Um die Hypothese zu überprüfen, daß die ektope TNFa Expression auf MHC Klasse I disparaten Transplantaten einen protektiven Effekt besitzt, wurden allogene tmTNFa transgene Haut- und Herztransplantationen durchgeführt.
Hauttransplantation
Syngene, allogene Kb-lo und tmTNFa x Kb-lo doppelt transgene Haut wurde auf B10.BR Empfänger transplantiert. Syngene Transplantate wurden wiederum akzeptiert. Es zeigte sich kein signifikanter Unterschied zwischen den mittleren Überlebenszeiten der allogenen Transplantate. Kb-lo transgene Haut wurde nach 14,4 ± 1,2 Tagen (n=8), tmTNFa x Kb-lo doppelt transgene Haut nach 14,7 ± 1,5 Tagen abgestoßen (n=3).
Um die Empfindlichkeit gegenüber proapoptotischen Signalen zu erhöhen, wurden in einer zweiten Versuchsreihe die Empfänger mit dem NFkB Inhibitor BAY 11-7085 ab dem 3. Tag postoperativ behandelt (22). Syngene Transplantate überlebten, Kb-lo transgene
Hauttransplantate wurden im Mittel nach 14,0 ± 0,7 Tagen abgestoßen (n=5), tmTNFa x Kb-lo doppelt transgene Transplantate bereits nach 12,0 ± 0,8 Tagen (n=4). Die Kombination des tmTNFa Transgens mit der NFkB Inhibitor Behandlung führte gegenüber den anderen
Gruppen zu einer relativ geringen aber signifikanten Verringerung des Transplantatüberlebens (p<0,01 gegenüber Kb-lo transgen unter BAY 11-7085, p<0,05 gegenüber tmTNFa x Kb-lo doppelt transgen ohne BAY 11-7085, T- Test).
Die Varianzanalyse erlaubte einen Vergleich der vier Versuchsgruppen und zeigte, daß eine signifikante Interaktion zwischen den Einflußgrößen tmTNFa Transgenität und NFkB Inhibitor BAY 11-7085 Behandlung besteht (p<0,01, Two Way ANOVA).
Tabelle 6 Rolle des tmTNF Transgens bei allogener Hauttransplantation
Spender Empfänger N Transplantat- überleben
Abbildung 8 Abszisse: Überlebenszeit in Tagen, Ordinate: prozentuales
Hauttransplantatüberleben; Spender tmTNF x Kb-lo doppelt transgen bzw. Kb-lo transgen, Empfänger: B10.BR; A: ohne Therapie, B: unter BAY 11-7085 Behandlung
Herztransplantation
Da tmTNFa transgene Mäuse ab sechs Wochen zunehmende Gelenkschwellungen durch Polyarthritis entwickeln, eignen sie sich nur in begrenztem Maße für die Zucht (55).
Aufgrund dessen standen wenige Tiere zur Verfügung.
Transplantiert wurden tmTNFa und Wildtyp Kb-lo transgene Herzen in Des- TZR transgene Empfänger. Drei von vier Transplantaten wurden innerhalb von 17 Tagen abgestoßen (13, 13, 17 Tage), während ein weiteres innerhalb von hundert Tagen nicht vollständig abgestoßen werden konnte, obwohl dieses temporär um den 12. Tag deutliche funktionelle
Einschränkungen aufwies (Corry Score 1 an Tag 12).
Es konnten nur zwei tmTNFa x Kb-lo doppelt transgene Herzen erfolgreich in Des- TZR
0
das zweite wiederum innerhalb von hundert Tagen nicht abgestoßen wurde (Corry Score 2 an Tag 16).
Der Versuch wurde mit tmTNFa und Wildtyp Kb-hi transgenen Spendern wiederholt. Kb-hi transgene Herzen wurden nach 6,4 ± 0,9 Tagen abgestoßen (n=5), im Gegensatz zu tmTNF x Kb-hi doppelt transgenen Herzen, die nach 7 und 8 Tagen abgestoßen wurden (n=2).
Somit ergab sich aus den vorliegenden Ergebnissen kein Hinweis auf ein tmTNFa vermitteltes verlängertes Transplantatüberleben.
Tabelle 7 tmTNF transgene Herztransplantate
Spender Empfänger n Transplantat- überleben
Tage
Durchschnitt Tage
B10.BR Des- TZR 5 >100 >100
Kb-lo Des- TZR 4 13,13,17,>100 tmTNF x Kb-lo Des- TZR 2 17,>100
Kb-hi Des- TZR 5 5,6,7,7,7 6,4 ± 0,9 tmTNF x Kb-hi Des- TZR 2 7,8 7,5 ± 0,7
CD30/ CD30L
Da Kurts et al. 1999 eine wesentliche Rolle des CD30 Moleküls für die Entstehung eines Diabetes mellitus nachweisen konnten, war es das Ziel weiterer Untersuchungen, die Bedeutung dieses Moleküls für alloreaktive Immunantworten zu untersuchen (63). Dafür wurden MHC Klasse I und II und komplett disparate Haut- und Herztransplantate in CD30 defiziente und Wildtyp B6 Empfänger transplantiert.
Hauttransplantation
Syngene B6, MHC Klasse I disparate bm1, MHC Klasse II disparate bm12 und komplett disparate BALB/c Haut wurde sowohl auf B6 Wildtyp als auch auf B6 CD30 defiziente Mäuse transplantiert.
Die syngene Kontrolle wurde von beiden Empfängern uneingeschränkt akzeptiert.
Es konnten außerdem zwischen den beiden Empfängergruppen keine Unterschiede im Überleben von komplett und MHC II disparater Haut festgestellt werden. BALB/c Haut wurde von B6 Mäusen nach 12,3 ± 0,6 Tagen (n=3), von CD30 defizienten nach 11,8 ± 0,4 Tagen (n=6) und bm12 Haut nach 15,8 ± 3,5 (Wildtyp, n=6) und 14,5 ± 1,5 (CD30-/-, n=6)
Tagen abgestoßen.
Dagegen fand ein Abstoßung MHC Klasse I disparater bm1 Transplantate durch CD30 defiziente Empfänger signifikant früher statt (p<0,01, T- Test) als durch B6 Wildtyp
Empfänger. Von CD30 defizienten Empfängern wurden bm1 Transplantate nach 14,0 ± 0,0 Tagen (n=6) und in der Kontrollgruppe nach 21,2 ± 3,5 Tagen (n=5) abgestoßen.
Tabelle 8 Beschleunigte Abstoßung allogener Hauttransplantate bei CD30 Defizienz
Spender Empfänger n Transplantat- überleben
Tage
Durch- schnitt Tage
Signifikanz
B6 CD30-/- 3 >100 >100
bm1 B6 5 18,19,19,25,25 21,2 ± 3,5
bm1 CD30-/- 6 14,14,14,14,14,14 14,0 ± 0,0
p<0,01 T- Test bm12 B6 6 12,13,13,19,19,19 15,8 ± 3,5
bm12 CD30-/- 6 12,14,14,15,16,16 14,5 ± 1,5
nicht signifikant BALB/c B6 3 12,12,13 12,3 ± 0,6
BALB/c CD30-/- 6 11,12,12,12,12,12 11,8 ± 0,4
nicht signifikant bm1 CD30+/+ BC6 3 14,14,15 14,3 ± 0,6
bm1 CD30-/- BC6 4 10,10,11,16 11,8 ± 2,9
nicht signifikant
Abbildung 9 Abszisse: Überlebenszeit in Tagen, Ordinate: prozentuales
Transplantatüberleben; A: bm1, B: bm12, C: BALB/c Transplantate, jeweils auf Wildtyp B6 respektive CD30 defiziente Empfänger, D: bm1 Spender, BC6 CD30+/+ respektive CD30 -/-Empfänger
Abstoßung allogener Herztransplantate durch CD30 defiziente Empfänger Daraufhin stellte sich die Frage, ob ein vergleichbarer Effekt im heterotopen
Herztransplantationsmodell zu finden sei.
Entsprechende Beobachtungen konnten nach Transplantation MHC Klasse I disparater Herzen gemacht werden. Während bm1 Herztransplantate aufgrund der geringeren
Immunogenität im Vergleich zu Haut von Wildtyp B6 Empfängern nicht abgestoßen wurden, stießen 3 von 6 CD30 defizienten Empfängern das Transplantat nach 20 bis 26 Tagen ab. Die restlichen drei Transplantate dieser Gruppe zeigten Funktionseinschränkungen ab Tag 20 bis 30 (Score 2 nach Corry), konnten sich aber nach 30 bis 40 Tagen wieder erholen (Score 4 nach Corry), während bm1 Transplantate in B6 Empfängern durchgehend uneingeschränkt funktionierten (Score 4 nach Corry) (siehe Abbildung 10 B).
Wildtyp
Tabelle 9 Abstoßung allogener Herztransplantate durch CD30 defiziente Empfänger
Spender Empfänger n Transplantatüberleben Tage
Durchschnitt Tage
bm1 B6 5 >100 >100
bm1 CD30-/- 6 20,26,29,>100,>100,>100
Abbildung 10 A: Abszisse: Überlebenszeit in Tagen, Ordinate: prozentuales
Transplantatüberleben, bm1 Herztransplantate, Wildtyp B6 respektive CD30 defiziente Empfänger; B: Abszisse: Zeit in Tagen, Ordinate: Corry Score (Mittelwert, n=3), Funktion der Herztransplantate der nicht abgestoßenen Organe, Wildtyp B6 versus CD30 defiziente Empfänger
Immunhistochemische Untersuchung MHC Klasse I disparater Herztransplantate in Wildtyp und CD30 defizienten Empfängern
Für histologische und immunhistochemische Untersuchungen wurden an Tag 20 und 25 MHC Klasse I disparate Herztransplantate aus CD30 defizienten und Wildtyp B6 Empfängern entnommen. Als syngene Kontrollen wurden B6 Herzen in B6 Empfänger transplantiert.
Nach HE Färbung fiel ein deutliches interstitiell lymphozytäres Infiltrat in allogenen
Herztransplantaten auf. Sowohl im Myokard als auch subperikardial und perivasal fand sich in CD30 defizienten im Vergleich zu B6 Wildtyp Empfängern eine deutlich stärkere
Ausprägung des lymphozytären Infiltrates (siehe Abbildung 11).
Um Informationen über die Zusammensetzung der infiltrierenden Zellen zu bekommen, wurden CD45, CD3 und CD8 positive Zellen immunhistochemisch gefärbt (siehe Abbildung 12). CD45 wird von allen Zellen der hämatopoetischen Reihe exprimiert, CD3 von allen T- Zellen, CD8 lediglich von zytotoxischen T- Zellen (87). Ausgezählt wurden jeweils fünf Gesichtsfelder auf drei verschiedenen Schnitten pro Transplantat bei 400-facher
0
Die Anzahl infiltrierender Zellen war jeweils in allogenen Transplantaten CD30 defizienter Empfänger am größten (siehe Tabelle 10). Weiterhin war in diesen Transplantaten nach zwanzig Tagen der Anteil CD8 positiver Lymphozyten an allen Lymphozyten deutlich erhöht im Vergleich zur Kontrollgruppe. Insgesamt konnte passend zur MHC Klasse I Disparität ein deutliches Überwiegen CD8 positiver Lymphozyten festgestellt werden (88-90).
Tag Gruppe CD45 CD3 CD8 CD8/
CD3
TUNEL
20 bm1 ® B6 CD30-/- +++ +++ ++ 87% -
durchschnittliche Anzahl pro Gesichtsfeld (400x)
bm1 ® B6 Wildtyp ++ ++ + 44% +/- Bereich
B6 ® B6 + +/- - - - 0
+/- 1-2
25 bm1 ® B6 CD30-/- +++ ++ ++ 100% - + 3-25
bm1 ® B6 Wildtyp + + + 100% +/- ++ 26-50
B6 ® B6 + +/- +/- - +++ >50
Tabelle 10 semiquantitative Auswertung der Zusammensetzung myokardialer Infiltrate
Um einen Einfluß apoptotischer Vorgänge auf Zusammensetzung und Ausprägung des Infiltrates nachzuweisen, wurden apoptotische Zellen mittels TUNEL Färbung markiert. Es konnte allerdings kein deutlicher Unterschied zwischen den verschiedenen Kombinationen festgestellt werden. In allogenen Transplantaten in B6 Wildtyp Empfängern fanden sich nur sehr vereinzelt TUNEL positive Zellen, während diese in Transplantaten CD30 defizienter Empfänger, als auch in syngenen Transplantaten nicht zu finden waren.
Zur Positivkontrolle wurden TUNEL positive Zellen im Thymus nachgewiesen.
Abbildung 11
Subperikardiale Infiltrate: A: syngenes Herztransplantat, B: MHC Klasse I disparates Transplantat, CD30+/+ Empfänger, C: MHC Klasse I disparates Transplantat, CD30 -/-Empfänger, myokardiale Infiltrate: D: syngenes Herztransplantat, E: MHC Klasse I disparates Transplantat, CD30+/+ Empfänger, F: MHC Klasse I disparates Transplantat, CD30-/- Empfänger, alle 25d, 200x
A D
B E
C F
Abbildung 12 CD8+ Lymphozyten in Herztransplantaten, 20d, 400x, A: syngen, B: allogen, CD 30+/+ Empfänger, C:
allogen, CD30-/- Empfänger
A
B
C
Rolle von schwachen Transplantationsantigenen bei der Abstoßung MHC Klasse I disparater CD30 defizienter Haut
Kurts et al. 2000 fanden heraus, daß der zuvor beschriebene ausgeprägte diabetogene Effekt CD30 defizienter T- Zellen nicht auf das fehlende CD30 Molekül, sondern auf Differenzen von schwachen Transplantationsantigenen aus dem Hintergrund von S129 Mäusen
zurückzuführen sei (91). Aufgrund dieser neuen Informationen wurden zusätzliche Kontrollen durchgeführt, um Einflüsse unterschiedlicher schwacher Transplantationsantigene zwischen Wildtyp und CD30 defizienten B6 Mäusen auszuschließen, obwohl initial bereits Kontrollen durchgeführt worden waren. B6 Hauttransplantate wurden durch CD30 defiziente Empfänger nicht abgestoßen.
Erste Ergebnisse zeigten, daß CD30 defiziente Hauttransplantate durch B6 Empfänger nach 12,5 ± 0,5 Tagen (n=6) abgestoßen werden. Diese relativ schnelle Abstoßung wies auf Unterschiede im Hintergrund der auf B6 rückgekreuzten CD30 defizienten Mäuse gegenüber C57/Bl6 Mäusen hin.
Um die Rolle dieser Differenz näher zu beleuchten, wurden CD30 defiziente Mäuse durch die AG C. Kurts (Nephrologie, MH Hannover) ein weiteres Mal auf B6 zurückgekreuzt. So standen CD30+/+ und CD30-/- mit vergleichbarem Hintergrund zur Verfügung. MHC Klasse I disparate Hauttransplantate wurden in diesem Fall von beiden Gruppen nach vergleichbarer Zeit abgestoßen. CD30+/+ Empfänger stießen bm1 Hauttransplantate nach 14,3 ± 0,6 Tagen ab (n=3) und CD30-/- Empfänger nach 11,8 ± 2,9 Tagen (n=4).
Aufgrund dieser Beobachtung muß davon ausgegangen werden, daß die beobachteten Unterschiede im Transplantatüberleben zwischen B6 Wildtyp und CD30 defizienten Empfängern nicht auf CD30 zurückzuführen sind.
Adenoviraler Gentransfer
Intraoperative virusvermittelte Transfektion vaskularisierter Herztransplantate Syngene Herztransplantationen wurden wie beschrieben durchgeführt. Die Koronararterien des Spenderherzens wurden während der Entnahme mit 200µl virushaltiger Lösung über die Aorta retrograd perfundiert. Die Gesamtmenge an verabreichten Viren betrug 1*1010 PFU.
Die Einheit PFU steht für die Zahl an Viren, die benötigt wird, um in der Zellkultur eine Zelle zu infizieren, und entspricht etwa 10- 20 Partikeln.
Nach der Injektion wurden die Spenderherzen entnommen und 10 Minuten in eisgekühlter
und damit Reperfusion des Organs vergingen weitere 25- 30 Minuten. Die Transplantate und ebenso die Empfängerleber wurden zu verschiedenen Zeitpunkten entfernt (6, 24 Stunden und 2, 7, 21 Tage) und histologisch auf Expression der b- Galaktosidase untersucht. Während nach 6 Stunden noch kein Nachweis der b- Galaktosidase gelang, war dies nach 24 Stunden bereits der Fall. Sowohl Herzmuskel- als auch Lebergewebe wiesen eine deutliche Expression des lacZ Gens auch nach 48 Stunden auf. An Tag 7 konnte eine Abnahme der
Expressionsdichte in der Leber festgestellt werden, nach 21 Tagen fand sich bereits keine Expression der b- Galaktosidase mehr. Im Herzmuskelgewebe konnte eine leichte Abnahme der Expressionsdichte nach 21 Tagen beobachtet werden.
Zeitpunkt 6h 24h 2d 7d 21d
Konzentration Organ
Zellen pro Gesichts-
feld (400x)
Herz - ++ ++ ++ + - 0
1*1010 PFU in 200µl
Leber - ++ ++ + - +/- 1-2
5*1010/ml, 15min Haut - + + + - + 3-10
5*1010/ml, 45min Haut - + ++ + - ++ >10
Tabelle 11 b- Galaktosidase Aktivität
Abbildung 13 Adenoviraler Gentransfer: oben: HTX, 2d, 1*1010 PFU, 200x; unten: HautTX, 7d, 200x
Transfektion von Hauttransplantaten
Syngene Hauttransplantate wurden über verschiedene Zeiträume (15 und 45 Minuten) in einer Adeno- lacZ haltigen Lösung (5*1010 PFU/ml) inkubiert und anschließend transplantiert. Die Explantation der Hauttransplantate erfolgte analog zu den durchgeführten
Herztransplantationen nach 6 und 24 Stunden, 2, 7 und 21 Tagen.
Nach 6 Stunden konnte wiederum keine Expression der b- Galaktosidase nachgewiesen werden. Nach 24 Stunden bis zum 7. Tag fand eine Expression statt. Die verlängerte
Inkubationszeit führte zu einer leichten Verbesserung der Transfektionsrate, ohne jedoch die Expression der b- Galaktosidase dauerhaft zu erhöhen.
Diskussion
Ziel dieser Arbeit war es, potentiell protektive Wirkungen ausgewählter Mitglieder der TNF/
TNF Rezeptor Superfamilie im heterotopen Herz- und Hauttransplantationsmodell an der Maus zu prüfen. Es wurde postuliert, daß die Expression proapoptotischer Moleküle wie CD95L, TNF und CD30L auf den Zelloberflächen des Spenderorgans durch Elimination alloreaktiver Lymphozyten eine Transplantatabstoßung stoppen beziehungsweise verzögern kann. Eine nicht selektive medikamentöse Immunsuppression könnte derart durch Induktion gewebespezifischer Toleranz vermieden werden.