Molekulare Untersuchungen zur Expression
humaner Hautalterungsmarker
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.
des Fachbereichs Biologie der Universität Hamburg
vorgelegt von
Christine Lahmann
Hamburg Februar 2002
Referent: Prof. Dr. W. Schäfer Korreferent: Prof. Dr. K. Harbers
Die vorliegende Arbeit wurde am
PAUL GERSON UNNA FORSCHUNGSZENTRUM der Beiersdorf AG Hamburg
Inhaltsverzeichnis
INHALTSVERZEICHNIS... 1
ABKÜRZUNGEN ... 5
1 EINLEITUNG ... 9
1.1 UV-bedingte Schädigung der Haut ... 9
1.1.1 Die Haut ... 9
1.1.2 UV-Strahlung ... 12
1.1.3 Photoageing... 14
1.2 Matrixmetalloproteinasen ... 16
1.2.1 Einteilung und Struktur der MMPs ... 17
1.2.2 Chromosomale Lokalisation der MMPs... 20
1.2.3 Regulation der MMPs der Haut... 20
1.2.3.1 Regulation der MMP-Genexpression ... 21
1.2.3.2 Regulation der MMPs durch Zymogenaktivierung ... 23
1.2.3.3 Inhibition der MMP-Aktivität durch TIMPs ... 24
1.3 Neutrophile Elastase ... 25
1.4 Fragestellung ... 25
2 MATERIAL... 27
2.1 Geräte... 27
2.2 Verbrauchsmaterialien... 29
2.3 Chemikalien und Reagenzien... 29
2.4 Kits ... 31
2.5 Puffer und Medien ... 32
Inhaltsverzeichnis 2
2.7 Stanzbiopsien (in vivo Hautmaterial) ... 33
2.8 Oligonukleotide ... 35
2.8.1 Northern-Sonden ... 35
2.8.2 TaqManâ RT-PCR Primer und Sonden... 36
3 METHODEN... 37
3.1 Zellkulturtechnik ... 37
3.1.1 Isolierung von HDF-Zellen ... 37
3.1.2 Kultivierung von Zellkulturen... 37
3.1.3 Zellzahlbestimmung nach Fuchs-Rosenthal ... 38
3.1.4 Einfrieren und Auftauen von Zellen... 38
3.2 Inkubation von HDF-Zellen mit verschiedenen Substanzen... 39
3.2.1 Inkubation mit a-Tocopherol ... 39
3.2.2 Inkubation mit H2O2... 40
3.3 Zytotoxizitätstest mit Neutralrot ... 40
3.4 UV-Bestrahlung ... 41
3.4.1 UVA-Bestrahlung von HDF-Zellkulturen... 41
3.4.2 SSR-Bestrahlung in vivo ... 42
3.4.2.1 Time Course Studie ... 43
3.4.2.2 Dose Response Studie ... 43
3.4.2.3 Reproduzierbarkeits- bzw. Epidermis-Dermis Trennstudie... 43
3.4.2.4 Repetitive UV-Expositionsstudie ... 43
3.4.3 UVA-Bestrahlung in vivo ... 44
3.4.4 UVB-Bestrahlung in vivo ... 45
3.5 Probenentnahme von in vivo Hautmaterial ... 46
3.6 RNA-Isolierung ... 46
3.6.1 RNA-Isolierung aus HDF-Zellkulturen... 46
3.6.2 RNA-Isolierung aus Stanzbiopsien ... 47
3.7 RNA-Quantifizierung mittels GeneQuantââââ... 47
Inhaltsverzeichnis 3 3.9 Northern-Analyse... 49 3.9.1 Northern-Blotting ... 49 3.9.2 Hybridisierung... 50 3.9.3 Chemilumineszenz-Detektion ... 50 3.10 TaqManââââ RT-PCR... 51
3.10.1 Prinzip der Real-Time TaqManâ-PCR ... 51
3.10.2 Design der Primer- und Sondensysteme... 54
3.10.3 TaqManâ RT-PCR Assay... 56
3.10.4 TaqManâ RT-PCR Analyse ... 57
3.11 Proteindetektion mittels ELISA... 61
3.11.1 MMP-1 ELISA... 61
3.11.2 TIMP-1 ELISA... 62
3.11.3 MMP-1/TIMP-1 Komplex ELISA ... 63
3.12 Statistik ... 63
4 ERGEBNISSE... 64
4.1 Etablierung der TaqManââââ RT-PCR-Systeme ... 64
4.1.1 Manganacetat-Optimierung... 64
4.1.2 Primer-Optimierung ... 67
4.1.3 Effizienzvergleich ... 69
4.2 Relative Quantifizierung von MMP-1 und TIMP-1 mRNA in vivo... 70
4.2.1 Erhöhte MMP-1 mRNA Expression bei Rauchern... 70
4.2.2 SSR Time Course Studie... 72
4.2.3 SSR Dose Response Studie ... 76
4.2.4 Reproduzierbarkeits- bzw. Epidermis-Dermis Trennstudie (SSR)... 79
4.2.5 UVA-Studie... 82
4.2.6 UVB-Studie... 85
4.2.7 Repetitive UV-Expositionsstudie (SSR) ... 89
4.3 Relative Quantifizierung von MMP-1 und TIMP-1 mRNA in vitro ... 92
4.3.1 UVA Time Course Studie ... 93
4.3.2 UVA Dose Response Studie... 95
4.3.3 Einfluss von a-Tocopherol... 97
Inhaltsverzeichnis 4
4.4 Quantifizierung von MMP-1 und TIMP-1 Protein in vitro ... 101
4.5 Relative Quantifizierung von Elastin und Elastase mRNA in vivo... 102
4.5.1 SSR Time Course Studie... 103
4.5.2 SSR Dose Response Studie ... 105
5 DISKUSSION... 108
5.1 MMP-1 und TIMP-1 mRNA Expression in vivo ... 108
5.1.1 Erhöhte MMP-1 mRNA Expression bei Rauchern... 109
5.1.2 UV-induzierte MMP-1 und TIMP-1 mRNA Expression in vivo... 110
5.2 MMP-1 und TIMP-1 Expression in vitro ... 117
5.3 Elastin und Elastase mRNA Expression in vivo ... 121
6 ZUSAMMENFASSUNG ... 125
7 LITERATUR... 127
8 ANHANG ... 139
8.1 Sequenzen der TaqManââââ RT-PCR Systeme... 139
8.1.1 GAPDH TaqManâ RT-PCR System ... 139
8.1.2 MMP-1 TaqManâ RT-PCR System ... 140
8.1.3 TIMP-1 TaqManâ RT-PCR System ... 141
8.1.4 Elastin TaqManâ RT-PCR System ... 142
8.1.5 Elastase TaqManâ RT-PCR System... 143
Abkürzungen 5
Abkürzungen
% Prozent
°C Grad Celsius
µ
mikro-7700 SDS 7700 Sequence Detection System AP-1 „activating protein-1“
ATF-2 „activating transcription factor-2“
BDF Beiersdorf AG
BLAST Basic Local Alignment Search Tool
BLU Boehringer Light Units
bp Basenpaare
bzw. beziehungsweise
cDNA komplementäre DNA
CIE Commission Internationale de l'Eclairage (Internationale Beleuchtungskommission)
CO2 Kohlendioxid
COLIPA European Cosmetic, Toiletry and Perfumery Industry
CPD Cyclobutan-Pyrimidin-Dimer
CPD-StarTM 2-Chlor-5-(4-Methoxyspiro{1,2-Dioxetan-3,2'-(5'-Chlor) Tricyclo[3.3.1.13,7]Decan}-4-yl)-1-Phenylphosphat, Dinatriumsalz
CT „threshold cycle“ (Schwellenwert)
Da Dalton dATP 2'-Desoxyadenosin-5'-triphosphat dCTP 2'-Desoxycytidin-5'-triphosphat DEPC Diethylpyrocarbonat dGTP 2'-Desoxyguanosin-5'-triphosphat DIG Digoxigenin
DMEM Dulbecco's Modifiziertes Eagle Medium
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure
Abkürzungen 6
dUTP 2'-Desoxyuridin-5'-triphosphat
ECM Extrazelluläre Matrix
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
EGF Epidermaler Wachstumsfaktor
ELISA „enzyme-linked immunosorbent assay“ ERK „extracellular signal regulated kinase“
EtBr Ethidiumbromid
F weiblich
Fab-Fragment Antigenbindende Einheit von Immunglobulinen
FAM 6-Carboxyfluorescein
FCS Fötales Kälberserum
FGF Fibroblasten Wachstumsfaktor
F-Pr. Forward Primer
GAPDH Glycerinaldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase
h Stunde(n)
H2O2 Wasserstoffperoxid
HCl Salzsäure
HDF Humane dermale Fibroblasten
HEPES [4-(2-Hydroxyethyl)-piperazino]-ethansulfonsäure HPLC „high pressure liquid chromatography“
HRP „horseradish peroxidase“ (Meerrettich Peroxidase)
IL Interleukin
J Joule
JNK Jun N-terminale Kinase
Kst. Kostenstelle l Liter M männlich -m Meter m- milli-M Mol
MAPK Mitogen-aktivierte Proteinkinase
MED Minimale Erythemale Dosis
MgCl2 Magnesiumchlorid
Abkürzungen 7
MMP-1 Matrixmetalloproteinase-1 MOPS Morpholinopropansulfonsäure
mRNA „messenger“ RNA
MT membranständig
n-
nano-NaCl Natriumchlorid
NaOH Natriumhydroxid
Neutralrot 2-Amino-3-methyl-7-dimethylamino-phenazoniumchlorid NHEK Normale humane epidermale Keratinozyten
NTC „no template control“
1O
2 Sauerstoff Singulett-Zustand
O2- Superoxidanion
OH· Hydroxylradikal
PBMC Periphere mononukleäre Zellen des Blutes PBS „phosphate buffered saline“
PCR Polymerase Kettenreaktion
Rn normalisierter Reporterfarbstoff
RNA Ribonukleinsäure
ROS Reaktive Sauerstoffspezies
ROX 6-Carboxy-X-rhodamin
rpm Umdrehungen pro Minute
R-Pr. Reverse Primer
RT Raumtemperatur
S Svedberg-Einheit
SAPK Stress-aktivierte Proteinkinase
SD Standardabweichung
SDS Natriumdodecylsulfat
sec Sekunde(n)
SEM „standard error of the mean“ SSC „standard saline citrat“-Puffer SSR „solar simulated radiation“
TAMRA 6-Carboxy-N,N,N',N'-tetramethylrhodamin
Taq Thermus aquaticus
Abkürzungen 8
TIMP-1 „tissue inhibitor of metalloproteinases“-1
Tm Schmelztemperatur
TMB 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin
TNF Tumor Nekrose Faktor
Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan U Unit (Einheit der Enzymaktivität)
u. a. unter anderem
UNG AmpEraseâ Uracil N-Glykosylase
UpM Umdrehungen pro Minute
UV Ultraviolett
V Volt
v/v Volumen pro Volumen
VIC Fluoreszenzfarbstoff (Formel patentgeschützt)
W Watt
w/v Gewicht pro Volumen
z. B. zum Beispiel
Zn Zink
Symbole für Aminosäuren
A Alanin M Methionin
B Asparagin oder Asparaginsäure N Asparagin
C Cystein P Prolin D Asparaginsäure Q Glutamin E Glutaminsäure R Arginin F Phenylalanin S Serin G Glycin T Threonin H Histidin V Valin I Isoleucin W Tryptophan K Lysin Y Tyrosin
Einleitung 9
1 Einleitung
1.1 UV-bedingte Schädigung der Haut
Ultraviolette (UV) Strahlung ist die Hauptursache für die exogene Schädigung der menschlichen Haut. Neben den akuten UV-induzierten Effekten wie dem Erythem (Sonnenbrand) und der Immunsuppression können schwerwiegende Langzeitfolgen wie Hautkrebs und frühzeitige Hautalterung (Photoageing) auftreten (Young 1990). Bei diesen chronischen Hautschädigungen kommt der Familie der Matrixmetalloproteinasen (MMPs) eine bedeutende Rolle zu (Tschesche und Farr 1998).
1.1.1 Die Haut
Die humane Haut ist mit einer Gesamtfläche von 1,5-2 m2 das größte Organ des menschlichen Körpers und stellt die äußere Begrenzung des Menschen zu seiner Umwelt dar (Jung 1995). Zu ihren Funktionen zählt neben dem Schutz vor physikali-schen (Druck, Temperatur, UV-Strahlung), chemiphysikali-schen und mikrobiologiphysikali-schen Umweltnoxen auch die Erhaltung des Feuchtigkeitshaushaltes und die Thermoregula-tion. Außerdem ist die Haut an der Vermittlung von Tast-, Temperatur- und Schmerz-empfindungen beteiligt.
Histologisch lässt sich die Haut in Epidermis, Dermis und Subcutis untergliedern (siehe Abbildung 1.1).
Die Epidermis als äußere Schicht der Haut ist ein mehrschichtiges, verhorntes Plattene-pithel mit einer Dicke von 30-300µm. Die Haupt-Zellpopulationen der Epidermis sind die Keratinozyten, die in unterschiedlichen Differenzierungsstadien auftreten. Die kubi-schen Zellen des einschichtigen Stratum basale sitzen der Basalmembran auf, die an die Dermis grenzt. In ihnen finden die mitotischen Zellteilungen des klassischen Prolifera-tionsgewebes Epidermis statt. Etwa alle zwanzig Tage teilt sich eine Basalzelle, wobei eine der Tochterzellen basal erhalten bleibt, während die andere in suprabasale
Schich-Einleitung 10
ten entlassen wird. Diese Zelle wandert unter kontinuierlicher Differenzierung vom vielschichtigen Stratum spinosum (Stachelzellschicht) über das ein- bis mehrschichtige Stratum granulosum (Körnerzellschicht) zum Stratum lucidum (Glanzschicht), bis sie innerhalb von zwei Wochen das Stratum corneum (kernlose Hornzellschicht) erreicht. Dort wird sie als Hornschuppe an der Hautoberfläche abgeschilfert. Neben den Kerati-nozyten kommen in der Epidermis außerdem Merkel-Zellen, MelaKerati-nozyten, die antigen-präsentierenden Langerhans-Zellen und Lymphozyten vor.
Die 30-150 nm dünne Basalmembran der Epidermis besteht aus zwei Hauptschichten, der Lamina lucida und der Lamina densa, die den Austausch von Zellen und Molekülen zwischen der Epidermis und der Dermis kontrollieren.
Abbildung 1.1: Aufbau der humanen Haut (Beiersdorf AG)
Epidermis
Dermis
Einleitung 11
Die Dermis stellt das unter der Epidermis gelegene Bindegewebe dar, das sich in der Tiefe bis zur Subcutis erstreckt. Die Dicke der Dermis hängt stark von der Lokalisation ab. Sie wird in das oberflächliche schmale Stratum papillare (Zapfenschicht) und das darunterliegende breite Stratum reticulare (Netzschicht) unterteilt. Die Dermispapillen des Stratum papillare sind zäpfchenförmig mit der Epidermis verzahnt, was die Versor-gung der Epidermis mit Nährstoffen erleichtert. Aufgrund ihrer VersorVersor-gungsfunktion ist diese Schicht hauptsächlich durch Zellen, Matrix, Lymphbahnen, Nerven und Kapilla-ren charakterisiert. Die dominieKapilla-renden Zellen der Dermis stellen die Fibroblasten dar; daneben kommen Makrophagen, Mastzellen sowie wenige Melanozyten vor. Die Fibro-blasten synthetisieren die amorphe Matrix und auch die Fasern der Dermis. Diese Fasern sind im Stratum papillare allerdings von untergeordneter Bedeutung. Das Stra-tum reticulare hingegen ist für die Reißfestigkeit sowie die Elastizität der Haut verant-wortlich und daher mit kräftigen Kollagenfaserbündeln und elastischen Fasern ausge-stattet.
Die wichtigsten Fasern der Dermis sind die extrazellulären Kollagenfasern, die die Zug-festigkeit der Haut bedingen. Kollagene, hauptsächlich vom Typ I, repräsentieren mit ca. 80 % den Hauptbestandteil allen dermalen Proteins (Uitto und Bernstein 1998). Die Kollagenfasern setzen sich aus Kollagenfibrillen zusammen, die wiederum aus je drei zu einer Tripelhelix verdrillten a-Kollagenketten bestehen. In einer Kollagenkette ist jeder dritte Aminosäurerest durch ein Glycin und jeder fünfte durch ein Prolin oder Hydroxyprolin repräsentiert (Bella et al. 1994). Daneben bilden die elastischen Fasern in der Extrazellulären Matrix (ECM) des Stratum reticulare ein starkes Netzwerk aus, das für die Elastizität der Haut verantwortlich ist (Christiano und Uitto 1994). Die elastischen Fasern bestehen neben Elastin zu 10 % aus Mikrofibrillen. Diese Mikrofi-brillen sind an das Elastin angelagert und enthalten verschiedene Glykoproteine wie das Fibrillin (Uitto et al. 1995). Die elastischen Fasern stellen nur einen relativ kleinen Anteil von 2–4 % des gesamten Proteins der Dermis dar (Uitto und Bernstein 1998). Die Füllsubstanz, die amorphe Matrix der Dermis, ist hauptsächlich durch H2 O-bindende Proteoglykane charakterisiert, die aus zahlreichen Glykosaminoglykanketten und einem linearen Kernprotein aufgebaut sind.
Einleitung 12
Daneben existieren in der Dermis für die Wahrnehmung von Reizen die Meissner-Körperchen (Mechanorezeptoren), die Vater-Pacini-Meissner-Körperchen (Druck- und Vibrati-onsrezeptoren) und die Ruffini-Körperchen (Dehnungsrezeptoren). Im tiefen Stratum reticulare entspringen die Haarfollikel sowie die Schweiß- und Talgdrüsen, die sich alle von der Epidermis ableiten.
Die Subcutis besteht aus lockerem Bindegewebe und ist von Kollagenfasern durchzo-gen. Sie dient im Wesentlichen als Fettspeicher, wodurch ein Schutz vor Wärmeverlust und mechanischen Belastungen gewährleistet ist.
1.1.2 UV-Strahlung
Die Sonne emittiert ein kontinuierliches Spektrum von 100-3000 nm (Gates 1965). Dazu gehören das kurzwellige, energiereiche UV-Licht (100-400 nm), der sichtbare Bereich (400-780 nm) und die Infrarotstrahlen (780-3000 nm), auf die die Wärmewir-kung der Sonne zurückgeht. Das UV-Licht wird nach der Internationalen Beleuchtungs-kommission CIE (1987) in drei Wellenlängenbereiche unterteilt: UVC (100-280 nm), UVB (280-315 nm) und UVA (315-400 nm). Der deutsche Fachnormausschuss Licht-technik definiert UVA als den Bereich zwischen 315 und 380 nm (1976).
Tabelle 1.1: Anteile der auf die Erdoberfläche treffenden Strahlung unter Idealbedingungen (Meeres-höhe, 90° Sonnenstand, wolkenlos, klare Luft) (nach Kindl und Raab 1993)
Strahlungsart Anteil der Gesamtintensität [%]
UVB (300-315 nm) 0,4
UVA (315-380 nm) 3,9
Sichtbares Licht (380-780 nm) 51,8
Infrarot A (780-1400 nm) 31,2
Infrarot B (1400-3000 nm) 12,7
Die Strahlung der Sonne trifft nicht unverändert auf der Erdoberfläche auf, sondern wird durch Absorption und Streuung stark geschwächt. Die UV-Strahlung unterhalb 175 nm wird bereits in großen Höhen vom Sauerstoff abgeblockt. Die UV-Strahlung im Bereich von 175 nm bis ca. 300 nm wird, abhängig von der Dicke der Ozonschicht, vom Ozon absorbiert (Kindl und Raab 1993). Das UVC ist somit auf der Erdoberfläche
Einleitung 13
ohne physiologische Bedeutung. Die übrigen Anteile der Strahlung erreichen mit unter-schiedlicher Stärke die Erde (siehe Tabelle 1.1).
Das auf die humane Haut treffende Licht wird zu unterschiedlichen Anteilen absorbiert bzw. reflektiert und gestreut. Wie tief die auf die Haut treffenden Lichtstrahlen eindrin-gen, hängt von der Wellenlänge des einfallenden Lichtes ab (siehe Tabelle 1.2).
Tabelle 1.2: Eindringtiefe von Strahlung unterschiedlicher Wellenlänge in die Haut (Urbach 1952) UV-Strahlung Sichtbares Licht Infrarot
llll [nm] 250 300 400 550 750 1000 1400
Epidermis (0,05-0,15 mm) 19 % 34 % 80 % 87 % 78 % 71 % 44 %
Dermis (1-4 mm) 11 % 16 % 57 % 77 % 65 % 65 % 28 %
Subcutis - - 1 % 5 % 21 % 17 % 8 %
Die energieärmere UVA-Strahlung dringt in tiefere Hautschichten als das UVB vor und schädigt die DNA auf indirektem Weg über die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies. (Tyrell 1995). Dabei wird die Energie der UVA-Strahlung von endogenen Chromopho-ren (PhotosensibilatoChromopho-ren) wie Porphyrinen, Flavinen, aromatischen AminosäuChromopho-ren und bestimmten Quinonen absorbiert und auf Sauerstoff übertragen. Infolgedessen werden der angeregte Singulett-Zustand (1O2), Superoxidanionen (O2-), Wasserstoffperoxid (H2O2) und die hochreaktiven Hydroxylradikale (OH·) gebildet (Klotz et al. 2001). Durch die reaktiven Sauerstoffspezies werden DNA-Basen oxidativ geschädigt, wobei 8-Hydroxyguanin einen der häufigsten UVA-induzierten Schaden darstellt (Zhang et al. 1997). Daneben resultieren DNA-Strangbrüche (Koch et al. 2001), DNA-Protein-Crosslinks (Peak und Peak 1989), aber auch Schädigungen von Proteinen und Zell-membranen durch Lipidperoxidation.
Die UVB-Strahlung wird größtenteils von der Epidermis absorbiert und dringt somit weniger weit als das UVA in die Hautschichten vor. Sie besitzt als energiereichere Strahlung ein höheres DNA-schädigendes Potential als das UVA (Young 1990) und interagiert direkt mit der DNA, u. a. durch die Bildung von Pyrimidin-Dimeren (Freeman et al. 1987) und Pyrimidin-(6-4)-Pyrimidon Photoprodukten (Rosenstein und Mitchell 1987). Des Weiteren reagiert das UVB mit Proteinen und führt zu
Decarboxy-Einleitung 14
lierungen sowie Desaminierungen, Veränderungen von Primär-, Sekundär- und Tertiär-strukturen, aber auch zu einer Inaktivierung bzw. Aktivierung von Enzymen.
Um UV-induzierte Schäden zu verhindern bzw. entstandene Schäden zu reparieren, verfügt die humane Haut über eine Reihe von effektiven Mechanismen. Die „Licht-schwiele“, eine Verdickung der Epidermis, führt dazu, dass die Eindringtiefe der UV-Strahlung in die Haut abnimmt. Melaninpigmente können UV-induzierte freie Radikale abfangen und dienen gleichzeitig als effektive UV-Filter (Gilchrest und Eller 1999). Die endogen in der Haut vorliegenden Antioxidantien a-Tocopherol (Vitamin E), Ascorbat (Vitamin C), Glutathion, b-Carotin und Ubichinol können ebenfalls mit reaktiven Sauerstoffspezies reagieren und diese unschädlich machen (Sies und Stahl 1995). Darüber hinaus besitzen die Zellen wirkungsvolle Antioxidans-Enzymsysteme wie die Superoxid-Dismutase, die Katalase und die Glutathion-Peroxidase (Anderson 1996). Die wichtigsten Reparaturmechanismen für die Beseitigung UV-induzierter DNA-Schäden stellen die Nukleotid-Excisions-Reparatur (Sancar und Tang 1993) und die Basen-Excisions-Reparatur (Demple und Harrison 1994) dar.
1.1.3 Photoageing
Hautalterung ist ein komplexer Vorgang, an dem neben den angeborenen Alterungspro-zessen („biologische Uhr“) auch äußere Einflüsse, insbesondere die UV-Strahlung, nachhaltig beteiligt sind (Photoageing) (Gilchrest und Yaar 1992).
Die angeborene intrinsische Alterung ist ein allgemeiner Prozess, der in jedem organi-schen System wie der Haut genetisch determiniert ist. Klinisch zeichnet sich die „normal“ gealterte Haut durch Trockenheit, gleichmäßige Pigmentierung, feine Falten, eine gewisse Schlaffheit und gutartige Gewebewucherungen (Neoplasmen) aus (Hadshiew et al. 2000). Obwohl die durchschnittliche Dicke des Stratum corneum im Zuge der Alterung relativ gleich bleibt, finden Änderungen in der Lipidzusammenset-zung und auch eine verspätete Wiederherstellung der Barrierefunktion nach Schädigung statt (Gilchrest 1989). Die Umsatzraten der Epidermis sinken um 30-50 % zwischen dem dreißigsten und achtzigsten Lebensjahr. Histologisch ist die intrinsisch gealterte Haut durch eine erhöhte Variabilität in der Dicke der Epidermis und der Größe der
indi-Einleitung 15
viduellen Keratinozyten gekennzeichnet. Sowohl die Zahl der aktiven Melanozyten als auch die der epidermalen Langerhans-Zellen ist reduziert. Dieses könnte für die verminderte UV-Protektion und die erniedrigte Immunantwort mit zunehmendem Alter verantwortlich sein. Die Dicke der Dermis ist ebenso wie die der Epidermis reduziert (Bhawan et al. 1995). Das Gleichgewicht zwischen Kollagen- bzw. Elastinsynthese und -abbau ist in Richtung der Degradation der Faserproteine verschoben und von einer vermehrten Desorganisation der Kollagenfasern begleitet. Des Weiteren ist die dermale Durchblutung und auch die Anzahl sowie Aktivität der Drüsen und Haare der Haut reduziert (Braverman 1986). Die Abflachung der Grenzschicht zwischen Epidermis und Dermis im Laufe der Jahre könnte einen reduzierten Nährstoffaustausch und eine erleichterte Separation der beiden Hautschichten bedingen, was zu einer erhöhten Fragilität der Haut nach Verletzungen führt (Hadshiew et al. 2000).
Viele Merkmale der intrinsisch gealterten Haut treten auch bei der chronisch UV-geschädigten Haut - zumeist in verstärkter Form - auf. Daneben gibt es einige Phäno-mene, die für das Photoageing charakteristisch sind. Klinisch ist die UV-geschädigte Haut durch starke Falten, eine auffällige Trockenheit und Schuppigkeit, eine ungleich-mäßige Pigmentierung, Lentigines und gutartige, prämaligne sowie maligne Hautverän-derungen gekennzeichnet (Kligman und Kligman 1986). Histologisch ist dieser Photo-aging-Prozess vor allem durch eine auffällige Akkumulation elastotischen Materials in der Dermis gekennzeichnet („solar elastosis“) (Bernstein et al. 1994). Chen et al. (1986) demonstrierten, dass sich dieses Material hauptsächlich von den elastischen Fasern, also zum Großteil vom Elastin, ableiten lässt. Obwohl sich das elastotische Material aus den normalen Bestandteilen der elastischen Fasern zusammensetzt, sind deren supramole-kulare Struktur und Funktionen schwerwiegend gestört (Uitto und Bernstein 1998). Daneben findet in UV-geschädigter Haut eine Reduktion des dermalen Kollagens um ca. 1 % pro Jahr statt (Shuster und Black 1975). Außerdem sind auch die Kollagenfa-sern zunehmend desorganisiert (Bernstein et al. 1996). Biochemische Analysen haben gezeigt, dass in UV-geschädigter Haut reduzierte Typ I und III Prokollagene (Talwar et al. 1995) und Cross-Links innerhalb der Kollagenmoleküle (Yamauchi et al. 1991) auftreten. Zusätzlich wurde eine erhöhte Elastin Genexpression detektiert (Bernstein et al. 1994).
Einleitung 16
Für die Ursachen der UV-bedingten Hautalterung gibt es in der Literatur verschiedene Hypothesen. So postulieren Hadshiew et al. (2000), Yaar und Gilchrest (1998) sowie Koch et al. (2001), dass die UV-abhängige Schädigung der genomischen und mitochon-drialen DNA mit einer nachfolgenden Störung der zellulären Funktionen neben der Krebsentstehung auch entscheidend an den Hautalterungsprozessen beteiligt ist. Des Weiteren wird in der Literatur der Verlust der Chromosomenstabilität durch Telomer-verkürzung als einer der Hauptmechanismen der zellulären Seneszenz diskutiert (Harley et al. 1990).
Fisher und Vorhees (1998) hingegen vertreten die Hypothese, dass für die frühzeitige Hautalterung hauptsächlich die Schädigung des dermalen Kollagens durch UV verant-wortlich ist. 1996 wurde von Fisher et al. postuliert, dass in diesen Prozess die Matrix-metalloproteinasen involviert sind, da diese durch UV-Licht induziert dermales Kolla-gen degradieren können (Fisher et al. 1997).
1.2 Matrixmetalloproteinasen
Matrixmetalloproteinasen (MMPs) sind eine Gruppe eng verwandter zinkabhängiger Enzyme, die aufgrund ihrer gemeinsamen strukturellen und funktionellen Eigenschaften eine eigenständige Unterfamilie der Metalloproteinasen bilden (Stöcker et al. 1995). Die etwa zwanzig bekannten Vertreter der MMPs sind in der Lage, die wesentlichen Komponenten der Extrazellulären Matrix (ECM) wie z. B. die Kollagene, Laminin, Elastin oder Fibronektin abzubauen (Birkedal-Hansen 1995). Dadurch sind sie in eine Vielzahl von physiologischen und pathologischen Prozessen involviert. Der kontrol-lierte Ab- und Umbau der ECM durch die MMPs spielt u. a. eine wichtige Rolle bei der Embryogenese, der Wundheilung, der Organbildung und der Angiogenese (Kähäri und Saarialho-Kere 1997). Im Gegensatz dazu kann eine dysregulierte MMP-Aktivität neben dem dermalen Photoageing auch an zahlreichen Erkrankungen wie der rheuma-toiden Arthritis, der Leberfibrose, der Paradontose, der Arteriosklerose und dem Wachstum sowie der Metastasierung von Tumoren beteiligt sein.
Einleitung 17
1.2.1 Einteilung und Struktur der MMPs
Die MMPs werden aufgrund ihrer Substratspezifität bzw. ihres Aufbaus aus verschiede-nen Domäverschiede-nen in die vier Untergruppen Kollagenasen, Gelatinasen, Stromelysine und membranständige MMPs unterteilt (siehe Tabelle 1.3, Kähäri und Saarialho-Kere 1997).
Tabelle 1.3: Nomenklatur und Substratspezifität der bisher am besten untersuchten humanen MMPs (in Anlehnung an Kähäri und Saarialho-Kere 1997)
Bezeichnung Substrate
Kollagenasen:
Fibroblasten Kollagenase (MMP-1) Kollagen III > I, II, VII, VIII, X, Aggrekan, a2-Makroglobulin
Neutrophile Kollagenase (MMP-8) Kollagen I > III, II, Aggrekan, a2-Makroglobulin
Kollagenase-3 (MMP-13) Kollagen II > I, III, IV, IX, X, XI, Gelatin, Fibronektin, Laminin, Tenascin, Aggrekan
Kollagenase-4 (MMP-18) Gelatin
Stromelysine:
Stromelysin-1 (MMP-3) Kollagen IV, V, IX, X, Fibronektin, Aggrekan, Nidogen, Elastin, Gelatin
Stromelysin-2 (MMP-10) Kollagen IV, V, IX, X, Fibronektin, Aggrekan, Nidogen, Elastin, Gelatin
Stromelysin-3 (MMP-11) a1-Proteinaseinhibitor
Metalloelastase (MMP-12) Kollagen IV, Fibronektin, Aggrekan, Nidogen, Elastin Matrilysin (MMP-7) Kollagen IV, Fibronektin, Aggrekan, Nidogen, Elastin
Gelatinasen:
Gelatinase-A (MMP-2) Gelatin, Kollagen IV, I, Fibronektin, Tenascin Gelatinase-B (MMP-9) Gelatin, Kollagen IV, I, II, V, XIV, a2-Makroglobulin
Membranständige MMPs:
MT1-MMP (MMP-14) pro-MMP-2 und andere MMPs, Kollagen I, II, III, Gelatin, Fibronektin, Laminin, Vitronektin, Aggrekan
MT2-MMP (MMP-15) nicht bekannt MT3-MMP (MMP-16) pro-MMP-2 MT4-MMP (MMP-17) nicht bekannt
Bei der UV-bedingten frühzeitigen Hautalterung spielen die Helikasen, zu denen die Fibroblasten Kollagenase (MMP-1) gehört, eine besondere Rolle, da allein diese
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Enzyme das tripelhelikale Typ I und III Kollagen der extrem stabilen Kollagenfibrillen der Dermis in thermolabile Fragmente abbauen können (Kirsner 2001). Die resultieren-den charakteristischen N-terminalen ¾ und C-terminalen ¼ Fragmente resultieren-denaturieren bei Körpertemperatur zu Produkten, die erst dann durch eine Vielzahl von weniger spezifi-schen Proteasen degradiert werden können.
Im Allgemeinen ist die Struktur der MMPs durch ein Signalpeptid, ein Propeptid, eine katalytische Domäne, eine Verbindungssequenz, die sogenannte „hinge“-Region, und eine Hämopexin ähnliche Domäne charakterisiert (siehe Abbildung 1.2).
Abbildung 1.2: Struktur der humanen MMPs
A: Kollagenasen und Stromelysine (außer MMP-7) B: Matrilysin (MMP-7)
C: Gelatinasen
D: Membranständige MMPs
Während das N-terminale hydrophobe Signalpeptid der Ausschleusung des Enzyms aus der Zelle dient und vor der Sekretion abgespalten wird, erhält das Propeptid die Latenz des Enzyms aufrecht und wird bei der Aktivierung proteolytisch entfernt. Die
Propep-Sig nalp eptid NH2 COOH Pro pept id Katalytische Domäne Zn++ Fibr onek tin T yp II Inse rts „hin ge Reg ion Häm opex in D om äne Tran sm em bran -Dom äne A D C B
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tid-Domäne (ca. 80 Aminosäuren) besitzt eine konservierte PRCG(V/N)PD Sequenz, wobei das Cystein innerhalb dieser Sequenz („Cystein-Switch“) das katalytische Zink komplexiert, um die Latenz der Pro-MMPs aufrechtzuerhalten (Van Wart und Birkedal-Hansen 1990). Für das Stromylesin-3 (MMP-11) und die MT-MMPs, die eine Furin-Schnittstelle zwischen dem Propeptid und der katalytischen Domäne aufweisen, konnte hingegen eine intrazelluläre Aktivierung durch Furin nachgewiesen werden (Pei und Weiss 1995).
Die katalytische Domäne der MMPs (ca. 170 Aminosäuren) enthält das konservierte Aminosäuremotiv HEXXHXXGXXH zur Komplexierung eines Zinkions im aktiven Zentrum (Bode et al. 1993), wobei die drei Histidinreste die Liganden für das Zinkion darstellen (Barrett et al. 1998). Außer dem katalytischen Zinkion besitzt die katalytische Domäne zusätzlich ein strukturelles Zinkion und zwei bis drei Calciumionen, die für die Stabilität und die Expression der enzymatischen Aktivität notwendig sind (Nagase und Woessner 1999). Daneben verfügt die katalytische Domäne über ein konserviertes Methionin, welches eine einzigartige „Met-turn“ Struktur bildet. Typisch für die Kolla-genasen ist ihre Helikase-Aktivität, für die die Sequenz 183RWTNNFREY191 in der katalytischen Domäne eins der Schlüsselelemente darzustellen scheint (Chung et al. 2000).
Alle MMPs bis auf das Matrilysin (MMP-7) besitzen zusätzlich zu diesen drei Domä-nen eine C-terminale Hämopexin ähnliche Domäne (ca. 210 Aminosäuren), die an der Substrat- und Inhibitorbindung beteiligt ist (Tschesche und Farr 1998). Das Fehlen dieser Domäne beim MMP-7 ist aller Voraussicht nach verantwortlich für dessen breite Substratspezifität (Kähäri und Saarialho-Kere 1997). Für die Kollagenasen ist diese Hämopexin ähnliche Domäne eine unbedingte Voraussetzung für das Schneiden von tripelhelikalem interstitiellen Kollagen, obwohl die katalytische Domäne allein die proteolytische Aktivität hinsichtlich anderer Substrate behält (Nagase und Woessner 1999).
Die beiden Gelatinasen MMP-2 und MMP-9 haben außerdem - spezifisch für ihre Gruppe - innerhalb der katalytischen Domäne drei Wiederholungen von Fibronektin Typ II ähnlichen Inserts (175 Aminosäuren), die mit Kollagenen und Gelatinen intera-gieren und daher ebenfalls für die Substratspezifität verantwortlich sind (Steffensen et
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al. 1995). Typisch für die membranständigen MMPs ist eine C-terminale Transmem-brandomäne (75-100 Aminosäuren), die eine Verankerung der Enzyme an der Oberflä-che von Zellen ermöglicht.
1.2.2 Chromosomale Lokalisation der MMPs
Bei der chromosomalen Lokalisierung der MMPs konnte auf dem langen Arm des Chromosoms 11 (11q22.2-3) ein Cluster identifiziert werden, der die Gene für diverse MMPs in folgender Reihenfolge enthält: MMP-8, MMP-10, MMP-1, MMP-3, MMP-12, MMP-7 und MMP-13 (Pendas et al. 1995). Diese Anordnung der Gene in Clusterform könnte ein Hinweis darauf sein, dass die aufgeführten Kollagenasen und Stromelysine durch sequentielle Duplikationen aus dem Gen eines gemeinsamen MMP-Vorfahrens hervorgegangen sind. Ebenso spricht die ähnliche Exon/Intron Organisation der MMP-Gene dieses Clusters für die Hypothese eines gemeinsamen Ursprungs (Pendas et al. 1997). Die anderen MMP-Gene konnten auf verschiedene Chromosomen verteilt lokalisiert werden. Sowohl die Genorte der beiden Gelatinasen wurden auf unterschiedlichen Chromosomen identifiziert (MMP-2 auf dem Chromosom 16 (16q13) und MMP-9 auf dem Chromosom 20 (20q12-13)), als auch die der membranständigen MMPs (MT1-MMP auf dem Chromosom 14 (14q12.2), MT2-MMP auf dem Chromo-som 16 (16q12.2) und MT3-MMP auf dem ChromoChromo-som 8 (8q21)) (Mattei et al. 1997). Dieses lässt neben einer frühen Abspaltung der Gene voneinander auf unterschiedliche Funktionen sowie Regulationen dieser strukturell verwandten MMPs schließen.
1.2.3 Regulation der MMPs der Haut
In der Haut können mehrere Zelltypen wie Keratinozyten, Fibroblasten, Makrophagen, Endothelzellen, Mastzellen, Eosinophile und Neutrophile MMPs produzieren (Kähäri und Saarialho-Kere 1997). Mit der Ausnahme der Speicherung von MMP-8 (Hasty et al. 1990) und MMP-9 (Ståhle-Bäckdahl und Parks 1993) in Neutrophilen sowie von MMP-7 in exokrinen Schweißdrüsen (Saarialho-Kere et al. 1995) werden die MMPs in der Haut nicht konstitutiv exprimiert, sondern durch exogene Signale wie UV-Strahlung induziert. Eine Regulation der MMP-Aktivität findet neben der Transkriptions- auch auf
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der Translationsebene durch Zymogenaktivierung und eine Inhibition der proteolyti-schen Aktivität statt.
1.2.3.1 Regulation der MMP-Genexpression
Die Transkription der MMPs wird durch eine Reihe von Zytokinen und Wachstums-faktoren wie Interleukin-1 (IL-1), IL-6, Tumor Nekrose Faktor-a (TNF-a), den epider-malen Wachstumsfaktor EGF, den Fibroblasten Wachstumsfaktor FGF und TGF-b beeinflusst (Mauviel 1993). Aber auch chemische Substanzen wie Phorbolester, Polypeptid- und Steroidhormone sowie Onkogene (c-Fos, c-Jun, Ras) kontrollieren die Expression der MMPs auf Transkriptionsebene. Der Einfluss der verschiedenen Fakto-ren variiert bei den einzelnen MMPs und ist dabei abhängig vom jeweiligen Zelltyp und der Dosis der Substanz. Dementsprechend können einzelne Faktoren unterschiedliche Effekte auf die MMP-Regulation haben. So ist beispielsweise bekannt, dass TGF-b im Falle von MMP-1 und MMP-3 eine inhibitorische, bei MMP-2 und MMP-9 jedoch eine induzierende Wirkung besitzt (Kerr et al. 1990, Salo et al. 1991). Daneben spielen bei der MMP-Genexpression Zell-Matrix Interaktionen und veränderte Zell-Zell Kontakte eine Rolle (Nagase und Woessner 1999). Fibroblasten und Endothelzellen, die in Typ I Kollagengelen kultiviert werden, exprimieren z. B. MT1-MMP, was durch a2b1 Integrin vermittelt zu sein scheint.
Alle induzierbaren MMP-Gene enthalten im 5'-flankierenden Promotorbereich ein AP-1
cis-regulatorisches Element, ungefähr in Position –70 vor der Initiationsstelle der
Transkription (Gaire et al. 1994). Durch die oben aufgeführten Stimuli wird der AP-1 Transkriptionsfaktor-Komplex aktiviert, der an das AP-1 cis-Element im Promotor bindet und somit die Transkription der korrespondierenden MMP-Gene initiiert. AP-1 Dimere bestehen aus Mitgliedern der Jun- und Fos-Genfamilie, die über die Aktivierung von drei verschiedenen Klassen von Mitogen-aktivierten Proteinkinasen (MAPKs) induziert werden (Karin et al. 1997). Zu den MAPKs zählen die durch extrazelluläre Stimuli regulierte Kinase (ERK), die Stress-aktivierte Proteinkinase/Jun N-terminale Kinasen (SAPK/JNKs) und p38. Im Allgemeinen resultiert die Aktivierung der ERK-Signaltransduktionskaskade in einer Phoshorylierung von Elk-1 und einer nachfolgen-den Aktivierung der c-Fos Transkription. Die Aktivierung von nachfolgen-den JNKs bewirkt eine
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Phosphorylierung von c-Jun. ATF-2 wird durch die JNKs und p38 phosphoryliert. Durch beides wird die Transkiption von c-Jun initiiert. In Abbildung 1.3 sind die drei MAP Kinase-Reaktionswege exemplarisch für den UV-Einfluss auf humane Haut in
vivo dargestellt.
Abbildung 1.3: Induktion der MAP Kinase Signaltransduktionswege durch UV-Einfluss auf humane
Haut in vivo (Fisher und Vorhees 1998)
Die UV-Aktivierung der Wachstumsfaktor- oder Zytokin-Rezeptoren führt über Rac zu einer Aktivierung der NADPH Oxidase. Dadurch werden reaktive Sauerstoffspezies (ROS) gebildet, die für die MAP Kinase Aktivierung notwendig sind. Die Aktivierung von ERK und JNK/p38 resultiert in einer Phosphorylierung (P) der Transkriptionsfak-toren ELK-1 bzw. c-Jun/ATF-2. Dadurch wird der Transkriptionsfaktor AP-1 (c-fos/c-jun) induziert, was wiederum zu einer Hochregulation der MMPs führt. Die Moleküle, für die gezeigt werden konnte, dass sie in humaner Haut in vivo durch UV aktiviert werden, sind mit einem Kästchen umrahmt.
Zusätzlich zur AP-1 Bindungsstelle konnte ein weiteres cis-Element, PEA3, im Promotorbereich einiger MMPs (MMP-1, -3, -7, -9, -10, -11, -12, –13) identifiziert
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werden (Pendas et al. 1997). Allerdings variiert dessen genaue Lokalisation weit stärker als beim AP-1. Das PEA3 Element bindet Mitglieder der ETS-Familie und reguliert die MMP-Expression in Kooperation mit AP-1 (Kähäri und Saarialho-Kere 1997, Bidder et al. 2000).
1.2.3.2 Regulation der MMPs durch Zymogenaktivierung
Alle MMPs werden als Proenzyme synthetisiert und zumeist als inaktive Pro-MMPs sezerniert, mit Ausnahme der MMPs, die durch Furin aktiviert werden (siehe oben, Nagase und Woessner 1999). So wird MMP-11 bereits in aktivierter Form aus den Zellen geschleust (Barrett et al. 1998).
Ein wichtiger Kontrollmechanismus für die enzymatische Aktivität der MMPs ist die Entfernung des Propeptids durch Proteolyse, wobei dieser Prozess der Zymogenaktivie-rung als „Cystein-Switch“ bezeichnet wird (Van Wart und Birkedal-Hansen 1990). Die Latenz der Pro-MMPs beruht darauf, dass die Propeptid-Domäne das aktive Zentrum komplexiert und damit den Zugang der Substrate zum katalytischen Zentrum blockiert. Dabei komplexiert die Thiolgruppe des Cysteinrestes aus der konservierten Propep-tidsequenz PRCG(V/N)PD das katalytische Zinkion, so dass das für die Katalyse erfor-derliche Wassermolekül nicht gebunden werden kann. Bei der Aktivierung wird zunächst die kovalente Zink-Cystein Bindung destabilisiert. Diese Destabilisierung kann entweder durch eine schrittweise Spaltung des Propeptids durch Proteasen wie Trypsin, Plasmin, bakterielle Proteasen (bei Entzündungen), aber auch durch andere MMPs erfolgen. Oder sie kann durch denaturierende Agenzien, Erhitzen, Oxidations-mittel, Disulfide oder Quecksilberverbindungen zu Stande kommen. Im Anschluss an die Destabilisierung findet eine vollständige Aufhebung der Wechselwirkung zwischen dem Cystein und dem Zink statt, wobei dieser letzte Schritt zumeist autokatalytisch abläuft.
Eine MMP-Aktivierung kann auch durch membrangebundene MT-MMPs erfolgen, womit zusätzlich Aktivierungsmechanismen an den Zelloberflächen bestehen. So können sich Komplexe aus Pro-MMP-2 und TIMP-2 an aktivierte MT-MMPs binden, die die latente MMP-2 Form zur aktiven prozessieren (Sato et al. 1994, Strongin et al.
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1995). Diese Form der Zymogenaktivierung spielt eine wichtige Rolle bei der Tumorzell-Invasion und Angiogenese (Nagase und Woessner 1999).
Wird Pro-MMP-1 durch die Stromelysine MMP-3 oder MMP-10 aktiviert, wird eine Kollagenase mit fünf- bis zwölfmal höherer spezifischer Aktivität im Vergleich zur autokatalytisch aktivierten Form erzeugt (Suzuki et al. 1990). Für dieses Phänomen wurde der Begriff „Superaktivierung“ geprägt. Sequenzanalysen ergaben, dass bei der „Superaktivierung“ durch Stromelysin die Spaltungsstelle des Propeptids um zwei Aminosäuren Richtung C-Terminus verschoben ist, so dass das mature aktive MMP mit einem N-terminalen stark konservierten Phenylalaninrest beginnt. Da dieser minimale Unterschied mit einer gravierenden Erhöhung der spezifischen Aktivität von MMP-1 einhergeht, wird angenommen, dass MMP-3 und MMP-10 eine wichtige Rolle bei der
in vivo Aktivierung von Prokollagenasen spielen.
1.2.3.3 Inhibition der MMP-Aktivität durch TIMPs
Die proteolytische Aktivität der MMPs wird neben der Hemmung durch unspezifische Inhibitoren wie a2-Makroglobulin und a1-Antiprotease insbesondere durch die spezifi-schen „tissue inhibitors of metalloproteinases“ (TIMPs) reguliert (Kähäri und Saarialho-Kere 1997). Die TIMP-Familie, die von den gleichen Zellen exprimiert wird, die auch die MMPs produzieren (Tschesche und Farr 1998), besteht aus vier Mitgliedern (TIMP-1, -2, -3, -4) mit einer Molekularmasse von 22-30 kDa und stellt eine homologe Gruppe mit einer Sequenzidentität von 40-50 % dar (Greene et al. 1996). Alle TIMPs inhibieren aktivierte MMPs mit einer relativ geringen Selektivität, indem sie feste, nicht-kovalente 1:1 Komplexe bilden (Willenbrock und Murphy 1994). Ausnahmen sind die relativ schwachen Interaktionen zwischen TIMP-1 und MT1-MMP bzw. MMP-2. Charakteristisch für die TIMPs ist ihre Struktur aus sechs disulfidverbrückten Schleifen, die eine inhibitorische N-terminale und eine bindungsverstärkende C-terminale Domäne bilden (Gomis-Rüth et al. 1997). Diese beiden Domänen stehen über eine Disulfidbrücke zwischen dem Cystein1 und Cystein70 in Verbindung. Die N-terminale Aminosäuresequenz C1TCVP der TIMPs bindet an das aktive Zentrum der MMPs ähnlich wie die MMP-Substrate, wobei das Zinkion unmittelbar von der Carbonyl- und Aminogruppe des N-terminalen Cysteins1 komplexiert wird. Dadurch
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verhindern sie ähnlich wie beim Propeptid der MMPs die Bindung des katalytisch wichtigen Wassermoleküls und der Substrate.
Zunehmend gelten die TIMPs als multifunktionelle Enzyme, da sie nicht nur die MMPs inhibieren, sondern auch auf die Bildung der Erythrozyten einwirken. Zudem stimulie-ren sie das Wachstum und die Diffestimulie-renzierung verschiedener Zellen, beeinflussen destimulie-ren Morphologie und Adhäsion, können die Angiogenese hemmen und sind möglicherweise an der Zellzyklusregulation und Apoptose beteiligt (Gomez et al. 1997).
1.3 Neutrophile Elastase
Neben einem Abbau der Kollagenfibrillen durch die MMPs ist die frühzeitige UV-bedingte Hautalterung durch eine Akkumulation elastotischen Materials in der Dermis gekennzeichnet. In diesen Prozess ist die neutrophile Elastase, eine Serinprotease, involviert, die aktiviert die elastischen Fasern der Haut degradieren kann (Uitto et al. 1995). Die Hauptquelle für die neutrophile Elastase sind dabei wahrscheinlich die Neutrophilen Zellen und die Mastzellen (Starcher und Conrad 1995). Diese inflammato-rischen Zellen sind in der Dermis sonnenexponierter Haut ungewöhnlich häufig in der Nähe elastotischen Materials zu finden (Pasquali-Ronchetti und Baccarani-Contri 1997, Frances und Robert 1984). Laut Takahashi et al. (1988) wird die neutrophile Elastase ausschließlich in den Myeloid-Vorläuferzellen des Knochenmarks exprimiert und in Granula reifer neutrophiler Zellen vor dem Verlassen des Knochenmarks gespeichert. Von den neutrophilen Zellen wird die Elastase z. B. in die Dermis transportiert. Nach der Stimulierung oder Lyse der Transportzellen wird die Elastase am Ort ihrer proteo-lytischen Aktivierung wie in der Nähe von elastischen Fasern ausgeschleust.
1.4 Fragestellung
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, mit Hilfe der TaqManâ RT-PCR Methode (Gibson et al. 1996) Assays für den quantitativen Nachweis der Genexpression von MMP-1, der als Helikase eine besondere Bedeutung beim Photoageing zukommt, und ihres spezifi-schen Inhibitoren TIMP-1 zu entwickeln. Nach der Optimierung dieser Systeme sollte
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als Schwerpunkt der Dissertation erstmals der solare UV-Einfluss auf die Genexpres-sion der Hautalterungsmarker MMP-1 und TIMP-1 in vivo quantitativ für individuelle Probanden bestimmt werden. Neben des Effektes von „Solar Simulated Radiation“ (SSR), die einen direkten Bezug zu der auf die Erdoberfläche treffenden solaren UV-Strahlung hat, sollten auch die relativen Wirkungen der UVA- und UVB-Exposition untersucht werden. Zudem war es die Aufgabe, den Einfluss der UV-Strahlung auf die MMP-1 und TIMP-1 mRNA Expression genauer zu lokalisieren und daher außer „intakter“ Haut auch separat die Epidermis und Dermis zu analysieren. Eine weitere Studie sollte aufklären, welche Effekte mehrmalige suberythemale SSR-Expositionen, denen der Mensch in der Natur ausgesetzt ist, auf den MMP-1 und TIMP-1 mRNA Level haben.
Es ist bekannt, dass neben der UV-Strahlung der Sonne auch das Rauchen stark zu einer frühzeitigen Hautalterung beiträgt (Ernster et al. 1995). Da die molekularen Grundlagen der Faltenentstehung durch das Rauchen noch überwiegend ungeklärt sind, sollte ferner die Wirkung des exogenen Faktors Rauchen auf die MMP-1 und TIMP-1 Genexpres-sion geprüft werden.
Parallel dazu sollten vergleichende Untersuchungen auf mRNA und Proteinebene in
vitro Aufschluss über weitere Regulationsmechanismen von MMP-1 und TIMP-1 wie
z. B. den Einfluss reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) geben. Diese in vitro Systeme könnten in Zukunft für die Entwicklung geeigneter protektiver Wirkstoffe zum Schutz vor UV-induzierter Hautalterung Anwendung finden.
Mittels der sensitiven TaqManâ-Technik ist es möglich, trotz limitierter Mengen an Untersuchungsmaterial mehrere Zielgene („Multifaktorscreening“) gleichzeitig zu analysieren. Daher sollten außer den MMP-1 und TIMP-1 Targets zwei weitere TaqManâ-Systeme für potentielle Hautalterungsmarker, für Elastin und sein degradie-rendes Enzym Elastase, etabliert werden, um sie hinsichtlich ihrer Einsatzmöglichkeiten bei in vivo Produktstudien zu prüfen.
2 Material
2.1 Geräte
ABI PRISMâ 7700 Sequence Detection System: PE Applied Biosystems, Weiterstadt Absaugpumpe (Absauggerät Miniport): Servox Medizintechnik GmbH, Köln
Autoklav (GVA 570): Fritz Gössner, Hamburg
Brutschrank (Typ BB16 Cu): Heraeus Instruments, Hanau
Elektrophoresekammer (HorizonÔ Horizontal Gel Electrophoresis System): Gibco BRL, Life Technologies, Eggenstein
Folienschweißgerät (Polystarâ 401 HM): Rische und Herfurth GmbH, Hamburg Geldokumentation:
Kamera (CS-1): Cybertech, Berlin
Monitor (CCTV): Hantarex, Florenz, Italien Printer (P68E): Cybertech, Berlin
UV-Transilluminator (TFX 20M): Vilber Lourmat, Marne la Vallee, Frankreich Video Copy-Processor: Mitsubishi, Japan
Heizblock (Thermomixer 5436): Eppendorf, Hamburg
Heizrührer (Type MR 2002): Heidolph Instruments, Schwabach
Homogenisiergerät (Ultra Turraxâ): IKA Labortechnik GmbH, Staufen
Horizontalschwenker (Typ 3014): Gesellschaft für Labortechnik GmbH, Burgwedel Hybridisierungsofen: Bachofer Laboratoriumsgeräte, Reutlingen
Hybridisierungsröhren: Amersham, Braunschweig Kühlgeräte:
-80 °C: National Lab, Mölln -20 °C: Liebherr, Ochsenhausen +4 °C: Bosch, München
Lichtmikroskop (Typ Wilovert S): Hund GmbH, Wetzlar Lumi-ImagerÔ: Boehringer Mannheim, Mannheim
Material 28
Netzgeräte:
Electrophoresis Constant Power Supply ECPS 3000/150: Pharmacia, Freiburg Power Supply (Typ 1000/500): Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA Nukleinsäurequantifizierungsgerät (GeneQuantâ RNA/DNA Calculator): Pharmacia LKB, England
pH-Meter (Typ 440): Corning, New York, USA Photographieren von Zellen:
Mikroskop (Axiovert 135 TV): Zeiss, Jena
Kamera (CF20 DXC Air): KAPPA Messtechnik, Gleichen Photometer:
Spectra Max 250: Molecular Devices, Sunnyvale, USA
SLT Spectra Image: SLT Labinstruments Deutschland, Crailsheim Pinzetten (gebogen): Bochem Laborbedarf, Weilburg/Lahn
Pipetten (Referenceâ variabel: 0,5–10 µl, 10–100 µl, 100–1000 µl): Eppendorf, Hamburg
Pipettierhilfe (pipetusâ-akku): Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt Quarzglasküvetten (5 mm, blue spot): Hellma, Müllheim
Radiometer (IL-1700): International Light, Newburyport, MA, USA Scheren (gebogen): Hammacher, Solingen
Sterile Werkbank (Lamin Air, Typ HBB 2448 S): Heraeus Instruments, Hanau UVA-Lichtquelle (UVASPOT 400): Dr. Hönle, Planegg-Martinsried
UV-Crosslinker (UV-Stratalinker): Stratagene, La Jolla, CA, USA Vakuumzentrifuge:
Vacuum Concentrator: Bachofer Laboratoriumsgeräte, Reutlingen Kühlfalle: Bachofer Laboratoriumsgeräte, Reutlingen
Vortexer (Vibrofix VF 1 Electronic): IKA Labortechnik GmbH, Staufen Waagen:
AE 200 Delta Range, Mettler, Gießen AT 261 Delta Range, Mettler, Gießen Typ U 4600 P, Sartorius, Göttingen
Wasserbad (Typ 1002): Gesellschaft für Labortechnik GmbH, Burgwedel Zellzählkammer (nach Fuchs-Rosenthal): Brand, Wertheim
Material 29
Zentrifugen:
Kühlzentrifuge (Rotanta RP): Hettich, Tuttlingen Kühlzentrifuge (5417R): Eppendorf, Hamburg Tischzentrifuge (5415C): Eppendorf, Hamburg
2.2 Verbrauchsmaterialien
Deckgläser: Dargartz, Hamburg
Filterpapier für Northern-Blotting (GB 002): Schleicher und Schüll, Dassel Gewebekulturflaschen (T25, T75, T175): Greiner, Frickenhausen
Gewebekulturschalen (Æ 60 mm): Greiner, Frickenhausen Kryoröhrchen mit Innengewinde: Greiner, Frickenhausen
MicroAmpâ Optical Caps (8 caps/strip): PE Applied Biosystems, Weiterstadt MicroAmpâ Optical Tubes (0,2 ml): PE Applied Biosystems, Weiterstadt Mikrotiterplatten (96-well): Greiner, Frickenhausen
Nylonmembran (positiv geladen): Boehringer Mannheim, Mannheim Parafilmâ: American National Can, Chicago, IL, USA
Pasteurpipetten: Brand, Wertheim
Pipettenspitzen gestopft (10 µl, 100 µl, 1000 µl): Biozym, Hessisch Oldendorf oder Aerosol Resistant Tipsâ: Molecular Bio-Products, San Diego, CA, USA Reaktionsgefäße (1,5 ml, 2 ml): Eppendorf, Hamburg
Sterile Pipetten gestopft (5 ml, 10 ml, 25 ml): Greiner, Frickenhausen Sterilfilter (0,2 µm): Sartorius, Göttingen
Transpore-MembranÔ: 3M Health Care, Borken
Zentrifugenröhrchen (15 ml, 50 ml): Greiner, Frickenhausen
2.3 Chemikalien und Reagenzien
Agarose (Ultrapure): Gibco BRL, Life Technologies, Eggenstein
Anti-Digoxigenin-AP (Fab-Fragmente): Boehringer Mannheim, Mannheim a-Tocopherol (Vitamin E): Sigma, Deisenhofen
Blocking-Reagenz: Boehringer Mannheim, Mannheim Borsäure: Sigma, Deisenhofen
Material 30
Bromphenolblau: Merck, Darmstadt Chloroform: Merck, Darmstadt Collagen R: Serva, Heidelberg
DEPC-behandeltes Wasser: Fluka, Neu-Ulm
DIG CDP-StarÔ: Boehringer Mannheim, Mannheim
DIG Easy Hyb Hybridisierungslösung: Boehringer Mannheim, Mannheim Dimethylsulfoxid: Merck, Darmstadt
Dulbecco's Modifiziertes Eagle Medium (DMEM): Gibco BRL, Life Technologies, Eggenstein
DMEM mit 20 mM Hepes: Gibco BRL, Life Technologies, Eggenstein
Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS): PAA Laboratories GmbH, Cölbe
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA): Sigma, Deisenhofen Ethanol: Merck, Darmstadt
Ethidiumbromid (0,7 mg/ml): Eurobio, Raunheim
Fötales Kälberserum (FCS): PAA Laboratories GmbH, Cölbe Formaldehyd: Fluka, Neu-Ulm
Formamid: Fluka, Neu-Ulm
Gentamicin: Gibco BRL, Life Technologies, Eggenstein Glycerin: Sigma, Deisenhofen
Isopropanol: Merck, Darmstadt
L-Glutamin: Gibco BRL, Life Technologies, Eggenstein Magnesiumchlorid: Merck, Darmstadt
Maleinsäure: Merck, Darmstadt
Morpholinopropansulfonsäure (MOPS): Sigma, Deisenhofen MP-Agarose: Boehringer Mannheim, Mannheim
Natriumacetat: Merck, Darmstadt Natriumchlorid: Merck, Darmstadt Natriumcitrat: Merck, Darmstadt Natriumhydroxid: Merck, Darmstadt Neutralrot: Sigma, Deisenhofen
RNAzolÔ: Biozol, Eching oder WAK-Chemie Medical GmbH, Bad Soden/Ts. Nutrient Mixture F-12 HAM: Sigma, Deisenhofen
Material 31
Sodiumdodecylsulfat (SDS): Merck, Darmstadt Sterilium: Bode Chemie, Hamburg
Tris: Merck, Darmstadt
Trypsin-EDTA (10 x): Gibco BRL, Life Technologies, Eggenstein Tweenâ 20: Sigma, Deisenhofen
Wasserstoffperoxid (30 %): Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim Xylencyanolblau: Merck, Darmstadt
2.4 Kits
MMP-1 ELISA: Oncogene, Calbiochem-Novabiochem GmbH, Bad Soden/Ts.
MMP-1/TIMP-1 Komplex ELISA: Oncogene, Calbiochem-Novabiochem GmbH, Bad Soden/Ts.
TIMP-1 ELISA: Oncogene, Calbiochem-Novabiochem GmbH, Bad Soden/Ts. RNeasyâ Total RNA Kit: Qiagen, Hilden
Material 32
2.5 Puffer und Medien
10 x DNA-Probenpuffer 50 % Glycerin, 0,2 % SDS, 0,05 % Bromphe-nolblau, 0,05 % XylencyaBromphe-nolblau, 49,7 % 1 x TBE
10 x MOPS 200 mM MOPS, 50 mM Natriumacetat, 10 mM EDTA, pH 7,0
10 x TBE 900 mM Tris, 900 mM Borsäure, 25 mM EDTA
20 x SSC 3 M NaCl, 300 mM Natriumcitrat, pH 7,0
Auftragspuffer 50 % (v/v) Formamid (deionisiert), 6 % (v/v) Formaldehyd, 1 x MOPS, 0,08 % (w/v) Bromphe-nolblau, 10 % (v/v) Glycerin
Biopsie-Transportmedium DMEM mit 20 mM HEPES, 20 % (v/v) FCS und 0,1 mg/ml Gentamicin
DIG Puffer 1 (Maleinsäurepuffer) 100 mM Maleinsäure, 150 mM NaCl, pH 7,5
DIG Puffer 3 (Detektionspuffer) 100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2, pH 9,5
HDF-Kulturmedium DMEM mit 22,5 % (v/v) F-12, 2 mM L-Glutamin, 50 µg/ml Gentamicin und 10 % (v/v) FCS
Material 33
2.6 HDF-Zellkulturen (in vitro Hautmaterial)
Humane dermale Fibroblasten (HDFs) wurden aus Hautbiopsien isoliert, die bei chirur-gischen Eingriffen im Allgemeinen Krankenhaus St. Georg, Hamburg, im Universitäts-klinikum Eppendorf, Hamburg, oder in der Schönheitsklinik Dr. med. H.-J. G. Barg-mann, Hamburg, anfielen. Die verwendeten Biopsien sind in Tabelle 2.1 aufgeführt.
Tabelle 2.1: Biopsien für die Isolierung von HDF-Zellen
Spender Alter Geschlecht Phototyp Entnahmestelle
1 > 50 M III Schulter 2 53 F ? Gesicht 3 34 F ? Bauch 4 49 F ? ? 5 48 F ? ? 6 41 F II Leiste 7 36 F ? ? 8 50-60 F III Brust
2.7 Stanzbiopsien (in vivo Hautmaterial)
Die in Tabelle 2.2 aufgelisteten gesunden Spender der Stanzbiopsien wurden im Labor von Prof. Dr. Antony R. Young (Department of Environmental Dermatology, St. John's Institute of Dermatology, King's College London, St. Thomas' Hospital, London, UK) rekrutiert. Jeder Proband wurde über die Durchführung der Studien genau informiert und gab sein schriftliches Einverständnis zur Teilnahme an den Studien, die von der Ethikkommission des St. Thomas' Hospital zuvor genehmigt worden waren.
Material 34
Tabelle 2.2: Stanzbiopsien
Spender Alter Geschlecht Phototyp Raucherstatus
1 24 F II 10/Tag 2 33 M I Nichtraucher 3 45 M II Raucher 4 27 M II Nichtraucher 5 28 F II 20/Tag, 6 Jahre 6 31 M II 10/Tag 7 25 F II Nichtraucher 8 33 M II 20/Tag, 16 Jahre 9 29 F I Raucher 10 23 M II Nichtraucher 11 20 F II Nichtraucher 12 20 F II Nichtraucher 13 35 M I 3/Tag, 18 Jahre 14 19 F II Nichtraucher 15 24 M II 15/Tag, 10 Jahre 16 27 M II 20/Tag, 12 Jahre 17 19 M II Nichtraucher 18 19 F II 20/Tag, 3 Jahre 19 36 M II Nichtraucher 20 34 F II Nichtraucher 21 35 M I Nichtraucher 22 19 F II Nichtraucher 23 35 M II 12/Tag, 18 Jahre 24 26 M II 20/Tag, 10 Jahre 25 22 M II 13/Tag, 6 Jahre 26 22 F II 20/Tag, 3 Jahre 27 22 M II Nichtraucher 28 27 M II Ex-Raucher 29 24 M II Ex-Raucher 30 31 M II Nichtraucher 31 29 F II Nichtraucher 32 21 F I Nichtraucher 33 20 M II Nichtraucher
Material 35
Spender Alter Geschlecht Phototyp Raucherstatus
34 23 F II Ex-Raucher 35 21 F II Nichtraucher 36 27 F II Nichtraucher 37 24 F II Nichtraucher 38 24 F II Nichtraucher 39 27 M II Nichtraucher
2.8 Oligonukleotide
2.8.1 Northern-SondenDie Sonden für die Northern-Analyse wurden von Herrn H. Mielke (Kst. 4212, Beiers-dorf AG, Hamburg) bereitgestellt.
Isolierte Gesamt-RNA aus HDF-Zellen wurde mit Hilfe des First-Strand cDNA Synthe-sis Kits von Pharmacia Biotech Europe GmbH, Freiburg, in cDNA umgeschrieben. Spezifische HPLC-gereinigte Primer für die Synthese der jeweiligen Sonde wurden von MWG Biotech, Ebersberg, bezogen. Nach der PCR mit den in Tabelle 2.3 aufgeführten Oligonukleotiden wurden die Amplifikate mit dem DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7), Boehringer Mannheim, in vitro transkribiert und DIG-markiert.
Tabelle 2.3: Primer für die Northern-Sonden
Target Primer Sequenz (5'-3') Amplifikat
GAPDH pGAP-3 GTCTTCACCACCATGGAGAAGGC 395 bp + T7
(26 bp) pGAP-T7-3 TTCTAATACGACTCACTATAGGGAGGG GCCATGCCAGTGAGCTTCCC MMP-1 COLA-NO-2 AGCAAATGCAGGAATTCTTTGGGC 538 bp + T7 (26 bp) COLA-NO-T7 TCCTAATACGACTCACTATAGGGAGGA CCACTGAAGGTGTAGCTAGGG
Material 36
2.8.2 TaqManââââ RT-PCR Primer und Sonden
Die HPLC-gereinigten Primer und Sonden für die TaqManâ RT-PCR Reaktionen wurden bei PE Applied Biosystems, Weiterstadt, erworben. Die TaqManâ-Sonde für das Housekeeping-Gen GAPDH wurde vom Hersteller mit dem Reporter-Farbstoff VIC markiert. Die übrigen Sonden wurden von PE Applied Biosystems am 5'-Ende mit dem Fluoreszenzfarbstoff FAM versehen.
Die Oligonukleotidsequenzen und die entsprechenden Amplifikatlängen für die einzel-nen TaqManâ RT-PCR Systeme sind in Tabelle 2.4 dargestellt.
Tabelle 2.4: TaqManâ RT-PCR Systeme
Target Oligonukleotide Sequenz (5'-3') Amplifikat
GAPDH Forward Primer TGGGTGTGAACCATGAGAAG 76 bp
Sonde CCTCAAGATCATCAGCAATGCCTCC
Reverse Primer GCTAAGCAGTTGGTGGTGC
MMP-1 Forward Primer AGCTAGCTCAGGATGACATTGATG 73 bp
Sonde CATCCAAGCCATATATGGACGTTCC
CAAA
Reverse Primer CCGATGGGCTGGACAGG
TIMP-1 Forward Primer TGGTGTCCCCACGAACTTG 63 bp
Sonde CCCTGATGACGAGGTCGGAATTGC
Reverse Primer CACCCACAGACGGCCTTC
Elastin Forward Primer AGTTTCCCTGTGGTGTAGGGC 90 bp
Sonde TCCATAGCCACCAGGCAGCTTGG
Reverse Primer GGGACCGCAACCTGGAGT
Elastase Forward Primer TGCACGTTGGCGTTGATG 90 bp
Sonde CCGACCCGTTGAGCTGGAGAATCAC
3 Methoden
3.1 Zellkulturtechnik
Alle Zellkulturarbeiten wurden unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Der Zustand und Konfluenzgrad der HDF-Zellen wurde regelmäßig lichtmikroskopisch überprüft.
3.1.1 Isolierung von HDF-Zellen
Humane dermale Fibroblasten wurden aus der Dermis von humanen Hautbiopsien isoliert (Tabelle 2.1).
Vorbereitend wurden Zellkulturschalen mit Collagen R (2 mg/ml in 0,1 % Essigsäure) unter der Sterilbank beschichtet. Nach dem Erhalt einer Hautbiopsie wurde diese direkt dem RT-warmen Transportmedium entnommen. Das Unterhautfettgewebe wurde präparativ entfernt, und die Biopsie wurde in ca. 5 mm x 5 mm große Stücke geschnit-ten. Mit der Epidermis nach oben und der Dermis nach unten orientiert wurden jeweils ein bis drei Hautstücke auf den mit Collagen R beschichteten Boden einer Zellkultur-schale überführt. Nach dem Antrocknen wurden die Biopsien vorsichtig mit 5 ml HDF-Medium pro Kulturschale überschichtet, ohne dass sich die Hautstückchen vom Boden lösten, und im Brutschrank bei 37 °C, 7 % CO2-Partialdruck und Wasserdampfsätti-gung inkubiert. Nach einigen Tagen konnten auswachsende Keratinozyten beobachtet werden, die zunehmend von Fibroblasten in dem für sie optimalen HDF-Medium verdrängt wurden. Beim Erreichen einer Konfluenz von ca. 80-90 % der primären HDF-Zellen wurden die Biopsiestücke verworfen und die Zellen in T75-Zellkulturfla-schen umgesetzt.
3.1.2 Kultivierung von Zellkulturen
Die HDF-Zellen wurden in HDF-Medium im Brutschrank bei 37 °C, 7 % CO2 -Partialdruck und Wasserdampfsättigung der Luft kultiviert. Alle zwei bis drei Tage
Methoden 38
wurde das Medium der Gewebekulturflaschen oder -schalen erneuert. Bei einer Konflu-enz von ca. 80-90 % wurden die adhärenten, als Monolayer wachsenden Fibroblasten passagiert. Dafür wurde unter der Sterilbank das HDF-Medium abgesaugt, und die Zellen wurden mit PBS ohne Ca2+- und Mg2+-Ionen gewaschen. Durch Zugabe von 10 x Trypsin-EDTA für 30 sec, Absaugen der konzentrierten Enzymlösung und einer anschließenden sechsminütigen Inkubation im 37 °C-Brutschrank erfolgte das Ablösen des Zellrasens. Dieser Verdau wurde durch das Aufnehmen der Fibroblasten in HDF-Medium abgestoppt, da das FCS des HDF-Mediums das Trypsin inaktiviert. Im Verhältnis 1:3 wurden die Zellen in neue Zellkulturflaschen (ca. 106 Zellen/T175) oder für Versu-che in Zellkulturschalen (1,5 x 105 Zellen/60 mm, Passage: 3-24) ausgesät.
3.1.3 Zellzahlbestimmung nach Fuchs-Rosenthal
Die Zellzahlbestimmung erfolgte nach der Methode von Fuchs-Rosenthal. Die mit einem Deckglas versehene Zählkammer wurde mit ca. 20 µl einer HDF-Zellsuspension (abtrypsinierte Fibroblasten in HDF-Medium) bestückt. Zur Ermittlung der Gesamt-zellzahl wurden fünf große Quadrate (1 mm2) bestehend aus 16 kleinen (0,06251 mm2, Tiefe: 0,2 mm) unter dem Lichtmikroskop ausgezählt, wobei die Zellen auf den oberen und rechten Grenzen einbezogen wurden. Die Gesamtzellzahl ergab sich aus folgender Gleichung:
[ ]
ml V N Ngesamt =å
GQ ´ 3´ 5 10 (3.1) Ngesamt = GesamtzellzahlN5GQ = Zellzahl der 5 großen Quadrate
V = Gesamtvolumen
3.1.4 Einfrieren und Auftauen von Zellen
Zur langfristigen Lagerung von HDF-Zellen wurden diese in flüssigem Stickstoff einge-froren: Die Zellzahl abtrypsinierter Fibroblasten wurde bestimmt und die Zellsuspen-sion für 5 min bei 900 rpm (4 °C) aufkonzentriert. Das Pellet wurde in HDF-Medium mit 10 % DMSO aufgenommen, so dass eine Endkonzentration von 106 Zellen/ml
Methoden 39
vorlag. Pro Kryoröhrchen wurden 1 ml Zellsuspension zunächst auf Eis gehalten, dann bei -20 °C vorgekühlt, bei -80 °C über Nacht eingefroren und schließlich in flüssigem Stickstoff bei -196 °C eingelagert.
Zum Auftauen der Fibroblasten musste das entsprechende Kryoröhrchen kurz zum Druckausgleich für den entweichenden Stickstoff geöffnet werden. Die aufgetauten HDF-Zellen wurden in 12 ml HDF-Medium aufgenommen, in eine T75-Gewebekultur-flasche überführt und über Nacht im 37 °C-Brutschrank inkubiert. Um die Reste des toxischen DMSOs zu entfernen, wurde direkt am nächsten Tag ein Medienwechsel durchgeführt.
3.2 Inkubation von HDF-Zellen mit verschiedenen Substanzen
3.2.1 Inkubation mit aaaa-TocopherolAls Stammlösung wurden 200 mg des Antioxidans a-Tocopherol (Vitamin E) pro ml Ethanol mit Hilfe des Vortex-Gerätes gelöst, mit Argon überschichtet, aliquotiert und bei -20 °C gelagert. Entsprechende Mengen der Stammlösung wurden in HDF-Medium aufgenommen und mit einer Endkonzentration von 3 mM, der im Labor gängigen, durch Zytotoxizitätstests ermittelten Konzentration, nach kräftigem Vortexen für die Experimente eingesetzt. Dabei wurde das Ethanol stärker als 1:100 verdünnt, so dass eine zytotoxische Wirkung dieses Lösungsmittels ausgeschlossen werden konnte (Labordaten). Generell wurde das lichtempfindliche Vitamin E soweit möglich vor UV-Einfluss geschützt.
1,5 x 105 Fibroblasten wurden pro 60 mm-Gewebekulturschale in HDF-Medium ausge-sät und 1-2 Tage im 37 °C-Brutschrank kultiviert. Die Zellen wurden mit PBS gewa-schen und für 24 h mit 3 mM Vitamin E im 37 °C-Brutschrank inkubiert. Als Kontrol-len wurden parallel Ansätze mit HDF-Medium ohne Antioxidans eingesetzt. Im Anschluss an die Inkubation mit a-Tocopherol wurden die HDF-Zellen mit UVA bestrahlt, oder die Gesamt-RNA wurde direkt für die Analyse der MMP-1 und GAPDH mRNA mittels Northern-Analyse isoliert.
Methoden 40
3.2.2 Inkubation mit H2O2
HDF-Zellen wurden durch exogene Exposition mit H2O2 oxidativem Stress ausgesetzt. 1,5 x 105 Fibroblasten wurden pro 60 mm-Zellkulturschale in HDF-Medium ausgesät und 1-2 Tage im 37 °C-Brutschrank kultiviert. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und in Anlehnung an Brenneisen et al. (1997) mit frisch angesetztem 0,1 bzw. 1 mM H2O2 in HDF-Medium oder PBS (mit Ca2+- und Mg2+-Ionen) für 1 h im 37 °C-Brut-schrank nebst entsprechenden Kontrollen inkubiert. Anschließend wurde die H2O2 -Lösung entfernt und durch frisches HDF-Medium ersetzt. Nach 24 h Inkubation im 37 °C-Brutschrank wurde die RNA isoliert und die MMP-1, TIMP-1 und GAPDH mRNA-Expression der HDF-Zellen mittels TaqManâ RT-PCR bestimmt.
3.3 Zytotoxizitätstest mit Neutralrot
Nach Borenfreund und Puerner (1985) kann die Neutralrot-Aufnahmekapazität von Zellen als ein Maß für die Zytotoxizität eines Agens genommen werden. Neutralrot (2-Amino-3-methyl-7-dimethylamino-phenazoniumchlorid) wird als Supravitalfarbstoff von intakten Zellen in den Lysosomen akkumuliert, wobei sich die schwach positiv geladenen Gruppen des Farbstoffs an die negativ geladenen Gruppen der lysosomalen Matrix anlagern. Werden Zellen durch toxische Substanzen oder Strahlung geschädigt, wird dieser Prozess beeinträchtigt. Tote Zellen nehmen überhaupt kein Neutralrot mehr auf.
Der Neutralrot-Test wurde als Viabilitätstest für die mit verschiedenen Wirksubstanzen inkubierten bzw. UVA-bestrahlten Fibroblasten verwendet: Die HDF-Zellen wurden im Anschluß an die jeweilige Behandlung mit PBS (mit Ca2+- und Mg2+-Ionen) gewaschen und für 2,5 h mit je 2 ml Neutralrot-Gebrauchslösung pro Gewebekulturschale im 37 °C-Brutschrank inkubiert. Nach Absaugen des Neutralrots und Waschen der Zellen mit PBS (mit Ca2+- und Mg2+-Ionen) wurde das in den Lysosomen akkumulierte Neutralrot während eines 10-minütigen Schüttelns der Fibroblasten bei 70 UpM in essigsaurem Alkohol (2 ml/Schale) durch Fixierung und Aufschluss der Zellen wieder freigesetzt. Eine 96-well Mikrotiterplatte wurde mit je 150 µl/well Ansatz bestückt, und
Methoden 41
die Neutralrot-Aufnahme wurde in sechsfach Ansätzen im Spektralphotometer bei 540 nm gemessen.
3.4 UV-Bestrahlung
3.4.1 UVA-Bestrahlung von HDF-Zellkulturen
Die UVA-Bestrahlung der HDF-Zellen erfolgte mittels einer UVASPOT 400 Licht-quelle mit UVB- und UVC-Sperrfilter. Das Emissionsspektrum dieser UV-Quelle ist in der Abbildung 8.6 im Anhang zu finden. Vor jedem Experiment wurde die Leistung der betriebswarmen UVA-Röhren mit einem IL-1700 Radiometer, dessen UVA-Messkopf mit einer Transpore-MembranÔ versehen wurde, bestimmt. Die spektrale Empfindlich-keit der UVA-Sonde lag bei 326-402 nm mit einem Sensitivitätsmaximum bei 368 nm. In der Regel wurde ein Strahlungsfluss von 4,5 x 10-3 - 5 x 10-3 W/cm2 in der Proben-ebene gemessen, wobei der Abstand zwischen der UV-Quelle und den zu bestrahlenden Zellen 50 cm betrug. Die Wärmeentwicklung der Lichtquelle wurde durch einen Venti-lator in der Bestrahlungseinheit ausgeglichen.
Die jeweilige Bestrahlungszeit wurde wie folgt berechnet:
[ ]
= êëé 2úûù¸ êëé 2úûù cm W Leistung cm J Dosis sec gszeit Bestrahlun (3.2)1,5 x 105 HDF-Zellen wurden pro 60 mm-Gewebekulturschale ausgesät und 2,5 Tage im 37 °C-Brutschrank kultiviert. Nach zweimaligem Waschen mit PBS wurden die Fibroblasten in PBS (mit oder ohne Ca2+- und Mg2+-Ionen) mit verschieden starken UVA-Dosen bestrahlt. Dabei waren die Zellkulturschalen nur mit einer Transpore-MembranÔ zum Schutz vor Kontaminationen bedeckt, wodurch eine UVA-Absorption durch das Medium oder den Kulturschalendeckel ausgeschlossen wurde. Nach der Bestrahlung oder dem Belassen der entsprechenden Kontrollen in der dunklen Steril-bank wurde das PBS abgesaugt, und die Zellen wurden mit neuem HDF-Medium (mit oder ohne FCS) für 24 h oder die angegebenen Zeiträume im 37 °C-Brutschrank
inku-Methoden 42
biert. Im Anschluss konnte die MMP-1, TIMP-1 und GAPDH mRNA- bzw. Proteinex-pression der HDF-Zellen analysiert werden.
3.4.2 SSR-Bestrahlung in vivo
23 Probanden (siehe Tabelle 2.2, Spendernummer 1-17 und 34-39) wurden im Labor von Prof. Dr. Antony R. Young (Department of Environmental Dermatology, St. John's Institute of Dermatology, King's College London, St. Thomas' Hospital, London, UK) unter Verwendung eines Sonnensimulatoren (Oriel Solar Simulator, Modell 81292, Oriel Instruments, Stratford, USA) mit „solar simulated radiation“ (SSR, 290-400 nm) bestrahlt. Der 1 kW leistungsstarke Sonnensimulator enthielt einen WG320 Filter und entsprach damit der COLIPA (European Cosmetic, Toiletry and Perfumery Industry) Norm. Die Dosis der Strahlung wurde mit einem Doppelmonochromator-Spektroradio-meter (Bentham Instruments, Reading, United Kingdom) ermittelt und routinemäßig mit einem Breitband-Thermopile-Radiometer (Medical Physics, Dryburn Hospital, Durham, United Kingdom) kontrolliert. In Abbildung 8.7 ist das Emmisionsspektrum des Oriel Solar Simulators dargestellt. Die Bestrahlungsstärke des SSR auf der Haut betrug ca. 13 mW/cm2, wobei der Abstand zwischen der UV-Quelle und der zu bestrahlenden Haut bei 11 cm lag. Die Anteile der einzelnen UV-Bereiche an der SSR-Strahlung sind in Tabelle 3.1 detailliert aufgeführt. Für jeden Probanden wurde visuell und mit Hilfe eines Erythemeters (Dia-Stron, Andover, UK) die spezifische Minimale Erythemale Dosis (MED) auf 1 cm2 großen Arealen des oberen Abdominalbereiches 24 h nach der Bestrahlung bestimmt.
Tabelle 3.1: UV-Anteile des Oriel Solar Simulators UV-Bereich
[nm] Bestrahlungsstärke[mW/cm2] Bestrahlungsstärke[%] Erythemwirksamkeit[%]
UVA (321-400) 1,17E+01 91,5 12,3
UVB (281-320) 1,08E+00 8,5 87,6
UVC (200-280) 1,17E-04 0,0 0,2
