Synthese von Gd(II)-Komplxen für die molekulare MRI

Dissertation

Synthese von Gd(III)-Komplexen für die molekulare MRI

Zur Erlangung des Grades eines

Dr. rer. Nat.

dem Fachbereich II (Biologie/Chemie)

der Universität Bremen

vorgelegt

von

Dipl. Chem. Timo Dansauer

aus Bremen

2008

Für meine Eltern und meine Frau

1. Prüfer Prof. Dr. Dieter Leibfritz (Universität Bremen)

2. Prüfer Prof. Dr. Wolf-Dieter Stohrer (Universität Bremen)

Inhaltsübersicht

Inhaltsübersicht..……….. VIII

1.0 Einleitung……… 1

1.1 Einleitung……….………... 1

1.2 Grundlagen der MR und MR-Bildgebung………... 8

1.3 Zellmarkierungsansätze von Kontrastmitteln……….... 9

1.4 Phospholipide und Zellmembranen……… 9

1.5 Steroide………... 11

1.6 Hydrazinsubstrate………. 12

1.7 Polyfluorierte und Polytrifluormethylierte Verbindungen………... 13

1.8 Neurotransmitter……….... 13

2.0 Aufgabenstellung……….. 18

3.0 Material und Methoden……….………... 19

3.1 Adrenale Pheochromacytoma Zellen aus der Ratte(PC12)……….… 19

3.2 C6-Glioma Zellen aus der Ratte..………... 19

3.3 Zellexperimente und Zellaufarbeitung………...…….. 20

3.4 Agarosegelphantom……… 20

3.5 Eppendorff-Cup-Agarosegelphantom……….…...……….. 21

3.6 MR-Messungen am 4,7T Bruker Biospec Tier-Scanner……… 21

3.7 EPR-Messungen……….. 21

3.8 T1-Zeitbestimmung………..…… 22

3.9 T2-Zeitbestimmung………... 23

3.10 NMR-Kinetik von Bishydrazid-DTPA-Gd Komplexen…………..…….. 23

4.0 Ergebnisse und Diskussion………... 24

4.1 Bis-hydrazid-DTPA-Gd(III)-Komplexe……..………..….... 24

4.1.1 Bis-Phenylhydrazido-DTPA-Ligand und Gd-(III)-Komplex...…. 24

4.1.2 Bis-2,4-Dinitrophenylhydrazido-DTPA-Ligand und Gd(III)-Komplex……… 25

4.1.3 Diskussion der EPR-Spektren…………..……… 26 4.1.4 Bis-(tertbutyl-carbamoylhydrazido)-DTPA-Ligand und

Gd(III)-Komplex………..……….. 27

4.1.5 Bis-(Hydrazido)-DTPA-Gd(III)-Komplex………... 28 4.1.6 T1-Relaxationszeiten von

Bis-Hydrazid-DTPA-Gd(III)-Komplexen... 28 4.1.7 NMR-Kinetik von Gd(III)-DTPA-Bishydrazid-Komplexen………. 30 4.2 Polyfluorierte Bis-benzyl-DTPA-Gd(III)-Komplexe……… 33 4.2.1 Bis-(4-fluorbenzylamido)-DTPA-Gd(III)-Komplex……….…. 33 4.2.2 Bis-(3,5-trifluormethylbenzylamido)-DTPA-Gd(III)-Komplex…… 33 4.2.3 Bis-(3,5-trifluormethylbenzyl)-DTPA-diester Gd-Komplexes…… 34 4.2.4 1H- und 19F-T1-Zeit-Messungen der polyfluorierten

Gd-Komplexe……….. 35

4.2.5 Temperatureffekte des 19F-NMR-Signals von fluorierten

DTPA-Komplexen………..……….… 37

4.3 Allgemeine Synthese von Bis-Steroid-DTPA- und

TTHA-diester-Gd(III)-Komplexen………... 38 4.4 Bestimmung der T1-Zeiten von

Steroid-TTHA-diester-Gd(III)-Komplexen………... 41 4.5 MR-Experimente an C6-Zellen mit

Bis-Steroid-TTHA-Gd(III)-Komplexen. ………. 44

5.0 Synthese von

Bis-Phosphatidylethanolamido(DPPE)-DTPA-Gd(III)-Komplex und Bis-(DPPE)-TTHA-Ligand……….. 45

6.0 Synthese des Bis-Normorphinamido-DTPA-Gd(III)-Komplex…………... 47

6.1 T1-, T2-Relaxationzeiten des

Bis-Normorphinamido-DTPA-Gd(III)-Komplex………...………... 47

6.2 Zerfall des Bis-Normorphinamido-DTPA-Gd(III)-Komplexes in

Zellkulturmedium….……….………. 49 6.3 MR-Experimente an C6-Zellen inkubiert mit

Bis-(Normorphinamido)-DTPA-Gd(III)-Komplex………..………... 50

7.0 Synthese von Ligandensystemen, die auf Cyclen basieren (DO3A,

7.1 Umsetzung von DOTA-Me-Glycinamid mit

3,5-Bis-Trifluormethylbenzylamin………..……… 53

7.2 Umsetzung von DOTA-Me-Glycinamid mit Normorphin…………..…... 53

7.3 Umsetzung von DOTA-Methyl-Glycinamids mit DPPE……..…………. 54

7.4 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7-tris-essigsäure-tert-butylester (DO3A). ………... 54 7.5 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7-tris-essigsäure-tert-butylester-10-ethylalkohols... 55 7.6 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7-tris-essigsäure-tert-butylester-10-essigsäuremethylesters... 56 7.7 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7-tris-essigsäure-tert-butylester-10-essigsäure-tert-butylcarbamoylhydrazids (DOTA-Hydra-Boc)…... 56

8.0 Zusammenfassung und Ausblick……….……… 59

9.0 Experimenteller Teil……….. 66

9.1 Darstellung von DTPA-Bisanhydrid………..……… 66

9.2 Darstellung von TTHA-Bisanhydrid……….. 66

9.3 Allgemeine Synthese von Bis-Hydrazid-DTPA-Liganden………. 67

9.4 Allgemeine Synthese von Bis-Hydrazid-DTPA-Gd-Komplexen……... 67

9.5 Bis-Phenylhydrazid-DTPA-Ligand und Gd(III)-Komplex…………...… 68

9.6 Bis-(2,4)-Dinitro-phenylhydrazido-DTPA-Liganden und Gd(III)-Komplex...……… 69

9.7 Bis-tert-butylcarbamoylhydrazido-DTPA-Ligand und Gd(III)-Komplex...……… 70

9.8 Bis-hydrazido-DTPA-Gd-Komplex……… 71

9.9 Allgemeine Synthese von fluorierten bzw. trifluormethylierten Benzyl-DTPA-diester bzw. bisamid-Liganden... 71

9.10 Allgemeine Synthese von fluorierten bzw. trifluormethylierten Benzyl-DTPA-diester bzw. bisamid-Komplexen... 72

9.12 Bis-(3,5-Bis-Trifluormethylbenzylamido)-DTPA-Ligand und

Gd-Komplex……… 73 9.13 Bis-(3,5-Bis-Trifluormethylbenzyl)-DTPA-diester-Liganden………….. 74

9.14 Synthese vom

Bis-(3,5-Bis-Trifluormethylbenzyl)-DTPA-diester-Gd-Komplex... 75 9.15 Allgemeine Synthese von steroidsubstituierten

DTPA-diester-Liganden……… 75 9.16 Bis-(11,17,21-trihydroxy-pregn-4-en-3,20-dion-21)-DTPA-diester [Bis-Cortisol-DTPA-diester]……… 76 9.17 Bis-(11,21-dihydroxy-4-pregnen-3,20-dion-21)-DTPA-diester [Bis-Corticosteron-DTPA-diester]……….. 77 9.18 Bis-(9-Fluor-16-methyl-11,17,21-trihydroxy-3,20-pregnandion-21)-DTPA-diester [Bis-Dexamethason-DTPA-diester]……….. 78 9.19 Bis-(17,21-dihydroxy-4-pregnen-3,11,20-trion-21)-DTPA-diester [Bis-Cortison-DTPA-diester]……….. 79 9.20 Bis-(5-Androstan-3-ol-17-on-3)-DTPA-diester [Bis-Androsteron-DTPA-diester]……….. 80 9.21 Bis-(3-Hydroxy-5-Cholan-24-carbonsäure-3)-DTPA-diester [Bis-Lithocholsäure-DTPA-diester]…..………. 81 9.22 Bis-(5-Cholesten-3)-DTPA-diester [Bis-Cholesterin-DTPA-diester].. 82 9.23 Allgemeine Synthese von Steroid-DTPA-Gd(III)-diester Komplexen.. 83 9.24 Bis-(5-Cholesten-3)-DTPA-diester-Gd(III)-Komplexes [Bis-Cholesterin-DTPA-diester-Gd]……….. 83 9.25 Bis-(11,17,21-trihydroxy-pregn-4-en-3,20-dion-21)-DTPA-dieste-Gd(III)-Komplexes [Bis-Cortisol-DTPA-diester-Gd]... 83 9.26 Bis-(17,21-dihydroxy-4-pregnen-3,11,20-trion-21)-DTPA-diester-Gd(III)-Komplexes [Bis-Cortison-DTPA-diester-Gd]... 84 9.27 Bis-(3-Hydroxy-5-Cholan-24-carbonsäure-3)-DTPA-diester-Gd(III)-Komplexes [Bis-Lithocholsäure-DTPA-diester-Gd]... 84 9.28 Bis-(5-Androstan-3-ol-17-on-3)-DTPA-diester-Gd(III)-Komplexes [Bis-Androsteron-DTPA-diester-Gd]………. 84

9.29 Bis-(9-Fluor-16-methyl-11,17,21-trihydroxy-3,20-pregnandion-21)-DTPA-diester-Gd(III)-Komplexes

[Bis-Dexamethason-DTPA-diester-Gd]... 85 9.30

Bis-(11,21-dihydroxy-4-pregnen-3,20-dion-21)-DTPA-diester-Gd(III)-Komplexes [Bis-Corticosteron-DTPA-diester-Gd]... 85 9.31 Allgemeine Synthese von Bis-Steroid-TTHA-Liganden……… 85 9.32 Bis-(9-Fluor-16-methyl-11,17,21-trihydroxy-3,20-pregnandion-21)-TTHA-diester [Bis-(Dexamethason)-TTHA-diester]……… 86 9.33 Bis-(17,21-dihydroxy-4-pregnen-3,11,20-trion-21)-TTHA-diester [Bis-Cortison-TTHA-diester]………... 87 9.34 Bis-(17,21-dihydroxy-1,4-pregnadien-3,11,20-trion-21)-TTHA-diester [Bis-Prednison-TTHA-Bis-(17,21-dihydroxy-1,4-pregnadien-3,11,20-trion-21)-TTHA-diester]………..……… 88 9.35 Bis-(11,17,21-trihydroxy-pregn-4-en-3,20-dion-21)-TTHA-diester [Bis-Cortisol-TTHA-diester]……… 89 9.36 Allgemeine von Steroid-TTHA-Gd(III)-diester Komplexen……… 90 9.37 Bis-(9-Fluor-16-methyl-11,17,21-trihydroxy-3,20-pregnandion-21)-TTHA-diester-Gd(III)-Komplex [Bis-Dexamethason-TTHA-diester-Gd]……… 90 9.38 Bis-(17,21-dihydroxy-1,4-pregnadien-3,11,20-trion-21)-TTHA-diester-Gd(III)-Komplex [Bis-Prednison-TTHA-diester-Gd]………….. 91 9.39 Bis-(11,17,21-trihydroxy-pregn-4-en-3,20-dion-21)-TTHA-diester-Gd(III)-Komplex [Bis-Cortisol-TTHA-diester-Gd-Komplex]…………... 91 9.40 Bis-(17,21-dihydroxy-4-pregnen-3,11,20-trion-21)-TTHA-diester-Gd(III)-Komplex [Bis-Cortison-TTHA-diester-Gd]……….. 92 9.41 Synthese des

Bis-(Dipalmitoylphosphatidylethanolamido)-DTPA-Liganden. ……… 92

9.42 Synthese des

Bis-(Dipalmitoylphosphatidylethanolamido)-DTPA-Gd(III)-Komplexes……… 94

9.43 Synthese des

Bis-(Dipalmitoylphosphatidylethanolamido)-TTHA-Ligand….………... 94

9.44 Synthese des Bis-Normorphin-DTPA-bisamids……….. 96 9.45 Synthese des Bis-Normorphin-DTPA-bisamid-Gd-Komplexes……… 97

9.46 Synthese von -Cholesterylhydrazin……… 97 9.47 Synthese des

1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-N,N´,N´´-tris-essigsäure-tert-butylester (DO3A)... 98 9.48 Synthese des

1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-N,N´,N´´,-tris-essigäure-tert-butylester-N´´´-essigsäuremethylester (DOTA-OMe).. 99 9.49 Synthese von N-Tert-butyl-carbamoyl-N´-Bromacetylbishydrazid….. 100 9.50 Synthese des

1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-N,N´,N´´-tris-

essigsäure-tert-butylester-N´´´-essigsäure-tert-butylcarbamoyldihydrazid (DOTA-Boc-hydrazid)………... 101 9.51 Synthese des

1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7,-trisessigsäure-10-essigsäurehydrazids……….. 102 9.52 Synthese des

1,4,7,10-Tetraazacyclododekan-N,N´,N´´,-tris-essigsäure-tert-butylester-N-ethylalkohol………...…. 103 9.53 Synthese des Essigsäure-2-iodethylester... 104 9.54 Synthese des

1,4,7,10-Tetraazacyclododekan-N,N´,N´´,-tris-essigsäure-tert-butylester-N-ethylessigester……….. 104

10.0 Literatur……… 106

Verwendete Abkürzungen……….. I

Tabellen- und Abbildungsverzeichnis………. III

Geräteliste………... VI

Danksagung………... VIII

Lebenslauf……….. X

1.1 Einleitung:

Als Magnet Resonanz Tomographie (MRT) bezeichnet man Kernspin-Resonanz-Untersuchungen am Menschen, wobei der Begriff Tomographie aus den griechischen Wörtern „tomos“ Schicht und „graphein“ Schreiben zusammengesetzt ist. Die Magnet-Resonanz-Bildgebung wurde durch die Arbeiten von Lauterbur et al.

[1]

erstmals beschrieben.

Dieses bildgebende Verfahren basiert auf der Messung eines ortsabhängigen NMR-Signals. Die magnetischen Momente von NMR-aktiven Kernen werden mittels ortskodierter Gradientenfelder lokalisiert. Da Wasser in lebenden Organismen den größten prozentualen Anteil ausmacht, ist es sinnvoll das Protonensignal des Wassers zu messen. Andere NMR-aktive Kerne wie 13C, 31P und 19F können ebenfalls gemessen werden, spielen aber im im Vergleich zu wasserbildgebenden Verfahren eine untergeordnete Rolle.

Die Signalintensität und somit das Signal/Rausch-Verhältnis hängen von der Konzentration des beobachteten Kerns (Spindichte), der Feldstärke des äußeren Magnetfeldes, der natürlichen Häufigkeit des zu beobachtenden NMR-aktiven Kerns und vom gyromagnetischen Verhältnis des betreffenden Kerns ab. Im lebenden Organismus ist Wasser unterschiedlich stark verteilt. In den Knochen oder im Fettgewebe liegt weniger Wasser vor als im Blut oder in der Blase. Das erzeugte Abbild gibt diesen Zusammenhang wieder und zeigt die einzelnen Gewebetypen unterschiedlich stark hervorgehoben. Das ortsabhängige Wassersignal bzw. die Signalintensität wird von Relaxationsprozessen (T1- bzw. T2-Relaxation) beeinflusst

und ist nach Anregung zeitabhängig. Die chemische Umgebung (Fette, Proteine etc.) und die physikalische Umgebung (Temperatur, Diffusion etc.) des beobachteten Wassers beeinflusst die Relaxationszeiten der einzelnen Regionen, was für die Bildgebung genutzt wird.

Die Relaxationzeit des Wassers in der Umgebung eines paramagnetischen Kontrastmittels ist stark verkürzt. Koordinative Relaxationsagentien enthalten mindestens ein paramagnetisches Zentralion, wobei der Paramagnetismus mit der Anzahl an paramagnetischen Ionen ansteigt und in wässriger Lösung die Relaxationszeit stärker verkürzt wird.

Die Wirkung dieser Kontrastmittel in einer T1-gewichteten Bildgebung beruht auf

einer koordinativen Wechselwirkung der umgebenden Wassermoleküle mit dem paramagnetischen Zentralion. Der paramagntische Komplex liegt in Lösung

solvatisiert vor. Die Solvathülle wird in zwei Bereiche, die innere und äußere Solvatationssphäre unterteilt. Die direkte koordinative Wechselwirkung des Wassermoleküls ist keinesfalls starr, sondern dynamisch. Ein Austausch von Wassermolekülen der inneren Solvatationssphere mit der äußeren Sphere findet in Lösung ständig statt. Die Austauschzeiten der Wassermoleküle zwischen innerer und äußerer Sphere betragen wenige ps[2].

Die Metallionen der Übergangsmetalle, Lanthaniden und Actiniden besitzen ungepaarte Elektronen in den Valenzorbitalen, was ein großes magnetisches Moment zur Folge hat. Eine Einfachbesetzung aller d-Orbitale bzw. f-Orbitale führt zu einem magnetischen Moment. Die Elektronenkonfiguration des Zentralions als auch die Koordinationszahl des verwendeten Liganden beeinflussen die Art des beobachteten Kontrastes (T1- bzw. T2-). Metallionen mit einzelnen doppeltbesetzten

d- bzw. f-Orbitalen führen zu einer verstärkten T2-Relaxation des untersuchten Kerns.

Die magnetischen Momente der Wasserstoffatome im Wassermolekül werden durch eine dipolare Wechselwirkung zwischen den magnetischen Momenten der ungepaarten Elektronen der Metallionen beeinflusst, wodurch eine Abnahme der Signalintensität des Protonensignals des Wassers in Umgebung des paramagnetischen Kontrastmittels zu beobachten ist. Die T1-Zeit des Wassersignals

einer wässrigen Lösung eines Kontrastmittels ist Konzentrations- und Feldstärkenabhängig. Verallgemeinert lässt sich sagen, je größer die Konzentration an Kontrastmittel ist, desto kürzer ist die T1-Zeit des Wassers. Mit steigender

Konzentration an Kontrastmittel in einer wässrigen Lösung nimmt ebenfalls die T2

*-Zeit ab, was eine Linienverbreiterung der Signale bewirkt.

Die freien zwei- bzw. dreiwertigen Ionen der Übergangsmetalle [Mn, Fe][3] und Lanthanoide [Dy, Gd] sind toxisch, was für eine Anwendung als MR-Kontrastmittel eine thermodynamisch und kinetisch stabile Komplexierung durch Chelat-Liganden erforderlich macht. Im Juni 1988 wurde Magnevist® (Abb. 1) der Schering AG, als erstes T1-MR-Kontrastmittelchelatkomplex für die Anwendung zugelassen.

Der Ligand des Magnevist® ist DTPA (Dieethylentriaminpentaacetat), ein Polyaminocarboxylatsystem. Der Gd-Komplex des DTPA zeichnet sich in der Transmetallierungsreaktion gegenüber Zink-(II)-Ionen durch eine relativ hohe thermodynamische und kinetische Komplexstabilität aus. Das Konkurrenzprodukt Omniscan® (Abb. 1) der Firma Bracco Ltd. auch Gadolinium-DTPA-BMA (Diethylentriaminpentaessigsäure-bis-dimethylamid) genannt, besitzt im Vergleich

zum Gd-DTPA eine geringfügig größere Komplexstabilität [7]. Eine Freisetzung von Gd3+-Ionen im menschlichen Körper war bei niedrigen Verweilzeiten im menschlichen Körper nicht zu erwarten. Neuere Arbeiten belegen, dass bei Patienten mit akuter Niereninsuffizienz, das Kontrastmittel länger im Körper verbleibt und es zu schwerwiegenden Gd-Intoxikationen kommen kann [4].

N N N O O O O O O O O O O Gd3+ N N N O O O N O O N O O O Gd3+ CH3 CH3 CH3 C H3 N N N O O O O O O Gd3+ N O O N N N O O O O O O O O O O Gd3+ O P O H O 2- 0 Gd(III)-DTPA Gd-DTPA-BMA -Gd-DOTA

Abb. 1: Strukturen von zugelassen MR-Kontrastmitteln (von rechts nach links Magnevist®, Omniscan®, Dotarem®, MS-325®)

Gadolinium, in ungebundener ionisierter Form, ist stark neurotoxisch und interagiert irreversibel an Calcium-Ionen–Kanälen (Niere/Leber/Gehirn) [5, 6, 7].

Nach Gabe dieser Kontrastmittelkomplexe bleiben diese aufgrund ihrer hydrophilen Eigenschaften im Gefäßsystem und sind keinesfalls in der Lage die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden. Nach Injektion des Kontrastmittels steht ein definiertes Zeitintervall zur Verfügung, da die erwähnten Diagnostika schnell unverändert über die Nieren ausgeschieden werden (Beim Magnevist beträgt die Plasmahalbwertszeit 1,5h) [8]. Die spezifischen medizinischen diagnostischen Fragestellungen erfordern den Einsatz von selektiveren Kontrastmitteln, was eine entsprechende chemische Funktionalisierung der paramagnetischen MR-Kontrastmittel mit Biomelekülen nahe legt, um molekulare rezeptorvermittelte Prozesse mittels MR-Bildgebung sichtbar zu machen.

Diese biosensitiven Komplexe zeigen mit Hilfe der MR-Bildgebung idealerweise Ort und Quantität der Wechselwirkung in der Zelle bzw. im Körper an.

Die folgenden Verknüpfungen von Kontrastmitteln mit Biomolekülen werden zur Zeit intensiv untersucht:

- Polypeptide bzw. Proteine zur Darstellung der extrazellulären Signalübertragung, bei denen die Proteine selektiv an extracellulären Rezeptoren (Somastatin) binden. (Die Aufnahme durch Zellen erfolgt soweit bekannt über Exocytose

- Moleküle (chemische Sonden), mit denen chemische oder physikalische Parameter bestimmt werden können (Glucose-Konzentration, pH-Wert, Calcium-Konzentration, Temperatur)

- Lipophile Seitengruppen, die an Zellmembranen und Vesikeln von Zellen (Fettsäuren, Phospholipide) binden

- Chemisch modifizierte Liposome, die mit Kontrastmitteln beladen sind

Bei der Synthese wird der verwendete Chelatligand mit dem biologisch aktiven Molekül verknüpft, dann entschützt und anschließend mit Gadolinium in wässriger Phase komplexiert. Das verknüpfte Molekül enthält häufig selbst koordinationsfähige Gruppen, die mit dem Gadolinium wechselwirken können. Im ungünstigen Fall wird Gadolinium außerhalb des Chelat-Liganden labil gebunden und kann in späteren Experimenten das zelltoxische Gd3+-Ion freisetzen.

Ein dazu alternatives Konzept „pre loading concept“ kehrt die Reaktionsreihenfolge um, wobei zunächst die Komplexierungsreaktion von Chelat-Ligand und Gadolinium durchgeführt und nach Abtrennung und Reinigung das biologisch aktive Molekül an den Gd-Komplex gebunden wird.

Nach der Komplexbindung ist das biologisch aktive Molekül in seiner Beweglichkeit eingeschränkt (sterische Einflüsse, Zunahme des Molekulargewichts), was oft die Bindungsfähigkeit zum molekularen Ziel „Target“ verringert.

Für bildgebende MR-Experimente an Zellen ist eine hohe Konzentration an bioaktiven Komplexen und deren Zielstrukturen „Targets“ wünschenswert.

Befinden sich zum Beispiel an der Zelloberfläche (Taget) nur wenige Rezeptoren, so ist eine Bindung des Kontrasmittels zur Zielstruktur möglich, jedoch kann diese nicht beobachtet werden.

Aus diesem Grund wurden sehr viel effektivere Kontrastmittel mit mehrkernigen Gadolinium-Chelatkomplexen oder Eisenoxidpartikeln (PIO´s) entwickelt [9, 10].

Eine physikalische Größe für die Effektivität eines Kontrastmittels ist die Relaxivität (1/T1) des Wassers bezogen auf die Konzentration an Kontrastmittel (1 mmol/l).

Eine Übersicht zeigt den Stand der Entwicklung Ende 2007:

Gadolinium-DOTA- modifiziert mit einem Steroidhormon (RU486) 1, welches an Progesteronrezeptoren interagiert - Meade et al. [11].

N N N N Gd3+ O O O O O O O O N H S N H O N N H H OH 1

DOTA-Gd-Komplex mit zwei Zuckereineinheiten 2 mit - Andre et al. [12].

OAc OAc OH O AcO N H N N H O N O S O S OAc OAc OH O AcO N H N N N N O O O O O O Gd3+ O 2 111

In3+-DOTA- mit Somatostatin-Rezeptor-bindenden Polypeptid 3, der in vivo an Tumorzellen der Ratte binden konnte - Antunes et al. [13].

N N N N O O O O O O O X N H O N H N H O O N H NH N H O NH2 N H O O H O N H S S O N H O H O H 3

Dimerer DO3A-Gd(III)-Komplex mit DTPA-Einheit 4 als ein Ca2+ bzw. Zn2+-sensitives Kontrastmittel - Mishra et al. [14].

N N N N O O O O O O Gd3+ N H O N OH O N N N H O O O H O O H N N N N O O O O O O Gd3+ 4

DO3A-Gd(III)- mit einer FITC-Fluoreszenzgruppe 5, das die Zellmembran durchdringt - Mishra et al. [15]. O N N N N O O O O O O Gd3+ N H S N H O OH O H O 5

DO3A-Gd p-Nitrophenol 6, macht pH-Werte in Titrationen zugänglich - Woods et al.

[16] . N N N N OH O2N O O O O O O Gd3+ 6

MS-325®ein seit 2006 zugelassenes lipophiles Kontrastmittel 7 für die Leberbildgebung [17]. N N N O O O O _O O Gd3+ O O O O O P O O H 7

Ein liposomales MRI Kontrasmittel 8, das ein Phospholipid(DPPE)-Molekül enthält und Micellen ausbilden kann - Grant et al. [18

N N N _N H O O O O _O O P O O O O O C₁₅H₃₁ O C₁₅H₃₁ O H O Gd3+ O O O 8

Gd-DTPA-Kontrastmittel 9, die mit Phosphorlipidmicellenmembranen wechselwirken können - Parac-Vogt et al. [19

N O N H O O N N H O N O O O O Gd3+ O O O O R R C₁₄H₂₉ C16H33 C₁₈H₃₇ Tetradecyl R= Hexadecyl Octadecyl ₉

DOTA-Gd(III)- Polyarginin 10 markiert 3T3-Zellen und wird in das Cytosol transportiert- Allen et al. [20, 21].

N H N H NH N H2 N H O O N N N N O -O O -O -O O OH O Gd3+ NH NH N H₂ 10

DOTA-Gd- Galactose 11 detektiert die Genexpression in Xenopopus laevis In vivo - Louie et al. [22]. OR OH O O OH N N N N O -O O -O -O O Gd3+ C H3 OH 11

Vierkerniger Gadolinium-(III)-DO3A-Komplex 12 - Jebasingh et al. [9] N N N N N N N N N N N N N N N N O O O O O O O O O O O O O OO O O O O O O O O O Gd3+ Gd3+ Gd3+ Gd3+ 12

Die gezeigten Moleküle enthalten als Chelat-Liganden meist das DOTA-System (1,4,7,10-Tetraazacyclododekan-N,N´,N´´,N´´´-tetraessigsäure bzw. DO3A-System (1,4,7,10-Tetraazacyclododekan-N,N´,N´´-triessigsäure) mit Gadolinium als Zentralion. Diese Liganden liefern thermodynamisch und kinetisch stabilere und damit weniger toxische Komplexe als die offenkettige DTPA-Struktur. Durch Funktionalisierung des Liganden kann der Gd-Koplexes länger im im Organismus verweilen, was bezüglich der Stabilität hohe Anforderungen stellt.

1,4,7,10-Tetraazacyclododecan und größere heterocyclische Verbindungen wurden erstmals 1954 von Stetter et al. [23, 24] beschrieben, aber erst 1976 von Stetter et al.

[25]

mit Chloressigsäure zum 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-N,N´,N´´,N´´´-tetraessigsäure (DOTA) alkyliert. Weitl et al. [26] berichten über den N,N´,N´´,N´´´-Tetrakis-(2,3-Dihydroxybeozoyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan-Liganden und deren Actiniden-(IV)-Komplexe im besonderen die Plutonium (IV)-Komplexe.

Die effektive Komplexierung von Radionukliden durch DOTA-Liganden ist für die SPECT-Bildgebung (Single Photon Emission Computer Tomography) bzw. PET-Bildgebung (Positronenemissionstomographie) als auch für eine Strahlentherapie von Tumorerkrankungen von großer Bedeutung. [13, 27, 28]

NMR-spektroskopische Untersuchungen an Lanthanoid DOTA-Komplexen wurden 1980 von Desreux et al. [29] durchgeführt.

1.2 Grundlagen der MR bildgebenden Verfahren (MRI)[30, 31]

In MR-bildgebenden Verfahren nutzt man den überlagernden Effekt von ortsabhängigen und sich zeitlich veränderbaren Gradientenfeldern G mit dem statischen Magnetfeld B0. Die xy-Komponenten des effektiven Magnetfeldes B0eff und

des entsprechenden Signals hängt somit von der Schaltung der Gradienten ab. Wirkt das Gradientenfeld während einer frequenzselektiven Anregung (mittels eines frequenzselektiven HF-Pulses), so wird nur eine definierte Schicht, die senkrecht zum Gradientenfeld steht, angeregt.

Die Schaltung eines Gradienten während der Signalaquisition (Frequenzkodierung), führt zu Spins mit ortsabhängig definierten Resonanzfrequenzen, die in Gradientenrichtung detektiert werden. Eine ortsabhängige Phaseninformation der Spins kann bei Schaltung des Gradientenfeldes G zwischen Anregungspuls und Aquisition erreicht werden (Phasenkodierung).

Die gemessene NMR-Signalintensität hängt von verschiedenen physikalischen Größen ab, i.e. Spin-Dichte , longitudinale Relaxationszeit T1, transversale

Relaxationszeit T2, effektive tranversale Relaxationszeit T2* und Temperatur T u.a.m.

Diese signalintensitätsbestimmenden Größen können vielfältig zur diagnostischen Bildgebung (Kontrastierung) genutzt und ortsabhängig bestimmt werden, wobei das nichtinvasive Messverfahren und die nicht vorhandene Strahlenbelastung die eigentlichen Vorteile der MRI ausmachen.

1.3 Zellmarkierungsansätze von Kontrastmitteln

In den folgenden Abschnitten wird auf die in dieser Arbeit verwendeten Verbindungen eingegangen. Die besonderen Eigenschaften sind für spätere Zellmarkierungsexperimente essentiell.

1.4 Phospholipide und Zellmembranen

Die Zellmembran besteht zu einem sehr hohen Anteil aus lipophilen Bestandteilen wie Phospholipiden und Cholesterin, welche sich in Lösung spontan zu einer Lipiddoppelschicht organisieren können. Phospholipide enthalten eine hydrophile polare Kopfgruppe (Phosphoethanolamin, Phosphoinostol, Phosphoserin, Phosphocholin etc.) und mindestens eine lipophile Seitengruppe (Fettsäuren mit einer C-Atomanzahl zwischen 14 und 24) und werden in Phosphoglyceride, Sphingomyeline und Glycolipide unterteilt.

Die ausgebildete Doppelschicht (Abb. 2) stellt eine Barriere für polare Substanzen und Ionen dar. Viele Proteine befinden sich in der Zellmembran, die an unterschiedlichsten Signaltransduktionsprozessen und Transportprozessen durch die Membran (Ionenkanäle, Substratcarrier etc.) beteiligt sind. Unter den Phospholipiden

stellen Dipalmitoylphostatidylethanolamin (DPPE) und Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) die Hauptbestandteile der Zellmembran dar.

O P O O O _OH O NH₂ O O O P O O O _OH O N+ O O O P O O O _OH O NH₂ O O COOH Dipalmitoylphosphatidylethanolamin Dipalmitoylphosphatidylcholin Dipalmitoylphosphatidylserin

Abb.2 Phospholipidstrukturen und der schematische Aufbau einer Lipid-Doppelschicht[91]

Die Selbstorganisation zur Lipiddoppelschicht ist auf Dispersionskräfte zwischen den Alkylseitenketten zurückzuführen, wobei die polaren Reste in den intra- und extrazellulären Raum zeigen. Phosphorlipide werden als Transportsysteme (Vesikel) zum markieren von Zellen bereits genutzt. Gd-Kontrastmittel oder Eisenoxidpartikel[34] (PIO), welche allein nicht in der Lage sind in die Zelle zu gelangen, werden zu einer wässrigen Suspension von Phospholipiden gegeben und mittels einer thermischen und einer Ultraschallbehandlung in beladene Vesikel überführt. Die mono-Verknüpfung an der zentralen Carboxy-Gruppe des DTPA mit einem Phospholipid (DPPE) wurde von Grant et al. [18] bereits beschrieben. Dieses monosubstituierte Phosphotidylamido-DTPA-Ligandensystem wurde mit Gadolinium-(III)-trichlorid zum Gd-DTPA-Komplex umgesetzt. Die in dieser Arbeit aufgeführte Auftragung der Relaxivitäten zur jeweiligen Konzentration des Mono-Dipalmitylphosphatidylamido-DTPA-Gd(III)-Komplexes in Wasser zeigt keinen linearen Anstieg, was auf Micellenbildung hindeutet. Die Ausbildung von Micellen konnte mittels elektronenmiskroskopischer Aufnahmen bestätigt werden.Parac-Vogt et al. [19] berichten 2006 über die Synthese einer Gd-DTPA-bisamid-Kontrastmittelsubstanzklasse (siehe Einleitung Verbindung 9), welche in

DPPC-Micellenmembranen einlagern kann. Die Micellengrößen wurden mittels eines Laser-Scattering-Microscop bestimmt und statistisch ausgewertet. Micellenbildende DOTA-Gd(III)-Komplexe sind in dem Patent von Cockbrain et al. [97] beschrieben.

1.5 Steroide

Steroide spielen in der belebten Natur eine wesentliche Rolle, so ist beispielsweise das Cholesterin als ein wesentlicher Bestandteil von Zellmembranen und als Ausgangssubstanz essentiell für die Biosynthese aller Steroidhormone (Gestagene, Androgene, Glucocorticoide, Mineralocorticoide, Östrogene) und Gallensäuren[61, 91]. Alle zuvor genannten Steroidklassen mit Ausnahme der Gallensäuren sind Botenstoffe in den vielfältigsten Bereichen. Glucocorticoide fördern die Gluconeogenese und den Glycogenaufbau und regulieren den Fettsäure- bzw. Proteinabbau [34]. Zunächst soll hier auf die Corticoide eingegangen werden. Das in

Abb. 3 mit Struktur dargestellte Hydrocortison (Cortisol) wird in der Nebenniere

erzeugt, und spielt eine Rolle als Botenstoff bei Entzündungsprozessen und Stress.

O OH O OH OH H H H 2 3 4 1 10 5 6 7 9 8 12 11 13 14 15 16 17

O

O

H

_H

H

OH

OH

O

H

Abb. 3 Konformation und Nummerierung des Hydrocortisons

O O O OH OH H H H O O O OH OH H H H O O H O OH OH H H H O O H O OH H H H O O H O OH F H H OH O H H H H O H H H H OH O H HO H H O H H H H O

Prednison Cortison Hydrocortison(Cortisol) Corticosteron Dexamethason verwendete Corticoide

Andere verwendete Steroide

Cholesterin Lithocholsäure _Ergosterin Androsteron

Die in Abb. 4 gezeigten Strukturen wurden zur Funktionalisierung der DTPA- bzw. TTHA-Liganden eingesetzt. Bei einem Vergleich der Strukturen ist zu erkennen, dass bei den Glucocorticoiden immer das gleiche Grundfragment vorhanden ist. Sie bestehen aus einem Steranringsystem, das in Position 3 eine Carbonyl-Gruppe trägt. Die Anzahl der Doppelbindungen im Ring A variiert, während die Hydroxy-Carbonyl-Einheit gebunden an C17 immer vorhanden ist. Die tertiäre OH-Gruppe in Position-C17 ist für eine Rezeptorbindung nicht zwingend notwendig. Zwei ähnliche molekulare Corticoid-Rezeptoren werden dabei unterschieden, der Corticoid-Typ-I- sowie der Mineralocorticoid-Typ-I-Rezeptor.

Die Bindungsaffinität und auch Bindungsspezifität zum Mineralo- bzw. Glucocorticoid-Rezeptor hängt von der Hydroxygruppe in Position C10 bzw. C17 und der Anzahl der Doppelbindungen in Ring A ab. Im Corticoid Dexamethason ist in C9-Position ein Fluoratom eingeführt worden und in C9-Position C16 befindet sich eine Methylgruppe. Corticoide werden medizinisch bei Autoimmunkrankheiten (Asthma, Neurodermitis, Psoriasis, Allergien) eingesetzt. Nach einer Bindung eines Corticoids an einen Mineralocorticoid-Rezeptor (MR) wird der K+-Ionen Haushalt in C6-Zellen beeinflusst [34-36]. Nach de Kloet et al. [36] findet die Überwindung der Blut-Hirn-Schranke über Endothelzellen statt, die das Multidrug-resisstance-P-Glycoprotein mdr-PGP) besitzen, was anhand von Tritium markierten Dexamethason nachgewiesen werden konnte. In der im Jahr 2007 erschienenen Arbeit von Piwien-Pilipuk et al. [38] wird berichtet, dass sich der MR-Rezeptor nicht in der Zellmembran befindet, sondern im Cytoplasma und nach Bindung des Agonisten sehr schnell in den Zellkern gelangt.

In den Arbeiten von Kumar et al. [39, 40] wird der Einfluss von Corticoiden auf C6 Zellen beschrieben. In Proteinessays wurde dabei eine eindeutige Überexprimierung der Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase festgestellt.

1.6 Hydrazin-Substrate

Die Darstellung von DTPA-bisamid-Komplexen und DTPA-Diester-Komplexen ist in der Literatur im Gegensatz zu Hydrazid-Ligandensystemen hinreichend beschrieben. Die Hydrazid-Bindung ist von der Hydrolysestabilität vergleichbar mit der von Säureamiden und kann nur im stark Sauren gespalten werden. Ein zugelassenes Kontrastmittel ist das Gadophrin® der Schering AG. Bei diesem Kontrastmittel sind zwei DTPA-Mono-hydrazid-Einheiten mit einer Porphyrin-Einheit verknüpft [41].

NH NH O N N N O O O O O O O O Gd3+ N H N H O N N N O O O O O O O O Gd3+ N N H N N H O O

Abb. 5 Struktur des Gadophrins®[41]

Die Möglichkeit der Verknüpfung von Biomolekülen an Ligandensysteme mittels einer Hydrazid-Bindung ist somit möglich. Biologisch aktive Hydrazin-Verbindungen, wie die Substanzklassen der Hydrazinopyridazine (Prizidilol, Hydralazin) und Nikotinsäurealkylhydrazide besitzen pharmakologische Eigenschaften, die therapeutisch genutzt werden bzw. wurden.

N N H O N H N N NH N H₂ Iproniazid Hydralazin

Abb. 6 Strukturen pharmakologisch aktiver Hydrazinverbindungen

Iproniazid (Abb. 6) ist ein Monoaminooxigenase-(MAO)-Inhibitor und wurde bei Depressionen eingesetzt. Hydralazin wird bei akuter Hypertonie eingesetzt, wobei die Wirkungsweise noch weitgehend unbekannt ist. Burton-Pye et al. [43] berichten 2005 über ein Hydralazin-Derrivat, welches an ein DO3A-Ringsystem verknüpft wurde (Abb. 7). Folgend wurden Lanthanoid(III)-Komplexe dargestellt und deren Fluoreszenzeigenschaften untersucht. N N N N O O O O O O N N N N Eu3+ [42] N H OO NH OMe MeO OMe NH NH N H NH O N O N N N O O O O O O O O Gd3+ N N O O O O O O O O Gd3+ [43]

T. N. Parac-Vogt et al. [43] berichten über einen zweikernigen verbrückten DTPA-Gd(III)-Komplex der mittels Hydrazid-Bidungen an ein symmetrisches Trägermolekül verknüpft wurde (Abb. 7). Dieser mehrkernige Gd(III)-Komplex besitzt eine große Wasseraustauschrate und eine hohe Relaxivität.

1.7 Polyfluorierte und polytrifluormethylierte Verbindungen

Der paramagnetische Einfluss von Lanthanoid-Komplexen auf NMR-aktive Kerne wie

19

F, 31P mit großem gyromagnetischem Verhältnis ist nach Literaturrecherchen bisher selten beschrieben. Relaxationsuntersuchungen an, mit dem Isotop 17O, 2H angereichertem Wasser (H217O, D2O) sind zwecks Bestimmung der Austauschraten

von Inner-sphere zu outer-sphere Wassermolekülen durchgeführt worden. Gong et al. [47] berichten über den T1-verkürzenden Einfluss von Gd-DTPA (Magnevist®) auf

Trifluoressigsäure, welche durch eine koordinative Wechselwirkung des Trifluoracetats zum Gd3+-Zentralion ausgelöst wird. In einem Patent von Platzek et al.

[48]

wird über polyfluorierte DO3A-Gd-(III)-Komplexe berichtet, welche nach einer Abstandgruppe „Spacer“ eine polyfluorierte Seitenkette tragen. Die gesamte Substanzklasse (Abb. 8 gezeigt) ist patentgeschützt.

R1 kann ein Wasserstoff sein, eine lineare oder verzweigte Alkylseitenkette C1-C10 oder eine Hydroxy- bzw. Polyhydroxyalkylkette R2 entspricht CH2-CH(OH)-CF3, CH2

-C(OH)(CH3)-CF3, CH2-CH(OH)-C(CF3)3,

CH2-CH(OH)-CH2-OC(CF3)3

M entspricht einem dreiwertigen Ion mit den Ordnungszahlen 21-29, 42, 44 oder 57-83

Abb. 8 Polyfluorierte DO3A-Alkyl-Derrivate für die 19F-Tomographie[47]

1.8 Neurotransmitter

Die Signaltransduktion (Reizleitung) findet zwischen den einzelnen Neuronen im Gehirn über Botenstoffe die sog. Neurotransmitter im synaptischen Spalt statt. Die Synapse ist die Verbindungsstelle zwischen zwei Neuronen. Jedes Neuron besitzt durchschnittlich 3-4 Synapsen und ist demzufolge mit drei bzw. 4 weiteren Neuronen verbunden. Im Gehirn sind ca. 1011 Nervenzellen vorhanden. Dies verdeutlicht die

N N N N O O O O O O n OH R1 R1 R1 R2 M

Dimension eines sehr komplexen Systems, das durch Botenstoffe und Rezeptoren gesteuert wird. Bestimmte Neurotransmitter übernehmen dabei spezifische Aufgaben der Reizleitung an bestimmten Rezeptoren. Die Neurotransmitter werden in bestimmte Klassen eingeteilt.

Catecholaminerge Neurotransmitter Tryptaminerge Neurotransmitter Aminosäuren bzw. Derivate Cholinerge Neurotransmitter Peptid Neurotransmitter Cannabinoide Dopamin NH2 O H OH Serotonin N H NH2 O H -Aminobutansäure O OH N H2 Acetylcholin O N + O Met-Enkephalin Tyr-Gly-Gly-Phe-Met Arachidonsäure-glycinamid NH O O O H Phenylethylamin NH2 Melatonin N H N H O C H3 O Glutamat O OH N H₂ OH O Leu-Enkephalin Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu Arachidonsäure-2-hydroxyethyl-amid NH O OH Adrenalin R=CH3 Noradrenalin R=H N H R OH O H OH N-Acetyl-aspartat O OH O OH NH O

Tab. 1 Wichtige Neurotransmitter für die Signaltransduktion im Gehirn[49 ,91]

Bestimmte Substanzen greifen in die Neurotransmitter Reizleitung ein (Tab. 1). Dies kann an den spezifischen Bindungsstellen (Rezeptoren), in der Biosynthese bzw. in der Ausschüttung der Neurotransmitter erfolgen. Unter den rezeptorbindenden Substanzen werden Agonisten und Antagonisten unterschieden. Äußerst effektive Agonisten mit hohen Rezeptoraffinitäten sind dabei in Pflanzen und Tieren zu finden (Alkaloide). Viele rezeptoraktive Substanzen sind exogen (z.B. Amphetamine) und kommen im lebenden Organismus nicht vor. Um die Wirkungsweise dieser Substanzen zu verstehen, ist es wichtig diese Substanzen mit den natürlichen Neurotransmittern strukturell zu vergleichen. In Tab. 2 sind natürliche und synthetische Substanzen dargestellt, die an den entsprechenden Wirkorten (Tab.1) interagieren. Die Bindungsspezifischen Strukturmerkmale sind soweit bekannt rot dargestellt.

Catecholaminerge Substanzen Tryptaminartige Alkaloide GABA (I)- bzw. NMDA/Glutamat (II) Rezeptor Acetyl-Cholin-Rezeptor Opiate Cannabinoide Mescalin NH2 O O O Lysergsäureamid NH N O N H2 (I) - Hydroxybutter-säure (GHB) O OH O H Succinylcholin O N + O O OH Morphin O N O H OH H (THC) O H H OH DMMA N H O O Harmin N H N O (II) Ibotensäure N H2 _ON O O OH Atropin N H O O OH Phencyclidin N Cannabidiol H H OH O H Myristicin O O O Psilocybin N H N O P O H O O H (I) Muscimol N H2 _ON O Pethnidin N O O Cannabinol O H H OH Ephedrin N H OH Ibogain N N H O H (I) Diazepam N N O Cl Fentanyl N O O N

Tab.2 Neuorotransmitter Rezeptor Agonisten mit den bindungsspezifischen Strukturfragmenten soweit bekannt in rot dargestellt[48]

Im Falle der Opiat-Rezeptor-aktiven, dopaminergen und serotonergen Agonisten ist ein Strukturfragment immer wieder zu erkennen. Bei den Opiaten ist es ein in der Konformation eingeschränktes sechsgliedriges aliphatisches N-heterocyclisches System, das immer ein konformatorisch starres Phenylpropylamin bzw. Phenylethylaminfragment trägt. Die Catecholamine besitzen ebenfalls ein Phenylethylamin-Grundgerüst, das im Gegensatz zu dopaminergen Agonisten am -C-Atom bzw. --C-Atom mit einer Methyl- oder Hydroxyl-Gruppe funktionalisiert ist. Am Phenylring befinden sich häufig in 3,4,5-Position Methoxy-Gruppen, die für eine verstärkte Rezeptoraffinität sowie eine erhöhte Bioverfügbarkeit und Resorption verantwortlich sind. Der Metabolismus von Myristicin wird in der Arbeit von Beyer et al. beschrieben, wobei das Myristicin an der Doppelbindung in E-Position aminiert wird und das neugebildete Dopamin(Amphetamin)-Derivat den eigentlichen Wirkstoff darstellt [27]. Diese Amphetamin-Derivate wurden mittels gaschromatographisch

gekoppelter Massenspektroskopischer Messungen im menschlichen Urin nachgewiesen.

In den abgebildeten serotonergen Agonisten ist immer eine Tryptamineinheit vorhanden, die meistens am Aminstickstoff alkyliert ist.

In der Arbeit von Duval et al. [28] wird die Ankopplung von Naltrinidol, eines synthetischen Opiats, an die Ligandensysteme DO3A bzw. DOTA mittels verschiedener Alkylamino- bzw. Alkylaldehyd-Abstandsgruppen mit variierender Kettenlänge beschrieben. Die erhaltenen Komplexe sind in der Lage an -opioid Rezeptoren zu binden. [28] N O OH N H OH C H2 N N N N O O O O O O In 111 3+ n N O OH N H OH C H2 nN H N N N N O O O O O O In 111 3+ O n n

Abb.9 Von Duval et al. beschriebene opiatfunktionalisierte 111In-Komplexe (rechts)

sowie autoradiographische Abbilder von Mäusegehirnen (links)[28]

Die Komplexierung mit dem Radioisotop 111Indium verlief in der besagten Arbeit von Duval et al. erfolgreich, sodass die Verbindungen mittels Autoradiographie in vitro an Mäusegehirnen getestet wurden. In vivo Untersuchungen verliefen jedoch mangels Durchgang durch die Blut-Hirn-Schranke und des raschen Abbaus in der Leber erfolglos. Das Ergebnis der in vitro autoradiographischen Untersuchungen war eine starke Anlagerung der opiat-funktionalisierten 111In-DOTA bzw. DO3A-Komplexe in striatialen und corticalen Hirnregionen. Zudem wurde eine starke Bindung des Komplexes im Hypocampus und schwach im Hypothalamus, sowie in den Colliculi beobachtet. [28](siehe Abb.9)

2.0 Aufgabenstellung:

Die Darstellung neuer DTPA, TTHA und DOTA Kontrastmittel für die Markierung von Zellen ist das Ziel dieser Arbeit, wobei mit biologisch aktiven Leitstrukturen wie Steroiden, Neurotransmittern aber auch mit lipophilen Substanzen (Phospholipiden) gearbeitet wurde. Die Charakterisierung der hergestellten Verbindungen erfolgt mittels zweidimensionaler hochaufgelöster NMR-Verfahren und der Massenspektrometrie.

Außerdem werden die MR-Eigenschaften mittels Spin-Echo- und Inversion Recovery Sequenzen in ausgewählten Fällen bestimmt. Die kinetische Stabilität bei einigen synthetisierten Verbindungen soll in NMR-Langzeitmessungen durchgeführt werden. Die Affinität dieser Verbindungen zu den Zielrezeptoren wird in Zellexperimenten an PC12-(Pheochromocytoma)-Zellen und C6-(Glioma)-Zellen durchgeführt.

3.0 Material

und

Methoden

3.1 PC12 adrenale Pheochromocytoma Zellen aus der Ratte

PC12-Zellen wurden freundlicherweise von Frau Prof. Richter Landsberg (Universität Oldenburg) zur Verfügung gestellt. Die Zellen wurden in RMPI 1640 Medium mit 10% Pferdeserum und 5% Kälberserum sowie 100 Einheiten Penicillin/Streptomycin und 2mmol/l Glutamin auf Sarstedt Cell+® für leicht adhärente Zellen kultiviert. Passagiert wurden die Zellen nach dem Absaugen durch Spülen mit frischem Medium mit anschließender Zentrifugation bei 1200U/min. Dabei erwies sich die Kultur der PC12-Zellen als schwierig, da die PC12-Zellen nur ein bis zwei Passagen auf diesen Schalen wuchsen. Die Kulturschalen wurden aus diesem Grund mit Rattenschwanzkollagen (30μg/cm2) beschichtet, was aber nicht zur verbesserten Kultur dieser Zelllinie führte. In flüssigem Stickstoff wurden die Zellen in 70% Medium, 20% FCS, 10% DMSO eingefroren und gelagert.

3.2 C6-Glioma Zellen aus der Ratte

Die eingefrorenen Zellen der 6. Passage wurden nach dem Auftauen schnellstmöglich in DMEM (Dulbeco´s modified Eagle Medium) mit 5% FCS (Fötales Kälberserum), 2mmol/l Glutamin und 100 Einheiten Penicillin/Streptomycin überführt. Nach der Zentrifugation der Zellsuspension bei 1200U/min für 4 Minuten, wurde das überstehende Medium vorsichtig abgesaugt. Die Zellen wurden in 10ml frischem Medium resuspendiert. Im Anschluß wurden die Zellen in mit 6ml Medium befüllte 10cm Nunc Surface® Kulturschalen ausgesät. Die Kultur der Zellen erfolgte im Brutschrank bei 37°C und 10%CO2. Nach 3-4 Tagen waren die Schalen konfluent

bewachsen und wurden passagiert. Das Medium wurde abgesaugt und die Schalen mit 2ml einer Trypsin/EDTA Lösung für 5-10 Minuten bei 37°C / 10%CO2 inkubiert

und im Anschluss durch mehrfaches Spülen von der Oberfläche gelöst. Die erhaltene Zellsuspension wurde in ein 50ml Zentrifugenröhrchen mit 20ml frischem Kulturmedium gegeben. Nach Zentrifugation bei 1200U/min für vier Minuten wurde der Überstand abgesaugt und das Zellpellet in Zellkulturmedium resuspendiert und anschließend erneut ausgesät. Die überschüssigen Zellen wurden in einer Lösung bestehend aus 70% DMEMMedium, 20% Fötales Kälberserum, 10% DMSO bei -86°C für 12 Stunden eingefroren und anschließend in einem Zelltank bei -196°C in flüssigem Stickstoff gelagert.

3.3 Zellexperimente und Zellaufarbeitung:

Die Inkubation der C6-Glioma-Zellen wurde in DMEM-Kulturnedium und 5% FCS sowie 100 Einheiten Penicillin/Streptomycin und Glutamin auf Nunc-Surface® Schalen durchgeführt. Die Zellen wurden von 12-24h inkubiert, wobei das Medium verschiedene Endkonzentrationen des Gd-Komplexes enthielt.

Folgende Rechnung ist dabei sehr wichtig:

Auf einer konfluenten Schale befinden sich im Schnitt ca. 107 Zellen, die mit einem Volumen von 7ml Medium überschichtet sind. Wie ist also der Konzentrationsbereich für die Inkubation des Kontrastmittels zu wählen? Diese Frage lässt sich beantworten, wenn die Teilchenzahl/Zelle errechnet wird. Bei Endkonzentrationen zwischen 5-50μmol/l sind somit theoretisch 3,011×1012-3,011×1013 Teilchen pro Zelle vorhanden. Aber nicht jedes dieser Teilchen wird an der Zelle binden, da nur eine begrenzte Anzahl an Bindungsstellen vorhanden ist und sich ein Großteil des Kontrastmittels im Medium befindet. Weiterhin kann das Kontrastmittel unspezifisch an der Zelle binden, was durch intensive Waschschritte der Zellen wieder rückgängig gemacht werden soll. Die Inkubationszeit als auch die Konzentration ist so zu wählen, dass keine toxischen Effekte zu erwarten sind. Die Zeitdauer wurde somit für alle Inkubationen auf 12 Stunden bei 10% CO2/37°C begrenzt. Häufig wurde als

lösende Komponente Dimethylsulfoxid zugesetzt, wobei darauf geachtet wurde, dass 0,1-Vol-% nicht überschritten wurden, da DMSO das Aufnahmeverhalten von Zellen sehr stark verändert [31].

3.4 Agarosegelphantom

In einer Kulturschale (Ø=5cm) wurden 3ml einer heißen wässrigen Lösung bestehend aus 1,6% Agarose und 0,9% NaCl gefüllt. Nach Abkühlen und Aushärten des Gels wurden mit einer Standbohrmaschine vier 5mm tiefe Löcher in das Agarosegel gebohrt. Die inkubierten Zellen wurden nach dem Waschen mit Medium und PBS-Puffer mit 100μl Medium überschichtet und blasenfrei mittels einer Mikroliterpipette in die Bohrungen pipettiert und mit Medium aufgefüllt. Das Phantom wurde anschließend mit heißer Agar-Lösung überschichtet. Das Medium der überschichteten Zellen verfärbte sich innerhalb von 30Minuten gelb. Da diese Phantomart trotz des Verschließens mit Parafilm sehr schnell austrocknete, beziehungsweise das Medium in das Agarosegel diffundierte

und die Zellen innerhalb einer Stunde trocken lagen, wurde das folgende abgewandelte Agarose-Gel-Phantom entwickelt:

3.5 Eppendorff-Cup-Agarose-Gel-Phantom

Die zentrifugierten gewaschenen Zellen wurden nach dem Absaugen des Überstandes mit 1ml Medium überschichtet und anschließend resuspendiert. Die erhaltene Zellsuspensionslösung wurde in ein 1ml Eppendorff Cup´s überführt und in einer Epperdorff-Cup-Zentrifuge 5 Minuten bei 1200U/min zentrifugiert. Die zentrifugierten mit Zellen befüllten Eppendorff Gefäße wurden mittels Haushaltskleber, vorsichtig ohne die Zellpellets aufzuwirbeln auf einen PVC-Kunststoffträger um das Agarfüllloch herum befestigt. Der Träger wurde in ein auf 5cm gekürztes 100ml Becherglas gestellt. Nun wurde eine 60°C warme frisch bereitete 1,6% Agar-Lösung in 0,9% NaCl-Lösung durch das Befüllloch luftblasenfrei mittels einer Messpipette vollständig eingefüllt.

Abb.10: Schematischer Aufbau eines Eppendorff-Cup-Agarose-Gel-Phantom

3.6 MR-Messungen am 4,7T Bruker Biospec Tier-Scanner

Das Phantom wurde auf einem Träger befestigt und im Resonator (Sende und Empfangsspule) ausgerichtet. Nach Feineinstellung des Resonators in Bezug zum Phantom („Shimmen“, „Matching“ und „Tuning“) wurde der 90°- und 180°-Pulswinkel bestimmt und die Empfängerverstärkung („Receiver Gain“) eingestellt. Es wurde ein Testbild erstellt (Localizer), anhand dessen der Messbereich (Field of View FOV) möglichst exakt eingestellt wurde. Jetzt wurden Messungen mit verschieden Pulssequenzen, unterschiedlichen Auflösungen und Schichtdicken durchgeführt.

3.7 EPR-(electron paragnetic resonance) Messungen

Die X-band EPR Spektren vom Bis-(phenylhyrazido)-DTPA-Gd- und Bis-(2,4-Dinitrophenylhydrazido)-DTPA-Gd-Komplex wurden an einem Bruker EMX Spektrometer aufgenommen, das mit einer Temperiereinheit ausgestattet ist.

Die Signalpositionen wurden unter Verwendung von internen Magnetfeld-Markern gemessen, die von einem NMR-Gaussmeter erzeugt wurden. Die magnetische Feldmodulation betrug dabei 100 kHz (peak-to-peak Amplitude | 3G). Die EPR-Spektren wurden an einem IBM® Computer unter Verwendung eines Programms, welches am STUBA entwickelt worden ist, zusätzlich simuliert.

3.8 T1-Zeitbestimmungen

Die Bestimmung der T1-Zeiten wurden mit der Inversion-Recovery-Pulssequenz

durchgeführt:

Abb.11: Verwendete Pulsequenz für Inversion Recovery Messungen

Es wurden 1mmol konzentrierte Lösungen in bidest. Wasser mittels der Inversion-Recovery-Sequenz (Abb. 11) ohne Deuteriumlock bei 4,7T (200MHz), 8,46T (360MHz) und 14,1T (600MHz) an einem CH-Dual-Kopf bzw. TXI-Probenkopf gemessen. Es wurde zunächst auf den FID (Freien Induktionsabfall) bzw. auf das Integral des Wassersignals geshimmt. Anhand der Pulssequenz in Abb. 11 ist zu erkennen, dass nach dem 180°X-Puls ein Gradient g0 (t=1ms) geschaltet ist, welcher

restliche transversale Magnetisierung dephasiert. Diese modifizierte Puls-Sequenz führte zu einer verbesserten Phase des Wassersignals auch bei kurzen Inversionszeiten. Nach jeder Messung wurde eine Wartezeit d1=12s (entspricht für reines Wasser (bei 8,4T) ca. vier T1-Zeiten) eingehalten. Die Auswertung der

Messung erfolgte mittels Integration der gemessen Wassersignale zur jeweiligen Inversionszeit W. Das Integral des ersten Messwertes bei W=10s wurde auf -1000 Flächeneinheiten normiert und in Bezug zu den Integralen der Messungen bei größeren Inversionszeiten gesetzt. Die 19F-Inversion-Recovery-Messungen wurden ohne Lock mit einem QNP-Probenkopf bei 8,46T an einer 1mmol/l konzentrierten Lösung von Kontrastmittel in Wasser ohne Schaltung des Gradienten durchgeführt. Die Bestimmung der T1-Zeiten erfolgte mittels halblogarithmischer Auftragung

(Matlab 6.0.5).

gº 180°x 90°x

 d1

3.9 T2-Zeitbestimmungen

Im Falle des Bis-Normorphin-DTPA-Gd(III)-bisamid-Komplexes wurde die T2-Zeit des

Wassersignals einer 1mmol/l Lösung 4,7T (200MHz) mit einem HC-Dual-Probenkopf mit dem Hahnschen-Spin-Echo-Experiments bestimmt. Zwischen den Einzelmessungen wurde ebenfalls 4T1–Zeiten abgewartet, um Verfälschungen der

T2-Zeiten durch Restmagnetisierung aus vorangegangenen Scans zu vermeiden. Die

Bestimmung der T2-Zeit erfolgte mittels halblogarithmischer Auftragung (Matlab

6.0.5).

3.10 NMR-Kinetik von Bishydrazid-DTPA-Gd-Komplexen

Die Stabilität der erhaltenen Hydrazid-DTPA-Gd(III)-Komplexe wurde unter Anwendung eines von Laurent et al. [51] entwickelten Verfahrens untersucht. Die in dieser Arbeit beschriebenen kinetischen Experimente wurden in ihrer Durchführung dahingehend geändert, dass das Reaktionsgemisch im Spektrometer bei 37°C ständig verblieb.

Eine 2,5mmol/l Gd(III)-Komplex Lösung wurde in Phosphatpuffer (pH=7) gelöst und bei T=37°C gemessen. Nach Bestimmung des exakten 180°-Pulses wurde mittels Inversion Recovery die T1-Zeit des Wassers bestimmt. Dieser Wert diente als

Startwert der Gesamtmessung. Anschließend wurde 1μl einer 250mmol/l-ZnCl2

-Lösung zu den bereits im NMR-Röhrchen vorliegenden 999μl Kontrastmittellösung in Phosphatpuffer zugegeben. Daraus ergibt sich eine Endkonzentration von 2,5mmol/l an Zink2+-Ionen. Die Lösung wurde gut durchmischt und die Zeitmessung augenblicklich danach gestartet. Alle zwei Stunden wurde der Pulswinkel des 180°X

-Pulses aufgrund des während der Transmetallierungsreaktion ausgefallenen GdPO4

überprüft bzw. korrigiert. Die zunehmende Signalbreite des Wassersignals ist auf das ausgefallene GdPO4 zurückzuführen. Da das Löslichkeitsprodukt des gebildeten

GdPO4 sehr klein ist, ist eine Beeinflussung der T1-Zeit durch in Lösung befindliches

Gadolinium kaum gegeben, jedoch ist ein systematischer Fehler zu berücksichtigen, da der Einfluss des paramagnetischen GdPO4 auf die T1-Zeit des Wassers nicht Null

ist. Bei den von Laurent et al. [51] durchgeführten kinetischen Messungen wurde vom auftretenden Gd-(III)-PO4-Niederschlag abgetrennt.

4.0 Ergebnisse und Diskussion

4.1 Bishydrazid-DTPA-Gd(III)-Komplexe

Die Herstellung von Bis-hydrazid DTPA-Ligandensystemen ist aufgrund der Bifunktionalität der Hydrazine sinnvoll. Eine sterisch nicht zu anspruchsvolle Funktionalisierung am -Stickstoff besitzt einen geringen Einfluss auf die Nukleophilie, weshalb am -Stickstoff trotz Funktionalisierung am -Stickstoff Alkylierungen vorgenommen werden können.

Zunehmende sterische Hinderung der Substituenten am Beispiel von DTPA-Bisamid-Gd(III)-Komplexen führt zu labileren Komplexen im Vergleich zum Gd-DTPA [51]. Dies liegt am höheren Substitutionsgrad der Bisamid-Komplexe und der damit labileren Koordination der Amid-Bindungen im Vergleich zur Carboxylat-Gruppe. Die eingeführte Hydrazid-Gruppe enthält trotz Abschwächung der koordinativen Wechselwirkung zum Zentralion eine zusätzliche Koordinationsstelle (-Stickstoff). Diese zusätzliche Koordinationsstelle kann zu einer Stabilitätserhöhung führen. Die Darstellung von Bis-Hydrazid-Ligandensystemen aus DTPA-Bisanhydrid verlief aufgrund der größeren Nukleophilie der Hydrazine im Vergleich zu den Aminen äußerst effektiv, was sich in den verkürzten Reaktionszeiten, sowie in der niedrigeren Reaktionstemperatur zeigte. Einige Hydrazin-Verbindungen werden oder wurden als Arzneimittel eingesetzt, was potentielle Umsetzungen von Hydrazinen mit DTPA-Bisanhydrid interessant macht.

4.1.1 Bis-Phenylhydrazido-DTPA-Ligand und Gd-(III)-Komplex

N H NH2 O N N N O OH O O O O O N N N O OH O O N H N H NH N H O OH O OH N N N O O O O N H N H NH N H O O O O Gd3+ + 2

Die Umsetzung von DTPA-bisanhydrid mit Phenylhydrazin in trockenem Dimethylformamid (DMF) führte zur Zielverbindung bestätigt durch 1H- und 13 C-NMR-Spektroskopie. Auch nach mehreren Waschschritten mit Chloroform und Acetonitril war immer noch DMF nachweisbar. Umkristallisationsversuche aus verschiedenen protisch polaren organischen Lösungsmitteln scheiterten.

Die Verbindung wurde anschließend mit GdCl3×6H20 komplexiert und der

4.1.2 Bis-2,4-Dinitrophenylhydrazido-DTPA-Ligand und Gd(III)-Komplex N H NH2 NO2 NO2 O N N N O OH O O O O O N N N O OH O O N H N H NH N H O OH O OH NO2 O2N NO2 NO2 N N N O O O O N H N H NH N H O O NO2 O2N NO2 NO2 O O Gd3+ + 2 357,32 g/mol C₁₄H₁₉N₃O₈ 198,14 g/mol C6H6N4O4 753,60 g/mol C₂₆H₃₁N₁₁O₁₆ 907,85 g/mol C₂₆H₂₈GdN₁₁O16

Die Reaktionsführung war bis auf die Reaktionsdauer analog zur Synthese des Bis-phenylhydrazido-DTPA-Liganden. Der Grund hierfür ist in dem sterischen und elektronischen Einfluss der Nitrogruppen auf die Nukleophilie des -Stickstoffs zu sehen. Da das 2,4-Dinitrophenylhydrazin ein Molekül Kristallwasser enthält und dieses sehr schwer zu entfernen ist, wurde das im Vergleich zum Produkt stark untergeordnete monosubstituierte Produkt beobachtet. Das Produkt war ein leuchtend gelber amorpher Feststoff mit geringer Löslichkeit in Wasser, was nach entsprechender Charakterisierung eine Komplexierung in einer Ethanol/Wasser Mischung erforderte. Bei der Komplexierung trat eine starke pH-wertabhängige Farbveränderung von gelb (pH-Bereich 1,8-2,5) über hellrot (pH-Bereich 2,5-4) zu dunkel violett (pH-Bereich 4-7) auf. Nach dem Entsalzen mittels Festphasenextraktion (QMA-Patrone Waters) wurde ein gelber Feststoff erhalten, der in ESI-MS-Spektren als Produkt identifiziert wurde. Das Dimere als auch das Radikal wurden nicht im ESI-MS-Spektrum beobachtet. Zur Erklärung der beschriebenen Farbänderung während der Komplexierung kommen folgende Möglichkeiten in Betracht.

1.) N-Pikryl-N´,N´-diphenylhydrazin [46] ist mittels PbO2 Chloroform zum Radikal

oxidierbar. Das gebildete Radikal ist als Feststoff über Jahre hinweg stabil.

R N O N H H NO2 NO2 R N O N H NO2 NO2 R N O N H C NO2 NO2 R N O N H C NO2 NO2 [Ox]

2.) Am E-Stickstoff ist ein Proton gebunden, welches durch den Einfluss der beiden Nitrogruppen acide ist und deprotoniert werden kann. Das gebildete Anion ist resonanzstabilisiert, wobei die Nitrogruppen an der Delokalisation der negativen Ladung beteiligt sind. Ein Push-Pull-Effekt führt zu einer starken Farbveränderung die pH-Wert abhängig ist.

R N O N H H NO2 NO2 R N O N H _NO 2 NO₂ R N O N H _NO 2 NO₂ -+B --HB

N-Oxid-DTPA-Gd-Radikalkomplexe sind in der Literatur beschrieben und deren paramagnetische Eigenschaften charaterisiert [45]. Um eine genauere Aussage zwecks Klärung der Farbveränderung während der Komplexierung treffen zu können, wurden zwei Hydrazid-DTPA-Gd(III)-Komplexe am STUBA (Slovenská technická univerzita v Bratislave) freundlicherweise von Herrn Dr. Marian Valko mittels Elektronenspin Resonanz Spektroskopie (EPR) untersucht.

4.1.3 Diskussion der EPR-Spektren

Das Gd3+-Ion hat eine 4f7 Elektronenkonfiguration (S7/2). Die gemessenen und

simulierten EPR-Spektren sind in Abb.12 dargestellt. Der Spin-Hamilton-Operator des Gd3+-Ions lautet:

»¼ º «¬ ª _{   }  ( 1) ( ) 3 1 _{2 2} 2 y x z S S E S S S D BgS H

E

g ist der g-Tensor, D und E sind die zero-field splitting (ZFS) Parameter. Oben

genannte Gleichung kann unter Berücksichtigung der Störungstheorie entsprechend der zwei Bedingungen angewendet werden:

1) Eine starke Zeeman-Wechselwirkung (Erster Teil in obiger Gleichung) und ein schwaches Kristallfeld des Gadolinium-Ions führt zu BgS >> D, E, woraus ein breites Signal um g = 2 im EPR-Spektrum resultiert [53].

2) Im Falle eines starken Kristallfeldes des Gadolinium-Ions gilt; D, E >>

BgS [54].

Das freie Gd3+-Ion besitzt die achtfache Spin-Entartung (S = 7/2). Das starke Kristallfeld spaltet diese Energieniveaus in vier zweifach entartete Energieniveaus auf. Das Zeeman-Feld beseitigt diese Entartungen. Eine Konsequenz ist die Möglichkeit des Elektronenübergangs der ungepaarten Elektronen zwischen diesen Energieniveaus, welches zu zusätzlichen Signalen bei g >> 2.00 und g < 2.00 führt. Signale bei niedrigem Feld befinden sich bei g = 3,44 und werden in den EPR-Spektren beider Verbindungen beobachtet.

Die Spektren wurden unter Anwendung des zero-field splitting Parameters D simuliert.

0 2000 4000 6000 8000

simulation experiment

Magnetic Field (Gauss)

Abb. 12: Das EPR-Spektrum vom Bis-(2,4-Dinitrophenylhydrazido)-DTPA-Gd-Komplex zusammen mit der computergestützten dform-Simulation. Mit den EPR-Parametern g(eff) = 2.001, D = 370 Gauss, Lorentz/Gauss = 1, spektralen Bandbreite von: Bx = 900 Gauss, By = 850 Gauss, Bz

= 570 Gauss.

Als Ergebnis bleibt festzuhalten, dass die EPR-Messung dieser beiden Gadolinium-DTPA-Hydrazid-Komplexe im Festkörper (Abb. 12) sehr ähnliche, ja fast identische Spektren ergab und keine Radikale beobachtet wurden und dies für eine Deprotonierung am E-Stickstoff spricht. Über einen ähnlichen pH-wertabhängigen Farbeffekt wird ebenfalls in der Arbeit von Woods et al. berichtet, in der ein p-Nitrophenol-DO3A-Gd(III)-Komplex vorgestellt wird [16] Die Lösung des ebenfalls beschriebenen Ytterbium-(III)-Komplexes zeigte eine starke Farbänderung, die zudem mit einer Änderung der Relaxivität des Wassersignals bei pH-Wertänderung im MR-Experiment einhergeht.

Dieser Effekt ermöglicht eine pH-Wertmessung durch MR-Bildgebung anhand des beobachteten T1-Kontrastes.

4.1.4 Bis-(tertbutyl-carbamoylhydrazido)-DTPA-Ligand und Gd(III)-Komplex

N H _NH 2 O O O N N N O OH O O O O O N N N O OH O O N H N H NH N H O OH O OH O O O O N N N O O N H N H NH N H O O O O O O O _O O O Gd3+ + 2 357,32 g/mol C14H19N3O8 132,16 g/mol C5H12N2O2 621,65 g/mol C24H43N7O12 775,90 g/mol C24H40GdN7O12 DMF/60°C/2h/N2 GdCl3/NaOH/H2O

Die Zielverbindung wurde analog zur Synthese des Bis-(Phenylhydrazido)-DTPA-Liganden dargestellt. Mehrmals durchgeführte intensive Waschschritte des

Produktes mit Chloroform, Acetonitril und Ether führten nicht zur Abtrennung des Lösungsmittels DMF, was als Verunreinigung in den 1H- und 13C-NMR-Spektren zu beobachten war. Umkristallisationsversuche blieben erfolglos, aufgrund der unzureichenden Löslichkeit des Liganden in organischen Lösungsmitteln. Der Ligand ist in bipolaren Lösungsmitteln bzw. protisch polaren Lösungsmitteln löslich. Die folgende Komplexierung ergab das Produkt als weißen Feststoff in guter Ausbeute.

4.1.5 Bis-(Hydrazido)-DTPA-Gd(III)-Komplex N N N O O N H N H NH N H O O O O O O O O O O Gd3+ N N N O O N H N H NH₂ N H₂ O O O O O O Gd3+ TFA /H₂O/i-Pr₃SiH/ 0°C/ 30min

-2 -2 CO₂ 775,90 C24H43GdN7O12 573,66 C14H24GdN7O8

Diese Zielverbindung ist als Bishydrazid bifunktionell und als Synthesebaustein für das „pre-Loading“-Konzept von Interesse. Da dieser Komplex nukleophil ist, sollte er beispielsweise mit Ketonen, Carbonsäuren, Aldehyden, Phosphorhalogeniden zu oligomeren Gadoliniumkomplexen reagieren. Der Syntheseweg über ein geschütztes monofunktionelles Hydrazid ist nötig, da bei der Reaktion des DTPA-Bisanhydrids mit wasserfreiem Hydrazin eine Polymerisation einsetzt. Die Darstellung dieser Koordinationsverbindung erwies sich als sehr schwierig und wurde unter variierenden Bedingungen (Temperatur, Mischungsverhältnis der Lösung bestehend aus Trifluoressigsäure/Triisopropylsilan/Wasser, Reaktionszeit) mehrmals durchgeführt. Nach Aufarbeitung wurde ein farbloses Öl beobachtet, dass sich nicht zur Kristallisation bringen ließ. ESI-Massenspektren zeigten die partielle Abspaltung der BOC-Schutzgruppen, als auch die Bildung der vollentschützten Zielverbindung. Eine weitergehende Untersuchung dieses Komplexes wurde nicht vorgenommen.

4.1.6 T1-Relaxationszeiten von Bis-Hydrazid-DTPA-Gd(III)-Komplexen

Die Bestimmung der T1-Zeiten wurde durch halblogarithmische Auftragung von ln((I0

-I_W)/ I0) zur Inversionszeit W durchgeführt. Die Steigung der erhaltenen Geraden

entspricht der negativen Relaxivität –R1. Mit MatLab 6.0.5 wurden Linearfits

T1 (4,7T)[ms] T1 (8,5T)[ms] T1 (14,1T)[ms] Bis-(phenylhydrazido)-DTPA-Gd 188,0±14 Bis-(phenylhydrazido)-DTPA-Gd 284,2±1,9 Bis-(phenylhydrazido)-DTPA-Gd 313,5±1,5 Bis-(tert-butylcarbamoyl-hydrazido)-DTPA-Gd 309,7±4,1 Bis-(tert-butylcarbamoyl-hydrazido)-DTPA-Gd 335,9±3,4 Bis-(tert-butylcarbamoyl-hydrazido)-DTPA-Gd 346,8±2,0 Bis-(2,4-dinitrophenylhydrazido)-DTPA-Gd 66,4±1,3 Bis-(2,4-dinitrophenylhydrazido)-DTPA-Gd 70,0±1 Bis-(2,4-dinitrophenylhydrazido)-DTPA-Gd 71,1±0,7

Tab.3 T1-Zeiten der dargestellten Bis-Hydrazid-DTPA-Gd(III)-Komplexe in H2O bei

verschieden Feldstärken N N N O O O O N H N H NH N H O O O O Gd 3+ O O O O N N N O O O O N H N H NH N H O O O O Gd3+ O O O O N N N O O O _O N H N H NH N H O O O O Gd3+ O O OO N N N O O O _O N H N H NH N H O OO O Gd3+ O2N O2N NO2 NO2 N N N O O O _O N H N H NH N H O O O O Gd3+ O2N O2N NO2 NO2 N N N O O O _O N H N H NH N H O O O O Gd3+ O2N O2N NO2 NO2 N N N O O O O N H N H NH N H O OO O Gd3+ N N N O O O O N H N H NH N H O O O O Gd3+ N N N O O O _O N H N H NH N H O O O O Gd3+ Gd

Die gemessenen T1-Zeiten nehmen für die einzelnen Komplexe mit größerer

Feldstärke zu. Die bestimmten Werte sind bei gleicher Feldstärke mit denen von bereits in der Literatur beschriebenen DTPA-Bisamid-Gd(III)-Komplexen vergleichbar.

Die beiden untersuchten gleichkonzentrierten wässrigen Lösungen des Bis-Phenylhydrazido-DTPA-Gd(III)- und des Bis-tert-butylcarbamoylhydrazido-DTPA-Gd(III)-Komplexes besitzen ähnliche Relaxationseigenschaften, was auf ähnliche sterische und elektronische Substituenteneinflüsse schließen lässt. Erkennbar ist, dass das 2,4-Dinitrophenylhydrazin-Derivat die T1-Zeit des Wassers im Vergleich zu

den anderen beiden Hydrazid-DTPA-Gd-Komplexen stark verkürzt.

Der Einfluss der Substituenten wird in Transmetallierungskinetiken deutlicher, die die beobachtete starke T1-Zeitverkürzung im Falle des

Bis-(2,4-Dinitrophenylhydrazido)-DTPA-Gd(III)-Komplexes erklären werden. (s. 4.1.7)

4.1.7 NMR-Kinetik von Gd(III)-DTPA-Bishydrazid-Komplexen

Hydrazine sind bifunktionell, die nach Reaktion mit dem DTPA-Bisanhydrid zum Bishydrazido-DTPA-Liganden zwei zusätzliche Koordinationsstellen an den E -Stickstoff-Atomen der Hydrazid-Bindungen enthalten. Die Möglichkeit der Deprotonierung in E-Position der Hydrazidbindung sollte zu einer ionischen Wechselwirkung mit dem Gd(III)-Zentralion und somit zu einer vergrößerten Stabilität gegenüber einer Transmetallierungreaktion mit Zinkionen führen.

O N N N O O O O N H O N H O O N H N H Gd3+ O O O O Zn2+ O N N N O O O O N H O N H O O N H N H Zn2+ O O O O GdPO₄ Phosphatpuffer -+

Abb. 13 Tranmetallierungsreaktion eines Gd-(III)-DTPA-bishydrazid-Komplexes in Gegenwart von Zink in Phosphatpuffer pH=7

Da sich die Relaxationszeiten nach Reaktionsbeginn sehr schnell ändern, wurde versucht, möglichst viele Datenpunkte nach Reaktionsbeginn zu erhalten. Deshalb wurde die Bestimmung der T1-Zeit zur jeweiligen Reaktionszeit anhand des

Fehler behaftet ist. Im Gesamtverlauf der Messung wurden die Parameter (Pulswinkel, Shim) mehrmals überprüft und zum Ende der Messung leicht korrigiert. Die Reaktionszeit wurde bei Darstellung des Nulldurchgangs auf dem Bildschirm abgelesen. Die graphische Auftragung der normierten Relaxivität (Relaxivität zur Zeit t dividiert Relaxivität zur Zeit t=0) zur Reaktionszeit t zeigt Abb. 14.

[51]

Abb.14 Links: Zerfallskurve der beiden Bishydrazid-DTPA-Gd(III)-Komplexe

(Bis-(phenylhydrazido)-DTPA-Gd, Bis-(tert-butylcarbamoylhydrazido)-DTPA-Gd)



Rechts: Zerfallskurven von DTPA-bisamid-Gd(III)-Komplexen bestimmt

von Laurent et al. [51]

Kontrastmittel-Gd(III)-Komplex R1(t=4320min)/ R1(t=0) Gd-DOTA[51] 0,99 Gd-DTPA[51] 0,49 MS-325[51] 0,75 Bis-Phenylhydrazido-DTPA-Gd(III) (t=773min) 0,10 Bis-(tert-Butylcarbamoylhydrazido)-DTPA-Gd(III) (t=694min) 0,10

Tab.4 Normierte Relaxivitäten von verschiedenen Gd(III)-Komplexen nach

angegebener Reaktionszeit der Transmetallierungsreaktion mit Zn2+-Ionen

Die longitudinale Relaxationszeit des Wassers vergrößert sich im Reaktionsverlauf, was durch eine Abnahme der Gd(III)-Komplexkonzentration bzw. der Zunahme der

Zink-Komplexkonzentration zu verstehen ist. Die bei der Transmetallierungsreaktion freiwerdenden Gadoliniumionen, werden durch den großen Phosphat-Überschuss gefällt und haben somit auf das Relaxationsverhalten des Wassers einen vernachlässigbaren Einfluss. (KL(GdPO4) =10-22,26mol2/l2)[55]

Die Messung der Transmetallierungsreaktion des Bis-(2,4-Dinitrophenylhydrazido)-DTPA-Gd-Komplexes verlief nach Zinkzugabe sehr schnell, sodass bereits nach 45 Minuten die T1-Relaxationszeit des Wassersignals über 2 Sekunden betrug. Dieser

Wert blieb über Stunden hinweg konstant. Außerdem trat beim Lösen des Bis-(2,4-Dinitrophenylhydrazido)-DTPA-Gd(III)-Komplexes in Phosphat-Puffer pH=6,8 ein weißer Niederschlag (GdPO4 bzw. Zn3(PO4)2) auf. Aus den vorhandenen Daten

wurde versucht die Geschwindigkeitskonstante k für diese beiden Transmetallierungsreaktionen anhand der Gleichung von Laurent et al. [51] zu ermitteln. kt LigGd LigGd LigGd LigGd _t  ¸¸¹ · ¨¨© §   f f ] [ ] [ ] [ ] [ ln 0 t LigGd]

[ Konzentration des Gadoliniumkomplexes zur Zeit t

f

]

[LigGd Konzentration bei t=f (Letzter Wert der Messung)

0 ]

[LigGd Anfangskonzentration zur Zeit t=0

Da die Konzentration des Gadoliniumkomplexes jederzeit proportional zur Relaxivität R1 ist, können die gemessen Relaxivitäten zu den gemessen Zeiten eingesetzt

werden.

Die Auftragung der zeitabhängigen Relaxivitäten nach der Gleichung von Laurent et al. [51] ergab keinen linearen Zusammenhang. Dies ist zum einen durch einen verfrühten Abbruch der Reaktion nach 694min bzw. 773min zu erklären. Des weiteren wurde der nichtlineare Verlauf von Laurent et al. bei der Bestimmung der Geschwindigkeitskonstante in einigen Kontrastmittelzerfallskinetiken beschrieben, wobei diese Transmetallierungsreaktionen nicht mit den Gleichungen einer Kinetik 2. Ordnung beschrieben werden können [56, 57]. Zudem besteht ein Einfluß des gefällten GdPO4 auf das Wasser. Die durchgeführten Experimente zeigen die Instabilität der

Bis-Hydrazid-DTPA-Komplexe und erklären die starke T1-Zeitverkürzung des

Bis-2,4-Dinitro-phenylhydrazido-DTPA-Gd(III)-Komplexes. Der Verlauf der Zerfallskurven steht in guter Realtion zu den von Laurent et al. bestimmten Zerfallskurven der

Bis-amid-DTPA-Gd(III)-Komplexe und bestätigt die Vermutung, das die Bishydrazid-DTPA-Gd-(III)-Komplexe instabiler als alle DTPA-Bisamid-Gd(III)-Komplexe sind.

4.2 Polyfluorierte Bis-Benzylamid-DTPA-Gd(III)-Komplexe

Folgende Edukte wurden verwendet: 4-Fluorbenzylamin, 3,5-Bis-trifluoromethylbenzylamin, 3,5-Bis-trifluormethylbenzylalkohol 4.2.1 Bis-(4-fluorbenzylamido)-DTPA-Gd(III)-Komplex NH2 F O N N N O OH O O O O O N N N O OH O O N H N H O OH O OH F _F N N N O O O O N H N H O O O O Gd3+ F _F + 2

Die Umsetzung von DTPA-Bisanhydrid mit 4-Fluorbenzylamin in trockenen DMF verlief problemlos zum gewünschten DTPA-bisamid-Liganden. Trotz der intensiven Waschvorgänge konnte das DMF nicht vollständig aus dem Produkt entfernt werden. Die erhaltene Verbindung wurde mittels hochaufgelöster 1H-, 13C- und 19 F-NMR-Spektroskopie sowie mittels ESI-MS charakterisiert.

Die anschließende Komplexierung erfolgte in Wasser. Die Verbindung wurde als weißer Feststoff nach dem Entsalzen und Lyophilisieren erhalten, und mittels 19 F-NMR-Spektroskopie in Wasser untersucht. Das 19F-NMR-Signal war sehr breit und kaum zu detektieren und lag bei der entsprechenden chemischen Verschiebung des Liganden. Dieser Effekt ist auf die paramagnetischen Eigenschaften des Gadolinium(III)-Zentralions, sowie die hohe Anzahl an heteronuklearen HF-Kopplungen zurückzuführen. 4.2.2 Bis-(3,5-trifluormethylbenzylamido)-DTPA-Gd(III)-Komplex NH2 CF₃ F₃C O N N N O OH O O O O O N N N O OH O O N H N H O OH O OH CF3 F3C F3C CF3 N N N O O O O N H N H O O CF3 F₃C F3C CF3 O O Gd3+ + 2

Die Darstellung und Aufreinigung dieser Verbindung erfolgte unter den gleichen Bedingungen wie die Darstellung des Bis-(4-Fluorbenzylamido)-DTPA-Liganden. Die Komplexierung wurde in einer Wasser/Ethanol-Mischung 4:1 durchgeführt, da der Ligand in Wasser schlecht löslich ist. Ligand und Komplex wurden erhalten und mittels 1H-, 13C- und 19F- bzw. im Falle des Komplexes mittels 19F-Kernresonanz