Eine empfindliche Methode zur Bilirubinbestimmung

444 Bartels u. Böhmer: Empfindliche Methode zur Bilimbinfcestimmung Z. klin. Chem. u. klin. Biochem.

7. Jg., S. 444—447, September 1969

Eine empfindliche Methode zur Bilirübinbestimmung

Von H. BARTELS und M. BÖHMER

Aus dem Chemischen Laboratorium des Bürgerspitals Basel

(Eingegangen am 8. April 1969)

Es wird eine Methode zur Bilirübinbestimmung beschrieben, welche als Diazokomponente das stabilisierte 2-Chlor-4-nitroanilin ver- wendet. Gekuppelt wird in saurem Milieu in Gegenwart von Ultravon als Löslichkeitsvermittler. Die Technik ist so konzipiert, daß lediglich eine Verdünnung und eine Pipettierung notwendig sind. Die Reagenzien sind stabil und preiswert, der Leerwert kann für Rou- tinezwecke vernachlässigt werden.

A sensitive method for the determination of bilirubin

A method is described for the determination of bilirubin, which employs the stabilised 2-chloro-4-nitroaniline as the diazo component.

Coupling is performed under acidic conditions in the presence of ultravone as the solubilising agent. The operation is designed so that only one dilution and one transfer by pipette are necessary. The reagents are stable and economical. For scanning purposes the blank may be ignored.

Die Kenntnis der Bilirubinkonzentration im Serum ist auch heute noch ein wichtiges Indiz zur Beurteilung von Schwere und Verlauf der verschiedenen Ikterusformen.

Im klinisch-chemischen Routinelabor wird sie durch die photometrische Messung des Kupplungsproduktes mit diazotierter Sulfanilsäure bestimmt. Unter Abspaltung eines Carboniumions reagiert das Diazoniumsalz in zwei Schritten zu einem Azofarbstoff mit * Indikator- eigenschaf ten: im stark sauren Bereich ist er blau, im neutralen rot und bei alkalischer Reaktion wieder blau (1).

R' R R" R" R R' '==( \ j f \ jf

X X >

l l I

H H H H H H

O N ' , . . . .

A A A 11

OH®

R R1 R R"

l l l II H H H N

. .. N-H l l l II H H H N

Reaktionsschema S. = Subslituentcn

Der molare Extinktionskoeffizient des Reaktions- produktes ist — bei der am meisten verwendeten Methode, welche im alkalischen Bereich mißt — am Maximum um 600 nm nur etwa 6,9 · 104.cm2/Mol (2);

man muß daher mit einer geringen Serumverdünnung arbeiten. Außerdem ist die Extinktion des Leerwert- ansatzes bei dieser Wellenlänge unter anderem von der Bilirubinkonzenträtion abhängig. Die Methode bedingt eine ganze Anzahl von Pipettierungen, die Diazo- komponente muß täglich frisch zubereitet werden.

Fragestellung

Unter Beibehaltung des seit über 80 Jahren bewährten Reaktionsmechanismus wollten wir eine * rationelle Technik entwickeln, die es dank eines höheren Extink- tionskoeffizienten des Kupplungsproduktes erlauben sollte, weniger Serum einzusetzen; möglicherweise würde sich der Leerwert erübrigen. Neben einem hohen Extinktionskoeffizieiiten des Kupplungsproduktes sind für die Diazokomponente noch folgende Kriterien zu erfüllen:

1. Sie muß sehr leicht zugänglich sein, sowie — auch in Lösung — über längere Zeit stabil bleiben.

2. Die Kupplungsreaktion soll schnell ablaufen, damit keine Wartezeiten auftreten.

3. Die maximale Extinktion soll bei einer Wellenlänge liegen, bei der der Leerwert eine minimale Extinktion aufweist.

Versucht wurde5 die Sulfanilsäure durch andere sub- stituierte Anilinderivate bzw. durch im Handel befind- liche, stabilisierte Diazoniumsalze zu ersetzen. Hier kommen besonders solche Substituenten in Frage, wel- che einen elektrophilen Charakter haben. Einerseits lassen sie eine Farbvertiefung erwarten und zudem eine schnelle Kinetik, da die positive Ladung am Diazo- stickstoff erhöht wird. Des weiteren versuchten wir, die

Z. klin. Chem. u. klin. Biochem. / 7. Jahrg. 1969 / Heft 5

Bartels u. Böhmen Empfindliche Methode zur Bilirubinbestimmung 445 in der Farbstoffchemie oft benutzte Fähigkeit gewisser

Azofarbstoffe, Metallkomplexe zu bilden, analytisch auszuwerten. Das diazotierte Bilirubin hat ebenfalls eine für Komplexbildung günstige Struktur:

Uiazo -Bilirubin

Kupferkomplex des Oiazo - Biliru bins

c

Unter Beteiligung des Stickstoffs im Pyrolkern können Chelate gebildet werden.

Ergebnisse

In Tabelle l sind die untersuchten Anilinderivate mit den entsprechenden Wellenlängen der maximalen Absorption und dem molaren Extinktionskoeffizienten zusammengestellt. Es kam uns hier nicht darauf an, Präzisionsmessungen durchzuführen, sondern einen Eindruck von der Variabilität der Farbtiefe und des Farbtons als Funktion der Substituenten zu bekommen.

Tab. l

Extinktionskoeffizienten von verschiedenen Diazobilirubinen

, [/7/600 7]

Abb. l

650 700 750

Anilinderivat (nm) c(cmz/Mol) pH

2-Chloranilin

2-Jodanilin 590

570 ^{0,65 ·}0,24 ·10«

10« 11,8

11,8

3-Jodanilin 590 0,32 - 106 11,8

4-Chloranilin

4-Jodanilin 590

590 0,24 - 10*

0,35 · 10» 11,8 11,8 2,4-Dichloranilin 600 0,70-10* 11,8 2-Chlor-4-nitroanilin 660 0,91 · l O5 11,8 2,4-Dibromanilin 590 0,61-10* 11,8

2,5-Dibromänilin 590 0,52 · 105 11,8

2,4,5-Trichloranilin Sulfanilsäure Echtrotsalz B Echtblausalz B B

600605 665620

0,71 · 10*

0,69 · 105

0,78 - 105

1,00· 10*

11,811,8 11,9n,

2-Chlor-4-nitro-anilin und Echtblausalz BB bewirken einen intensiven bathochromen Shift der Absorptions- bande und weisen auch einen hohen molaren Extink^

tionskoeffizienten auf. Die Reaktion ist jedoch für Echtblausalz BB sehr heikel, da die Kupplung erst oberhalb von pH 7 genügend schnell abläuft, wo das Reaktionsprodukt der Autoxydation unterliegt und schnell ausbleicht.

Versuche, die Komplexbildung mit Metallsalzen zur Farbvertiefung heranzuziehen, schlugen fehl: Zwar reagieren Kupfer-, Nickel- und Kobaltionen zu schön gefärbten Komplexsalzen, und es tritt auch eine batho- chrome Verschiebung der Absorptionsbande auf, aber gleichzeitig eine Verbreiterung. Der Extinktionskoef- fizient ist niedriger.

Es war von Interesse, den Einfluß der Schwermetall- ionen des Serums auf die Nachweisreaktion des Bili- rubins zu untersuchen. Wäßrige Bilirubinlösungen wurden in Gegenwart von physiologisch möglichen Metallionenkonzentrationen gekuppelt: 500^g/100 m/

an Cu, Fe und Co haben keinen meßbaren Einfluß auf

Spektrum des Kupferkomplexes von Diazobilirubin 5 ml Harnstoff/Na-Benzoat

0,5 ml Bili-Control 20 mg/100 ml 0,25 ml diazotierte Sulfanilsäure

(10 ml Sulfanilsäure , in 0,25M HC1 + 0,1 ml NaNO8 0,1 M) pH 6,6

0,2 mf CuSO4 · 5 H2O 100 mg/100 ml

die Absorptionsbande des mit diazotierter Sulfanilsäure und Bilirubin erhaltenen Farbstoffes. Die weiteren Experimente wurden mit 2-Chlor-4-nitroanilin durchge- führt. Diese Verbindung läßt sich wegen der in ver- dünnter Säure geringen Löslichkeit nicht so leicht diazotieren, wie z. B. Sulfanilsäure. Aus diesem Grunde sahen wir davon ab, die Diazotierung täglich auszu- führen. Wir stellten das entsprechende Diazoniumsalz dar und brachten es mitNaphthalin-l,5-disulfosäurezur Fällung. Dieses stabilisierte Salz ist sehr gut löslich und in saurem Milieu auch über mehrere Wochen (wir prüften bis zu sechs Wochen) genügend stabil, solange kein Licht Zugang hat. Diese Tatsache veranlaßte uns, die Kupplung bei saurem pH vorzunehmen, was .-weiterhin den Vorteil hat, daß das Bilirubin Oxydations- stabil ist. Die Elektrophilie der Diazogruppe reicht aus, um bei einem pH von <^2 eine hinreichend schnelle Kinetik der Kupplung zu erhalten.

Schwierig ist hingegen, das nicht glucuronidierte Bili- rubin bei stark saurem pH in Lösung zu bringen, so daß die Farbbildung trotzdem nur sehr langsam abläuft. Als Löslichkeitsvermittler bei der Kupplung im Neutral- bereich werden verschiedene Substanzen zugesetzt.

Benzoesäure ist aber bei saurem pH nicht löslich, Diphyllin oder Coffein unwirksam, Methanol bewirkt Trübungen. HILLMANN (3) schlägt die Verwendung von Äthylenglykol vor, das aber wegen der hohen Viskosität unpraktisch ist. Mischungen aus Methanol und Äthylen- glykol stellen einen Kompromiß dar. Noch befriedigen- dere Resultate erhält man bei Verwendung von Dis- persionsmitteln, die in der präparativen industriellen Chemie verwendet werden. Wir haben eine Reihe dieser bezüglich ihrer akzelerierenden Wirkung auf die Farb- bildung untersucht und Ultravon JF¹), Neolansalz P¹) und Teepol²) als sehr wirksam befunden. Bei Verwen- dung von Teepol treten jedoch hin und wieder Nieder- schläge auf. Die beiden übrigen Substanzen beschleuni- gen die Umsetzung von diazotiertem 2-Chlor-4-nitro- anilin und Bilirubin / Albumin (Bili-Control Merz &

*) Ciba AG, Basel.

2) Shell Corp.

Z. klin. Chem. u. klin. Biochem. / 7. Jahrg. 19697Heft 5

446 Bartels u. Böhmer: Empfindliche Methode zur Bilirubinbestimmung Dade) bei pH 1,8 und einer Konzentration von 10 mg/

100 ml des Ansatzes so stark, daß nach 3 Minuten be- reits > 98% umgesetzt sind.

Bezüglich der differenzierten Bestimmung des glucuro- nidierten Bilirubins — dem „direkt reagierenden" — ist zu bedenken, daß bei neutralem oder gar alkalischem pH das unglucuronidierte Bilirubin ebenfalls in Lösung geht und schneller diazotiert wird. Die Erfassung der glucuronidierten Verbindung sollte daher mit einer möglichst schnell kuppelnden Diazokomponente ge- schehen. Da die Reaktionsordnung der Farbreaktion komplexer Natur ist, lassen sich keine Geschwindigkeits- konstanten berechnen. Qualitative Versuche, bei denen, wie herkömmlich die Extinktion nach l Minute als Maß genommen wurde, machen wahrscheinlich, daß z. B. das 2,4-Dichloranilin und 2-Chlor-4-nitro-anilin der Sul- fanilsäure überlegen sind, indem sie bei gleichem pH um einiges schneller reagieren.

Um herauszufinden, bei welcher Wellenlänge der Serum- leerwert am kleinsten ist, nahmen wir die Spektren einer Reihe verdünnter Seren auf. Ansätze, welche mit Ultravon/Salzsäure und Fehling II-Lösung — in der Art wie unter „Methodisches" angegeben —· verdünnt wurden, zeigten, daß die Lösungen oberhalb von 640 nm nahezu optisch leer waren, so daß eine Messung mit Vorteil hier ausgeführt wird.

Methodisches Reagenzien

Die Reagenzien stammen, wenn nichts anderes erwähnt, von Merck A.G. Darmstadt oder Fluka Buchs/SG (Schweiz). Das Diazo-2-chlor-4-nitro-anilin wurde selbst hergestellt. Falls die Substanzen nicht chromato- graphisch rein waren, wurden sie umkristallisiert, bis dieses Kriterium zutraf.

Darstellung des stabilisierten Diazoniumsal- zes von 2-Chlor-4-nitro-anilin

Zu 30 m/ demineralisiertem Wasser gibt man l g Dis- persionsmittel (Ultravon W, Brandoran A), 60 g 33proz.

Salzsäure und innerhalb 15 Minuten unter Rühren 31,6 g fein pulverisiertes, getrocknetes 2-Chlor-4-nitro- anilin. Nachdem eine homogene Dispersion erhalten wurde, wird 100 g fein gestoßenes Eis zugesetzt, wonach die Temperatur auf —8° fällt. Nunmehr werden unter die Flüssigkeitsoberfläche (!) 32,5 ml40proz. NaNO2- Lösung innerhalb 5 Minuten zugegeben. Die ablau- fende Reaktion wärmt die Lösung auf 7—8° auf.

Nachdem 30 Minuten gerührt wurde, ist die Base fast restlos in Lösung gegangen. Den filtrierten Ansatz tropft man unter Rühren in eine konzentrierte Lösung von Naphthalin-l,5-disulfosäure. Der rot-orangene Nieder- schlag wird abfiltriert und im Vakuum getrocknet.

Reagenz-Lösungen

Dia^olosung 0,106 mM 2-Chlor-4-nitro-anilin.

50 mg des stabilisierten Diazo-2-chlor-4-nitro-anilins werden mit 100 m/IN HC1 und 10 m/ Ultravon gelöst

und mit demineralisiertem Wasser auf 1000 m/ aufge- füllt. (Im Dunkeln bei 4° mindestens l Monat haltbar.) Fehling II-Lösung Tartrat 0,3725 M, NaOH 0,625 N.

105 g Kalium-Natriumtartrat und 25 g Natrium-hy- droxid werden auf 1000 m/ aufgefüllt (unbeschränkt haltbar).

Meßansatz

0,1 m/ Serum wird in l ml Diazolösung pipettiert und nach 3 Minuten mit l ml Fehling II-Lösung versetzt.

Gemessen wird bei 660—-680 nm oder bei der Hg-Linie 691 nm. ' .

Diskussion der Methode

Die ausgearbeitete Methode benützt das stabilisierte Diazoniumion des 2-Chlor-4-nitro^anilins als Kupplungs- komponente. Die Reaktion findet bei pH 2 statt, wobei das unkonjugierte Bilirubin durch Ultravon in Lösung gebracht wird. Anschließend wird alkalisch gestellt, so daß die Lösung von rot nach blau umschlägt. Eine Standardkurve, welche aus einer Bilirubin/Albumin- Lösung verdünnt wird, gehorcht dem LAMBERT- BEERschen Gesetz bis zu einer Konzentration von 15 mg/100 ml Bilirubin. Störende Substanzen konnten wir nicht finden. In saurem Ansatz beruht das Ausmaß der roten Farbe zum größten Teil auf der Konzentration des Kupplungsproduktes mit Bilirubin. Der Rest geht auf Reaktionsprodukte mit Histidin und Tyrosin zurück, die aber oberhalb pH H nicht in eine blaue Farb- komponente umschlagen. Mit einer reinen Albumin- lösung von 8 g/100 m/ findet man eine Extinktion für pH 11 bei einer Wellenlänge um 660 nm, welche etwa 100 //g/100 m/Bilirubin vortäuscht. Das gleiche gilt für den größten Teil der Seren. Lediglich bei sehr stark lipämischen Proben läßt sich ein größerer Leerwert messen: für Seren mit der Extinktion von 134 (bei 600 nm) fanden wir Leerwerte, die eine Konzentration von 0,4 mg/100 m/ Bilirubin vortäuschen. Das zuge- setzte Ultravon vermag nicht nur das Bilirubin in Lösung zu bringen, sondern auch einen Teil des Fetts zu dispergieren. Im folgenden führen wir einige Kri- terien an, welche die Brauchbarkeit der beschriebenen Technik demonstrieren sollen:

Ein wichtiges Argument ist die Reprodu^ierbarkeit der gefundenen Werte. Diese schätzen wir ab, indem Doppelbestimmungen in je zwei verschiedenen Serien durchgeführt wurden. Um den „psychologischen Effekt"

bei der Ablesung auszuschalten, wurde nicht ein be- stimmtes Serum, sondern täglich ein anderes, das jeweils am Vortage analysiert worden war, in die Serie gegeben.

Aus der graphischen Darstellung (Abb. 2) ist ersicht- lich, daß die auftretenden Fehler über einen weiten Konzentrationsbereich ±3% nicht überschreiten, was für klinische Zwecke voll ausreichend ist.

Eine Vorstellung über die Spe^ifität der Methode wurde gewonnen, indem mit einer Referenzmethode Ver- gleichswerte erhalten wurden. Als Referenzmethode 2. klin. Chem. u. klin. Biochem. / 7. Jahrg. 1969 / Heft 5

Bartels u. Böhmcr: Empfindliche Methode fcur Bilirubinbestimmung 447

10

1. Bestimmung

2. Bestimmung 6 8 10

Bilirubm [mg/loomf\ ^1Z

Abb. 2

Reproduzierbarkeit der Bilirubinbestimmung unter Routinebedin- gungen an zwei aufeinanderfolgenden Tagen.

1Z 10

.

D i - Chlor'-4 -nitroonilin

Diozosulfanil säure l i _ 6 ' 10

Bilirubin \mg/100ml~\ 1Z

Abb. 3

Darstellung von Wertepaaren, die einerseits mit der hier beschriebenen Methode und andererseits mit der klassischen Sulfanilsäure-Technik

erhalten wurden.

wählten wir die von MICHAELSSON (4). Da die Bilirubin- werte innerhalb des Normalbereiches nur von unter- geordneter Wichtigkeit sind, wurden nur erhöhte Kon- zentrationen verglichen. Die Ergebnisse sind in Ab- bildung 3 dargestellt. Die Gegenüberstellung beweist,

daß die Arbeitshypothese richtig war. Der gleiche Reaktionsmechanismus ergibt weitgehend identische Konzentrationen, so daß die aus der Erfahrung gewach-, senen klinischen Interpretationsmöglichkeiten der Werte erhalten bleiben.

Literatur 1. BILLING, B. H., P. G. COLE und G. M. ZATHE, Biochem. J. 65,

774 (1957). — 2. LAUBER, K., diese Z. 5⁹ 278 (1967), — 3. HILL- MANN, G. und G: BERGER, diese Z. 5, 92 (1967). — 4. MICHA- ELSSON, M., Scand. J. clin. Laborat. Invest. 13, 56 (1961).

Dr. H. Bartels Bürgerspital CH 4000 Basel

Z. klin. Chem. u. klin. Biochem. / 7. Jahrg. 1969 / Heft 5