Viszeral- und Transplantationschirurgie der
Medizinischen Hochschule Hannover
Organprotektion durch Mitglieder der TNF/ TNFR Superfamilie
im Haut- und heterotopen
Herztransplantationsmodell an der Maus
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin
an der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Jan Henrik Beckmann aus Rinteln
Hannover 2002
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 14.04.03.
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover.
Rektor : Prof. Dr. Horst v. der Hardt Betreuer : Prof. Dr. Dr. Matthias Hoffmann Referent : Prof. Dr. Kurt Wonigeit
Korreferent : Prof. Dr. Volkhard Kaever Tag der mündlichen Prüfung: 14.04.03
Promotionsausschussmitglieder : Prof. Dr. Jürgen Klempnauer
Prof. Dr. Johann Karstens
Prof. Dr. Benno Ure
EINFÜHRUNG 4
Bedeutung und Funktion von Apoptose und Nekrose 4
Wege der Apoptoseinduktion 5
Mitglieder der TNF und TNF Rezeptor Superfamilie 6
Mechanismen der Signaltransduktion 6
Bedeutung von Apoptose im Immunsystem 8
Der besondere Status des Immunprivilegs 9
Induktion von Toleranz durch Apoptose induzierende Liganden 10 Einfluß des CD95L Moleküls auf allogene Abstoßungsreaktionen 10
Apoptoseinduktion durch TNF a 11
CD30/ CD30L Interaktion nach allogener Transplantation 13
Adenoviraler Transfer protektiver Gene 14
Fragestellung 15
MATERIAL UND METHODEN 16
Mausstämme 16
CD30 Screening 17
Lösungen für DNA Gewinnung und Polymerasekettenreaktion 18
DNA Isolierung 19
Polymerasekettenreaktion 19
Primer 20
Elektrophorese 20
Operative Eingriffe 20
Tierschutzrechtliche Bestimmungen 20
Tierhaltung 21
Narkose, Nachbehandlung 21
Hauttransplantation 22
BAY 11-7085 23
Herztransplantation 23
Organentnahme 23
Operation des Empfängers 24
Beurteilung der Funktion des Transplantates 26 Tötung und Organentnahme zwecks histologischer Aufarbeitung 26
Adenoviraler Gentransfer 26
Operative Durchführung des Gentransfers 27
Herstellung monoklonaler Antikörper 27
Lösungen 27
Biotinylierung 29
Titration 29
Histologie 29
Anfertigen von Gewebeschnitten 29 Hämatoxilin Eosin Färbung 30 Immunhistologische Färbung 30
X- Gal Färbung 31
TUNEL Färbung 32
Statistik 33
Semiquantitative Auswertung der Histologien 33 Unabhängiger T- Test zum Vergleich der Überlebenszeiten 33
ERGEBNISSE 34
Heterotope Herztransplantation 34
CD95/ CD95L 34
Transplantation CD95 Ligand transgener allogener Haut 34 Syngene Transplantation CD95L transgener Transplantate 35 Transplantation allogener CD95L transgener Haut auf lpr Empfänger 35
Herztransplantation 37
Immunhistopathologische Veränderungen im Transplantat 37
TNF/ TNFR 40
Hauttransplantation 40
Herztransplantation 41
CD30/ CD30L 42
Hauttransplantation 42
Abstoßung allogener Herztransplantate durch CD30 defiziente Empfänger 44 Immunhistochemische Untersuchung MHC Klasse I disparater Herztransplantate in Wildtyp und CD30
defizienten Empfängern 45
Rolle von schwachen Transplantationsantigenen bei der Abstoßung MHC Klasse I disparater CD30
defizienter Haut 49
Adenoviraler Gentransfer 49
Intraoperative virusvermittelte Transfektion vaskularisierter Herztransplantate 49 Transfektion von Hauttransplantaten 52
DISKUSSION 53
Akzelerierte Abstoßung durch Expression von CD95L 53
Einfluß von tmTNFa auf Abstoßungsreaktionen 57
Rolle des CD30 Moleküls nach allogener Transplantation 60
Adenoviraler Gentransfer 62
ZUSAMMENFASSUNG 65
LITERATUR 66 ANHANG 76
Tabelle der Verbrauchsmaterialien und Geräte 76
Ansätze gebräuchlicher Lösungen 78
Abkürzungsverzeichnis 79
DANKSAGUNG 80 LEBENSLAUF 81 VERÖFFENTLICHUNGEN 82
WISSENSCHAFTLICHE VORTRÄGE 82
ERKLÄRUNG 83
Einführung
Die Organtransplantation ist Mittel der Wahl zur Therapie des irreversiblen Organversagens und spielt eine zunehmend wichtige Rolle nicht nur als letztmögliche, sondern ebenso als elektive Operation.
Trotz entscheidender Verbesserungen der Operationstechnik, der Organkonservierung und letztendlich auch des Transplantatüberlebens steht ein Problem noch immer im Mittelpunkt.
So werden allogene Transplantate durch das Immunsystem des Empfängers als fremd erkannt und angegriffen. Immunsuppressive Medikamente, die eingesetzt werden, um dies zu
verhindern, haben teilweise erhebliche Nebenwirkungen (1-3). Während die akute Abstoßung medikamentös relativ gut unterdrückt werden kann, führt die chronische Dysfunktion häufig zu einem späteren Verlust des Organs. Eine Möglichkeit, auf Immunsuppression zu
verzichten und die chronische Dysfunktion zu verhindern, ist, die körpereigene Abwehr gegenüber Transplantaten spezifisch zu unterdrücken. Dieser Zustand wird als Toleranz bezeichnet. Die gezielte Toleranzinduktion ist daher ein wichtiges Ziel der
transplantationsimmunologischen Forschung (4). Ein Konzept zur Induktion peripherer gewebespezifischer Toleranz besteht darin, das Transplantat durch Expression
proapoptotischer Moleküle vor infiltrierenden alloreaktiven Lymphozyten zu schützen.
Um dieses Konzept wissenschaftlich zu untersuchen, wurde die Maus als Versuchsmodell gewählt. Im Mausmodell stehen zahlreiche transgene und knock out Stämme zur Verfügung.
Mit Hilfe dieser Tiere läßt sich die Auswirkung eines bestimmten Moleküls auf das Transplantatüberleben untersuchen. Das primär vaskularisierte Modell der heterotopen Herztransplantation wurde neben der nicht vaskularisierten Hauttransplantation ausgewählt, da es der klinischen Situation mit in der Regel primär vaskularisierten Transplantaten gleicht.
Bedeutung und Funktion von Apoptose und Nekrose
Als Apoptose wird der programmierte Zelltod beschrieben. Durch verschiedene Stimuli wird dieser Prozeß aktiv nach einem genetisch festgelegten und kontrollierten Programm ausgelöst.
Die physiologische Funktion der Apoptose ist die gezielte und planmäßige Elimination unnützer, alter, verletzter oder gefährlicher Zellen.
Streng davon zu unterscheiden ist der Terminus Nekrose. Nekrose findet sich nach Zellschädigung, beispielsweise durch Hitzeeinwirkung, und führt zu einem Verlust der Integrität der Zellmembran mit nachfolgendem Schwellen und Platzen der Zelle. Es kommt passiv zu einer unkontrollierten Freisetzung zahlreicher intrazellulärer proinflammatorischer
Substanzen, welche eine unspezifische Entzündungsreaktion in Gang setzen (5).
Apoptose weist morphologisch deutliche Unterschiede auf. Hier schrumpft die Zelle und verdichtet sich. Das Chromatin kondensiert an der Kernmembran. Der Kern zerfällt
(Karyorhexis), dessen Fragmente finden sich in den Apoptosekörperchen (apoptotic bodies) wieder, die sich während des Prozesses vom Rest der Zelle ablösen (budding). Die
Apoptosekörperchen werden von Makrophagen und dendritischen Zellen phagozytiert (6).
Typischerweise kommt es dabei nicht zu einer Entzündungsreaktion.
Biochemisch kommt es innerhalb dieses Prozesses zu einer DNA Fragmentierung durch Endonukleasen in circa 185 bp lange Segmente. Die Vervielfältigung an DNA Endstücken nutzt man beim histologischen Nachweis von Apoptose mittels TUNEL Färbung (terminal dUTP- digoxigenin nick end labeling) (7) (siehe Material und Methoden, TUNEL Färbung).
Wege der Apoptoseinduktion
Induziert wird Apoptose über sekretorische und nicht sekretorische Wege. Zytotoxische Lymphozyten sezernieren Perforin, das die Zellmembran der Zielzelle durchlässig werden läßt für Granzyme. Granzyme aktiviert die unten beschriebene Caspasenkaskade, induziert somit Apoptose über den sekretorischen Weg (8).
Über den nicht sekretorischen Weg induzieren Zytokine der TNF Superfamilie Apoptose.
Diese aktivieren über spezifische Rezeptoren der Zielzelle und nachgeschaltete
Adapterproteine Zystein Proteinasen (Caspasen), die den Apoptosemechanismus auslösen (9,10) (siehe Abbildung 1).
Insbesondere seien hier CD95L, TNF und CD30L erwähnt, die über die zugehörigen Rezeptoren ihre proapoptotische Wirkung entfalten (siehe Tabelle 1).
Rezeptor Ligand death domain Adapterprotein
TNFR I TNF a vorhanden TRADD
TNFR II TNF a keine TRAF
CD95 (Fas) CD95L vorhanden FADD
CD30 CD30L keine TRAF CD40 CD40L keine TRAF
OX40 OX40L keine TRAF
4-1BB 4-1BBL keine TRAF
Tabelle 1 Mitglieder der TNF Rezeptor Superfamilie (11,12)
Mitglieder der TNF und TNF Rezeptor Superfamilie
Der Tumor Nekrose Faktor a konnte 1984 aus Makrophagen isoliert werden. Mittlerweile subsumieren sich unter dem Begriff TNF Superfamilie viele strukturell verwandte Liganden wie CD27L, CD30L, CD40L, CD95L, OX40L, 4-1BBL und TRAIL. Es handelt sich um Typ II Membranproteine, die untereinander allerdings nur eine Homologie von 20- 25%
aufweisen. Die Liganden binden an spezifische Rezeptoren der TNF Rezeptor Superfamilie.
Die Rezeptoren sind ebenso zahlreich wie ihre Liganden. Dazu gehören unter anderem TNFR I und II, CD27, CD30, CD40, CD95, NGFR, OX40, 4-1BB. Hierbei handelt es sich um Typ I Membranproteine, die sich sämtlich durch eine extrazelluläre zysteinreiche
Aminosäuresequenz auszeichnen (CRD, cysteine rich domain) (11-13).
Abbildung 1 Signaltransduktion ausgewählter Mitglieder der TNFR Superfamilie, modifiziert nach Lee 97 (14), Duckett 97 (15), Baker 98 (12), Chiarle 99 (16)
Mechanismen der Signaltransduktion
Intrazellulär am C- terminalen Ende verfügen TNFR I und CD95 im Gegensatz zu CD30 über eine ca. 80 Aminosäuren lange Sequenz, die für die Vermittlung der proapoptotischen Signale notwendig ist. Dies ist die sogenannte „death domain“, Todesdomäne (17) (siehe Tabelle 1).
Adapterproteine wie TRADD (TNF Receptor associated death domain) und FADD (Fas associated death domain) binden an diese „death domain“ und übermitteln zytotoxische als
auch zytoprotektive Signale.
Vom TNF Rezeptor I ausgehende proapoptotische Signale werden über das TRADD Molekül und sekundär über FADD vermittelt, während CD95 direkt über FADD seine Wirkung entfaltet. Nur FADD verfügt über eine sogenannte „death effector domain“, die durch Proteolyse bestimmter Proenzyme zur Bildung von Zystein Proteasen (Caspasen) führt. Da diese Caspasen auch durch andere Caspasen aktiviert werden können, kommt es zur
Auslösung einer Kettenreaktion. Diese wird als Caspasenkaskade bezeichnet, an deren Ende die Zerstörung der chromosomalen DNA durch Endonukleasen und der apoptotische Zelltod stehen (12,18) (siehe Abbildung 1).
Die Aktivierung der TNF Rezeptoren, TNFR II eingeschlossen, führt jedoch über weitere Faktoren wie RIP (receptor interacting protein), TRAF 2, NIK (NFkB inducing kinase) und IKK (IkB kinase complex) zur Aktivierung des nukleären Transkriptionsfaktors NFkB (nuclear factor k B), welcher in erster Linie antiapoptotische Effekte aufweist (19-21). NFkB liegt im Zytoplasma gebunden an IkB vor, das bei Aktivierung durch IKK phosphoryliert und degradiert wird. Daraufhin kann NFkB in den Zellkern eindringen und die Transkription der entsprechenden Gene aktivieren.
Durch geeignete Substanzen läßt sich die IKK vermittelte Trennung von NFkB und IkB inhibieren, die antiapoptotische Wirkung des aktivierten TNFR aufheben und die Zelle apoptoseempfindlicher machen (22).
Das CD30 Molekül besitzt dagegen keine intrazelluläre Todesdomäne. Wie es seine
Wirkungen entfaltet, ist nicht vollständig geklärt. CD30 vermag mit TRAF 2 zu interagieren und somit ebenfalls NFkB zu beeinflussen. Sowohl eine Aktivierung als auch eine Inhibition von NFkB sind beschrieben worden (15,23). Ebenso wurden Vermutungen über eine direkte Aktivierung der Caspasenkaskade durch CD30 geäußert (16).
Die Mechanismen der Signaltransduktion der TNF Rezeptor Superfamilie sind sehr komplex und werden auf vielfältige Weise von verschiedenen Faktoren beeinflußt. Vielfach existieren widersprüchliche Ergebnisse, die belegen, daß noch lange nicht alle Regelkreise und
Kofaktoren bekannt sind.
Abbildung 2 Apoptoseinduktion durch CD95L (FasL)
A: CD95 vermittelter aktivierungsinduzierter Zelltod (AICD), B: Apoptoseinduktion durch zytotoxische T- Zellen, C: Immunprivileg und protektive CD95L Expression durch Tumorzellen, Abbildung modifiziert nach Nagata 1997 (10)
Bedeutung von Apoptose im Immunsystem
Apoptose ist im Immunsystem der entscheidende Mechanismus, über den potentiell autoreaktive und nicht mehr benötigte Immunzellen beseitigt werden. Während der Thymozytenreifung werden T- Zellen, die auf körpereigene Peptide und MHC reagieren, durch Apoptose eliminiert (24). Ausgediente Effektorzellen müssen eliminiert werden, um die Immunantwort zu begrenzen. Aktivierte T- Lymphozyten reagieren im Gegensatz zu naiven T- Lymphozyten besonders apoptoseempfindlich, so daß sie nach Abschluß der
Immunantwort durch aktivierungsinduzierten Zelltod (AICD) eliminiert werden können.
Dadurch wird der T- Zell Pool konstant gehalten und Homöostase gewährleistet (25) (siehe
Abbildung 2 A).
CD95/CD95 Ligand Interaktion spielt hierbei eine wichtige Rolle. Defekte innerhalb des Systems durch Mutationen des CD95 und ebenso CD95L Gens verdeutlichen dies. Lpr Mäuse mit defektem CD95 Molekül und gld Mäuse mit funktionellem Ausfall des CD95 Liganden sind nicht in der Lage, eine Immunantwort effektiv abzuschalten, und zeigen daher eine erhöhte Inzidenz an Lymphadenopathien und Autoimmunerkrankungen (26,27). Ähnliche Beobachtungen wurden beim ALPS (autoimmune lymphoproliferative syndrome) auch beim Menschen gemacht (28).
Diese Regulationsmechanismen werden in verschiedener Weise mit immunologischen Vorgängen nach allogener Organtransplantation in Zusammenhang gebracht. So können auf der einen Seite in das Transplantat einwandernde zytotoxische T- Lymphozyten Apoptose in als fremd erkannten Spenderzellen induzieren im Sinne einer klassischen akuten
Transplantatabstoßung (29) (siehe Abbildung 2 B). Auf der anderen Seite wird auch über eine wesentliche Rolle dieser Mechanismen für die Immunsuppression diskutiert. So findet sich im heterotopen Herztransplantat in der Maus kein Zusammenhang zwischen der Stärke der akuten Abstoßungsreaktion und der Apoptoserate im Transplantat. Ein unter medikamentöser Therapie nicht abgestoßenes, allogenes Transplantat wies eine wesentlich höhere
Apoptoserate auf, als ein nicht behandeltes, in akuter Abstoßung befindliches Transplantat (30-32). Möglicherweise kam es zu einer Elimination alloreaktiver Spenderlymphozyten im Sinne einer Toleranzinduktion.
Der besondere Status des Immunprivilegs
Organe wie die vordere Augenkammer und der Hoden besitzen einen besonderen
immunologischen Status. Eine Abstoßung transplantierter allogener Zellen findet dort nicht statt (33). Virale Infektionen führen dort nicht zu ausgedehnten Immunreaktionen, die einen zerstörerischen Einfluß auf die Funktion von Auge und Hoden ausüben könnten (34). Diese Organe werden daher als immunprivilegiert bezeichnet.
Der Grund für diesen Status des Immunprivilegs wird in der konstitutiv hohen Expression des CD95 Liganden in der vorderen Augenkammer und durch Hodengewebe gesehen (35,36).
Virale Infektionen funktionell CD95L defizienter gld- Mäuse führten zu schweren Schäden der vorderen Augenkammer, die bei Mäusen mit funktionellem CD95L nicht auftraten. CD95 positive, aber nicht CD95 negative Tumorzellen wurden in der vorderen Augenkammer durch
Die Interaktion zwischen CD95 Ligand exprimierenden Zellen und CD95 exprimierenden Lymphozyten wird für diesen besonderen immunologischen Status verantwortlich gemacht.
Die Arbeitsgruppe um Donald Bellgrau konnte im Tiermodell zeigen, daß unter die
Nierenkapsel transplantiertes allogenes Hodengewebe im Gegensatz zu Hodengewebe einer CD95L defekten gld- Maus nicht abgestoßen wird (38). CD95L könnte also auch ein Rolle bei Abstoßungsreaktionen spielen. Diese Ergebnisse werden inzwischen allerdings sehr kontrovers diskutiert, da sie sich durch andere Arbeitsgruppen nicht reproduzieren ließen (26).
Induktion von Toleranz durch Apoptose induzierende Liganden
Möglicherweise läßt sich das Prinzip des Immunprivilegs auf allogene Organtransplantate übertragen. Eine Expression von proapoptotischen Molekülen durch das Transplantat könnte zu einer Elimination einwandernder alloreaktiver Lymphozyten führen und dadurch
gewebespezifische Toleranz induzieren (siehe Abbildung 2 C). Da das Immunsystem auf diese Weise nur lokal beeinflußt würde, käme es nicht zu einer systemischen
Immunsuppression mit gesteigerter Anfälligkeit gegenüber Infektionen und erhöhter Tumorinzidenz.
Neben dem CD95 Liganden kommen auch andere Apoptose induzierende Mitglieder der TNF Superfamilie für einen derartigen Einsatz in Frage. Eigene Erfahrungen wurden mit CD95L, TNFa und CD30L gemacht.
Einfluß des CD95L Moleküls auf allogene Abstoßungsreaktionen
Der CD95 Ligand (40 kDa) wird hauptsächlich von aktivierten T- und Natürlichen Killerzellen exprimiert (10). Zusätzlich findet sich eine konstitutiv hohe Expression im Hodengewebe durch Sertoli Zellen und in der vorderen Augenkammer.
Der zugehörigen Rezeptor CD95 (48 kDa) wird in Herz, Lunge, Leber, Thymus und Lymphozyten exprimiert. Gegenüber ruhenden T- und B- Lymphozyten, die eine schwache Expression des Moleküls aufweisen, tragen aktivierte Lymphozyten CD95 in hoher Dichte (39,40).
Um die Bedeutung von CD95L in einem transgenen Mausmodell untersuchen zu können, wurde in der eigenen Arbeitsgruppe eine Maus entwickelt, in der der humane CD95 Ligand unter der Kontrolle des Interferon induzierbaren Mx- Promotors exprimiert wird. Diese Mäuse weisen eine ubiquitäre Expression des Transgens auf. Phänotypisch zeigen sie außer
schuppigen Hautläsionen an Ohr und Schwanz mit histologisch nachgewiesenen
subepidermalen Granulozyteninfiltrationen keine immunologischen Fehlentwicklungen oder Krankheiten und besitzen eine normale Lebenserwartung. Die CD95L Expression konnte auf mRNA Ebene, jedoch nicht immunhistologisch nachgewiesen werden (41). Der Mx-
Promotor wurde benutzt, um eine starke Expression durch proinflammatorische Wirkungen im Rahmen der Transplantation und von Abstoßungsreaktion zu erreichen und potentiell negative Auswirkungen einer permanent hohen CD95L Expression zu vermeiden.
Der humane CD95 Ligand eignet sich für Untersuchung des Einflusses auf allogene
Abstoßungsreaktionen im Mausmodell, da aufgrund einer 76,9 prozentigen Homologie des murinen gegenüber dem humanen Liganden keine Speziesspezifität existiert. Der humane CD95 Ligand vermag auch über den murinen Rezeptor Apoptose zu induzieren (42).
Apoptoseinduktion durch TNF a
Tumor Nekrose Faktor Rezeptor Typ I und II sind, wie CD95, Typ I Membranproteine mit einem Molekulargewicht von 55 respektive 75 kDa. In unterschiedlicher Dichte werden diese zwei Rezeptoren praktisch ubiquitär exprimiert (43,44).
Der zugehörige Ligand Tumor Nekrose Faktor a existiert in membrangebundener Form als 28 kDa schweres Typ II Membranprotein und in durch Matrixmetalloproteinasen abgespaltener, löslicher Form mit einem Molekulargewicht von 17 kDa. Exprimiert wird TNFa von
Makrophagen und Monozyten, Lymphozyten, Mastzellen und Granulozyten (45,46).
TNFa trägt zur Aktivierung und Differenzierung verschiedener Zellarten bei, kann die Expression von Adhäsions- und MHC Moleküle induzieren, führt zur Ausschüttung von IL-1 und anderer Zytokine und wirkt daher proinflammatorisch. Im Rahmen des letalen septischen Schocks spielt TNFa eine entscheidende Rolle und besitzt weiterhin starke
Tumorzytotoxizität (44,47).
Neben der proinflammatorischen Wirkung spielt TNFa ebenso eine wichtige Rolle bei der Begrenzung inflammatorischer Prozesse und Proliferation von Lymphozyten. So führte die Injektion von abgetöteten Corynebakterien (C. parvum) in TNFa defiziente Mäuse initial zu einer geringeren Entzündungsreaktion im Vergleich zu TNFa+/+ Mäusen, was für die
proinflammatorische Rolle des TNFa Moleküls spricht. Zu einem späteren Zeitpunkt
In Analogie zu CD95/CD95L Interaktionen, vermag TNFa über TNFR I Apoptose in Zielzellen zu induzieren. So konnte in der Peripherie von TNFR I defizienten Mäusen eine verminderte Apoptoserate zytotoxischer T- Lymphozyten beobachtet werden (49). Auch wurde beobachtet, daß in lpr und gld Mäusen trotz defektem CD95 Rezeptor beziehungsweise Liganden eine durch TNFa vermittelte periphere Deletion von Lymphozyten in geringem Maße stattfindet (50).
Der Einfluß der TNFa/ TNFR Interaktion auf autoimmunologische Vorgänge ist vielseitig.
Die lokale Überexpression von TNFa in pankreatischen Inselzellen in RIP- TNFa transgenen Mäusen führte zu einer schweren und dauerhaften Insulitis. Interessanterweise führte diese Insulitis allerdings nicht zu einem manifesten Diabetes mellitus (51). Vielmehr bot
TNFa sogar einen gewissen Schutz gegen den Untergang der insulinproduzierenden Zellen.
So verhindert die Expression von TNFa in Langerhans Inselzellen in NOD Mäusen die Entwicklung eines Diabetes. Im Gegensatz zu nicht transgenen NOD Kontrolltieren, die zu 80% nach 25 Wochen erkrankt waren, litten zum gleichen Zeitpunkt nur 15% der TNFa transgenen unter Diabetes (52).
Für die zytotoxische Wirkung scheint die neben der löslichen Form des TNFa Moleküls existierende membranständige Form (tmTNFa) verantwortlich zu sein (45). Lymphozyten, die mit tmTNFa exprimierenden Zellen kokultiviert wurden, konnten über direkten
Zellkontakt Apoptose induzieren, während die lösliche Form dies nicht bewirkte (53).
Spezielle Matrixmetalloproteinasen spalten das membranständige TNFa Molekül und generieren somit die lösliche Form. Durch Deletion von 12 Aminosäuren kann dieser Vorgang verhindert werden. Von der Arbeitsgruppe G. Kollias wurden transgene Mäuse entwickelt, die eine solche Deletionsmutante des humanen (54) und auch des murinen (55) TNFa Moleküls exprimieren.
In diesen Stämmen konnte auf mRNA Ebene das murine tmTNFa Transgen in zahlreichen Organen nachgewiesen werden, darunter auch in Haut- und Herzmuskelgewebe. Die Mäuse entwickeln sich anfänglich normal, weisen ab einem Lebensalter von sechs Wochen
zunehmende Gelenkschwellungen durch Polyarthritis auf (55).
Diese Mäuse wurden verwendet, um die Auswirkungen des tmTNFa Moleküls auf das
Transplantatüberleben zu untersuchen. Die membranständige Variante des Tumor Nekrose Faktors wurde ausgewählt, da sie für die zytotoxischen Effekte verantwortlich gemacht wird und durch die lokale Expression potentielle Nebenwirkungen eines systemisch erhöhten TNFa Levels entfallen.
CD30/ CD30L Interaktion nach allogener Transplantation
CD30, ein Typ I Membranprotein mit 120 kDa, ist in Keimzentren von Lymphknoten, Milz und im Thymus zu finden und wird durch aktivierte und Memory T- Zellen exprimiert (56).
Ursprünglich wurde CD30 auf Hodgkin und Reed- Sternberg Zellen identifiziert. Später konnte auch eine Expression durch zahlreiche andere pathologisch veränderte Zellen nachgewiesen werden wie Lymphom-, Karzinom- und durch HIV infizierte Zellen (57).
Der CD30 Ligand (40 kDa) wird von Makrophagen und von aktivierten T- Zellen exprimiert und hat wie seine verwandten Zytokine der TNF Familie vielseitige Wirkungen. Einerseits kann er die Proliferation von T- Zellen anregen, andererseits Apoptose von T- Zellen auslösen (23,58,59).
CD30/ CD30 Ligand Interaktion führt zu einer Aktivierung von NFkB. Dieser Mechanismus verläuft über sogenannte TNFR assoziierte Faktoren (TRAF 2 und 5) (60). Andererseits kann CD30 eine Degradierung von TRAF 2 bewirken, somit gegenteilig eine NFkB Aktivierung verhindern und dadurch proapoptotisch wirken (15) (siehe Signaltransduktion). Diese Mechanismen würden eine Erklärung für Beobachtungen von Amakawa et al. 1996 und Chiarle et al. 1999 bieten. Sie fanden eine verminderte Apoptoserate von T- Zellen im Thymus CD30 defizienter Mäuse (61), respektive eine verstärkte negative Selektion im Thymus CD30 überexprimierender Mäuse (16). Diese Beobachtungen werden allerdings inzwischen höchst kontrovers diskutiert (62) (vergleiche Diskussion).
Neben einer indirekten Wirkung der CD30/CD30L Interaktion über TRAF 2 und NFkB auf Apoptoseprozesse wird über eine direkte proapoptotische Wirkung durch Aktivierung der Caspasenkaskade spekuliert (16), obwohl CD30 im Vergleich zu CD95 und TNFR I über keine intrazelluläre Todesdomäne verfügt (23) (siehe Signaltransduktion).
Kurts et al. 1999 zeigten im Diabetesmodell der Maus, daß CD30 defiziente T- Zellen in einer mehr als tausendfach geringeren Konzentration Diabetes auslösten als CD30 positive Wildtyp Zellen. Nach Antigenkontakt im Parenchym des Pankreas konnte eine starke
der Kontrolle autoreaktiver Lymphozyten eine wesentliche Rolle spielt, mag dies auch für alloreaktive Lymphozyten gelten. Zur Untersuchung ähnlicher Effekte bei allogener Transplantation wurden Versuche mit CD30 defizienten Mäusen durchgeführt.
Adenoviraler Transfer protektiver Gene
Für den Fall, daß geeignete Moleküle gefunden werden, die durch Überexpression im
Spenderorgan zu einer Verlängerung des Transplantatüberlebens führen oder gar Toleranz zu induzieren vermögen, müssen Methoden entwickelt werden, die eine Expression bestimmter protektiver Gene durch adulte Organe ermöglichen. Entsprechende Gene müssen dazu in das Gewebe transferiert werden. Mehrere Methoden des Gentransfers sind bereits etabliert und beschrieben worden. So werden einfache mechanische Methoden von virusabhängigen Methoden unterschieden.
Nackte DNA kann direkt von Zellen aufgenommen werden, wenn auch in einer relativ geringen Rate (64). Etwas effektiver gelingt der Transfer von in Liposomen eingeschlossener DNA (65). Auch läßt sich auf kleinen Goldpartikeln liegende DNA durch Beschuß der Zielzellen einbringen, ohne diese dadurch zu zerstören (66).
Ergiebiger erweist sich jedoch der viral vermittelte Gentransfer. Hierzu lassen sich manipulierte Lenti-, Parvo- und Adenoviren verwenden (67). Adenoviren bieten sich im besonderen Maße an, da diese im Gegensatz zu Retroviren auch ruhende Zellen zu transfizieren vermögen und eine hohe Effizienz aufweisen (68,69).
Adenoviraler Gentransfer spielt klinisch bereits experimentell bei der Behandlung
verschiedenster maligner, angeborener, infektiöser und autoimmunologischer Krankheiten eine Rolle (69-71). Die Organtransplantation bietet sich insofern im besonderen Maße für den viralen Gentransfer an, als eine selektive Perfusion ex vivo stattfinden kann. Eine
unerwünschte Transfektion anderer Organe kann relativ einfach vermieden oder vermindert werden (72).
Fragestellung
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Rolle proapoptotischer Moleküle der TNF/ TNFR Superfamilie zu untersuchen. Es wurde die Hypothese aufgestellt, daß eine Protektion allogener Transplantate durch die Expression proapoptotischer Moleküle erreicht werden kann.
Um diese Moleküle auch therapeutisch in Transplantaten exprimieren zu können, wurde die Methode des adenoviralen Gentransfers im Tiermodell angewendet und in Hinsicht auf Nutzen und Problematik untersucht.
Mittels mikrochirurgischer Techniken wurde das Modell der heterotopen Herztransplantation an der Maus in der Arbeitsgruppe etabliert.
Das primär vaskularisierte Herztransplantationsmodell wurde neben dem nicht
vaskularisierten Schwanzhauttransplantationsmodell verwendet, um mögliche protektive Effekte des Mx-huCD95L Transgens zu untersuchen. Als Parameter wurden die
Transplantatfunktion, die Überlebenszeit der Transplantate sowie histologische und immunhistologische Untersuchungen herangezogen.
Um potentielle protektive Wirkungen des tmTNFa Moleküls zu untersuchen, wurden
tmTNFa transgene Organe ebenfalls im MHC Klasse I disparaten Modell transplantiert. Eine zusätzliche postoperative Behandlung mit dem NFkB Inhibitor BAY 11-7085 wurde in einer zweiten Versuchsreihe zwecks Steigerung der Empfindlichkeit gegenüber proapoptotischen Signalen durchgeführt.
Als weiteres potentiell protektives Mitglied der TNFR Superfamilie wurde die Rolle des CD30 Moleküls bei Transplantation von MHC Klasse I, MHC Klasse II und komplett disparaten Organen untersucht.
Schließlich wurde für weiterführende zukünftige Experimente und im Hinblick auf eine klinische Anwendung ein Modell zum intraoperativen Gentransfer mittels Adenoviren etabliert. Dabei wurde die Frage geklärt, ob konservierte Organe durch einfache Perfusion ex vivo mit Adenoviren transfiziert werden können. Diese Methode wurde dahingehend
optimiert, einen adenoviralen Transfer protektiver Gene durchführen zu können.
Material und Methoden
Mausstämme
Stamm H-2 Lokus Eigenschaften Herkunft/ Referenz
B10.BR H-2k
C57Bl/6 (B6) H-2b
BALB/c H-2d
B6.CH2bm1 (bm1) H-2bm1 b- Mutante 1, MHC Klasse I
B6.CH2bm12 (bm12) H-2bm12 b- Mutante 12, MHC Klasse II C. Melief, Leiden
179-4 H-2k Kb- transgen, schwache Expression, (Kb-lo) (73) 178-3 H-2k Kb- transgen, starke Expression, (Kb-hi) (73) 10506 H-2k anti Kb T- Zellrezeptor transgen (Des) (74) 51B H-2k Mx-CD95L transgen (respektive Kb-lo, Kb-hi) (41)
lpr H-2k funktioneller Ausfall von CD95 (75)
A86 H-2k tmTNFa transgen (respektive Kb-lo, Kb-hi) (55) CD30-/- H-2b CD30-/-, über fünf Generationen rückgekreuzt
von S129 auf B6 T. Mak, Toronto, (61)
Alle verwendeten Mausstämme und Rekombinanten wurden im Zentralen Tierlabor der Medizinischen Hochschule Hannover unter der Leitung von Prof. Dr. med. vet. H.-J. Hedrich gehalten und gezüchtet (siehe Material und Methoden, Tierhaltung).
Bei den B10.BR Mäusen handelte es sich um nicht veränderte Inzuchtmäuse, die den MHC Haplotyp H-2k auf einem B10 Hintergrund besitzen.
Auf dem gleichen Hintergrund wurden zwei Linien Kb - transgener Mäuse generiert, die Kb in niedriger Dichte (179-4, Kb-lo), 33% im Vergleich zu C57Bl/6, respektive in hoher Dichte (178-3, Kb-hi), 150% im Vergleich zu C57Bl/6, exprimieren (73).
Ebenso wurden anti Kb T- Zellrezeptor transgene Mäuse auf den B10.BR Hintergrund zurückgekreuzt, deren T- Zellrezeptoren gegen das Kb Molekül gerichtet sind. Anti- Kb Des- TZR transgene Mäuse wurden freundlicherweise von Drs. B. Arnold, G. Hämmerling und G.
Schönrich, DKFZ Heidelberg, zur Verfügung gestellt (74).
Weiterhin wurden in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Schröder, Rüther und Wonigeit Mx-CD95 Ligand transgene Mäuse verwendet. Es handelt es sich um den humanen CD95 Liganden, der unter der Kontrolle des Interferon induzierbaren Mx Promotors steht (41).
Als Kontrolle dienten CD95 defiziente lpr Mäuse. Diese besitzen eine Mutante des CD95 Moleküls, welches nicht funktionsfähig ist (75).
Ein weiteres Transgen, das tmTNFa Molekül, exprimieren A86 transgene Mäuse, freundlicherweise von G. Kollias, Hellenic Pasteur Institute Athen, Griechenland, zur
Verfügung gestellt. Es handelt sich um eine Deletionsmutante, die dazu führt, daß das TNFa Molekül ausschließlich membrangebunden vorkommt (55).
51B (Mx-huCD95L) transgene und A86 (tmTNFa) transgene Mäuse wurden ebenso auf den B10.BR Hintergrund rückgekreuzt.
Untersuchungen bezüglich des CD30 Moleküls wurden auf dem C57Bl/6 Hintergrund
durchgeführt. Beim C57Bl/6 (B6) Stamm handelt es sich um nicht veränderte Inzuchtmäuse.
Die b- Mutante 1 umfaßt Mäuse mit einem veränderten MHC Klasse I Molekül. Der Unterschied gegenüber B6 Mäusen besteht hierbei lediglich in drei Aminosäuren.
Bm12 Mäuse besitzen ein verändertes MHC Klasse II Molekül.
CD30 knockout Mäuse wurden freundlicherweise von Dr. Tak Mak aus Toronto zur Verfügung gestellt (61).
Diese wurden fünfmal auf den B6 Hintergrund rückgekreuzt. Zucht und Screening erfolgte in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Dr. C. Kurts der Abteilung Nephrologie der
Medizinischen Hochschule Hannover (63).
Als Spender komplett MHC inkompatibler Organe wurden BALB/c Mäuse verwendet.
CD30 Screening
Die Erkennung und Unterscheidung homozygoter und heterozygoter CD30 defizienter Mäuse erfolgte mittels der Polymerasekettenreaktion. Die Polymerasekettenreaktion (PCR) erlaubt die selektive in vitro Amplifikation von DNA-Abschnitten. Benötigt wird dazu eine DNA Probe des zu testenden Organismus. Bestimmte Sequenzen dieser DNA Probe lassen sich durch die Polymerasekettenreaktion in großer Zahl amplifizieren. Vorhandensein
beziehungsweise Fehlen einer Sequenz in der Gelelektrophorese gibt direkt Aufschluß über das getestete Genom.
Lösungen für DNA Gewinnung und Polymerasekettenreaktion (PCR) Digestionspuffer,
20 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA,
1% Natriumdodecylsulfat (SDS), 0,5% Proteinase K (Merck, Darmstadt), pH 7,4
TE Puffer,
10 ml einer 1M Tris/ HCl- Stammlösung pH 7,6, 2 ml 0,5M EDTA pH 8,0
auf einen Liter mit destilliertem Wasser auffüllen pH 7,6, evtl. nachjustieren
PCR Lösung I, Primer für CD30 Defizienz, 28,25 µl bidestilliertes H2O,
6 µl 25 mM MgCl2 (Merck, Darmstadt),
5 µl 20 mM dNTPs (Amersham Pharmacia Biotech Inc), 5,5 µl 10x PCR Puffer (Promega),
0,5 µl je Primer für CD30 Defizienz, 20 pmol/µl (MWG Biotech), 0,25 µl Taq Polymerase (Goldstar 1/10) (Eurogentec)
PCR Lösung II, Primer für CD30 Wildtyp,
wie Lösung I, nur Primer für CD30 Wildtyp
Agarose Gel, 1,5 %,
130 ml bidestilliertes H2O 2,25g Agarose
15 ml 10x TBE Puffer
TBE Laufpuffer, 1x,
80 ml 10x TBE Puffer 720 ml bidestilliertes H2O
DNA Isolierung
Zur Gewinnung von Gewebeproben wurden fünf Millimeter der Schwanzspitze narkotisierter Mäuse abgeschnitten. Diese wurde über Nacht mit 500 µl Digestionspuffer bei 55°C
inkubiert. Die Probe wurde nun geschüttelt und bei 15000 Umdrehungen pro Minute zehn Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein weiteres Eppendorfröhrchen überführt, mit 500 µl Isopropanol (Raumtemperatur) versetzt und geschüttelt. Nach zehn Minuten wurde die Probe wie zuvor zentrifugiert. Der Überstand konnte nun verworfen werden, während das Sediment mit 200 µl 70%igem Ethanol gemischt wurde. Es folgte erneutes Zentrifugieren und Verwerfen des Überstandes. Bei 65°C wurde die Probe nun zwei bis drei Stunden getrocknet und schließlich 200 µl TE Puffer hinzugegeben. Für die Polymerasekettenreaktion wurden 4µl dieser Probe verwendet.
Polymerasekettenreaktion
Jeweils 4 µl der isolierten DNA Probe wurden mit den zwei verschiedenen PCR Lösungen versetzt und im PCR Thermocycler (Landgraf) wie unten aufgeführt bei verschiedenen Temperaturen inkubiert.
initiale Denaturierung 94°C 5 Minuten 1 Zyklus Denaturierung 94°C 2 Minuten
Annealing 63°C 1 Minuten
Elongation 72°C 1 Minuten
25 Zyklen
finale Elongation 72°C 7 Minuten
Ende 4°C 1 Zyklus
Die PCR an sich benötigt drei verschiedene Temperaturstufen. Im ersten Schritt wird die Doppelstrang- DNA denaturiert, also in zwei Einzelstränge zerlegt. Dies geschieht bei 94°C.
Bei 63°C folgt das Anlagern der Primer (Annealing) an die Einzelstränge. Bei 72°C wird am 3´-OH-Ende des Primers von der DNA-Polymerase durch Anbau der dNTPs der neue
Komplementärstrang synthetisiert. Eine Abfolge von Denaturierung, Annealing und
Elongation wird als ein Zyklus bezeichnet. Die Sequenz zwischen den zwei Primern wird bei jedem Durchgang verdoppelt. Im Allgemeinen werden mit 25-30 Zyklen optimale Ergebnisse erreicht.
Primer
Zur PCR wurden zwei Oligonukleotid-Paare (MWG-Biotech) eingesetzt:
CD30 Wildtyp forward: 5´-CAA CCC TGG CTG AGT TAC TC-3´
CD30 Wildtyp reverse: 5´-AGC GGC AGG TTC TCC AGG TA-3´
CD30 knockout forward: 5´-CAA CCC TGG CTG AGT TAC TC-3´
CD30 knockout reverse: 5´-TAT CAG GAC ATA GCG TTG GCT AC-3´.
Die forward Primer sind identisch und binden an die Wildtyp- DNA und die DNA der
knockout Variante. Die jeweiligen reverse Primer binden nur spezifisch an die Wildtyp- DNA bzw. die gentechnisch modifizierte DNA und generieren dadurch Produkte mit
unterschiedlichen Längen (850bp für Wildtyp- Gen, 800bp für CD30 knockout).
Elektrophorese
Zur Darstellung der PCR- Produkte wurde eine Agarosegel- Elektrophorese mit Hilfe eines Minigel- Elektrophorese „Protean 3-Systems“ (BioRad) durchgeführt. Dazu wurde die
Apparatur nach Anweisung des Herstellers montiert und mit 1,5%igem Agarose- Gel gefüllt.
Nach Aushärtung des Gels wurden die Kämme aus den Gelen entfernt und die Taschen mit 1x TBE Laufpuffer gespült. 20 µl des PCR- Produktes wurden mit 4 µl Bromphenolblau- Xylen- Zyanol (Sigma- Aldrich) versetzt und sorgfältig gemischt. 20 µl dieser Lösung wurden in die Taschen pipettiert.
Die Elektrophorese wurde bei 100 Volt für 60 Minuten durchgeführt. Eine Anfärbung erfolgte durch Hinzupipettieren von 7 µl Ethidium- Bromid (Life Technologies) für 7 Minuten. Nach anschließendem Waschen mit 200 ml Laufpuffer für 3 Minuten erfolgte die Dokumentation unter UV-Exposition mit einem Geldokumentationsgerät „GelPrint 2000i“ (MWG Biotech).
Die Größenbestimmung wurde anhand einer mitlaufenden DNA- Leiter durchgeführt.
Operative Eingriffe
Tierschutzrechtliche Bestimmungen
Die im Nachfolgenden beschriebenen Versuche an der Maus wurden durch die
Bezirksregierung Hannover (AZ 96-922 und 00-273) genehmigt. Der Autor erhielt eine Ausnahmegenehmigung zur Durchführung von Versuchen an Wirbeltieren gemäß § 9 Absatz 1 Satz 4 des Tierschutzgesetzes durch die Bezirksregierung.
Weiterhin wurde ein vierzigstündiger Kursus der Versuchstierkunde an der Tierärztlichen Hochschule Hannover absolviert. Die Inhalte des Kursus orientierten sich an Empfehlungen der FELASA (Federation of European Laboratory Animal Science Associations – Kategorie B).
Tierhaltung
Alle Mäuse wurden während des gesamten Versuchszeitraums in einem Genlabor der Sicherheitsstufe 1 gehalten. Die Räume standen unter Überdruck und wurden nur nach Händedesinfektion und mit Schutzkleidung, Handschuhe, Mundschutz und Kopfhaube, betreten.
Die Tiere wurden auf staubfreiem Weichholzgranulat in einem Makrolonkäfig des Typs II gehalten. Die Raumtemperatur lag konstant bei 20°C mit 50- 60 prozentiger Luftfeuchtigkeit.
Die Belichtung erfolgte in einem 12 Stunden Hell- Dunkel- Rhythmus. Die Fütterung erfolgte ad libitum mit Altromin 1324 Alleinfutter (Altromin GmbH, Lage) und Leitungswasser. Der Gesundheitszustand wurde täglich durch das Pflegepersonal überwacht sowie durch
monatliche veterinärmedizinische Kontrollen.
Narkose, Nachbehandlung
Bei allen operativen Eingriffen wurden die Tiere mit Ketamin und Rompun
(Xylazinhydrochlorid) narkotisiert. Dazu wurde eine Lösung aus 1/10 Ketamin, 1/10 Rompun und 8/10 Ringer- Lactat hergestellt. Männchen bekamen 450 µl (75 und 15 µg/g Ketamin bzw. Rompun), Weibchen 350 µl (60 und 12 µg/g). Die Lösung wurde intraperitoneal appliziert.
Zur schnelleren postoperativen Erholung wurden die Tiere unter einer Infrarotlampe erwärmt.
Abbildung 3 Hauttransplantation, Transplantat und – bett
Hauttransplantation
Hauttransplantationen wurden modifiziert nach Billingham und Medawar 1953 durchgeführt (76). Der oder die Spender wurden durch Begasung mit Kohlendioxid und anschließende zervikale Dislokation getötet, die Schwanzhaut abpräpariert und in kühler physiologischer Kochsalzlösung gelagert, um im Regelfall innerhalb von 60 Minuten transplantiert zu werden.
Der Rücken der Empfänger wurde im Bereich des zukünftigen Transplantatbetts rasiert und desinfiziert. Die Kutis wurde lokal, ohne das subkutane Fettgewebe und dessen sichtbare Gefäße zu verletzen, abpräpariert (siehe Abbildung 3). Dort wurden die verschiedenen Schwanzhauttransplantate Seite an Seite eingebettet, wobei höhere Paßgenauigkeit ein besseres Anwachsen und später bessere Beurteilbarkeit gewährleistete. Bis zu vier verschiedene Transplantate kamen auf einem Empfänger zu liegen. Fixiert wurden die Transplantate mit einer granulationsfördernden Salbenkompresse (Branolind) und einem zirkulären Klebeverband, der relativ eng anliegen mußte, ohne jedoch die Atmung und Bewegung der Beine zu beeinträchtigen.
Die Tiere wurden daraufhin bis zur Entfernung der Verbände täglich inspiziert, um ein
eventuelles Verfangen der Beine oder Verbeißen am Verband zu korrigieren. Am 7. bis 8. Tag wurden die Verbände in einer Ether- Kurznarkose entfernt. Die Transplantate waren zu
diesem Zeitpunkt fest angewachsen.
Zur weiteren Beurteilung der Abstoßung der Transplantate wurden sie täglich inspiziert.
Eine Abstoßung wurde festgestellt, sobald die Transplantate auf ein Drittel der Ursprungsgröße zusammengeschrumpft waren.
BAY 11-7085
Empfänger von tmTNFa transgenen allogenen Hauttransplantaten wurden postoperativ über 15 Tage täglich mit dem NFkB- Inhibitor BAY 11-7085 behandelt (Alexis Corporation, Schweiz).
Es handelt sich um (E)3-[(4-t-Butylphenyl)sulfonyl]-2-propenenitrile (C13H15NO2S), welches in Polyethylenglykol gelöst und im Verhältnis 1:5 mit 5% BSA (bovine serum albumin) in PBS verdünnt wurde. Die tägliche Dosis betrug 5µg/g Körpergewicht (22).
Herztransplantation
Die heterotope Herztransplantation an der Maus wurde modifiziert nach Corry et al.
durchgeführt (77). Erlernt wurde diese Technik während eines Aufenthaltes am John
Radcliffe Hospital in Oxford, England, in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Kathryn J.
Wood.
Im Folgenden werden die Operationsschritte getrennt beschrieben. In der Praxis wurde der Empfänger vor der Entnahme vorbereitet, um die Ischämiezeit des Transplantates zu minimieren.
Organentnahme
Nach Wirkungseintritt der Narkose wurden Haut und Peritoneum median eröffnet, der Schnitt nach lateral bis hinter die hintere Axillarlinie rippennah erweitert. Dünndarm und
Mesenterium wurden auf der linken Seite gelagert, um damit die großen Gefäße Vena cava inferior und Aorta abdominalis freizulegen.
Nun punktierte man die Vena cava inferior und infundierte etwa 1,5 ml eisgekühlte Ringer- Lactat Lösung mit insgesamt 300 IU Heparin. Die Kanüle verblieb einen Moment im Gefäß, um eine Verteilung im Gefäßsystem zu gewährleisten, wurde dann gezogen, um den Spender ausbluten zu lassen.
Der Thorax wurde eröffnet, indem man die Rippen rechts und links der Wirbelsäule und das Zwerchfell durchtrennte und die gesamte Thoraxvorderwand nach kranial umklappte. Das Herz wurde mit einer kühlen feuchten Kompresse nach kranial gelagert, um freie Sicht auf die
der Vena azygos und der Vena cava superior verfahren. Die Aorta ascendens wurde vor dem Abgang des Truncus brachiocephalicus sauber durchtrennt, danach der Truncus pulmonalis ebenso kurz vor der Bifurkation. Die Lungenvenen wurden ligiert, das Herz nun vorsichtig herausgezogen und in einer kalten Ringer- Lactat Lösung gelagert. Die Ischämiezeit des Herzens betrug regelmäßig unter vierzig Minuten.
Operation des Empfängers
Nach Narkoseeinleitung wurde das Abdomen des Empfängers median bis zum Xiphoid eröffnet. Nach Einlegen des Retraktors wurde der Darm nach kranial, auf den Thorax, in feuchten Kompressen gelagert. Insbesondere mußte eine Torsion der Darmschlingen vermieden werden. Blase und Uterus beziehungsweise Hoden und Samenbläschen wurden kaudal gelagert, ebenso in feuchten Kompressen. Das Colon descendens wurde mobilisiert und mit Hilfe einer feuchten Schlinge mit leichtem Zug nach links verlagert. Das dorsale Peritoneum parietale wurde eröffnet und die nach dorsal abgehenden Gefäße der Aorta abdominalis und Vena cava inferior mit 7-0 Seide (Resorba, Nürnberg) ligiert. Die Vena cava inferior und Aorta abdominalis wurden von Fettgewebe befreit, wobei kleinere Gefäße und Lymphgefäße nach Möglichkeit erhalten blieben.
Die Gefäße wurden mit den Gefäßklemmen kranial und kaudal abgeklemmt, die Aorta abdominalis mit einer Stichinzision (27- 30g Kanüle) eröffnet und mit Ringer- Lactat Lösung gespült, die Öffnung mittels mikrochirurgischer Schere erweitert. Die Aorta des Transplantats wurde nun mit Haltenähten kranial und kaudal in Position gebracht, die entsprechenden Wände mit jeweils fünf Stichen vernäht. Hierbei wurde 10-0 Ethilon® mit einer 3/8 6,5mm Nadel (Nadel BV-2, Ethicon, Norderstedt) verwendet. Entsprechend wurde die venöse Anastomose fertiggestellt, die kaudal der aortalen Anastomose lag, um einen direkten beidseitigen Zugang zu den verschiedenen Anastomosen zu haben.
Um die Nähte wurde Tabotamp (Ethicon, Norderstedt) als Hämostyptikum gelegt, ohne die Gefäße zu komprimieren. Die distale Klemme wurde geöffnet. Nach ungefähr einer Minute konnte auch die proximale Klemme entfernt werden. Das transplantierte Herz fing kurz darauf an zu schlagen.
Die ausgelagerten Organe wurden sorgfältig zurückgelegt, mit angewärmter Ringer- Lactat Lösung umspült, das Abdomen in zwei Schichten (Peritoneum und Haut) mit 4/0 Dexon®
(Nadel HR 22, Ethicon, Norderstedt) geschlossen.
Der Empfänger erhielt abschließend noch 2ml Ringer- Lactat subkutan zur einmaligen Volumensubstitution und wurde im weiteren Verlauf täglich überwacht.
Abbildung 4
oben: heterotope Herztransplantation, Situs während der Naht der venösen Anastomose; unten: Situs nach durchgeführter Anastomosierung;
1:Herztransplantat, 2:Colon descendens, 3:rechte und linke Niere
1 3
3
2
Beurteilung der Funktion des Transplantates
Die Funktion des transplantierten Herzens wurde mittels Palpation und diagnostischer
Laparotomie beurteilt. Zur Beschreibung der Untersuchungsergebnisse bei Palpation bediente man sich eines Score von null bis vier nach Corry (77).
0 keine spürbare Kontraktion
1 sehr schwache Kontraktion und niedrige Frequenz 2 erniedrigte Frequenz und oder Arrhythmien
3 verminderte Kontraktionsstärke mit normaler rhythmischer Frequenz
4 normale Frequenz und regelrechter Rhythmus
Tabelle 2 Corry Score, Funktion von Herztransplantaten (77)
Bei unsicherer palpatorischer Beurteilung und zur abschließenden Kontrolle wurde eine diagnostische Laparotomie durchgeführt, die die direkte visuelle Kontrolle erlaubte.
Tötung und Organentnahme zwecks histologischer Aufarbeitung
Die Tiere wurden durch Inhalation von Kohlendioxid getötet und zervikal disloziert.
Hauttransplantate wurden mit einer Pinzette abgezogen und in Tissue Freezing Medium (Jung/ Reichert, Nußloch) in flüssigem Stickstoff bei –196°C eingefroren. Die Herzen wurden herauspräpariert und daraufhin ebenso auf –196°C schockgefroren.
Adenoviraler Gentransfer
Die adenoviralen Konstrukte wurden freundlicherweise von der Arbeitsgruppe PD Dr. S.
Kubicka und Prof. C. Trautwein der Abteilung Gastroenterologie der Medizinischen Hochschule Hannover repliziert und zur Verfügung gestellt.
Der in dieser Arbeit verwendete rekombinante Adenovirus trägt das lacZ Gen unter der Kontrolle des CMV- Promotors (78). Der Virus ist replikationsdefizient, da er eine Deletion in der E1- Region enthält, die für die Virusreplikation notwendig ist. In der zur Vermehrung der Viren verwendeten Zellkultur ist diese virale E1- Region stabil integriert, so daß das virale Genom komplettiert wird und eine Replikation stattfinden kann (79).
Die Perfusion der Transplantate erfolgte innerhalb des S2 Genlabors des Zentralen Tierlabors der MHH.
Operative Durchführung des Gentransfers
Für diese Versuche wurde die Entnahmeprozedur leicht modifiziert. Nach Unterbindung der venösen Gefäße wurde die virenhaltige Lösung über den thorakalen Part der Aorta
descendens infundiert, die vorher distal der Punktionsstelle ligiert wurde, um retrograd die Koronararterien zu perfundieren.
Diese Entnahmen wurden im S2 Genlabor des Zentralen Tierlabors der Medizinischen Hochschule Hannover durchgeführt.
Herstellung monoklonaler Antikörper
Lösungen
Zellkulturmedium,
RPMI 1640, Life Technologies LTD (Paisley, Scotland), 10 % FCS, Biochrom KG Seromed (Berlin),
50 U/ml Penicillin, Biochrom KG Seromed (Berlin), 50 µg/ml Streptomycin, Biochrom KG Seromed (Berlin), 4 mM L- Glutamin, ICN Biochemicals (Costa Mesa, CA, USA)
Waschpuffer,
20 mM Na2HPO4 und 20 mM NaH2PO4 Lösung wurden gemischt, bis sich ein pH Wert von 7,0 einstellte.
Elutionspuffer,
100 mM Glycin-HCl, pH 2,7
Neutralisationspuffer,
1 M Tris-HCl, pH 9,0
Regenerationspuffer
2 M Harnstoff, pH 7,0
Coomassie Brillantblau G250, Sigma (Deisenhofen),
25 % Methanol, 5 % Essigsäure
0,1 % Coomassie Brillantblau (Endkonzentration),
Kopplungspuffer für die Biotinylierung, 100 mM Natriumhydrogencarbonat,
Biotinamidocaproate N-Hydroxysuccinimide Ester, Sigma Chemicals (USA), Konzentration in Abhängigkeit der Proteinkonzentration der Antikörperlösung.
Produktion
Zur Gewinnung monoklonaler Antikörper wurden Hybridomzellen bei einer Temperatur von 37°C, 5%igem CO2 Partialdruck und 95%iger Luftfeuchtigkeit für drei bis fünf Tage
kultiviert. Anschließend wurde die Kultur in ein Zentrifugenröhrchen überführt und bei 300 facher Erdbeschleunigung und einer Temperatur von 4°C zehn Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde bis auf eine Mindestmenge von 500 ml gesammelt. Der restliche Überstand als auch die Zellen wurden im Kulturmedium rekultiviert.
Aufreinigung
Um Zellfragmente aus dem Antikörperüberstand zu entfernen, wurde dieser durch einen 0,45µm Celluloseacetatfilter (Sartorius, Göttingen) gegeben und mit HCl auf ein pH Wert von 6,7 eingestellt.
Zur Aufreinigung wurde eine Protein G Sepharose Säule (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) verwendet. Durch Spülung mit Waschpuffer, mengenmäßig dem fünffachen Säulenvolumen entsprechend, wurde die Säule equilibriert (Flußrate 1-2 ml/min).
Mit einer Flußrate von nicht mehr als einem Mililiter pro Minute wurde nun der Überstand über die Säule gegeben. Hierbei binden die Antikörper an das Protein G. Um nicht gebundene Proteine, wie Albumin, zu entfernen, wurde die Säule wieder mit Waschpuffer (Flußrate 1-2 ml/min) gespült, bis der Schreiber der Chromatographieanlage (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) kein Protein mehr anzeigte (Nullinie).
Die gebundenen Antikörper wurden nun durch den Elutionspuffer (Flußrate 1 ml/min) gelöst.
Sobald ein Proteinpeak sichtbar wurde, wurde das Eluat mit einem 50 ml Röhrchen, in dem sich bereits 0,5 bis 1 ml Neutralisationspuffer befand, aufgefangen. Die Gewinnung des Eluats wurde nach Rückgang des Proteinpeaks auf etwa die Hälfte abgebrochen.
Die Säule wurde weiterhin mit dem Elutionspuffer gespült, bis kein Protein mehr nachweisbar war. Es folgte eine abschließende Spülung mit dem Regenerationspuffer.
Das gewonnene Eluat wurde im Anschluß in einem Dialyseschlauch mit einem Durchmesser von 12- 14000 Da (Medicell International Ltd, London, England) über Nacht gegen PBS dialysiert.
Quantitative Proteinbestimmung, Proteinassay nach Bradford
Zur Bestimmung des Proteingehalts des Eluats, wurde eine Verdünnungsreihe (bis 1:32) hergestellt. 100 µl der Proben wurde mit 100 µl der Coomassie Brillantblau Lösung versetzt und gut vermischt. Bei einer Wellenlänge von 595 nm wurde die Absorption in einem
Photometer (Titertek, ICN Biomedical GmbH, Meckenheim) gemessen. Durch Vergleich mit einer Eichreihe, konnte der Proteingehalt des Eluats bestimmt werden.
Biotinylierung
Mittels einer PD10 G-25M Säule (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) wurde die Biotinylierung der Antikörper durchgeführt. Dazu wurde Biotin S-NHS (Sigma Chemicals, USA) mit DMF in einer Konzentration von 1 mg/ml gelöst. Die Säule wurde mit
Kopplungspuffer vorgespült, bevor 50 µg Biotin pro 1 mg Protein auf die Säule gegeben wurde. Die Reaktionszeit betrug 30 Minuten bei ständiger Bewegung unter Raumtemperatur.
Zur Gewinnung des biotinylierten Antikörpers wurde die Säule mit PBS gespült. Die Lagerung des Antikörpers erfolgte bei minus 20°C.
Titration
Um den Antikörper in geeigneter Konzentration einsetzen zu können, wurde er an Gewebeschnitten in verschiedenen Konzentration ausgetestet. Nach Beurteilung der Färbequalität wurde die optimale Konzentration festgelegt.
Histologie
Anfertigen von Gewebeschnitten
Alle Proben wurden im Kryostat (Jung/ Reichert, Nußloch) bei –20°C geschnitten. Es wurden 5 µm dicke Schnitte angefertigt, mit Objektträgern aufgenommen und über Nacht (12 bis 24
Stunden) bei Raumtemperatur luftgetrocknet. Nach dem Trocknen wurden die Schnitte direkt weiterverarbeitet oder bei minus 20°C gelagert.
Hämatoxilin Eosin Färbung
Zur HE- und immunhistologischen Färbung wurden die Proben für 10 Minuten in Azeton bei Raumtemperatur fixiert, dann erneut getrocknet. Nach Fixierung wurden die Proben innerhalb von 24 Stunden verarbeitet.
Die luftgetrockneten Präparate wurden 7 Minuten in Hämalaun gefärbt, danach 15 Minuten in Leitungswasser gebläut und gewaschen. Darauf folgten 30 Sekunden in Eosin, 3 Minuten in 75% Ethanol und 3 mal 3 Minuten in reinem Alkohol. Als letztes folgten zwei Bäder zu je einer Minute in Xylol. Die Einbettung erfolgte mit Eukitt Einbettmedium (Riedel de Haen, Seelze).
Immunhistologische Färbung
Immunhistochemische Färbungen wurden in mehreren Schritten durchgeführt. Die Inkubation erfolgte in einer feuchten Kammer, um ein Austrocknen der Präparate zu verhindern. Das darauffolgende Waschen der Präparate erfolgte in PBS, nach jedem Schritt für jeweils dreimal 5 Minuten. Alle Schritte wurden bei Raumtemperatur durchgeführt.
Im Falle der Benutzung von biotinylierten Antikörpern wurde endogenes Biotin (Leber, Niere, Herz) durch ein spezielles Kit geblockt (Blocking Kit, Vector Laboratories,
Burlingame). 15 Minuten wurde mit einer Avidinlösung inkubiert, weitere 15 Minuten mit einer Biotinlösung.
Die verdünnten Primärantikörperlösungen verlangten eine einstündige Inkubationszeit.
Sekundärantikörper, GaR Antikörper bzw. Streptavidin- Peroxidase, 30 Minuten. Darauf folgte die eigentliche Färbung mit 3-Amino-9-Ethylcarbazole (AEC) mit einer zehnminütigen Inkubationszeit. AEC führt in Anwesenheit von Peroxidase zu einer Rotfärbung.
Gegengefärbt wurde eine Minute mit Hämalaun. Die Präparate wurden mit vorher auf 50°C erwärmter Glycerin- Gelatinelösung eingebettet.
Bei den Primärantikörpern handelte es sich entweder um Antikörper der Ratte, welche mit anti- Ratten Antikörper der Ziege (GaR) und eine daran gekoppelte Peroxidase markiert wurden (Dianova, Hamburg), oder um biotinylierte Antikörper, welche wiederum mit Streptavidinperoxidase (Dianova, Hamburg) markiert wurden. GaR Sekundärantikörper wurden mit Normalem Maus Serum versetzt, um eine unspezifische Anfärbung zu vermeiden.
Alle verwendeten Primär- und Sekundärantikörper sind in der folgenden Tabelle gelistet.
Name Klon Spezifität Isotyp Bezugsquelle Verdünnung Referenz
CD3 KT3 mCD3 Rat IgG2a,k AG Hoffmann 1:100 (80)
CD45 bio ALI-4A2 mCD45 mIgG3 biotinyliert
AG Hoffmann 1:20 (81)
CD8 53-6.7 mCD8 Rat IgG2a,k AG Hoffmann 1:500 (82)
Gr 1 (Ly-6G) RB6.8C5 Granulozyten Rat IgG2b AG Hoffmann 1:1000 (83) Streptavidin
Peroxidase
Biotin Dianova
(Hamburg)
1:200
GaR Per polyklonal IgG und
IgM F(ab)2
Dianova (Hamburg)
1:50 Normales
Maus Serum
AG Hoffmann 1:25
Tabelle 3 verwendete Primär- und Sekundärantikörper
X- Gal Färbung
X- Gal Färbelösung,
5- Bromo 4-Chloro 3-Indoyl- Galactosid wurde in einer Konzentration von 10 mg/ml in DMF (Dimethylformamid) gelöst.
300 µl dieser Stammlösung wurde mit 2,7 ml PBS verdünnt.
Zusätzlich erfolgte die Zugabe von 30 µl 500 mM/l Kaliumcyanoferrat Fe3+, 30 µl 500 mM/l Kaliumcyanoferrat Fe2+ und 10 µl 1 molarer
Magnesiumchloridlösung.
Das Ansetzen der Lösung erfolgte unmittelbar vor Färbebeginn.
Die X- Gal Färbung dient dem Nachweis der b- Galaktosidase Aktivität nach adenoviralem Transfer des lacZ Gens.
Die Präparate wurden für 10 Minuten in 96% Ethanol fixiert, getrocknet und vor der Färbung in PBS gewaschen. Daraufhin wurden sie für 18h in einer feuchten Kammer bei 37°C mit 200- 400 µl der oben beschriebenen X- Gal Färbelösung inkubiert. Eine Gegenfärbung erfolgte mit Eosin, wie oben angegeben. (Eosinfärbung, Dehydrierung und Abdeckung siehe HE Färbung)
b- Galaktosidase exprimierende Zellen vermögen das chromogene Substrat X- Gal zu einem
TUNEL Färbung (terminal dUTP- digoxigenin nick end labeling)
Diese Technik erlaubt die Anfärbung apoptotischer Zellen und basiert auf der Tatsache, daß im Rahmen der Apoptose die DNA durch Endonukleasen in circa 185 bp lange Fragmente zerlegt wird. TdT (Terminale Desoxynukleotidyl Transferase) bindet Digoxigenin Nukleotide an die 3‘-OH Enden der DNA Fragmente. Mittels Anti- Digoxigenin Antikörpern werden apoptotische Zellen aufgespürt (7).
Die TUNEL Färbung wurde nach den Färbevorschriften des Herstellers des ApopTag® Plus In Situ Apoptosis Detection Kits der Firma Oncor durchgeführt.
Lösungen für TUNEL Färbung
Neutrale Formalinpufferlösung 10% (NBF), enthält 10% Formalin in PBS.
Terminale Desoxynukleotidyl Transferase (TdT Lösung), 38 µl Reaction Buffer (S7101-2),
16 µl TdT Enzym (S7101-3),
muß auf Eis gelagert und innerhalb von 6 Stunden verwendet werden.
Stoppufferlösung,
1 ml Stop/ Wash Buffer (S7101-4), 34 ml destilliertes Wasser,
wurde vor Gebrauch auf 37°C erwärmt.
DAB Färbelösung,
117 µl DAB Dilution Buffer (S7101-9), 13 µl DAB Substrate (S7101-8),
wurde kurz vor Gebrauch angesetzt.
Fixierung
- 10 min NBF - 2 x 5 min PBS
- 5 min Ethanol: Essigsäure 2:1 bei –20°C - 2 x 5 min PBS
Färbung
- 1 min Equilibration Buffer (S7101-1) - 1 h TdT Lösung, Inkubation bei 37°C,
zur Negativkontrolle wurde TdT Enzym durch PBS ersetzt, - 10 min Stoppufferlösung
- 3 x 5 min PBS
- 30 min Anti- Digoxigenin- Peroxidase (S7101-5), feuchte Kammer - 4 x 5 min PBS
- 3-6 min DAB Färbelösung
- Glycerin- Gelatinelösung zur Einbettung
Positive Zellen färbten sich braun.
Statistik
Semiquantitative Auswertung der Histologien
Um Gewebeschnitte nach immunhistologischer beziehungsweise X- Gal Färbung semiquantitativ vergleichen zu können, wurden die angefärbten Zellen von jeweils fünf repräsentativen Gesichtsfeldern auf 3 Schnittebenen pro Tier bei 400 facher Vergrößerung ausgezählt. Die Bereiche von – bis +++ wurden in Abhängigkeit der Gesamtdichte positiver Zellen festgelegt.
Unabhängiger T- Test zum Vergleich der Überlebenszeiten
Die Überlebenszeiten von allen Transplantaten wurden mittels SPSS 9.0 erfaßt. Für jede Gruppe wurden die Anzahl der Tiere (n), die mittlere Überlebenszeit, sowie die
Standardabweichung berechnet. Der unabhängige T- Test erlaubte den direkten Vergleich zweier Gruppen und gab Auskunft über mögliche signifikante Unterschiede. Ein signifikanter Unterschied wurde bei p<0,05 festgestellt.
In den Experimenten um tmTNFa spielen zwei Einflußgrößen eine Rolle, die tmTNFa Transgenität, sowie die Behandlung mit BAY 11-7085. Um zu prüfen, ob eine Interaktion zwischen den beiden Faktoren stattfindet, wurde eine Varianzanalyse (Two Way ANOVA) durchgeführt.
Kaplan Meier Überlebenskurven dienen zur Demonstration der Ergebnisse.
Ergebnisse
Heterotope Herztransplantation
Das Modell der heterotopen Herztransplantation an der Maus konnte erfolgreich etabliert werden, nachdem die mikrochirurgischen Techniken während eines Aufenthaltes am John Radcliffe Hospital in Oxford, England, in Kooperation mit der Arbeitsgruppe Kathryn J.
Wood erlernt wurden.
Die Erfolgsquote der Operation lag nach entsprechender Einarbeitung bei 95%. Alle erfolgreich syngen transplantierten Empfänger überlebten den gesamten beobachteten Zeitraum von hundert Tagen.
Die Operationsdauer von Schnitt bis Hautnaht des Empfängers inklusive der Explantation betrug 60 bis 75 Minuten. Die Ischämiezeit des Transplantats betrug 30 bis 35 Minuten, davon 10 Minuten kalte Ischämie, und bewegt sich daher bezüglich des Ischämie- Reperfusionsschadens in einem unproblematischen Bereich (84).
Komplikationen stellten Blutungen, meist durch insuffiziente Anastomosen verursacht, Stenosen und Thrombosen, ebenso durch fehlerhafte Anastomosierung verursacht, und die seltene Querschnittslähmung dar. Letztere wurde möglicherweise durch das Abbinden der nach dorsal abgehenden Gefäße der Aorta abdominalis verursacht. Hinzukommender Blutdruckabfall durch Blutungen führte schließlich zur Mangelperfusion des Rückenmarks.
CD95/ CD95L
Zur Untersuchung der Auswirkung ektoper CD95L Expression auf MHC Klasse I disparaten Kb- transgenen Haut- und Herztransplantaten, wurden diese auf B10.BR beziehungsweise Des TZR- transgene Empfänger transplantiert. Als Kontrollgruppe wurden einfach Kb- transgene nicht Mx-huCD95L transgene MHC Klasse I disparate Spenderorgane transplantiert. Als Positivkontrolle wurden syngene Transplantationen durchgeführt.
Transplantation CD95 Ligand transgener allogener Haut
Kb-lo transgene Haut (179-4) wurde als Wildtyp und als Mx-CD95 Ligand transgene Variante auf B10.BR und Des TZR- transgene Mäuse transplantiert. Als Positivkontrolle diente jeweils ein syngenes B10.BR Schwanzhauttransplantat.
Syngene Haut wurde sowohl von B10.BR als auch Des- TZR transgenen Empfängern uneingeschränkt angenommen.
Kb-lo transgene Haut wurde von B10.BR Empfängern im Mittel nach 14,4 ± 1,2 Tagen (n=8) abgestoßen, während Mx-CD95L x Kb-lo doppelt transgene Haut bereits nach 11,8 ± 1,5 Tagen (n=5) abgestoßen wurde.
Ein ähnliches Bild zeigte sich auch bei Des- TZR transgenen Empfängern. Diese stießen Kb-lo transgene Haut nach 12,4 ± 1,1 (n=5) und Mx-CD95L x Kb-lo doppelt transgene Haut bereits nach 10,0 ± 1,2 Tagen (n=5) ab.
Allogene Mx-CD95 Ligand transgene Haut wurde demnach in beiden Gruppen signifikant früher abgestoßen als allogene Wildtyp Transplantate (p<0,05, T- Test).
Syngene Transplantation CD95L transgener Transplantate
Um die Frage zu klären, ob dieser die Abstoßung beschleunigende Effekt allein durch das Mx-CD95L Transgen hervorgerufen wird, wurde Mx-CD95L x Kb-lo doppelt transgene Haut auf Kb-lo transgene Empfänger transplantiert. Diese syngenen Mx-CD95L transgenen
Transplantate wurden nicht abgestoßen. Das Transgen allein führte somit nicht zur Abstoßung.
Transplantation allogener CD95L transgener Haut auf lpr Empfänger
Um zu beweisen, daß die beschleunigte Abstoßung Mx-CD95L x Kb-lo doppelt transgener Hauttransplantate ein direkter Effekt des Mx-huCD95L Transgens ist, wurde ebenso auf lpr Empfänger transplantiert, welche kein funktionelles CD95 Molekül besitzen, somit auch nicht beschleunigt abstoßen dürften.
Tatsächlich wurde in lpr Empfängern im Vergleich zu der Kontrollgruppe keine beschleunigte Abstoßung beobachtet. Lpr Mäuse stießen allogene Wildtyptransplantate nach 14,3 ± 0,6 (n=3) und Mx-CD95L transgene allogene Transplantate vergleichbar nach 14,0 ± 1,0 Tagen (n=3) ab.
Tabelle 4 Auswirkungen des CD95 Liganden auf Überlebenszeiten von Hauttransplantaten
Spender Empfänger n Transplantat- überleben
Tage
Durch- schnitt Tage
Signifikanz
B10.BR Des- TZR 11 >100 >100
Kb-lo Des- TZR 5 11,12,12,13,14 12,4 ± 1,1 Mx-CD95L x Kb-lo Des- TZR 5 9,9,10,10,12 10,0 ± 1,2
p<0,05 T- Test
B10.BR B10.BR 13 >100 >100
Kb-lo B10.BR 8 13,14,14,14,14,14,15,17 14,4 ± 1,2 Mx-CD95L x Kb-lo B10.BR 5 10,11,12,12,14 11,8 ± 1,5
p<0,05 T- Test
B10.BR lpr 3 >100 >100
Kb-lo lpr 3 14,14,15 14,3 ± 0,6
Mx-CD95L x Kb-lo lpr 3 13,14,15 14,0 ± 1,0
nicht signifikant
Mx-CD95L x Kb-lo Kb-lo 3 >100 >100
Abbildung 5 Abszisse: Überlebenszeit in Tagen, Ordinate: prozentuales Transplantatüberleben; Spender jeweils Mx-CD95L x Kb-lo doppelt transgen bzw. Kb-lo transgen, Empfänger: A: B10.BR, B: Des- TZR transgen, C: lpr
Kb-lo è B10.BR
Kb-lo
è DES- TZR
Wildtyp CD95L
0 20 40 60 80 100
5 10 15 20
0 20 40 60 80 100
5 10 15 20
0 20 40 60 80 100
5 10 15 20
Kb-lo è lpr
