelle (NO-Transportmodell) verwendet. Endobronchiale NO-Messungen früherer Untersuchungen untermauern diese Modellrechnungen (Silkoff PE et al. 1997).

Eine Vielzahl von Faktoren beeinflusst die gemessene Konzentration des exhalierten NO. Diese lassen sich zusammenfassend in patientenbezogene und technische Einflussfaktoren unterscheiden. Patientenbezogen ist hierbei beispielsweise das Vorliegen eines Virusinfektes zum Zeitpunkt der Messung, der durch eine Stimulierung der Epithelzellen zu einem erhöhten exhalierten NO (eNO) führt (De Gouw HW et al.

1998). Ebenso ist die Ernährung als patientenbezogener Faktor zu bezeichnen.

Nitratreiche Kost kann zu höheren (Olin AC et al. 2001) und Kaffeegenuss zu niedrigeren (Bruce C et al. 2002) eNO-Werten führen. Raucher zeigten in Studien niedrigere (Yates DH et al. 2001) und ältere Menschen höhere (Olin AC et al. 2006) eNO-Werte.

Bei den technischen Faktoren ist die exspiratorische Flussrate hervorzuheben. Der Einfluss der Flussrate wird vereinfacht dadurch erklärt, dass bei langsamer Strömungsgeschwindigkeit der Luft durch die Bronchien mehr NO von den Bronchialwandungen in das Lumen gelangen kann als bei hoher Strömungsgeschwindigkeit.

Um die Vergleichbarkeit der gewonnenen Daten sicherzustellen wurden bereits 1999 von der American Thoracic Society (ATS) Empfehlungen zur Durchführung der eNO- Messungen herausgegeben, auf deren Grundlage auch die für diese Arbeit relevanten Messungen vorgenommen wurden (ATS 1999, siehe 2.4.1 dieser Arbeit).

1.3. Klinische Bedeutung von exhaliertem NO bei allergischen Atemwegserkrankungen

Mittlerweile ist anerkannt, dass die Bestimmung von NO im Exhalat, die nicht-invasiv unter standardisierten Bedingungen und mit entsprechenden Messgeräten einfach durchgeführt werden kann, zur Verlaufskontrolle der Erkrankung und zur Überprüfung der Wirksamkeit anti-inflammatorischer Medikamente beim Asthma bronchiale geeignet ist (Kharitonov SA et al. 2000).

Holz et al. kamen in einer Übersichtsarbeit aus dem Jahr 2004 zu dem Schluss, dass der klinische Informationsgehalt des eNO mit dem der Sputum-Eosinophilen sowohl bezüglich der Diagnostik als auch der Steroid-Therapiesteuerung vergleichbar ist (Holz O et al. 2004). Allerdings war der noch relativ hohe Anschaffungspreis der Messgeräte

1. Einleitung 7 von 30.000 bis 40.000 Euro hiernach als Kritikpunkt anzumerken. Smith et al.

veranschaulichten in einer 2004 veröffentlichten Studie, dass die eNO-Messung bezüglich der Diagnostik des Asthmas den anderen Verfahren in der Sensitivität überlegen ist (Smith AD et al. 2004). Sie führten Peak-Flow- sowie Lungenfunktionsmessungen durch und verglichen die hierbei vor und nach einer Steroidbehandlung erhobenen Befunde mit denen einer jeweils zeitgleich durchgeführten eNO-Messung und Sputumuntersuchung. Es zeigte sich in Bezug auf die Sensitivität bei der Diagnostik einer Atemwegsinflammation eine deutliche Überlegenheit der Bestimmung von exhaliertem NO und der Untersuchung auf Sputum- Eosinophilie, wobei die eNO-Messung wegen ihrer schnellen und unproblematischen Durchführung als am vorteilhaftesten eingeschätzt wurde. Mehrere weitere Studien konnten aufzeigen, dass Patienten von einer eNO-Messung profitieren. So sahen Pijnenburg et al. zum Beispiel eine hohe Spezifität und Sensitivität des exhalierten NO bezüglich der Vorhersagbarkeit des Wiederauftretens asthmatischer Beschwerden bei Kindern nach Absetzen einer steroidalen Therapie (Pijnenburg MW et al. 2005). Bei Kindern mit mittelgradigem bis schwerem Asthma bronchiale verglichen die Autoren eine Therapiesteuerung (inhalative Kortikosteroide, ICS) anhand der Symptome mit der Therapiesteuerung durch die Kombination aus Symptomen und eNO-Werten. Obwohl bezüglich des primären Endpunktes der Studie, nämlich der Steroid-Dosis, kein Unterschied bestand, zeigte sich in der eNO-Gruppe eine geringere bronchiale Hyperreagibilität. Hieraus schlossen die Verfasser, dass eine Dosis-Titration unter Berücksichtigung der eNO-Werte zu einer wichtigen Optimierung des Erreichens der objektiven Therapieziele bei diesen Patienten führen kann (Pijnenburg et al. 2005).

Smith et al. befassten sich 2005 ebenfalls mit der Therapieoptimierung durch eNO- Messungen. Sie untersuchten mit ICS behandelte, an Asthma erkrankte Erwachsene und kamen zu dem Schluss, dass durch Berücksichtigung der eNO-Werte eine signifikante Reduktion der ICS-Dosis ohne Kompromittierung der Asthma- Symptomkontrolle erzielt werden kann (Smith AD et al. 2005).

1.4. Pollenexpositionsraum

Der Nachweis, dass ein umweltüblicher Allergenkontakt tatsächlich im Rahmen einer allergischen Rhinitis oder eines Asthma bronchiale zu einer Entzündungsreaktion mit nachfolgend erhöhter NO-Exhalation führt, ist nicht leicht zu erbringen bzw. Daten unterschiedlicher Patienten sind nur schwer zu vergleichen. Zu berücksichtigen sind zum einen Störfaktoren wie beispielsweise Zigarettenrauch, Abgase und andere Umwelteinflüsse, die sich auf die Höhe der exhalierten NO-Menge auswirken, und zum

1. Einleitung 8 anderen die Tatsache, dass ein Rückschluss auf das auslösende Allergen und dessen Konzentration unter Alltagsbedingungen kaum möglich ist.

Eine Möglichkeit, verlässliche Daten zu erhalten bieten Forschungseinrichtungen, in denen umweltübliche Atmosphären simuliert werden können. Dies sind große Expositionsräume, in denen Reinstluft erzeugt wird, der dann wiederum bestimmte Partikel wie zum Beispiel Pollen zugeführt werden können. Entsprechend wird ein solcher Expositionsraum dann auch als Pollenexpositionsraum bezeichnet. Unter Studienbedingungen kann hier eine bestimmte Anzahl von Probanden während eines festgelegten Zeitraumes einer genau definierten Konzentration des Allergens ausgesetzt werden. Die Klimabedingungen wie Temperatur und Luftfeuchtigkeit können während des Zeitraumes kontrolliert und konstant gehalten werden. Auf diese Weise lassen sich mit einer relativ geringen Anzahl von Probanden reproduzierbare Daten erheben. Insbesondere sind exaktere Vergleichsstudien unterschiedlicher Probandenkollektive möglich. Pollenexpositionsräume werden bereits seit einiger Zeit in Wien, Toronto und Atlanta eingesetzt. Seit Anfang 2001 ist eine solche Einrichtung auch in Hannover im Fraunhofer Institut für Toxikologie und Experimentelle Medizin in Betrieb, wo die dieser Studie zugrunde liegenden Untersuchungen vorgenommen wurden.

1.5. Fragestellung

Es ist bekannt, dass eine inhalative Allergenprovokation zu einer Erhöhung des exhalierten NO führt (Kharitonov et al. 1995, Deykin et al. 1998). Hierbei werden allerdings vergleichsweise hohe Allergendosen eingesetzt und eine Verschlechterung der Lungenfunktion zur Bestimmung der Früh- und Spätreaktion induziert. Unbekannt ist, wie sich das eNO nach einer umweltüblichen Allergenexposition verändert und ob eine Asthma-Komorbidität der Patienten mit allergischer Rhinitis einen Einfluss auf das eNO bewirkt.

Die vorliegende Arbeit sollte deshalb untersuchen, wie sich die NO-Konzentration im Exhalat von Patienten mit allergischer Rhinitis mit und ohne Asthma-Bronchiale- Komorbidität nach einer umweltüblichen Allergenprovokation unter standardisierten Bedingungen in einem Pollenexpositionsraum verändert. Ein weiterer wichtiger Aspekt war die Frage, ob das exhalierte NO auch als prognostischer Marker für das Auftreten asthmatischer Beschwerden bzw. für die Instabilität eines bestehenden Asthma bronchiale im Rahmen einer solchen Allergenprovokation dienen und damit zur Sicherheit der Probanden im Pollenexpositionsraum beitragen kann.

2. Methodik 9

2. Methodik

2.1. Studiendesign

Die hier zusammengefassten Untersuchungen wurden im Rahmen einer pharmakologischen Dosisfindungsstudie („Effect of loteprednol etabonate nasal spray suspension on seasonal allergic rhinitis assessed by allergen challenge in an environmental exposure unit“, Krug et al. 2005) durchgeführt und haben zur Vermeidung saisonaler Effekte in den Herbst- und Wintermonaten stattgefunden. Vor der eigentlichen Randomisierung in die genannte Studie wurden die Studienteilnehmer auf ihre Eignung überprüft und insbesondere durch eine Exposition im Pollenraum auf ihre klinische Reaktionsbereitschaft und Symptomatik für die weitere Studienteilnahme getestet. Die Überprüfung der Eignung erfolgte durch Anamnese, Pricktest, Lungenfunktionstest sowie Metacholinprovokation.

Bei 55 Patienten mit allergischer Rhinitis (Asthmatiker und Nichtasthmatiker) wurde die Auswirkung einer definierten Pollenexposition auf die Höhe des exhalierten NO ermittelt. Hierzu wurden die Probanden 4 Stunden mit einer definierten Konzentration von Knäuelgraspollen in einem Pollenraum exponiert. Alle 30 Minuten wurden von den Patienten die allergiebezogenen Symptome protokolliert. Stündlich erfolgten Lungenfunktionsmessungen. Die Bestimmung des exhalierten NO erfolgte unmittelbar vor und unmittelbar nach der Pollenexposition sowie ca. 24 Stunden nach der erstmaligen Messung. Während des Zeitraumes nach Abschluss der Pollenexposition bis zur eNO-Messung am folgenden Tag dokumentierten die Patienten aufgetretene asthmatische Symptome sowie die Ergebnisse der in festgelegten Abständen vorgenommenen Peak-Flow-Messungen. Zur Behandlung eventuell auftretender asthmatischer Beschwerden wurde den Patienten ein Salbutamol-Dosieraerosol ausgehändigt.

2.2. Probanden

Im Rahmen der oben genannten Phase-II-Studie wurden Probanden rekrutiert, die unter einer saisonalen allergischen Rhinitis litten. Aus den Teilnehmern der Studie, die durch die Ethikkommission der Medizinischen Hochschule Hannover genehmigt worden war, wurde unter Berücksichtigung weiterer Ein- und Ausschlusskriterien ein Probandenkollektiv ausgewählt, das sich aus Probanden mit und ohne Asthma zusammen setzte.

2. Methodik 10 Insgesamt konnten 55 Probanden für die Teilnahme an dieser Pilotstudie gewonnen werden. Alle Probanden nahmen freiwillig nach schriftlicher Einwilligungserklärung an der Studie teil und hatten jederzeit die Möglichkeit, die Teilnahme ohne Nennung von Gründen zu beenden.

2.2.1. Ein- und Ausschlusskriterien 2.2.1.1. Einschlusskriterien

- männliche und weibliche Probanden im Alter von 18 bis 65 Jahren - Anamnese einer saisonalen allergischen Rhinitis

(mindestens innerhalb der letzten 2 Jahre, Auslöser Gräserpollenallergie) - Nachweis einer positiven Hautreaktion auf Gräserpollen (insbesondere

Knäuelgras) in einem Prick-Test innerhalb der letzten 12 Monate vor Studienbeginn - Erreichen von mindestens 80 Prozent der altersentsprechenden Normwerte für

Vitalkapazität und FEV1 bei einer Lungenfunktionsmessung

2.2.1.2. Ausschlusskriterien

- Rauchen innerhalb der letzten 12 Monate vor Studienbeginn

- Symptome einer allergischen Rhinitis zum Zeitpunkt des Studienbeginns - Infekterkrankung innerhalb der letzten 2 Wochen vor Studienbeginn - mittelgradiges oder schweres Asthma bronchiale

(mehr als 2 x / Woche tagsüber bzw. mehr als 2 x / Monat nachts auftretende auf die asthmatische Grunderkrankung zurück zu führende Beschwerden wie Luftnot, Brustenge, Husten oder nächtliches Erwachen)

- Beginn einer Hyposensibilisierungsbehandlung im letzten Monat vor Studienbeginn - maligne Erkrankungen in den letzten 5 Jahren vor Studienbeginn

- weitere Erkrankungen bzw. erforderliche Behandlungen, die mit der Studie nicht vereinbar gewesen wären bzw. die Sicherheit des Patienten gefährdet hätten - Alkohol- und / oder Drogenabusus

- regelmäßige Einnahme von nichtsteroidalen Antirheumatika

(ausgenommen ASS bis zu 200 mg/d zur Thrombozytenaggregationshemmung) - regelmäßige oder vorübergehende Einnahme bzw. Anwendung von

Glukokortikoiden und anderen Medikamenten, sofern die nachfolgend aufgeführten Auswaschzeiten nicht eingehalten werden konnten (Tabelle 2):

- bronchiale Hyperreagibilität ohne Asthmaanamnese

2. Methodik 11

2.2.2. Voruntersuchungen

2.2.2.1. Anamnese und körperliche Untersuchung

Im Rahmen der Anamnese wurden Alter, Größe und Gewicht der Probanden festgestellt, sowie Parameter des Asthma bronchiale und der Allergischen Rhinitis erfasst. Unter anderem wurden folgende Informationen erhoben: Krankheitsdauer, Triggerfaktoren, Symptomhäufigkeit, nächtliche Symptome, Einschränkung der Belastbarkeit, bekannte Allergien, Familienanamnese, Vorerkrankungen und Medikamentenanamnese. Bei der körperlichen Untersuchung wurden Blutdruck und Herzfrequenz ermittelt sowie die Auskultation des Thorax vorgenommen. Außerdem erfolgte eine HNO-Ärztliche Untersuchung der oberen Luftwege sowie eine Blutuntersuchung.

2.2.2.2. Pricktest

Zur Durchführung des Hauttests stand ein Standard-Testsystem mit verschiedenen Allergenlösungen zur Verfügung. Folgende Allergene wurden volarseitig auf die Unterarme der Probanden aufgetragen und mittels einer Stichlanzette in die Haut eingebracht:

Gräsermischung, Wiesenlischgras, Knäuelgras, Beifuß, Spitzwegerich, Roggen, Dermatophagoides farinae, Dermatophagoides pteronissinus, Hund, Katze, Alternaria tenuis, Cladosporium sp..

Zur Überprüfung der korrekten Durchführung des Tests wurde ebenso mit einer 0,9- prozentigen Kochsalzlösung und einer Histaminlösung verfahren.

Arzneimittel Auswaschzeiten

vor Studienbeginn Während der Studie Topische Corticosteroide (ocular und nasal) 2 Wochen nicht erlaubt Corticosteroide (inhalativ, oral oder i.v.) 4 Wochen nicht erlaubt Corticosteroide (i.m. oder intra-articulär) 12 Wochen nicht erlaubt kurz wirksame Antihistaminika (z.B. Azelastine) 12 Stunden nicht erlaubt

Terfenadin, Fexofenadin 48 Stunden nicht erlaubt

lang wirksame Antihistaminika (z.B. Loratadin) 96 Stunden nicht erlaubt

Astemizol 12 Wochen nicht erlaubt

Theophyllin 24 Stunden nicht erlaubt

Systemische Antibiotika 2 Wochen nicht erlaubt

Immuntherapie (Hyposensibilisierung) 1 Monat nicht erlaubt Tabelle 2: Zum Studienausschluss führende Arzneimitteleinnahmen bzw. Auswaschzeiten

2. Methodik 12 Nach 15 Minuten Einwirkzeit erfolgte die Auswertung durch Ausmessen des größten Durchmessers der entstandenen Quaddel. Ein gegenüber der Kochsalzkontrolle um 3 und mehr Millimeter größerer Quaddeldurchmesser wurde als positive Reaktion auf das jeweilige Allergen gewertet. Gültig war das Testergebnis nur dann, wenn auch die Histaminlösung eine derartige Reaktion hervorgerufen hatte.

2.2.2.3. Lungenfunktionsmessung

Im Rahmen einer Spirometrie, deren Durchführung gemäß der Standard Operating Procedure (SOP) des Fraunhofer Instituts für Toxikologie und Experimentelle Medizin in Anlehnung an die Empfehlungen der American Thoracic Society (ATS 1995) erfolgte, wurden unter anderem folgende Lungenfunktionsparameter ermittelt:

Forcierte Vitalkapazität (FVC)

Forciertes Exspiratorisches Volumen in 1 Sekunde (FEV1) Peak Exspiratory Flow (PEF)

2.3. Metacholinprovokation

Zur Erfassung einer eventuell bestehenden Hyperreagibilität des Bronchialsystems wurden die Probanden einer inhalativen Metacholinprovokation unterzogen.

Zur Durchführung stand ein Verneblungsgerät für inhalative Allergenprovokationen zur Verfügung. Dieses wurde in Verbindung mit einer Absaugvorrichtung verwendet, über die eine Verteilung des nach der Inhalation abgeatmeten Luft-Aerosolgemisches im Provokationsraum vermieden wurde.

Die Vorgehensweise richtete sich nach dem von L. Grönke et. al. (1995) entwickelten Protokoll, wonach zuerst eine 0,9-prozentige Kochsalzlösung und später eine aufsteigende Konzentrationsreihe von Metacholinlösungen in exakt vorgegebenen zeitlichen Abständen inhaliert werden muss. Die Auswirkung auf die Lungenfunktion wird nach diesem Protokoll zu genau festgelegten Zeitpunkten durch eine Spirometrie überprüft. Kriterium für den Nachweis einer bronchialen Hyperreagibilität ist der Abfall des FEV1 nach Inhalation der jeweiligen Metacholinlösung im Verhältnis zum FEV1- Ausgangswert nach Inhalation der Kochsalzlösung. Die Metacholinkonzentration, nach deren Inhalation das Ausgangs-FEV1 um 20 % abfällt, wird als PC20 bezeichnet. Ist dieser Abfall bei einer inhalierten Metacholinkonzentration von 8 mg/ml noch nicht eingetreten, so gilt das Bronchialsystem zu diesem Zeitpunkt als nicht hyperreagibel.

Kommt es hingegen zu einer Verschlechterung des FEV1 um 20 % und mehr, so erfolgt eine Einteilung der Überempfindlichkeitsreaktion in Abhängigkeit von der zu dem

2. Methodik 13 entsprechenden Zeitpunkt inhalierten Metacholinkonzentration in leichtgradig ( >2 - 8 mg/ml), mittelgradig (>0,5 - 2 mg) und schwergradig (≤0,5 mg/ml).

2.4. NO - Messung

2.4.1. Messtechnik

Für die Messungen wurde ein Gerät der Firma Sievers (Sievers 280 NOA, Boulder, Colorado, USA) verwendet, das auf der Basis der Chemiluminiszenz- Analyse arbeitet.

Mittels eines Generators gebildetes Ozon reagiert mit dem vorhandenen (ausgeatmeten) NO zu NO2. Mit einem Photomultiplier werden nun auf die ablaufende Reaktion zurückzuführende Lichtquanten gemessen, deren Menge in direktem Verhältnis zum analysierten NO steht.

Das Gerät und das dazugehörige Computerprogramm („Restricted Breath“, Sievers, USA) waren so eingestellt, dass die Messungen bei einer 30sekündigen Ausatmung mit einem konstanten Flow von 50 ml/sec gegen einen Widerstand von 16 cm H2O durchgeführt werden mussten. Der Verlauf der Messungen konnte von den Probanden und Untersuchern am Bildschirm verfolgt werden. Die Anordnung der Messgeräte wird in dem nachfolgenden Schaubild (Abbildung 1) verdeutlicht.

Grundlage für Vorbereitung und Durchführung der Messungen waren die Empfehlungen der American Thoracic Society (ATS 1999).

Abbildung 1: Aufbau und Anordnung der Messgeräte (modifiziert nach ATS 1999)

V Zwei-Wege-Ventil DL Druckleitung D Druckmessgerät M Mundstück

D DL

NOA

EW M

C

V

NOL

EW Exspirationswiderstand C Computer

NOA NO-Analysator NOL NO-Leitung

2. Methodik 14

2.4.2. Durchführung der Messungen

Die Bestimmung des NO-Gehaltes im Exhalat wurde direkt vor der Allergenprovokation, unmittelbar danach und am nächsten Morgen vorgenommen.

Die Durchführung der Messungen erfolgte nach einem dafür entworfenen Protokoll, das die Vorbereitung des Gerätes, die Instruktion der Probanden und den Ablauf der Messungen regelte und gleichzeitig der Dokumentation diente.

Vor Beginn der Messungen wurde das Gerät jeweils entsprechend der Gebrauchsanweisung geeicht. Die aktuellen Umweltbedingungen wurden in der Software festgehalten.

Der Proband wurde angewiesen, tief durch den Mund einzuatmen, dann das Atemventil in den Mund zu nehmen und daraufhin langsam sowie gleichmäßig für einen Zeitraum von 30 Sekunden auszuatmen. Auf dem Monitor konnte der Verlauf der Messung verfolgt und kontrolliert werden.

Eine Messung bestand aus 3 korrekt durchgeführten Einzelmessungen. Wichen die jeweils ermittelten Werte um mehr als 5 % voneinander ab, so waren weitere Einzelmessungen erforderlich.

Als Ergebnis wurde der Mittelwert von 3 gültigen Einzelmessungen festgehalten.

2.5. Allergenprovokation

Das Fraunhofer Institut für Toxikologie und Experimentelle Medizin in Hannover verfügt über die Möglichkeit, in seinem Pollenexpositionsraum bis zu 18 Probanden gleichzeitig unter festgelegten klimatischen Bedingungen einer definierten Pollenkonzentration zu exponieren.

In einer 2003 veröffentlichten Studie konnte gezeigt werden, dass die Allergenprovokation im Pollenexpositionsraum eine effektive, reproduzierbare, sichere und praktikable Methode ist, klinische Monocenter-Studien über die Effektivität antiallergischer Therapien durchzuführen, respektive klinische Grundlagenforschung zu betreiben (Krug N et al. 2003). Die klinische Anwendbarkeit der Pollenexposition im Expositionsraum des Fraunhofer Instituts wurde in einer 2005 veröffentlichten Studie bestätigt (Krug N et al. 2005).

Zur Pollenexposition wurden Pollen von Knäuelgras (Dactylis glomerata) verwendet.

Es wurde eine Konzentration von 4000 Pollen/m³ im Expositionsraum eingestellt.

2. Methodik 15

2.5.1. Ablauf einer Pollenexposition

Nach vorhergehender Spirometrie betraten die Probanden den Expositionsraum, wobei sie zum Schutz der Kleidung sowie zur Vermeidung eines Partikeleintrages in den Expositionsraum und einer späteren Pollenverschleppung Einmal-Schutzanzüge trugen.

Einmal stündlich erfolgte eine Überprüfung der Lungenfunktionsparameter mittels Spirometrie. Bei einem FEV1 von weniger als 60 % des Ausgangswertes war ein vorzeitiger Abbruch der auf 4 Stunden festgelegten Pollenexposition vorgesehen. Eine abschließende Spirometrie wurde 60 Minuten nach Verlassen des Expositionsraumes durchgeführt.

2.5.2. Dokumentation der Rhinitis-Symptome

In 30minütigen Abständen protokollierten die Probanden während der Pollenexposition die aufgetretenen allergischen Symptome. Hierzu war ihnen ein vorgefertigter Symptom-Score-Bogen ausgehändigt worden, auf dem sie die Möglichkeit hatten, die Symptome „Fließschnupfen“, „nasale Verstopfung“, „Niesen“ und „Nasenjucken“

subjektiv durch Ankreuzen vorgegebener Schweregrade (0 = nein, 1 = gering, 2 = mäßig, 3 = stark) einzustufen.

Die ermittelten Score-Punkte wurden später zum „Total-Nasal-Symptomscore“ (TNSS) addiert. Maximal waren 12 Score-Punkte zu vergeben.

2.5.3. Dokumentation der Peak-Flow-Werte sowie der Asthma-Symptome

Während des restlichen Tages und der Nacht nach dem Aufenthalt im Expositionsraum führten die Probanden Peak-Flow-Messungen durch (siehe 2.1.) und protokollierten deren Ergebnisse entsprechend. Das Protokoll wurde am nächsten Morgen abgegeben.

Eventuell aufgetretene Symptome einer allergischen Atemwegsreaktion (Husten, beengtes Atmen, Giemen, nächtliches Erwachen aufgrund von Atembeschwerden) sowie der Gebrauch des mitgegebenen Salbutamol-Dosieraerosols wurden abgefragt und protokolliert. Die erwähnten Symptome wurden gemäß ihrer Ausprägung (0 = nein, 1 = gering, 2 = mäßig, 3 = stark) zu einem Symptomscore (Asthma-Symptomscore - ASSC) zusammengefasst. Maximal war auch hier ein Symptomscore von 12 Punkten zu erreichen.

2. Methodik 16

2.6. Statistik

Diese Pilotstudie adressiert keine konfirmatorische Fragestellung, sondern untersuchte die Messbarkeit und den Messwertverlauf des exhalierten NO nach umweltüblicher Allergenprovokation. Die Zahl der untersuchten Studienteilnehmer orientierte sich daher an der Machbarkeit ohne a priori Fallzahlberechnung.

Zur statistischen Bearbeitung der erhobenen Daten wurden die Tabellenkalkulations- und Statistikprogramme Microsoft Excel (Version 2000) und GraphPad Prism (Version 3.0) verwendet.

Zum deskriptiven statistischen Vergleich der Rhinitiker mit und ohne Asthma wurde der ungepaarte T-Test, für Auswertungen innerhalb des Kollektivs der gepaarte T-Test verwendet. Falls nicht anders angegeben, werden die Mittelwerte sowie der Standard Error of the Mean (SEM) genannt. Die Korrelation zwischen einzelnen Parametern wurde anhand von linearen Regressionsanalysen ermittelt. Das Signifikanzniveau wurde bei p < 0,05 festgelegt.

2.7. Liste der verwendeten Materialien

Reagenzien: Hersteller:

NaCl (0,9% steril) B. Braun Melsungen AG, Melsungen,

Deutschland

Pricklösungen ALK Scherax Arzneimittel GmbH

Hamburg, Deutschland

Metacholinchlorid Synopharm, Barsbüttel, Deutschland

Materialien:

Lanzetten ALK-Abelló, Horsholm, Dänemark

Pollen (Dactylis glomerata) Biopol Laboratory Inc., Spokane, WA, USA

Geräte:

Masterscope-Spirometer Jaeger GmbH, Würzburg, Deutschland mit Zubehör:

- Laptop-Computer Toshiba

- Software LabJäger Version V4.52i - Software Spirometrie Fluss-Volumen V4.52f

- Bakterienfilter Mikro Guard

2. Methodik 17

NO-Messeinheit NOA 280 Firma Sievers, Boulder, USA mit Zubehör:

- Pentium-Computer

- Restricted-Breath-Software - Exhalationskit

Verneblungseinheit Prov Air II ZAN, Oberthulba, Deutschland mit Zubehör:

- Abluft-Absaugvorrichtung - Stoppuhr

3. Ergebnisse 18

3. Ergebnisse

3.1. Probandendaten und Voruntersuchungen

Insgesamt konnten 55 Probanden in die Studie eingeschlossen werden. Davon entfielen 33 auf die Gruppe der Nicht-Asthmatiker und 22 auf die Gruppe der Asthmatiker. Von 3 Probanden (1 Asthmatiker und 2 Nicht-Asthmatiker) konnten die Daten aufgrund fehlender Compliance (Nichterscheinen bei der Untersuchung am Folgetag nach der Exposition) nicht vollständig erhoben werden, so dass sie aus der Studie ausgeschlossen wurden.

Die Tabelle 3 zeigt die demographischen Daten der verbliebenen 52 Probanden und die Ergebnisse der Voruntersuchungen (Prickreaktion und Metacholinprovokation).

Zwischen der Gruppe der Asthmatiker und der Nicht-Asthmatiker fanden sich demographisch keine signifikanten Unterschiede. Auch bezüglich des Ausmaßes der Prickreaktion auf Knäuelgras unterschieden sie sich nicht signifikant.

Rhinitiker Asthmatiker Nicht-Asthmatiker P-Wert

Anzahl [n] 21 31 -

Alter [Jahre] 27,4 +/- 1,5 24,7 +/- 0,56 n.s.

Verteilung männlich / weiblich [n] 10 / 11 15 / 16 - Prickreaktion auf Knäuelgras [mm] 6,2 +/- 0,53 8,2 +/- 0,71 n.s.

PC20 [mg/ml] 5,2 +/- 0,68 > 8,0 < 0,05

Tabelle 3:

Demographische Daten und Befunde des Pricktests sowie der Metacholinprovokation (PC20) der Rhinitiker ohne und mit Asthma-Bronchiale-Komorbidität. Es wurden die Mittelwerte +/- Standard Error of the Mean (SEM) bzw.

die Anzahl (n) angegeben.

3. Ergebnisse 19

20 30 40 50 60

0 Stunden 4 Stunden 24 Stunden

eNO [ppb]

Asthmatiker

Nicht- Asthmatiker

*

*

P=0,0030 P=0,0037 P=0,0060

3.2. NO – Messungen

Abbildung 2:

Mittelwerte des NO im Exhalat (eNO) des gesamten Probandenkollektivs in parts per billion (ppb) vor (0 Stunden), unmittelbar nach Allergenexposition (4 Stunden) sowie am folgenden Morgen (24 Stunden) +/- SEM. Der Stern markiert die signifikante Änderung (P = 0,0003) in Bezug zum Ausgangswert (0 Stunden).

Abbildung 3:

Mittelwerte des NO im Exhalat (eNO) in parts per billion (ppb) vor (0 Stunden), unmittelbar nach Allergenexposition (4 Stunden) sowie am nächsten Morgen (24 Stunden) - getrennte Darstellung der Asthmatiker und Nicht-Asthmatiker +/- SEM. Die oben genannten P-Werte spiegeln die signifikant unterschiedlichen eNO-Werte der beiden Gruppen zu den 3 verschiedenen Messzeitpunkten wider. Der Stern kennzeichnet die signifikante Änderung (*¹ P = 0,0283 | *² P = 0,0041) in Bezug zum Basiswert (0 Stunden) der selben Gruppe.

20 30 40 50 60

0 Stunden 4 Stunden 24 Stunden

eNO [ppb]

*

3. Ergebnisse 20 In der Abbildung 2 ist der Verlauf der eNO-Werte des Gesamtkollektivs vor (0 Stunden) und nach der Allergenexposition (4 Stunden) sowie bis zum nächsten Morgen (24 Stunden) ersichtlich. Nach der 4stündigen Allergenexposition waren diese Werte unverändert. Bei der NO - Messung am nächsten Morgen war ein deutlicherer Anstieg zu verzeichnen, der signifikant im Bezug zu den Basiswerten war (P= 0,0003).

Die Abbildung 3 zeigt, dass Patienten mit einer allergischen Rhinitis sowie positiver Anamnese bezüglich asthmatischer Vorerkrankungen einen signifikant höheren NO- Wert im Exhalat (P-Wert zu den Messzeitpunkten jeweils < 0,05) im Vergleich zu den Rhinitikern ohne zusätzliche Asthmaanamnese aufwiesen.

Bei beiden Gruppen stieg der eNO-Wert nach Allergenexposition in vergleichbarer Höhe an, so dass die Differenz zwischen den eNO-Werten beider Gruppen annähernd gleich blieb.

Nachfolgend wird in den Abbildungen 4 und 5 die Änderung der NO-Konzentration im Exhalat der Asthmatiker (Abbildung 4) und Nicht-Asthmatiker (Abbildung 5) in Einzelverläufen im Bezug zum Ausgangswert aufgezeigt. Zur späteren Diskussion wurden auffällige Einzelverläufe gekennzeichnet (ID5, ID21, ID 26).

Es wird veranschaulicht, dass sich die Werte des exahlierten NO nach der Allergenprovokation im Pollenexpositionsraum zum Teil sehr unterschiedlich veränderten. So gab es neben einem nahezu linearen eNO-Anstieg bis zum Messzeitpunkt nach 4 und 24 Stunden auch Einzelverläufe, die unmittelbar nach der Exposition einen Abfall des eNO und erst bis zur Messung nach 24 Stunden einen Anstieg gegenüber den Ausgangswerten aufzeigten. Auch konnte beobachtet werden, dass in Einzelfällen der eNO-Wert zunächst anstieg und dann bis zum nächsten Morgen unter den Ausgangswert abfiel.

3. Ergebnisse 21

Abbildung 4:

Veränderung der NO-Werte [ppb] im Exhalat der Asthmatiker vor (0 Stunden), unmittelbar nach Allergenexposition (4 Stunden) sowie am nächsten Morgen (24 Stunden). ID5 und ID21=

Probandenidentifikationsnummern zur späteren Diskussion.

Abbildung 5:

Veränderung der NO-Werte [ppb] im Exhalat der Nicht-Asthmatiker vor (0 Stunden), unmittelbar nach Allergenexposition (4 Stunden) sowie am nächsten Morgen (24 Stunden). ID26 = Probandenidentifikationsnummer zur späteren Diskussion.

-20 -10 0 10 20 30 40 50 60 70

0 Stunden 4 Stunden 24 Stunden

eNO-Änderung [ppb]

-20 -10 0 10 20 30 40 50 60 70

0 Stunden 4 Stunden 24 Stunden

eNO-Änderung [ppb]

ID5

ID21

ID26

3. Ergebnisse 22

3.3. Peak-Flow-Werte und Symptomscores

In der nachfolgend abgebildeten Tabelle 4 werden die Mittelwerte der Peak-Flow- Variabilität (PEF-Variabilität), der Peak-Flow-Änderung (PEF-Änderung), des Asthma- Symptomscores (ASSC) sowie des Total-Nasal-Symptomscores (TNSS) +/- SEM der Rhinitiker mit und ohne Asthma gegenübergestellt.

Rhinitiker Asthmatiker Nicht-

Asthmatiker P-Wert PEF-Variabilität (%) Mittelwert 8,30 6,24 n.s.

SEM 1,19 0,68

PEF-Änderung (l/min) Mittelwert - 42,4 - 34,8 n.s.

SEM 5,39 4,32

ASSC Mittelwert 0,8 0,1 n.s.

SEM 0,30 0,05

TNSS Mittelwert 7,14 7,03 n.s.

SEM 0,46 0,40

Tabelle 4:

Peak-Flow-Werte (PEF-Variabilität und -Änderung) sowie Symptomscores

ASSC = Asthma-Symptomscore | TNSS = Total-Nasal-Symptomscore – beide während der Exposition PEF-Werte wurden nach der Exposition bis zum nächsten Morgen ermittelt (siehe 2.5.2 bis 2.5.3) n.s. = nicht signifikant

3.4. Korrelationen

3.4.1. eNO-Basiswert - Bronchiale Hyperreagibilität (PC20)

Bei den Asthmatikern zeigte sich ein Zusammenhang zwischen dem NO-Basiswert und der bronchialen Hyperreagibilität (PC20). Umso empfindlicher das Bronchialsystem auf die inhalierte Metacholinkonzentration reagierte (je niedriger also die PC20), desto höher war der eNO-Basiswert (r = -0,48 | P = 0,0142 - siehe Abbildung 6). Da die Werte für die PC20 oberhalb von 8mg/ml nicht mehr stetig verteilt sind, wurde zusätzlich die Korrelation von eNO-Basiswert und PC20 für die Patienten mit nachgewiesener bronchialer Hyperreagibilität, also einer PC20 < 8mg/ml betrachtet. Hier zeigte sich wie für die Gesamtgruppe der Asthmatiker ebenfalls eine signifikante Korrelation mit einem r=-0,56 (p=0,038).

3. Ergebnisse 23

Abbildung 6:

Korrelation zwischen dem NO im Exhalat (eNO) vor Provokation (Basiswert | 0 Stunden | [ppb]) und der bronchialen Hyperreagibilität (PC20 [mg/ml]) bei den Asthmatikern.

Bronchiale Hyperreagibilität ohne Asthmaanamnese war ein Ausschlussgrund (2.2.1.2.), so dass für die Nicht-Asthmatiker ein Zusammenhang zwischen der PC20 und dem eNO-Basiswert nicht zu prüfen war.

3.4.2. eNO-Basiswert – Total-Nasal-Symptomscore (TNSS)

a)

0 2 4 6 8 10 12 14

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

eNO Basiswert [ppb]

TNSS

r = 0,21 | P = 0,1781 0

1 2 3 4 5 6 7 8

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

eNO Basiswert [ppb]

PC 20 [mg/ml]

r = -0,48 | P = 0,0142

3. Ergebnisse 24

Abbildungen 7a und 7b:

Korrelationen zwischen dem NO im Exhalat (eNO) vor Provokation (Basiswert | 0 Stunden | [ppb]) und den Total-Nasal-Symptomscores (TNSS) bei den Asthmatikern (Abbildung 7a) und Nicht-Asthmatikern (Abbildung 7b).

Wie aus den Abbildungen 7a und 7b ersichtlich, konnte sowohl bei den Asthmatikern als auch den Nicht-Asthmatikern kein Zusammenhang zwischen dem TNSS und den eNO-Basiswerten gefunden werden.

3.4.3. eNO-Basiswert - Peak-Flow-Variabilität b)

0 2 4 6 8 10 12 14

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

eNO Basiswert [ppb]

TNSS

a)

0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

eNO Basiswert [ppb]

PEF-Variabilität [%]

r = 0,28 | P = 0,1136 r = -0,10 | P = 0,2800

3. Ergebnisse 25

Abbildungen 8a und 8b:

Korrelationen zwischen dem NO im Exhalat (eNO) vor Provokation (Basiswert | 0 Stunden | [ppb]) und der Peak-Flow-Variabilitäten [%] bei den Asthmatikern (Abbildung 8a) und Nicht-Asthmatikern (Abbildung 8b).

Die Abbildungen 8a und 8b zeigen, dass die Peak-Flow-Variabilität bei den Asthmatikern und Nicht-Asthmatikern breit gestreut war und dass es keine Korrelation mit den eNO-Basiswerten gab.

3.4.4. eNO-Basiswert - Asthma-Symptomscore (ASSC) b)

0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

eNO Basiswert [ppb]

PEF-Variabilität [%]

a)

0 1 2 3 4 5 6

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

eNO Basiswert [ppb]

ASSC

r = -0,06 | P = 0,3771

r = 0,31 | P = 0,0870

3. Ergebnisse 26

Abbildungen 9a und 9b:

Korrelationen zwischen dem NO im Exhalat (eNO) vor Provokation (Basiswert | 0 Stunden | [ppb]) und den Asthma-Symptomscores (ASSC) bei den Asthmatikern (Abbildung 9a) und Nicht-Asthmatikern (Abbildung 9b).

Wie aus den Abbildungen 9a und 9b ersichtlich, wurde bei den Asthmatikern in 7 Fällen gegenüber 3 Fällen bei den Nicht-Asthmatikern ein Asthma-Symptomscore >0 dokumentiert.

Auffällig war, dass ein erhöhter ASSC bei den Asthmatikern mit höheren eNO-Werten auftrat. Eine signifikante Korrelation mit den eNO-Basiswerten war jedoch bei beiden Gruppen statistisch nicht feststellbar.

b)

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

eNO Basiswert [ppb]

ASSC

r = 0,28 | P = 0,0591

4. Diskussion 27

4. Diskussion

In der vorliegenden Arbeit wurde bei Patienten mit allergischer Rhinitis untersucht, welchen Einfluss eine unter standardisierten Umweltbedingungen in einem Pollenexpositionsraum durchgeführte Allergenprovokation auf das exhalierte NO als Marker einer allergischen, bronchialen Entzündung hat. Zusätzlich sollte analysiert werden, ob ein klinisch/lungenfunktioneller Zusammenhang mit dem exhalierten NO besteht und ob sich die eNO-Messung als klinischer Marker eignet, das Risiko asthmatischer Komplikationen durch eine Allergenprovokation in einem Pollenexpositionsraum zusätzlich zur Lungenfunktion abschätzen zu können.

Nach aktuellem Stand der Wissenschaft liegen die im Exhalat bei einer Flussrate von 50ml/s gemessenen NO-Werte bei gesunden nicht-atopischen Personen zwischen 10 und 25 ppb (Olin AC et al. 2006). Vorangegangene Untersuchungen haben auch NO- Werte von 30±40 ppb an einem Normalkollektiv beschrieben (Olin AC et al. 2004). Die relativ große Variabilität des Normalbereiches ist erklärbar durch eine Reihe von Einflussfaktoren (siehe Einleitung) und macht deutlich, dass ohne deren Berücksichtigung eine klinische Interpretation von eNO-Konzentrationen erschwert wird. Basierend z.T. auf der kleineren Lungengröße liegen die Normalwerte bei Kindern in der Regel niedriger (5±15 ppb - Malmberg LP et al. 2006). Alle bisher in der Literatur verfügbaren Normalwerte (siehe oben sowie Olivieri M et al. 2006) können daher nur der Orientierung dienen. NO-Werte sind in der Regel intraindividuell gut reproduzierbar.

Daher erscheint eine Orientierung an einem individuellen Normalwert in der Regel aussagekräftiger, als ein anhand von Gruppenuntersuchungen ermittelter Medianwert (Holz et al. 2007).

Im Vergleich zu den publizierten Normalwerten gesunder Probanden zeigen sich in unserer Studie bereits erhöhte Ausgangs-eNO-Werte des Probandenkollektivs vor Allergenprovokation (siehe 3.2. Abbildung 2), welche einen Tag nach Allergenexposition zusätzlich ansteigen.

Betrachtet man in unserem Probandenkollektiv die eNO-Mittelwerte der asthmatischen getrennt von denen der nicht-asthmatischen Rhinitiker, so erkennt man einen signifikanten Unterschied zwischen diesen beiden Gruppen (siehe 3.2. Abbildung 3).

Die Asthmatiker haben insgesamt höhere eNO-Werte als die Nicht-Asthmatiker. Bei beiden Gruppen ist der Anstieg des eNO am Tag nach der Allergenprovokation annähernd gleich, so dass die Differenz der eNO-Mittelwerte zwischen den beiden Gruppen zu den genannten Messzeitpunkten nahezu gleich bleibt.

4. Diskussion 28 Eine Erklärung der erhöhten Ausgangswerte bei Patienten, die zusätzlich zur allergischen Rhinitis unter einem Asthma bronchiale leiden, lässt sich durch die Betrachtung des Ursprungs des von uns gemessenen eNO finden. Wie bereits in der Einleitung geschildert, wird das exhalierte NO nahezu vollständig in den Atemwegen und nicht im Alveolarraum gebildet (Jörres RA 2000). Gebildet wird das exhalierte NO vorwiegend von einer induzierbaren Isoform des Enzyms Stickstoffmonoxid-Synthase (NOS), welches zum Beispiel in bronchialen Epithelzellen, Makrophagen und eosinophilen Granulozyten vorkommt. Diese induzierbare NO-Synthase (iNOS auch NOS2) unterscheidet sich von den zwei weiteren, jedoch konstanten Isoformen des Enzyms (eNOS und nNOS, alternative Bezeichung NOS1 und NOS3) vorwiegend dadurch, dass sie nicht durch intrazelluläre Kalziumausschüttung, sondern durch proinflammatorische Zytokine und Endotoxine aktiviert wird (Kharitonov et al 2001).

Ist es zum Beispiel im Rahmen einer allergischen Atemwegsentzündung zu einer vermehrten Bildung der iNOS gekommen, kann diese über Stunden bis Tage NO in erheblich höherer Menge produzieren als die konstanten Isoformen des Enzyms. Hamid et al. beschrieben schon 1993 ein vermehrtes Vorkommen der iNOS in den unteren Atemwegen von Asthmatikern (Hamid et al. 1993). Die bereits vor der Allergenprovokation im Vergleich zu den Nicht-Asthmatikern höheren eNO-Werte der Asthmatiker führen wir auf dieses chronisch erhöhte Vorkommen der iNOS und eine daraus resultierende höhere basale NO-Produktion zurück.

Unmittelbar nach dem Ende der Allergenprovokation im Pollenexpositionsraum fand sich in unserem Probandenkollektiv keine richtungweisende Veränderung der eNO- Konzentration. Andere Studien berichten sogar von einem moderaten Abfall der eNO- Werte nach Allergenprovokation (Jörres 2002) bzw. unmittelbar nach einer Metacholinprovokation (Silvestri et al. 2000).

Der Zeitraum unmittelbar nach Beendigung der Allergenprovokation ist am ehesten der allergischen Frühreaktion zuzuordnen. Diese Phase führt immunologisch zu Reaktionen überwiegend durch eine IgE-vermittelte Histaminausschüttung aus Mastzellen, welche noch nicht zu einer Induktion der iNOS führt. Ob die verhältnismäßig lange Allergenprovokation bereits zu einer zellulären Infiltration und konsekutiv vermehrten Induktion der iNOS geführt hat, kann durch die von uns durchgeführten Untersuchungen nicht geklärt werden. Hierzu müsste nach 4stündiger Exposition eine bronchoskopische Materialgewinnung durchgeführt oder zumindest ein induziertes Sputum gewonnen werden.

Der Anstieg der eNO-Werte bei den Asthmatikern und Nichtasthmatikern bis zum Zeitpunkt der Messung am nächsten Morgen steht hingegen eindeutig mit der durch die

4. Diskussion 29 Allergenexposition ausgelösten Immunantwort, insbesondere der erwähnten Infiltration von eosinophilen Granulozyten, in Zusammenhang.

Laut Kay et al. kommt es in Abhängigkeit von der Menge des auf den Organismus einwirkenden Allergens im Anschluss an die Frühreaktion zu einer allergischen Spätreaktion, welche lungenfunktionell ihr größtes Ausmaß 6 bis 9 Stunden nach der Allergenexposition erlangt und danach langsam wieder abfällt (Kay et al. 2001). Diese Spätreaktion führt an der Haut zur Akkumulation von eosinophilen und neutrophilen Granulozyten, die wiederum die Infiltration von CD4-positiven T-Zellen und basophilen Granulozyten nach sich zieht (Ying et al. 1999). Die Spätphase bronchialer und nasaler Reaktionen beinhaltet eine vergleichbare zelluläre Infiltration (Macfarlane et al. 2000).

Überträgt man diese Erkenntnisse auf unsere Studie, so kann die allergische Spätreaktion bei unseren Probanden am nächsten Morgen, also ca. 24 Stunden nach Beginn und ca. 20 Stunden nach Beendigung der Allergenexposition, schon wieder unter ihre maximale Ausprägung zurück gefallen sein. Das nach wie vor verhältnismäßig hohe Vorkommen von Entzündungszellen, insbesondere der eosinophilen Granulozyten, muss in Verbindung mit der nachhaltig erhöhten Aktivität der iNOS zu den in Bezug zum Basiswert signifikant erhöhten eNO-Werten bei ihnen geführten haben. Insofern sehen wir das eNO als Marker der allergischen Spätreaktion an.

Wie aus den Abbildungen 4 und 5 im Ergebnisteil (3.2.) ersichtlich ist, gab es sowohl bei den Asthmatikern als auch den Nicht-Asthmatikern nach der Allergenexposition Veränderungen der eNO-Werte, die nicht mit oben angenommenen Mechanismen übereinstimmen. So gab es in beiden Gruppen Einzelverläufe, die, verglichen mit dem Ausgangswert, unmittelbar nach der Allergenprovokation geringere eNO-Werte aufzeigten, bei der Messung nach 24 Stunden sogar unter ihren Ausgangswerten blieben bzw. noch weiter abfielen. Hierfür ließ sich keine sichere Erklärung finden. Eine in weiteren Studien engmaschigere Kontrolle der eNO-Werte, die einen genaueren zeitlichen Verlauf der eNO-Konzentrationen im Exhalat während und nach der Allergenexposition aufzeigt, wäre in diesem Zusammenhang von großem Interesse.

Einige Studien zeigten einen Zusammenhang zwischen dem vermehrten Vorkommen von allergischen Entzündungszellen und einer erhöhten bronchialen Reagibilität (Wardlaw et al.

1983, Kirby et al. 1987 und Bentley et al. 1992). Andere hingegen konnten diese Verbindung nicht herstellen (Jefferey et al. 1989, Adelroth et al. 1990 und Crimi et al. 1998). Auch konnte in Studien eine Korrelation zwischen Eosinophilie im Sputum und eNO bzw. erhöhter bronchialer Hyperreagibilität und eNO gezeigt werden (Dupont et al. 1998).

4. Diskussion 30 In unserer Studie konnten wir eine Korrelation (r= -0,48 / P= 0,0142) der PC20-Werte mit den eNO-Basiswerten bei den Asthmatikern feststellen (siehe 3.4.1 - Abbildung 6).

Hohe PC20-Werte, und damit eine geringe bis nicht vorhandene Hyperreagibilität, gingen demnach mit niedrigen eNO-Werten einher. Wir können somit Duponts Feststellung trotz geringer Probandenzahlen bestätigen.

Zu berücksichtigen ist allerdings, dass nur 10 der 21 eingeschlossenen Asthmatiker unserer Studie vor dem Aufenthalt im Pollenexpositionsraum eine bronchiale Hyperreagibilität aufwiesen. Blieben die nicht-hyperreagiblen Asthmatiker bei der Berechnung der Korrelation außen vor, ergab sich eine höhere Korrelation mit einem Wert von r = -0,56 (P = 0,0383). Korrelationsbestimmend ist hierbei dann ein Patient mit sehr hohem eNO und sehr niedriger PC20. Eventuell hätte eine erneute Bestimmung der bronchialen Hyperreagibilität im Anschluss an die Messung des eNO 24 Stunden nach Allergenexposition zu weiteren Erkenntnissen geführt, da die bronchiale Hyperreagibilität als Indikator der akuten Eosinophilie angesehen werden kann (Grönke et al. 2002), die durch die Pollenexposition ausgelöst worden sein muss.

Aufgrund der Tatsache, dass die teilnehmenden Probanden nach Aufenthalt im Pollenexpositionsraum zwecks Bestimmung weiterer inflammatorischer Biomarker der Atemkondensatdiagnostik zugeführt wurden, und laut Prüfplan aufgrund fehlender Machbarkeit keine erneute Metacholinprovokation vorgesehen war, kann unsere Untersuchung diesbezüglich keine weitere Information liefern.

Offen bleiben muss an dieser Stelle, womit sich die im Ergebnisteil markierten

„auffälligen“ Einzelverläufe (ID5, ID 21, ID26) erklären lassen. So fanden wir beispielsweise bei einem Asthmatiker eine besonders starke eNO-Erhöhung einen Tag nach Allergenprovokation bei Vorliegen einer bronchialen Hyperreagibilität (3.2. - Abbildung 4 - ID5). Eine sogar noch stärker ausgeprägte eNO-Erhöhung fand sich aber auch bei einem Nicht-Asthmatiker, welche alle keine bronchiale Hyperreagibilität aufwiesen (siehe 3.2. - Abbildung 5 - ID26). Demgegenüber fiel beispielsweise bei einem Asthmatiker der eNO-Wert von einem Ausgangswert von 72,2 ppb unmittelbar nach Allergenprovokation deutlich ab und erreichte nach 24 Stunden noch nicht einmal wieder seinen Ausgangswert, obwohl der Proband eine nachgewiesene bronchiale Hyperreagibilität hatte (siehe 3.2. - Abbildung 4 - ID21). Dieses belegt die zu Beginn der Diskussion erwähnte interindividuelle Variabilität.

Eine weitere Frage dieser Arbeit war wie eingangs erwähnt, ob anhand der gemessenen eNO-Werte eine Voraussage getroffen werden kann, welchem Risiko Probanden im Rahmen einer Allergenexposition in einem Pollenexpositionsraum ausgesetzt sind, asthmatische Beschwerden und/oder einen Abfall des Peak-Flow zu bekommen. Kharitonov et al. stellten bereits 1995 fest, dass erhöhte NO-Werte im