Die Interaktion des NCoR/SMRT Repressor- Komplexes mit dem E8AE2C Protein humaner
Papillomviren führt zur Inhibition der viralen Replikation
Dissertation
der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Eberhard Karls Universität Tübingen
zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften
(Dr. rer. nat.)
vorgelegt von Marcel Dreer aus Albstadt
Tübingen 2016
Inhalt
1. Zusammenfassung...1
2. Einleitung... 2
2.1 Klassifizierung und Charakterisierung humaner Papillomviren... 2
2.2 Genomorganisation... 3
2.3 Lebenszyklus humaner Papillomviren... 3
2.4 Der virale Replikationsursprung...4
2.5 Das E1 Protein - die virale Helikase... 5
2.6 Das E2 Protein - ein Regulator der Transkription und Replikation... 7
2.7 Das E8AE2C Protein - Repressor der viralen Transkription und Replikation...7
2.8 Der NCoR/SMRT-Komplex... 8
2.9 Aufgabenstellung... 10
3. Material... 11
3.1 Geräte (Tabelle 1)... 11
3.2 Kleingeräte / Verbrauchsmaterial (Tabelle 2 ) ... 12
3.3 Fertige Reaktionssysteme (Tabelle 3)... 13
3.4 Enzyme... 14
3.5 Primäre Antikörper (Tabelle 4 ) ...14
3.6 Sekundäre Antikörper: (Tabelle 5 ) ... 16
3.7 siRNA (Tabelle 6)... 17
3.8 Gelelektrophoresemarker... 18
3.9 Medien und Puffer... 18
3.9.1 Puffer und Lösungen (Tabelle 7 ) ... 18
3.9.2 Medien für Bakterienkultur (Tabelle 8 )... 21
3.9.3 Medien für Zellkultur (Tabelle 9 ) ... 22
3.10 Bakterienstämme... 23
3.11 Eukaryotische Zellen (Tabelle 10)... 23
3.12 Oligonukleotide... 23
3.13 Plasmide und Vektoren...25
4. Methoden... 30
4.1 Herstellung kompetenter Bakterienzellen...30
4.2 Kultivierung von Bakterien zur Plasmidisolation...30
4.3 Präparative Plasmidisolation... 30
4.4 Messung der DNA-Konzentration...30
4.5 Transformation von DNA in kompetente Bakterien...30
4.6 Langzeitlagerung von Bakterien...30
4.7 Kulturbedingungen eukaryoter Zellen... 31
4.8 Einfrieren und Auftauen von Zellen... 31
4.9 Transfektion von Humanzellen mit siRNA für Immunblotanalyse...31
4.10 Transfektion von Humanzellen mit DNA für Luziferase-Reporter Assay, qRT-PCR und Immunblotanalyse... 31
4.11 Transfektion von Humanzellen mit siRNA und DNA für Luziferase-Reporter Assay, qRT-PCR und Immunblotanalyse... 32
4.12 Luciferase-Reporter Assay... 33
4.13 DNA-Standardmethoden... 33
4.14 Fragmentelution aus Agarosegelen... 33
4.15 Ligation von DNA-Fragmenten mit T4-DNA Ligase... 33
4.16 Hybridisierung von Oligonukleotiden zu doppelsträngiger DNA...33
4.17 Sequenzierung...34
4.18 DNA Isolation aus Eukaryotenzellen... 34
4.19 Dpnl Verdau zum Nachweis neu-replizierter DNA... 34
4.20 Quantitative Real-Time PCR (qPCR)... 34
4.21 Bestimmung der Reporterplasmidreplikation... 35
4.22 Gesamtzellextrakte zur Immunblotanalyse... 35 4.23 Herstellung nukleärer Extrakte zur Immunblotanalyse.
4.24 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)...
4.25 Transfer der Proteine auf eine Nitrozellulose-Membran (Western-Transfer)... 36
4.26 Immunologischer Nachweis transferierter Proteine... 36
4.27 (Ko-)lmmunpräzipitation... 36
4.28 Tryptischer Verdau der Proteine... 37
4.29 NanoLC-MS/MS Analyse... 37
4.30 MS Daten Verarbeitung und Analyse...38
4.31 Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP)...38
4.32 Indirekte Immunfluoreszenzanalyse von Proteinen... 39
4.33 „Proximity Ligation Assay“ (PLA)... 39
5. Ergebnisse...40
5.1 Die E8AE2C Proteine von HPV1 (Genus p) und HPV8 (Genus ß) agieren als Repressoren der viralen Replikation und Transkription... 40
5.2 HPV E8AE2C Proteine interagieren mit dem zellulären NCoR/SMRT Komplex...42
5.3 E8AE2C rekrutiert den NCoR/SMRT-Komplex in nukleäre Fokusse... 44
5.4 Der NCoR/SMRT-Komplex führt zur E8-vermittelten Repression der Replikation... 50
5.5 Der NCoR/SMRT-Komplex führt zur E8-vermittelten Repression der Transkription ....55
5.6 Der NCoR/SMRT-Komplex sorgt für die E8-vermittelte Repression der Transkription bei replizierenden viralen Genomen...57
5.7 Der NCoR/SMRT-Komplex hat keinen Einfluss auf die Histonacetylierung von replizierenden und nicht-replizierenden Reporterplasmiden...60
5.8 Der NCoR/SMRT-Komplex hat keinen Einfluss auf die Proteinmengen von E1/E2...62
5.9 Der NCoR/SMRT-Komplex hat keinen Einfluss auf die DNA-Bindung von E l und E2 64 5.10 E8AE2C vermittelt die Repression nicht über eine Manipulation von Brd4... 66
5.11 HPV31 E l wird posttranslational modifiziert... 69 5.12 E8AE2C vermittelt die Repression nicht über posttranslationale Modifikationen von E l
5.13 Massenspektrometrische Analysen deuten auf neue Interaktionspartner für HPV31
E 1... 73
5.14 Der „Proximity Ligation Assay“ bestätigt die Interaktion von HPV31 E1 mit zellulären Proteinen... 77
5.15 E8AE2C führt NCoR/SMRT-abhängig zum Verlust der Interaktionen von E l mit p80 und P o lo ... 80
6. Diskussion... 83
6.1 Die Interaktion des NCoR/SMRT-Komplexes mit den E8AE2C Proteinen phylogenetisch diverser HPV führt zur Repression der Replikation... 83
6.2 Die Repression der Replikation erfolgt unabhängig vom Grad der Histonacetylierung 85 6.3 Der NCoR/SMRT-Komplex hat keinen Einfluss auf die DNA-Bindung von E l und E2 86 6.4 Der NCoR/SMRT-Komplex hat keinen Einfluss auf E1-Acetylierungen... 86
6.5 Der NCoR/SMRT -Komplex verhindert die Ausbildung eines replikationskompetenten Komplexes...88
6.6 Schlusswort... 91
7. Literaturverzeichnis... 92
8. Abkürzungsverzeichnis... 106
9. Akademischer Lebenslauf...110
10. Publikationen... 111
11. Danksagung 112
