Aus der Klinik für Thorax-, Herz- und Gefäßchirurgie Medizinische Hochschule Hannover (Direktor Prof.Dr.med. A.Haverich) Untersuchung zur Ausbildung der Transplantatvaskulopathie unter lokaler Applikation eines Tyrosinkinaseinhibitors im Aortentransplantationsmodel der Ratte
Dissertationsschrift zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin an der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Michael Prokop aus Celle Hannover 2007
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 28.08.2007 Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover
Präsident: Prof. Dr. Dieter Bitter-Suermann Betreuer: Prof. Dr. med. Matthias Karck Referent: Prof. Dr. med. Faikah Güler
Korreferent: Prof. Dr. med. Bernhard Schieffer Tag der mündlichen Prüfung : 28.08.2007 Promotionsausschussmitglieder:
Prof. Dr. Hermann Haller Prof. Dr. Klaus Otto Prof. Dr. Gesine Hansen
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung...2
2. Material und Methode...4
2.1 Das Transplantationsmodel...4
2.2 Matrix...7
2.3 Tyrphostin AG1295...8
2.4 Morphometrie...8
2.5 Immunhistochemie...9
2.6 Statistische Auswertung...11
3. Ergebnisse...11
3.1 Morphometrie...11
3.2 Immunhistochemie...13
4. Diskussion...19
5. Zusammenfassung...26
6. Danksagung...27
7. Literatur...28
8. Abkürzungsverzeichnis...38
1. Einleitung
Die Transplantatvaskulopathie (TVP) bezeichnet die koronare Herzkrankheit des transplantierten Herzen, „heart allograft vascular disease“ (Miller 1992). Sie ist nach wie vor die Hauptursache für ein Transplantatversagen im Langzeitverlauf nach Herztransplantation (Pethig 1997, Dhaliwal 2006).
Die Ätiologie und Pathogenese der TVP sind seit der Erstbeschreibung (Thomson 1969, Bieber 1970) nicht abschließend geklärt.
Grundlage aller bisherigen Theorien ist ein Endothelschaden der Gefäße durch sowohl immunologische (alloantigen-abhängige) (Vassalli 2003) als auch nicht- immunologische (alloantigen-unabhängige) Faktoren. Zu den nicht immunologischen Faktoren, welche für die Entstehung der TVP mitverantwortlich sind, zählen die Ischämie des Transplantates von der Zeit der Explantation bis zur seiner Reperfusion im Empfängerorganismus. Auch wird das Endothel durch das Abklemmen der Gefäße und die Naht der Gefäßanastomosen mechanisch verletzt. Weiterhin fanden sich sowohl im Tierexperiment als auch bei menschlichen Herztransplantationen Hyperlipidämie und Infektionen mit dem Cytomegalie Virus (CMV) für die Entstehung der TVP mitverantwortlich.
Zu den für die Entstehung der TVP ursächlich immunologischen Faktoren zählen HLA Inkompatibilität zwischen Spender und Empfänger.
(Übersicht bei Fellstrom 1996, Deng 1998, Weis 1997, 2000, Orbaek A 1999, Aranda 2000, Avery 2003, Valantine 2004, Ramzy 2005, Kass 2006).
Die Verletzung des Endothels verursacht eine vermehrte Expression von Wachstumsfaktoren. In tierexperimentellen Untersuchungen zur TVP wurde eine vermehrte Expression von Wachstumsfaktoren, neben anderen insbesondere des Platelet-derived growth factor (PDGF) und seines Rezeptors gefunden (Lemström 1997, Mancini 2000). Auch nach humaner Herztransplantation (HTx) fand sich bioptisch eine vermehrte Expression (Gordon 1992) dieses für die Pathogenese der Neointima so wichtigen Wachstumsfaktors (Waltenberger 1997, Armstrong 1996, Sack 2004).
PDGF hat in der Gefäßwand eine starke mitogene Wirkung, insbesondere auf die glatten Muskelzellen der Media. Dadurch kommt es zu einer Proliferation und Migration der glatten Muskelzellen von der Media in die Intima des Gefäßes.
Dieses geschieht im Sinne eines Reparaturprozesses (Häyry 1998) („response to injury“ (Hosenpud 1992, Schwartz 1995)). Letztendlich führt die Entstehung dieser Neointima zur Einengung des Gefäßlumens.
In den vergangenen Jahren fand man eine neue Möglichkeit, die Wirkung von Wachstumsfaktoren durch die funktionelle Hemmung ihrer Tyrosinkinasen zu unterdrücken (Levitzki 1995, 1996, Waltenberger 2000).
Tyrosinkinasen sind enzymatisch aktive bzw. aktivierbare Domänen derjenigen Rezeptoren, die für die Generierung und Weiterleitung des wachstumsfaktor- induzierten Signals notwendig und verantwortlich sind (Übersicht bei Heldin 1998).
Ziel dieser Studie war es zu untersuchen, ob sich die TVP im Aortentransplantationsmodel der Ratte (Mennander 1991, Isik 1992) durch die lokale, von außen am Transplantat erfolgende Applikation von Tyrphostin AG1295 abschwächen lässt.
Es handelt sich hierbei um eine niedermolekulare Substanz aus der chemischen Gruppe der Tyrphostine (Kovalenko 1994, Gazit 1996), welche selektiv die Tyrosinkinase des PDGF ß-Rezeptors hemmt und deren Wirksamkeit im Restenosemodel bereits nachgewiesen werden konnte ( Banai 1998, Fishbein 2000).
Mit Hilfe histologischer Übersichtsfärbungen (HE) (Abb. 5) sowie immunhistochemischer Färbungen (Abb. 6) wurden die transplantierten Gefäße hinsichtlich ihrer histomorphologischen Veränderungen, sowie der Expression ausgewählter Proteine untersucht.
2. Material und Methode
2.1 Das Transplantationsmodel
In dieser Untersuchung wurde das heterotope Aortentransplantationsmodel der Ratte eingesetzt, welches 1991 von Mennander et. al. zur experimentellen Untersuchung der TVP beschrieben wurde (Mennander 1991).
Die Haltung der Versuchstiere sowie die Durchführung der Eingriffe erfolgte im Rahmen des unter der Nummer AZ 96/906 bei der Bezirksregierung Hannover angezeigten und bewilligten Versuchsvorhabens.
Männliche adulte Tiere der Ratteninzuchstämme Wistar-Furth (WF) (AG-B2, RT1v) und dark agouti (DA) (AG-B4, RT1a) (Dennis 1993) mit einem Gewicht von 200-300 g wurden zur Transplantation benutzt (Zentrales Tierlabor der Medizinischen Hochschule Hannover, n= 39).
Die Tiere wurden in 4 experimentelle Gruppen (Tab.1) eingeteilt.
Gruppe 1 Gruppe 2
allogen transplantiert allogen transplantiert
ohne Behandlung Matrix mit AG 1295
Gruppe 3 Gruppe 4
allogen transplantiert syngen transplantiert
Matrix ohne AG 1295 ohne Behandlung
Tab.1 Die Gruppen 1 – 3 wurden allogen transplantiert, die Gruppe 4 wurde syngen transplantiert
(Anmerkung: Die im nachfolgenden Text benannten Gruppennummern (1-4) beziehen sich immer auf die hier in Tab.1 vorgenommene Definition. Der entsprechende Entnahmezeitpunkt des Transplantates (20 oder 80 Tage) wird jeweils angegeben.)
Bei der allogenen Stammkombination (Gruppe 1-3) diente DA als Spender und WF als Empfänger. Bei der syngenen Stammkombination (Gruppe 4) diente DA sowohl als Spender als auch Empfänger.
Nachdem Spender – und Empfängertier mit Ketamin (100mg/kg i.p.) und Xylazin (Rompun) (10mg/kg i.p.) anästhesiert worden waren, wurden sie in Rückenlage fixiert. Dem Spendertier wurde nach Thorakotomie ein 1 cm langes Stück der Aorta descendens entnommen, welche mit Ringerlösung durchspült und bis zu ihrer Implantation in das Empfängertier in 4 Grad Celsius kalter Ringerlösung aufbewahrt wurde. Nach medianer Laparatomie am Empfängertier wurde die Aorta abdominalis dargestellt und distal des Abganges der Aa. renalis bis zur Bifurkation präpariert.
Nach Setzen einer proximalen und distalen Klemme wurde das Gefäß quer durchtrennt und das Transplantat zwischen die beiden Gefäßstümpfe mit fortlaufender 9-0 Prolenenaht End-zu-End anastomosiert (Piza-Katzer 1974). Gruppe 1 diente als Kontrollgruppe (allogene Transplantation ohne Behandlung). Bei den Tieren der Gruppe 2 und 3 (Tab. 1) wurde jetzt um das Transplantat eine Matrix (s.
2.2) gelegt, welche so zusammengenäht wurde, dass sie das Transplantat nicht komprimierte aber trotzdem der Adventitia anlag und nicht verrutschen konnte (Abb.
1). War die Matrix mit AG1295 beschichtet (Abb. 3), so zeigte diese Seite zum Transplantat. Anschließend wurde die Wunde verschlossen. Als Operationsmikroskop stand ein Zeiss´sches binoculares Monoskop mit einer 40- fachen Vergrößerung zur Verfügung. Die Zeit von der Entnahme des Transplantates bis zum Lösen der Klemmen nach Implantation betrug bei allen Experimenten ca. 45 min. Die Tiere erhielten anschließend freien Zugang zu Wasser und Futter.
Die Entnahme der Transplantate erfolgte zu zwei unterschiedlichen (20 und 80 Tage ) Zeitpunkten nach der Operation.
Kurz vor Entnahme wurden die Transplantate durch Perfusion mit 150 ml 10 % Formaldehyd druckfixiert. In die Aorta descendens erfolgte eine Inzision in welche ein Infusionssystem eingeführt wurde. Die Infusionsflasche mit dem Formalehyd wurde 1,5 m über Herzniveau aufgehängt und so das Formaldehyd mit Druck in das Gefäßsystem des Tieres infundiert (Golomb 1996, Sterpetti 1999).
Abb. 1 Matrix unterhalb des Aortentransplantates. Die proximale und distale Anastomose (Pfeile) liegen genau auf der Kante der Matrix. Die mit AG 1295 beschichtete Seite (weiß) liegt der Adventitia des Transplantates an.
Abb. 2 Aortentransplantat explantiert nach 80 Tagen (Gruppe 2). AG 1295 ist vollständig von der Matrix freigesetzt, übrig bleibt
die transparente blanke Matrix
2.2 Matrix
Die Matrix zur lokalen perivaskulären Freisetzung bestand aus einem Ethylen- vinylacetat co-polymer, (EVA) (Elvax 40, Du Pont Chemical Co., DE, USA).
EVA und AG1295 (s. 2.3) wurden so in Methylchlorid gelöst, dass sich eine 15%ige Lösung ergab (Golomb 1994,1996).
Diese Lösung wurde in Petrischalen gegossen und getrocknet. Anschließend wurde die erhärtete Matrix in Stücke geschnitten (0.3mm*1cm*0.8cm).
Um eine unidirektionale Freisetzung von AG1295 zu erreichen, wurde eine Seite der Matrix mit einem nativen EVA –Film versiegelt (Abb. 3.).
Die Freisetzungskinetik (in vivo) von AG-1295 aus der Matrix (0.3mm) zeigt, dass nach 28 Tagen 98% des Tyrphostins aus der Matrix freigesetzt sind, dieses entspricht einer ungefähren Dosis von 40µg/kg pro Tag (Fishbein 2000).
Abb. 3 EVA Matrix (transparent) mit AG 1295 (weiß) beschichtet
2.3 Tyrphostin AG1295
AG1295 (6,7-dimethyl-2-phenylquinoxalin) ist eine niedermolekulare Substanz aus der chemischen Gruppe der Tyrphostine (Quinoxaline), welche selektiv die Tyrosinkinase des PDGF-ß Rezeptors hemmt (Kovalenko 1994).
Durch die Blockierung dieses Enzyms bleibt die ligandeninduzierte (PDGF-BB) Autophosphorylierung des Rezeptors aus, so dass die anschließende Signalkaskade zur Weiterleitung des biologischen Signals abbricht (Kovalenko 1997, Heldin 1998).
2.4 Morphometrie
Die in Paraffin eingebetteten Transplantate wurden in der Mitte senkrecht zu ihrer Längsachse in 4 µm dicke Scheiben (n=4-6) geschnitten und mit Mayer´s Hämatoxylin- Eosin gefärbt. Die auf Objektträger montierten histologischen Schnitte wurden zur Entfernung des Paraffins für 30 Minuten in Xylol gebracht und in einer absteigenden Alkoholreihe (Isopropanol) (98 – bis 70 %) ausgewaschen.
Anschließend für 5 Minuten in Hämalaun nach Mayer, kurz in Leitungswasser gespült und für 15 Minuten in fließendem Leitungswasser gebläut. Anschließend für 3 Minuten Färbung in 1 % Eosin, kurzes Auswaschen mit aqua dest. Ansteigende Alkoholreihe (70 – 100 % Isopropanol), 3 Minuten Xylol, abschließend eindecken.
Ein Bild von jedem Schnitt wurde mit einer Videokamera, welche mit dem Okular eines Lichtmikroskops verbunden war, auf eine VHS Videokassette in 40-facher Vergrößerung aufgenommen.
Die Bilder der Aortenquerschnitte wurden auf einen Bildschirm übertragen und mit Hilfe eines Bildanalyseprogramms (Tape Measure ® , Indec Systems, San Francisco, California) vermessen.
Ausgemessen wurde die Fläche des Gefäßlumens (Fläche umschrieben von der Lamina elastica interna), die Fläche der Neointima und die Fläche der Media (Fläche umschrieben von der Lamina elastica interna und Lamina elastica externa).
Aus diesen Flächenmessungen wurde die relative Dicke der Neointima und der Media (Qint 1 und Qmed 2 ) an der Gesamtfläche des Gefäßquerschnittes berechnet (Abb. 4 ).
Abb.4 Definition der einzelnen Messflächen des Gefäßquerschnittes. Die Gesamtfläche des Gefäßquerschnittes besteht aus der Summe der Einzelflächen von Media, Neointima und Gefäßlumen.
1 Qint bezeichnet die relative Dicke (%) der Neointima:
(Qint = Neointima/(Gefäßlumen+Neointima+Media) * 100)
2 Qmed bezeichnet die relative Dicke (%) der Media:
(Qmed = Media/(Gefäßlumen+Neointima+Media) * 100) (Akyurek 1995)
2.5 Immunhistochemie
Es wurden folgende Antikörper benutzt:
1. PDGFR-ß (St. Cruz Biotechnology Inc. cat.sc-432)
affinitätsgereinigtes polyklonales Kaninchenantiserum gegen menschlichen PDGF rezeptor-ß), welches mit dem korrespondierenden Rezeptor der Ratte kreuzreagiert.
2. Smooth-muscle-actin (Dako Corp., Hamburg Germany; cat. M0635) monoklonaler Antikörper gegen smooth-muscle-actin der Ratte
3. CD3+ (Biermann, Bad Nauheim, Germany cat. DPC SM253D) monoklonaler Antikörper gegen CD3+ T-Lymphozyten der Ratte
4. CD8+ (Biermann; cat. DPC SM259D)
monoklonaler Antikörper gegen CD8+ T-Lymphozyten der Ratte Immunhistochemische Färbungen
Für die Färbung des Gewebes wurden die in Paraffin eingebetteten Transplantate unter Kühlung am Microtom in 1-2 µm dicke Scheiben geschnitten und auf APES (3- Aktinopropyltrihoxysilene) beschichtete Objektträger gezogen, um die Haftung des Gewebes zu verbessern. Danach wurden sie mit Xylol entparaffiniert und in einer absteigenden Alkoholreihe (90% - 70% - destilliertes Wasser) rehydriert um anschließend in TRIS- (Trihydroxymetylaminomethanol) Puffer gespült zu werden.
Die wärmeinduzierte Epitopendemaskierung wurde mit der Mikrowelle durchgeführt (Citratpuffer; pH 6; 30 min). Das polyclonale Antiserum (PDGF-ß) wurde für 30 min in normalem Kaninchenserum (Verdünnung 1:50) bei Raumtemperatur inkubiert. Der Sekundärantikörper (Envision, DAKO Corp.) wurde ebenfalls für 30 min bei Raumtemperatur (Verdünnung 1:100) inkubiert. Als Farbsubstrat diente Neufuchsin.
Für die Färbung (indirekt) mit den monoklonalen Antikörpern wurde das Gewebe ebenfalls für 30 Minuten in der Mikrowelle vorbehandelt und anschließend mit Anti- smc (Verdünnung 1:50), Anti CD3+ (Verdünnung 1:40) und Anti CD8+ (Verdünnung 1:50) gefärbt. Zuvor war mit der Avidin-Biotin Methode die Sensivität erhöht worden. Überdies war mit der Tyramintechnik eine Signalverstärkung induziert worden ( von Wasielewski 1997).
Auswertung der Immunfärbung
Für die semiquantitative Auswertung der Immunfärbung (Lemström 1997) wurde jede Gefäßschicht einzeln in eine von vier definierten Graden eingeteilt:
Grad 0 = negativ;
Grad 1 = schwach(< 10 % positive Zellen);
Grad 2 = mäßig (10 % - < 50% positive Zellen);
Grad 3 = stark (≥ 50 % positive Zellen).
2.6 Statistische Auswertung
Die statistische Aufarbeitung erfolgte computergestützt mit Hilfe eines Auswertungsprogramms (SPSS ® für Microsoft Windows, Version 10.0).
Es wurde zunächst eine deskriptive Auswertung mit Berechnung der Mittelwerte und der Standardabweichungen durchgeführt. Da die Ergebnisse keiner Normalverteilung unterlagen, erfolgte die Signifikanzprüfung mit einem nichtparametrischen Test für unabhängige Stichproben (Kruskall-Wallis-Test). Für den Vergleich von 2 Gruppen untereinander wurde der Mann-Whitney-U-Test verwendet. Ein p < 0,05 wurde als statistisch signifikant betrachtet.
◆ (Anmerkung: Die syngene (Gruppe 4) nach 20 Tagen (n=2) wurde mit keiner anderen Gruppe statistisch verglichen. Sie diente nur zur Darstellung, dass in diesem Modell allein alloantigen-unabhängige Faktoren nach 20 Tagen zu keiner Neointimaausbildung führen.)
3. Ergebnisse
3.1 Morphometrie Intima
Nach 20 Tagen kam es in keiner Gruppe zur Ausbildung einer Neointima.
Nach 80 Tagen entwickelte sich bei der Gruppe 1 (allogene Kontrollgruppe) eine Neointima, deren Fläche (Qint) 23,8±6,8% an der Gesamtfläche des Gefäßquerschnittes betrug (Abb. 3 und Tab. 2).
Im Vergleich dazu betrug die Fläche der Neointima bei den Transplantaten, um welche die EVA Matrix mit AG 1295 (Gruppe 2) gewickelt worden war, 11,8±9,1%.
In allogenen Transplantaten, die mit unbehandelter EVA Matrix behandelt worden waren (Gruppe 3), betrug die Fläche der Neointima (Qint) nach 80 Tagen 21,9±6,2%.
(Abb. 3 und Tab. 2).
Die syngenen Transplantate (Gruppe 4) entwickelten auch nach 80 Tagen keine Neointima (0,0±0,0%).
In der Gruppe 2 (AG 1295) war die Neointimaausbildung nach 80 Tagen signifikant (p=0.042) geringer im Vergleich zur Gruppe 1 (Kontrolle).
Abb. 5 Aortenquerschnitt nach 80 Tagen allogener Transplantation
links Gruppe 1 (ohne Behandlung) , rechts Gruppe 2 (mit AG 1295 behandelt) I = Neointima, M = Media, Pfeil = Lamina elastica interna
(Färbung mit Mayer´s Hämatoxylin-Eosin , 200-fache Vergrößerung)
Media
Die relative Dicke der Media (Qmed) zeigte nach 20 Tagen in keiner Gruppe eine signifikante Änderung.
Nach 80 Tagen zeigten alle allogenen Transplantate (Gruppen 1-3) gegenüber den syngenen Transplantaten (Gruppe 4) eine Abnahme der relativen Dicke (Qmed) (Tab.2).
Gruppe Qint % Qmed % 1 (Kontrolle allogen) 23.8±6.8 26.9±3.3
2 (AG1295 10%) 11.8±9.2 ✻ 25.4±5.2
3 (Matrix nativ) 22±6.2 21±1.2 ✻✻
4 (Kontrolle syngen) 0.0±0.0 39.5±13.4
Tab.2 Ergebnisse der Morphometrie nach 80 Tagen, (✻ p= 0.042 gegenüber Gruppe 1,✻✻ p= 0.016 gegenüber Gruppe 4)
3.2 Immunhistochemie Intima
Im Verlauf von 60 Tagen kam es in der Kontrollgruppe (Gruppe 1) zu einem Anstieg der Expression von glattem Muskelaktin in der Neointima (0.8±0.3 nach 20 Tagen vs.
3.0±0.0 nach 80 Tagen ) (Tab.3).
Zu beiden Zeitpunkten (20 und 80 Tage) zeigte sich in den drei allogenen Gruppen kein von der Gruppe abhängiger Unterschied in der Färbeintensivität von glattem Muskelaktin.
Wie erwartet kam es in der syngenen (Gruppe 4) nach 20 Tagen zu keiner (0.0±0.0) und nach 80 Tagen zu einer schwachen (0.3±0.3) Anfärbung mit glattem Muskelaktin.
CD3+ T-Lymphozyten und CD8+ T-Lymphozyten wurden in den Gruppen, deren Transplantate umwickelt worden waren (Gruppen 2 und 3) schwach bis mäßig exprimiert, ohne dass sich ein von der Gruppe abhängiger Unterschied zwischen den einzelnen Gruppen ergab.
In der sygenen (Gruppe 4) wurden zu keinem Zeitpunkt CD3+ T-Lymphozyten noch CD8+ T-Lymphozyten exprimiert. , In der Gruppe 1 kam es nach 20 Tagen zu einer schwachen bis mäßigen Expression des PDGF-ß Rezeptoren, im Vergleich zu einer minimalen Expression nach 20 Tagen in den Transplantaten der Gruppe 2.
Nach 80 Tagen war ein solcher Unterschied in der Expression von PDGFR-ß nicht zu beobachten, sie war schwach bis mäßig sowohl in der Gruppe 1 als auch in der Gruppe 2.
Nach 20 Tagen war die intimale Expression des PDGF-ß Rezeptoren in der Gruppe 2 (AG 1295) signifikant (p= 0.029) geringer im Vergleich zur Gruppe 1 (Kontrolle).
Syngene Allogene Matrix mit Matrix Kontrollen
(Gruppe 4)
Kontrollen (Gruppe 1)
AG-1295 (Gruppe 2)
Nativ (Gruppe 3)
(n=2) ◆ (n=4) (n=4) (n=5)
Antikörper
20 Tage
SMCs (α-actin, MO695) 0.0 ± 0.0 0.8 ± 0.3 1.3 ± 0.7 2.1 ± 0.5 CD3+T-lymphocytes (SM253D) 0.0 ± 0.0 0.6 ± 0.3 1.4 ± 0.6 2.0 ± 0.3 CD8+T-lymphocytes (SM295D) 0.0 ± 0.0 0.7 ± 0.4 1.8 ± 0.3 2.1 ± 0.4
PDGFR-ß (sc 432) 0.0 ± 0.0 1.5 ± 0.2 0.3 ± 0.2a 1.1 ± 0.4
Syngene Allogene Matrix mit Matrix Kontrollen Kontrollen AG-1295 nativ
(n=5) (n=9) (n=5) (n=4)
Antikörper
80 Tage
SMCs (α-actin, MO695) 0.3 ± 0.3 3.0 ± 0.0 2.9 ± 0.1 3.0 ± 0.0 CD3+T-lymphocytes (SM253D) 0.1 ± 0.1 1.0 ± 0.0 1.1 ± 0.1 1.0 ± 0.0 CD8+T-lymphocytes (SM295D) 0.2 ± 0.1 1.4 ± 0.1 0.6 ± 0.2 0.4 ± 0.2
PDGFR-ß (sc 432) 0.4 ± 0.3 1.3 ± 0.2 1.7 ± 0.3 1.7 ± 0.5
aP=.029 vs. Allogene Kontrolle (Gruppe 1)
SMC, smooth muscle cell.
Tab. 3 Immunhistochemische Färbung der Intima
◆ siehe Anmerkung zu 2.6 (Seite 9)
Media
Die Media der syngenen Kontrollgruppe (Gruppe 4) bestand hauptsächlich aus smooth muscle actin (SMA) positiven Zellen, sowohl nach 20 Tagen als auch nach 80 Tagen.
Im Vergleich dazu zeigten die allogenen Gruppen (Gruppen 1-3) eine deutliche Abnahme der SMA positiven Zellen nach 80 Tagen. Eine Abnahme der SMA positiven Zellen in den allogenen Gruppen zeigte sich auch schon nach 20 Tagen, hier war sie bei den mit AG1295 behandelten Transplantaten (Gruppe 2) am stärksten.
Die Färbeintensität für CD3+ T-Lymphozyten und CD8+ T-Lymphozyten war bei den syngenen Kontrollen (Gruppe 4) zu beiden Zeitpunkten schwach.
Verglichen mit den syngenen Kontrollen (Gruppe 4) nach 20 Tagen, gab es einen Anstieg der Expression von CD+3 T-Lymphozyten bei allen allogenen Gruppen (Gruppe 1-3) zu diesem Zeitpunkt, welcher hauptsächlich in der CD8+ Subpopulation auffiel.
Die zelluläre Expression von PDGFR-ß war schwach bis mäßig in allen Gruppen mit einem leichten Anstieg im zeitlichen Verlauf von 20 zu 80 Tagen.
Von diesem Anstieg ausgenommen waren die syngenen Kontrollen (Gruppe 4), in welchen die Färbeintensivität für PDGFR-ß über den Zeitverlauf gleichblieb.
Es zeigten sich keine signifikanten Unterschiede unterhalb der einzelnen Gruppen.
Syngene Allogene Matrix mit Matrix Kontrollen
(Gruppe 4)
Kontrollen (Gruppe 1)
AG-1295 (Gruppe 2)
Nativ (Gruppe 3)
(n=2)◆ (n=4) (n=4) (n=5)
Antikörper
20 Tage
SMCs (α-actin, MO695) 3.0 ± 0.0 2.5 ± 0.4 0.9 ± 0.2 1.8 ± 0.4
CD3+T-lymphocytes (SM253D) 1.0 ± 0.0 2.1 ± 0.4 1.7 ± 0.1 1.8 ± 0.3 CD8+T-lymphocytes (SMD295D) 0.2 ± 0.0 1.2 ± 0.5 0.9 ± 0.2 0.8 ± 0.2
PDGFR-ß (sc 432) 1.2 ± 0.1 1.4 ± 0.1 1.3 ± 0.6 1.4 ± 0.3
Syngene Allogene Matrix mit Matrix Kontrollen Kontrollen AG-1295 nativ
(n=5) (n=9) (n=5) (n=4)
Antikörper
80 Tage
SMCs (α-actin, MO695) 3.0 ± 0.0 1.1 ± 0.0 1.1 ± 0.1 1.6 ± 0.4
CD3+T-lymphocytes (SM253D) 0.7 ± 0.1 1.2 ± 0.0 1.0 ± 0.0 1.2 ± 0.2 CD8+T-lymphocytes (SMD295D) 0.4 ± 0.1 1.1 ± 0.1 0.7 ± 0.2 0.5 ± 0.2
PDGFR-ß (sc 432) 1.9 ± 0.2 0.7 ± 0.1 1.2 ± 0.4 1.0 ± 0.5
◆ siehe Anmerkung zu 2.6 (Seite 9) SMC, smooth muscle cell.
Tab. 4 Immunhistochemische Färbung der Media
Adventitia
Nach 20 Tagen und nach 80 Tagen zeigte sich in den allogenen Gruppen (Gruppen 1-3) hauptsächlich eine Anfärbung von SMA positiven Zellen. Dieses zeigte sich nicht in den syngenen Kontrollen (Gruppe 4) (p=0.03 vs. allogene Kontrollen (Gruppe 1) nach 80 Tagen).
Zwischen den allogenen Gruppen (Gruppen 1-3) wurde kein signifikanter Unterschied beobachtet.
Zu beiden Zeitpunkten gab es bei den allogenen Gruppen eine mäßige bis starke Infiltration mit CD3+ T-Lymphozyten und CD8+ T-Lymphozyten, auch hier wurde wie bei den SMA positiven Zellen kein signifikanter Unterschied bezüglich der Expression von CD3+ und CD8+ T-Lymphozyten zwischen den Gruppen gefunden.
In den syngenen Kontrollen (Gruppe 4) kam es nur zu einer schwachen Infiltration der Adventitia mit CD3+ und CD8+ T-Lymphozyten.
Hier war die Expression von PDGFR-ß schwach bis mäßig, sowohl nach 20 als auch nach 80 Tagen.
Bei den allogenen Gruppen (Gruppen 1-3) war die Expression von PDGFR-ß mäßig bis stark, ohne dass ein signifikanter Unterschied zwischen den einzelnen allogenen Gruppen gefunden werden konnte.
Syngene Allogene Matrix mit Matrix Kontrollen
(Gruppe 4)
Kontrollen (Gruppe 1)
AG-1295 (Gruppe 2)
Nativ (Gruppe 3)
(n=2)◆ (n=4) (n=4) (n=5)
Antikörper
20 Tage
SMCs (α-actin, MO695) 1.0 ± 0.0 2.0 ± 0.4 2.0 ± 0.7 2.9 ± 0.1 CD3+T-lymphocytes (SM253D) 1.3 ± 0.3 2.5 ± 0.5 2.0 ± 0.5 2.8 ± 0.1 CD8+T-lymphocytes (SM295D) 1.0 ± 0.0 2.3 ± 0.6 1.9 ± 0.5 2.1 ± 0.4
PDGFR-ß (sc 432) 1.0 ± 0.0 2.6 ± 0.2 1.9 ± 0.4 2.5 ± 0.2
Syngene Allogene Matrix mit Matrix Kontrollen Kontrollen AG-1295 nativ
(n=5) (n=9) (n=5) (n=4)
Antikörper
80 Tage
SMCs (α-actin, MO695) 1.0 ± 0.0c 2.2 ± 0.2 2.3 ± 0.4 1.9 ± 0.4 CD3+T-lymphocytes (SM253D) 1.0 ± 0.1 2.4 ± 0.1 2.0 ± 0.4 2.8 ± 0.2 CD8+T-lymphocytes (SM295D) 1.4 ± 0.4 2.5 ± 0.1 2.5 ± 0.2 2.0 ± 0.3
PDGFR-ß (sc 432) 1.6 ± 0.3 2.2 ± 0.1 2.7 ± 0.1 2.6 ± 0.2
cP=0.03 vs. Allogene Kontrolle (Gruppe 1) SMC, smooth muscle cell. ◆ siehe 2.6
Tab. 5 immunhistochemische Färbung der Adventitia
Abb. 6
Immunhistochemische Färbung : PDGFR-ß subintimal bei Gruppe 1 nach 20 Tagen (A), PDGFR-ß subintimal bei Gruppe 4 nach 20 Tagen (B), PDGFR-ß in der Neointima bei Gruppe 1 nach 80 Tagen (C), PDGFR-ß in der Neointima bei Gruppe 2 (nach 80 Tagen) (D), Smoth muscle actin (SMA) in der Media bei Gruppe 4 nach 20 Tagen (E), SMA in der Adventitia bei Gruppe 1 nach 20 Tagen (F), , (200-fache Vergrößerung)
4. Diskussion
Am 3. Dezember 1967 führte Christiaan Barnard am Groote Schuur Hospital Kapstadt in Südafrika die erste menschliche Herztransplantation durch (Barnard 1967). Der Patient verstarb 18 Tage nach der Operation an einer Pneumonie.
Mit der klinischen Einführung des Cyclosporin A durch Shumway 1980 konnte die 5 Jahres Überlebensrate nach Herztransplantation auf über 80 % angehoben werden (DiBardino 1999, Banner 2004). Nach der Beherrschung der akuten Organabstoßung trat das Problem der chronischen Abstoßung mit dem klinischen Bild der
Tansplantatvaskulopathie immer mehr in den Vordergrund. Bis heute ist es nicht gelungen, eine allumfassende Lösung für dieses Problem zu finden. Neben den vielen bisher gefundenen experimentellen Ergebnissen zu dieser Fragestellung zeigte diese Studie folgende Resultate:
(1) AG1295 ein selektiver Inhibitor der Tyrosinkinase des PDGFR-ß, hat einen hemmenden Einfluss auf die Entwicklung der Transplantatvaskulopathie im Aortentransplantationsmodel der Ratte.
( Die Fläche der Neointima (Qint) nach 80 Tagen in der Gruppe 2 (AG 1295) war signifikant kleiner im Vergleich zur Gruppe 1 (Kontrolle) (p=0.042)).
(2) Ein Anstieg intimaler Expression von PDGFR-ß, wie er zu einem frühen Zeitpunkt (20 Tage) nach der allogenen Transplantation beobachtet wurde, war durch die Behandlung mit AG1295 abgeschwächt.
( Die intimale Antikörperfärbung mit PDGFR-ß nach 20 Tagen in der Gruppe 2 (AG 1295) war signifikant geringer im Vergleich zur Gruppe 1 (Kontrolle) (p=0.029)).
(3) Die lokale Freisetzung von einem polymeren Trägersystem kann ein
effektives Mittel sein, um die Ausbildung der Transplantatvaskulopathie zu verringern.
Diese Ergebnisse stützen die bisherigen Theorien, welche Wachstumsfaktoren im allgemeinen (Waltenberger 1997, Sterpetti 1999) und PDGF und seinem Rezeptor im speziellen (Hart 1997, Giese 1999) eine funktionelle Rolle in der Pathophysiologie der Transplantatvaskulopathie zuschreiben.
Die Wirkung des PDGF kann auf unterschiedliche Weise blockiert werden:
Durch Neutralisierung von PDGF mit einem polyklonalen Antikörper konnte die Akkumulation glatter Muskelzellen und die Ausbildung einer Neointima nach Ballondilatation bei der Ratte verhindert werden (Ferns 1991).
Ungeachtet ihrer hohen Spezifität sind monoklonale Antikörper in ihrer klinischen Anwendung nicht besonders geeignet, da sie eine parenterale Gabe erfordern und eine Produktion von Anti-Antikörpern auslösen können, was Ihre langfristige Anwendung limitiert (Hayry 1998).
Neuere Untersuchungen zeigten, dass es möglich ist, die Signalkaskade innerhalb der Zelle durch Blockierung von Tyrosinkinasen des Rezeptors zu inhibieren. Diese Gruppe von Enzymen gehört zur Familie der Onkoproteine und spielt eine entscheidende Rolle bei normalen sowie pathologischen proliferativen Prozessen zahlreicher Zellen, einschließlich der glatten Muskelzellen (Levitzki 1992).
Der zugrunde liegende Mechanismus beruht auf einer Einflussnahme der Dimerisation des Wachstumsfaktors, welche die Phosphorylisierung spezifischer Tyrosinmoleküle im Rezeptor einleitet. Dieser durch die Tyrosinkinase vermittelte Autophosphorilierungsprozeß initiiert eine Kette von Signalkaskaden, welche das initale Signal in den Zellkern weiterleiten. (Lemmon 1994).
Mittlerweile stehen Instrumente zur Verfügung, die die Aktivität der durch Tyrosinkinasen getriggerten Signalkaskaden inhibieren (Levitzki 1995, Buchdunger 1995). So wurde auf der Basis der Struktur natürlich vorkommender Inhibitoren eine Klasse von niedermolekularen Proteintyrosinkinaseinhibitoren synthetisiert und als Tyrphostine bezeichnet (die Namensgebung erfolgte im Hinblick auf die inhibitorische Wirkung der Phophorilierung der Tyrosine) (Levitzki 1992, Kovalenko 1994, 1997).
Bereits in früheren Arbeiten ließ sich zeigen, daß Tyrphostin AG1295 ein hochselektiver Blocker der Tyrosinkinase des PDGF-Rezeptors ist, obwohl aber in Anbetracht der großen Anzahl bekannter Proteinkinasen denkbar wäre, dass dieses Präparat auch Wirkung gegen andere Kinasen aufweist (Levitzki 1992, Kovalenko 1994, 1997).
In der vorliegenden Studie zeigte die lokale Behandlung mit Tyrphostin AG1295 eine deutliche Inhibition der Neointimabildung in den allogenen Aortentransplantaten (Gruppe 2). Dieses Ergebniss korrespondiert mit der Inhibition der intimalen Expression von PDGF-Rezeptor ß.
Ein ähnliches Ergebnissmuster zeigte sich in einer früheren Untersuchung, in der das Angioplastiemodell an der Rattencarotis verwendet wurde. Auch hier wurde die Downregulation des Rezeptors durch Behandlung mit AG1295 von einer Abschwächung der Neointimabildung begleitet (Fishbein 2000).
In unserer Untersuchung war diese Downregulation des Rezeptors reversibel, was sich durch eine ähnliche Färbeintensität ( für den Rezeptor ) zwischen behandelter Gruppe (Gruppe 2) und Kontrollgruppe (Gruppe 1) an Tag 80 zeigte. D.h. eine zunächst durch AG1295 abgeschwächte Rezeptorexpression nach 20 Tagen war nach 80 Tagen wieder angestiegen.
Somit erscheint wahrscheinlich, dass die Reduktion der Neointimabildung an Tag 80 eine Folge der frühen Inhibition der Tyrosinphosphorylation im Rezeptormolekül ist (Fishbein 2000).
Die Reduktion von SMA positiven Zellen, die wir in der Media der allogenen Gruppen beobachteten, steht im Einklang mit einer zuvor von Mennander beobachteten Reduktion von glatten Muskelzellen der Media während der Entwicklung der Transplantatvaskulopathie (Mennander 1993). Dieses erklärt auch eine Abnahme der Fläche der Media in den allogenen Gruppen im zeitlichen Verlauf (vom 20. zum 80. postoperativen Tag). Diese Beobachtung könnte im Zusammenhang mit einer CD8+ T-Lymphozyten induzierter Apoptose von glatten Muskelzellen stehen (Legare 2000, Vessie 2005).
Unsere Daten stützen diese Hypothese in soweit als wir einen Anstieg in der Färbeintensität für CD3+ T-Lymphozyten nach allogener Transplantation beobachteten, besonders ausgeprägt in der CD8+ T-Lymphozytensubpopulation.
Demnach könnte die merkliche Reduktion der SMA-Positiven Zellen, die wir in der Media der behandelten Transplantate (Gruppe 2) beobachteten, einer Kombination des antiproliferativen Effektes von AG1295 mit einer CD8+ T-Lymphozyten induzierten Destruktion der Media zugeschrieben werden.
Eine generelle Limitation dieser Beobachtungen begründet sich in der Tatsache, daß in der Ratte auch andere Zellen als die T-Zellen das CD8+ Antigen exprimieren ( z.B.
natürliche Killerzellen ).
Die Prädominanz von SMA positiven Zellen und die Färbeintensität für PDGF- Rezeptor ß, die wir in der Adventitia in allogen transplantierten Gruppen fanden, stimmt mit früheren Beobachtungen von Akyurek und Mitarbeitern , die ein ähnliches Transplantationsmodell verwendeten, überein.
Entsprechend ihren Ergebnissen beruht dieser Befund wahrscheinlich auf der PDGF-induzierten Migration von glatten Muskelzellen in die Adventitia (Akyurek 1996).
Die vorliegende Studie ist zwar die erste, die zeigt, dass eine kontrollierte lokale Freisetzung eines Tyrphostins von einer Trägermatrix die Proliferation glatter Muskelzellen, wie sie bei der Transplantatvaskulopathie beobachtet wird, inhibiert.
Das generelle Konzept der lokalen Freisetzung direkt am Transplantat ist allerdings nicht neu: Bolling und Mitarbeiter berichteten, dass mit Cyclosporin beschichtete Trägermatrizes, die bei Herztransplantationen von Ratten mit implantiert wurden, die akute allogene Abstoßung inhibierten (Bolling 1991).
In der jüngeren Vergangenheit wurden überdies mehrere Systeme zur lokalen Freisetzung von Medikamenten zur Verhinderung der Restenose nach Ballonangioplastie untersucht (Banai 1998, Fishbein 2000, Gottsauer-Werner 1997).
Die In vitro und In vivo Freisetzungskinetik von AG1295 von einer Trägermatrix , die in dieser Untersuchung benutzt wurde, zeigt ein nahezu lineares Profil, das mit einer Dosis von in etwa 40 µg/kg pro Tag entspricht. Somit sind circa 98% des Medikamentes (AG1295) 28 Tage nach der Implantation freigesetzt (Fishbein 2000).
Aus folgendem Grund ist die lokale Freisetzung von Medikamenten ein attraktives Konzept für die Prophylaxe der chronischen Abstoßung:
Angesichts dessen, daß die PDGF-Rezeptor ß Expression in interstitiellen Entzündungszellen und Endothelzellen positiv mit der akuten Abstoßung allogener Transplantate in der Ratte korreliert war und das die akute Abstoßung ein wichtiger Risikofaktor für das Auftreten der chronischen Abstoßung ist, wäre es sinnvoll während der kritischen frühen Phase nach Transplantationen eine hohe lokale Medikamentenkonzentration zu gewährleisten (Levitzki 1995, Lemström 1997).
Diese ist durch eine lokale Medikamentenfreisetzung zu bewerkstelligen, wodurch auch eine Metabolisation des Medikamentes vor Erreichen des eigentlichen Wirkungsortes umgangen wäre. Nach intramuskulärer oder intravenöser Gabe ist AG1295 dagegen schnell abgebaut (Golomb 1996 , 1997).
Im Vergleich zu anderen Modellen der Transplantatvaskulopathie (Mehta 1996, Armstrong 1997) bietet das heterotope Aortentransplantationsmodel der Ratte den Vorteil, dass es möglich ist ein einzelnes Gefäß in seinem gesamten Querschnitt zu untersuchen. Die Anbringung der Matrix um das transplantierte Gefäß ist sehr gut möglich und gewährleistet so einen engen Kontakt der Adventitia mit der Trägersubstanz. Bei der experimentellen Herztransplantation ist es dagegen vergleichsweise schwierig ein Koronargefäß über einen längeren Abschnitt auf die Ausbildung einer TVP zu untersuchen (Armstrong 1996). Klinisch könnten unterschiedliche Medikamente während der Transplantation in das Perikard appliziert werden. Da das Perikard eine relativ impermeable Grenzstruktur darstellt, ließe sich somit eine hohe Konzentration eines Medikamentes über einen längeren Zeitraum aufrechterhalten, welches länger auf die epicardialen Koronarien einwirken könnte (Sriram 2001).
Auch ist es beim Aortenmodell möglich die Wirkung der zu untersuchenden Substanz unabhängig von einem Immunsupressivum zu untersuchen (z.B. Cyclosporin A) welches nachweislich bereits einen hemmenden Einfluß auf die Neointimaausbildung (Adams 1992) und die Endothelzellzerstörung (Andriambeloson 2001) ausübt. Die Beschädigung der Endothelzellen scheint durch Abklemmen des Gefäßes, Gefäßanastomose, Ischämie und Reperfusion zunächst mechanisch bedingt zu sein, bei den allogenen Transplantaten kommt es jedoch zu einem zweizeitigen Verlust
der Zellen, welcher immun vermittelt zu sein scheint (Gohra 1995 , Bojakowski 2000).
Wichtig ist der zeitliche Ablauf in den einzelnen Gefäßkompartimenten. Die Untersuchung der Angioplastie an der Rattencarotis führte zur Definition von 3
„Wellen“ innerhalb der Neointimaausbildung (Schwartz 1995). Zunächst kommt es zu einer kompletten Zerstörung der Endothelzellen und einem extensiven Untergang der mediaständigen glatten Muskelzellen. Die erste Antwort auf die Zerstörung, genannt
„erste Welle“ besteht in einer Proliferation der glatten Muskelzellen und beginnt ungefähr 24 Stunden nach der Dilatation. Eine Inhibition dieses initialen proliferativen Ereignisses durch Unterbrechung des Zellzyklusses führt zu einer geringeren Ausdehnung der Neointima. Es konnte in mehreren Studien gezeigt werden, dass diese Zyklusunterbrechung nur in den ersten Tagen nach der Verletzung funktioniert und somit Einfluß auf die spätere Ausprägung der Neointimaausbildung hat (Sriram 2001, Schwartz 1995).
Die Wanderung der glatten Muskelzellen von der Media durch die Lamina elastica interna bezeichnet die „zweite Welle“. Bereits nach 4 Tagen lassen sich auf der luminalen Seite der Lamina elastica interna Muskelzellen nachweisen. Es ist nicht bekannt, wie lange die Migration dauert. Dabei hat PDGF einen hauptsächlichen Einfluß auf die Muskelzellmigration und nicht auf die Proliferation. Die Verabreichung von PDGF-BB führt zu einer 10 bis 20 fachen Zunahme der Muskelzellmigration, aber nur zu einer Verdopplung der Proliferationsrate.
Sind die Muskelzellen im Gefäßlumen angekommen, beginnen sie sich zu teilen.
Dieses kann Wochen bis Monate andauern und wird als „dritte Welle“ bezeichnet.
Die Untersuchung von Geraghty et al. (Geraghty 1996) zeigte, dass es innerhalb der
„dritten Welle“ zu einer Umwandlung des Phenotypes der Muskelzelle kommt. Ein Teil der kontraktilen Muskelzellen wandeln sich zu sekretorischen Muskelzellen um, bauen extracelluläre Matrix auf und stimulieren benachbarte kontraktile Zellen zur Umwandlung in sekretorische.
Die Rolle von PDGF bei der Verletzung des Gefäßendothels ist auch beim Pavian untersucht worden ( Giese 1999, Englesbe 2004). Hier zeigte sich ebenfalls zu
einem frühen Zeitpunkt nach der Verletzung eine Antikörperfärbung in der Intima.
Auffallend war, dass durch die Hemmung des Beta Rezeptors (Heldin 1992) die Neointimaausbildung reduziert werden konnte, eine Hemmung des Alpha Rezeptors dagegen hatte keinen Einfluß .
Zusammenfassend läst sich sagen :
1. AG1295 schwächt die Ausbildung der Neointima signifikant ab.
2. Die Expression des PDGF Rezeptors in der Gefäßwand wird durch AG1295 zunächst signifikant abgeschwächt, steigt später aber wieder an.
3. Eine Abnahme der glatten Muskelzellen in der Media geschieht durch Migration dieser Zellen in die Intima, hier entsteht eine Neointima.
5. Zusammenfassung
Bis zum heutigen Zeitpunkt ist die endgültige Pathogenese der Transplantatvaskulopathie nicht geklärt. Das Zusammenspiel von nicht immunogen und immunogenen Faktoren ist sehr komplex. Betrachtet man allein die große Anzahl an Wachstumsfaktoren, welche bei der TVP eine Rolle spielen ( Delafontaine 1999) wird es verständlich wie schwierig es ist alle in einer einzigen Studie zu berücksichtigen. Die von uns eingesetzte Substanz hat im Gegensatz zu anderen Proteinkinaseinhibitoren (Myllarniemi 1997, Sihvola 1999) den Vorteil hochselektiv nur die Kinase des PDGFR ß zu hemmen. So ist eine Einflussnahme auf andere Rezeptoren ausgeschlossen und es kann eine gezielte Untersuchung der Wirkung eines einzigen Rezeptors erfolgen. Auch ist die Wirksamkeit von AG 1295 im Restenosemodell (Fishbein 2000) bereits gezeigt worden.
Vor dem Hintergrund einer bereits erwiesenen Wirkung des Wirkstoffes in der Pathogenese eines vasoproliferativen Prozesses setzten wir AG 1295 erstmals experimentell bei einer Transplantation ein. Hinzu kam ein zweiter neuer Ansatz in dieser Fragestellung :
Die lokale Applikation des Wirkstoffes am Transplantat.
Dieses warf eine wenig untersuchte Fragestellung auf, denn betrachtet man die unterschiedlichen Applikationswege des AG1295 von endoluminal (Intima) (Fishbein 2000) und von perivasculär (Adventitia), so stellt sich die Frage, welches Kompartiment den wesentlichen Beitrag in der Pathogenese der Neointimabildung hat. Auch ist die Migration der Muskelzellen in die Intima und in die Adventitia beobachtet worden (Akyrek 1996). Der Mechanismus durch welchen Einwirkungen an der Adventita zu einer Intimahyperplasie führen ist nicht geklärt (Huehns 1996) aber Fibroblasten in der Adventitia scheinen ursächlich beteiligt zu sein (Satore 2001).
Sicherlich müssen die Ergebnisse, welche an diesem Modell gewonnen wurden kritisch betrachtet werden und können nicht einfach auf den Menschen übertragen werden. Dennoch erscheint ein lokaler Behandlungsansatz der Transplantatvaskulopathie mit entsprechenden Pharmaka vor dem Hintergrund der erhobenen Datensätze möglich.
6. Danksagung
Ich bedanke mich bei Herrn Professor Dr. Matthias Karck für die fachlich gute, geduldige und lange Betreuung der Arbeit, bei Herrn Dr. Rolf Meliss für die Einweisung und Unterstützung bei den immunhistochemischen Techniken, sowie bei Frau Dr. Marjukka Myllärniemi (Universität Helsinki) für die Anleitung der mikrochirurgischen Techniken.
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Lebenslauf
Michael Prokop
Geboren am 08.05.1972 in Celle
Studium
1994 bis 1996 an der Martin Luther Universität Halle Wittenberg 1996 bis 2000 an der Medizinischen Hochschule Hannover 2000 bis 2001 Kantonsspital Luzern (Schweiz)
Tameside General Hospital Manchester (England) Medizinische Hochschule Hannover
Ausbildung
2001 bis 2003 Klinik für Thorax-, Herz- und Gefäßchirurgie der Universität Mainz (Professor Oelert)
2003 bis 2005 Klinik für Hals-Nasen-Ohren-Heilkunde der Medizinischen Hochschule Hannover
(Professor Lenarz)
seit April 2005 Klinik für Hals-Nasen-Ohren-Heilkunde des Klinikums der Stadt Wolfsburg
(Dr. Vogt-Hohenlinde)
Forschungsaufenthalte und Vorstellung der Dissertationsarbeit an den Universitäten Helsinki und Jerusalem
Ergebnisse der Dissertation wurden in TRANSPLANTATION Vol. 74, 1335–1341, No. 9, November 15, 2002 veröffentlicht.
Anlage 2
Erklärung nach § 2 Abs. 2 Nrn. 5 und 6
Ich erkläre, dass ich die der Medizinischen Hochschule Hannover zur Promotion eingereichte Dissertation mit dem Titel Untersuchung zur Ausbildung der Transplantatvaskulopathie
unter lokaler Applikation eines Tyrosinkinaseinhibitors
im Aortentransplantationsmodel der Ratte in der Klinik für Thorax-, Herz- und Gefäßchirurgie
Medizinische Hochschule Hannover unter Betreuung von Professor Matthias Karck mit der Unterstützung durch Dr. Rolf Meliss ohne sonstige Hilfe durchgeführt und bei der Abfassung der Dissertation keine anderen als die dort aufgeführten Hilfsmittel benutzt habe.
Ich habe diese Dissertation bisher an keiner in- oder ausländischen Hochschule zur Promotion eingereicht. Weiterhin versichere ich, dass ich den beantragten Titel bisher noch nicht erworben habe.
Ergebnisse der Dissertation wurden/werden in TRANSPLANTATION Vol. 74, 1335–1341, No. 9, November 15, 2002 veröffentlicht.
Hannover, den 31.05.2006
MichaelProkop (Unterschrift)
8. Abkürzungsverzeichnis
CMV= Cytomegalie Virus
EVA = Ethylen-vinylacetat co-polymer HE = Hämatoxylin Eosin
HLA = Human leucocyte antigen
PDGF = Plateled-derived growth factor SMC = smooth muscle cell
TVP = Transplantatvaskulopathie
