Der Einfluss von Astrozyten auf die Remyelinisierung im Tiermodell für Multiple Sklerose

Aus der Neurologischen Klinik der Medizinischen Hochschule Hannover

(Direktor Prof. Dr. med. R. Dengler)

Der Einfluss von Astrozyten auf die Remyelinisierung im Tiermodell für Multiple Sklerose

DISSERTATION

Zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin an der Medizinischen Hochschule Hannover

Vorgelegt von

Katharina Thea Rosina Bauer aus Ulan-Ude (Republik Burjatien, Russland)

Hannover, 2015

Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule am 28.10.2015

Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover

Präsident: Prof. Dr. med. Christopher Baum

Betreuer der Arbeit: Prof. Dr. med. Martin Stangel Referent/Referentin: PD Dr. rer. nat. Martina Dorsch Korreferent: Prof. Dr. med. Jens Dieter Rollnik Tag der mündlichen Prüfung: 28.10.2015

Prüfungssausschussmitglieder: Prof. Dr. med. Hermann Müller-Vahl Prof. Dr. med. Marc Ziegenbein Prof. Dr. med. Frank Schuppert

Meiner Familie gewidmet

I

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung ... 1

1.1. Multiple Sklerose ... 1

1.2. Remyelinisierung ... 2

1.3. Funktion von Astrozyten ... 4

1.4. Zielsetzung ... 6

2. Material und Methoden ... 7

2.1. Das Cuprizone-Modell ... 7

2.2. Versuchstiere ... 7

2.3. Versuchsaufbau ... 8

2.4. Versuchsdurchführung ... 9

2.5. Materialgewinnung ... 9

2.6. Färbungen ... 10

2.7. Auswertung ... 17

3. Ergebnisse ... 20

3.1. Etablierung des geeigneten Zeitpunktes zur Untersuchung der Remyelinisierung im Cuprizone-Modell... 20

3.2. Astrozytenablation in GFAP-TK transgenen Mäusen während der Remyelinisierung ... 21

3.3. Auswirkung der Astrozytenablation zum Zeitpunkt der beginnenden Rekrutierung von Oligodendrozytenvorläuferzellen ... 24

3.4. Astrozytenablation zum Zeitpunkt der Remyelinisierung hat keinen Einfluss auf die Anzahl von Mikroglia ... 32

3.5. Astrozytenablation ab der Woche 5 zeigt keine Auswirkung auf die Remyelinisierung ... 34

4. Diskussion ... 36

4.1. Methodische Grundlagen ... 36

II 4.2. Etablierung eines geeigneten Zeitpunktes zur Untersuchung der

Remyelinisierung ... 37

4.3. Warum die Arbeit von wissenschaftlichem Interesse ist ... 38

4.4. Astrozytenablation hindert die Remyelinisierung durch Mangel an Oligodendrozytenvorläuferzellen am Ort der Schädigung ... 40

4.5. Astrozytenablation während der Remyelinisierung hat keinen Einfluss auf die Anzahl von Mikroglia ... 41

4.6. Astrozytenablation ab der fünften Woche der Cuprizone-Fütterung hat keinen Einfluss auf die Remyelinisierung ... 43

4.7. Weiterführende Überlegungen ... 44

5. Schlussfolgerung ... 46

6. Zusammenfassung ... 47

7. Literaturverzeichnis... 49

8. Danksagung ... 64

9. Lebenslauf ... 65

10. Schriftenverzeichnis ... 67

11. Erklärung nach §2 Abs. 2 Nr. 6 und 7 der Promotionsordnung ... 68

III

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: Schema des Versuchsaufbaus………..9 Abb. 2: Scoring-System zur Beurteilung des Ausmaßes der Myelinisierung………….18 Abb. 3: Mangelnde Demyelinisierung bei Astrozytenablation in der 3. Woche der

Cuprizone-Gabe………...21

Abb. 4: Astrozyten im Verlauf………23

Abb. 5: Verlauf des Myelinisierungsgrades anhand der MOG- Färbung……….…...25 Abb. 6: Vergleich des Verlaufes des Myelinisierungsgrades in den Myelin-Färbungen

PLP, CNPase und LFB.………...26

Abb. 7: Vergleich des Verlaufes des Myelinisierungsgrades in den Myelin-Färbungen

MAG und MBP………...27

Abb. 8: Verlauf der Oligodendrozyten………29 Abb. 9: Oligodendrozytenvorläuferzellen im Verlauf………..…..….31 Abb. 10: Verlauf der Mikroglia während der Remyelinisierung………..33 Abb. 11: Fehlende Auswirkungen der Astrozytenablation nach 5 Wochen Cuprizone- Fütterung………..35

Tabellenverzeichnis

Tab. 1: Verwendete Primärantikörper………...11-12 Tab. 2: Verwendete Sekundärantikörper……….13

IV

Abkürzungsverzeichnis

Abb. Abbildung

ANOVA Analysis of variance

APC Anti-adenomatus polyposis coli Aqua dest. Destilliertes Wasser

bzw. beziehungsweise Ca ²⁺ Calcium

CD8⁺ Zytotoxische T-Zellen

CD44 Oberflächenmolekül, Hyaluronsäure-Rezeptor CNPase Cyclic nucleotide 3' phosphodiesterase CNTF Ciliary neurotrophic factor

CO Kohlenstoff-Monoxid DAB 3,3`Diaminobenzidin

DAPI 4'-6-Diamidino-2-phenylindole DNA Deoxyribonucleic acid

EAE Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis ebd. ebenda, wie vorgenannt

EBV Epstein-Barr-Virus et al. et alii, und andere evtl. eventuell

FGF Fibroblast growth factor

g Gramm

GABA Gamma-Aminobutyric Acid GCV Ganciclovir

GFAP Glial fibrillary acidic protein HCl Chlorwasserstoff, Salzsäure H₂O₂ Wasserstoffperoxid

IBA-1 Ionized calcium binding adaptor molecule 1 IFN-β Interferon-β

IGF-1 Insulin-like growth factor-1 IgG Immunglobulin G

IL-x Interleukin x i.p. intraperitoneal K⁺ Kalium

Kg KG Kilogramm Körpergewicht

V LFB/PAS Luxol-Fast-Blue/Periodic-Acid-Schiff-Färbung

LIF Leukemia inhibting factor

M Mol

MAG Myelin-assoziiertes Glykoprotein MBP Myelin basic protein

mGluR muskarinerge Glutamat-Rezeptoren MHC Major histocompatibility complex ml Milliliter

mm Millimeter µm Mikrometer

MOG Myelin Oligodendrozyten Glykoprotein mRNA messenger Ribonucleic acid

MRZR Masern-Röteln-Zoster-Reaktion MS Multiple Sklerose

NO Stickstoffmonoxid

Nogo-A Anti-Neurite Outgrowth Inhibitor Protein A Nr. Nummer

Olig2 Oligodendrocyte transcription factor

OPC oligodendrocyte precursor/progenitor cells, Oligodendrozytenvorläuferzellen p Konfidenzintervall

PBS phosphate buffered saline PDGF platelet derived growth factor pGCV phosphoryliertes Ganciclovir PLP Proteolipid-Protein

RCA-1 Ricinus-communis-Agglutinin-1

SEM standard error of the mean, Standardfehler Tab. Tabelle

TG transgen

TGF-α tumor growth factor α TK Thymidin-Kinase TNF-α Tumor necrosis factor α v.a. vor allem

WT Wildtyp z.B. zum Beispiel

ZNS Zentrales Nervensystem

1

1. Einleitung

1.1. Multiple Sklerose

Die Multiple Sklerose (Enzephalomyelitis disseminata) ist eine Erkrankung des zentra- len Nervensystems (ZNS), die mit Demyelinisierung der grauen und weißen Substanz einhergeht und in Abhängigkeit von dem Ort der Läsionen gravierende Behinderungen verursachen kann. (Compston & Coles, 2008). Die Ursachen für die Erkrankung sind noch nicht endgültig geklärt. Es handelt sich um ein komplexes Zusammenspiel von genetischen Faktoren und Umwelteinflüssen. Hierfür sprechen die hohe Koinzidenz der Erkrankung bei eineiigen Zwillingen (Robertson et al., 1996a) sowie die erhöhte Er- krankungswahrscheinlichkeit von Kindern und Geschwistern von Patienten mit MS (Robertson et al., 1996b). Andererseits konnte auch eine deutliche Zunahme der Krank- heitsprävalenz mit zunehmenden Abstand zum Äquator beobachtet werden, die sich bei Migration der des Migrationslandes anpasst (Kurtzke, 1975; Dean & Kurtzke, 1971). Es wird auch eine infektiöse Komponente diskutiert. Hier scheint vor allem das Epstein- Barr-Virus eine Rolle zu spielen. Ein Großteil der in den MS-Läsionen nachgewiesenen B-Lymphozyten sind mit EBV infiziert (Serafini et al., 2007).

Den Pathomechanismus der Erkrankung machen einerseits autoreaktive T- Lymphozyten aus, die im aktivierten Zustand leicht die Blut-Hirn-Schranke passieren können (Keegan & Noseworthy, 2002). Im zentralen Nervensystem binden sie über den MHC (major histocompatibility complex) II Rezeptor mit Antigen-präsentierenden Zel- len (z.B. Mikroglia oder Makrophagen), wodurch Zytokine ausgeschüttet werden.

Durch die daraus resultierende Entzündungsreaktion werden Oligodendrozyten und die Myelinbildung beeinträchtigt (ebd.). Zudem können CD8⁺ Zellen (zytotoxische T- Lymphozyten) die Myelinscheide direkt zerstören. Andererseits gibt es die Hypothese, dass Antikörper gegen Myelinproteine eine wichtige Rolle spielen. Zum Beispiel wur- den Antikörper gegen das Myelin Oligodendrozytenglykoprotein (MOG), welches nur im zentralen Nervensystem vorkommt, in MS-Läsionen nachgewiesen (Genain et al., 1999). Allerdings fand man Antikörper gegen andere Myelinproteine sowohl in Kon- trollen als auch in MS-Patienten (Reindl et al., 1999).

Das histopathologische Korrelat der Multiplen Sklerose sind lokal demyelinisierende Areale, die als Plaques bezeichnet werden (Lassmann, 2013). Diese Läsionen treten

2 gehäuft in der periventrikulären weißen Substanz, im Hirnstamm, im Kleinhirn (Faze- kas et al., 1999) und im Rückenmark (Nijeholt et al., 2001) auf. Im akut-entzündlichen Stadium bilden sich inflammatorische Infiltrate aus T-Lymphozyten, B-Lymphozyten und Plasmazellen, dadurch kommt es zur Demyelinisierung und als Folge zur Axonde- generation (Lassmann, 2013). In einigen aktiven Plaques sind Astrozyten nachweisbar.

Sie verlieren in dem durch die Entzündung ödematösem Bindegewebe ihre Polarität und lösen ihre Zell-Zell-Kontakte. Dadurch kommt es zu einem Untergang, und die verblie- benen Astrozyten hypertrophieren (Brosnan & Raine, 2013). Die Regeneration beginnt bereits parallel zur akuten Inflammation mit der Phagozytose von Zell- und Myelinde- bris (Compston & Cooles, 2008). Die Remyelinisierung wird durch die Migration von Oligodendrozytenvorläuferzellen zum Ort der Läsion eingeleitet, welche die Fähigkeit zur Myelinisierung haben (Scolding et al., 1998).

Die Läsionen in der grauen Substanz weisen eine geringere Infiltration mit T- Lymphozyten und eine geringere Invasion mit Mikroglia/Makrophagen auf (Bo et al., 2003). Es scheint eine Assoziation zwischen Ausbreitung der kortikalen Läsionen und Schwere der kognitiven Einschränkung zu geben (Calabrese et al., 2009; Roosendaal et al., 2009) sowie auch einen Zusammenhang zwischen den MS-Phänotypen. So ist bei der progressiven Form der MS die kortikale Beteiligung ausgeprägter als bei der rezidi- vierend-remittierenden Form (Bozzali et al., 2002; Agosta et al., 2006).

1.2. Remyelinisierung

Myelin ist eine lipidreiche Struktur, die zur elektrischen Isolierung der Axone dient. Im ZNS werden diese Membranschichten durch die Oligodendrozyten gebildet, dabei um- schlingt ein einzelner Oligodendrozyt mehrere Axone in seiner Umgebung. Die im pe- ripheren Nervensystem dafür verantwortlichen Schwann-Zellen gehören dagegen immer einem einzelnen Axon an (Buttermore et al., 2013). Bei der Multiplen Sklerose und an- deren demyelinisierenden Erkrankungen wird diese Isolationsschicht zerstört. Anders als früher angenommen, verfügt das Nervensystem jedoch über Reparaturmechanismen, sodass eine Remyelinisierung stattfinden kann (Jadasz et al., 2012).

Remyelinisierung ist die Wiederherstellung der Myelinschicht und der Wiederaufbau der saltatorischen Erregungsleitung. Die Myelinschicht ist nicht nur für eine schnelle

3 Erregungsleitung notwendig, sondern auch essentiell für das Überleben der Axone (Franklin & ffrench-Constant, 2008). Bei der Multiplen Sklerose schlägt die Remyelini- sierung oft fehl. Dadurch entsteht ein Axonschaden (Stangel et al., 2010; Irvine &

Blakemore, 2008) und es ist anzunehmen, dass dies der Grund für eine Progression der Erkrankung, auch unter immunsuppressiver Therapie, ist (Franklin & ffrench-Constant, 2008). Durch die Remyelinisierung werden funktionelle Defizite, zumindest teilweise wieder behoben (Jeffery & Blakemore 1997; Liebetanz & Merkler, 2007).

Im ZNS sind für die Remyelinisierung Stammzellen verantwortlich, die sich in soge- nannte oligodendroglial precursor/progenitor cells (OPCs) ausdifferenzieren (ffrench- Constant & Raff 1986 a, b). Diese Zellen sind sowohl in der grauen als auch in der wei- ßen Substanz vorhanden und machen, ebenso wie die Mikroglia, etwa 5-8% der Zellen im ZNS aus (Levine et al., 2001; Horner et al., 2000; Franklin & ffrench-Constant, 2008). Der Reparaturvorgang kann in 3 verschiedene Stadien eingeteilt werden: die OPC-Aktivierung, -Rekrutierung und -Differenzierung (Bruce et al. 2010; Franklin &

Kotter 2008). Es wird angenommen, dass die Einleitung des Reparaturvorgangs durch die OPCs mit Hilfe von Mikroglia und Astrozyten erfolgt, die sehr empfindlich auf Än- derungen der Homöostase reagieren (Glezer et al, 2006; Rhodes et al., 2006; Franklin &

ffrench-Constant, 2008), welche bereits bei beginnender Demyelinisierung auftreten.

Mikroglia und Astrozyten haben die Fähigkeit Wachstumsfaktoren wie beispielsweise PDGF und FGF zu produzieren und somit die OPC-Aktivierung, -Rekrutierung und - Differenzierung zu fördern (Wolswijk & Noble, 1992; Hinks & Franklin, 1999; Mes- sersmith et al., 2000; Franklin & ffrench-Constant, 2008). Schon sehr früh in dem Remyelinisierungsprozess teilen sich die OPCs und induzieren die Expression von oli- godendrogenen Genen, zum Beispiel Olig1, Olig2 und Nkx2.2 (Arnett et al., 2004; Le- vine et al., 2001; Stangel et al., 2011). Nach erfolgreicher Rekrutierung beginnen die OPCs mit den demyelinisierten Axonen zu interagieren. Dadurch differenzieren sie in ausgereifte Oligodendrozyten und exprimieren neue Myelinproteine (Arnett et al., 2004).

Das neu gebildete Myelin bildet jedoch dünnere und kürzere Schichten, wodurch sich auch der Abstand zwischen den Ranvier’schen Schnürringen verkürzt (Franklin &

ffrench-Constant, 2008). In Abhängigkeit vom Durchmesser des Axons ist entwick- lungsgeschichtlich eine bestimmte Myelinschichtdicke optimal (Blakemore, 1974;

Franklin & ffrench-Constant, 2008), die bei einem Wiederaufbau aber nie erreicht wird.

4 Dadurch ist die Nervenleitgeschwindigkeit reduziert (Ludwin & Maitland, 1984; Fran- klin & ffrench-Constant, 2008).

Wie gut die Remyelinisierung funktioniert hängt neben krankheitsspezifischen Deter- minanten auch von unabhängigen Faktoren ab. So wird sie mit zunehmendem Alter (Shields et al., 1999; Rando, 2006; Franklin & ffrench-Constant, 2008), bei Männern früher als bei Frauen (Li et al., 2006) ineffizienter. Die krankheitsspezifischen Faktoren sind noch nicht eindeutig untersucht. Es gibt aber Hinweise, dass, zumindest in einem Teil der Läsionen die OPCs selber zu einem direkten Angriffspunkt werden. Dafür spricht z.B. der Nachweis von Antikörpern gegen das Antigen NG2 (Niehaus et al., 2000). Es ist jedoch auch möglich, dass in MS-Läsionen die Differenzierung der OPCs fehlschlägt. Dies kann evtl. dadurch bedingt sein, dass hier Faktoren enthalten sind, die die Remyelinisierung verhindern. Es werden der Notch-jagged-Signalweg, als negativer Regulator der Remyelinisierung (Wang et al., 1998; Franklin & ffrench-Constant, 2008) oder die Akkumulation des Glykosaminoglykans Hyaluron in MS-Läsionen, ebenfalls einem Inhibitor der Remyelinisierung, diskutiert (Franklin & ffrench-Constant, 2008).

Weiterhin ist unklar, welche Rolle Astrozyten bei diesen Prozessen einnehmen, und ob sie die Remyelinisierung fördern oder hemmen.

Die untersuchten Therapiemöglichkeiten sind zum einen die Implantation von unter- schiedlichen Zelltypen, die evtl. fördernd für die Remyelinisierung sein können, z.B.

OPCs (Groves et al., 1993; Zhang et al., 1999; Windrem et al, 2004), neurale Stamm- zelllinien (Hammang et al., 1997) und Glia-Vorläuferzellen aus embryonalen Stamm- zellen (Brüstle et al., 1999). Die andere Möglichkeit ist es die endogene Remyelinisie- rung zu unterstützen. Es fiel aber schon bald auf, dass hier der optimale Zeitpunkt für den die Remyelinisierung fördernden Faktor notwendig ist. So ist z.B. PDGF vor allem für die Migration und Proliferation der OPCs zuständig, er wirkt jedoch hemmend auf die OPC-Differenzierung (Wang et al., 2007). Es sind daher weitere Studien notwendig, um die grundlegenden Mechanismen der Remyelinisierung aufzudecken.

1.3. Funktion von Astrozyten

Astrozyten sind der häufigste Zelltyp im ZNS. Es sind 3 Formen von reifen Astrozyten beschrieben: der protoplasmatische Astrozyt kommt vor allem in der grauen Substanz

5 vor. Den fibrösen Astrozyten findet man bevorzugt in der weißen Substanz, in der er sehr viele Fortsätze ausbildet. Als letzte Form gibt es die länglichen Astrozyten, die sich in die Müller-Zellen der Retina sowie in die Bergmann-Zellen des Kleinhirns einteilen lassen. (Kimelberg, 2007, 2010; Kimelberg & Nedergaard 2010).

Es ist lange bekannt, dass Astrozyten eine wichtige Funktion in der Aufrechterhaltung des interzellulären Milieus im ZNS haben (Walz & Wuttke, 1989), indem sie die bei hoher elektrischer Aktivität der Neurone ausgeschütteten Substanzen aufnehmen und somit eine Anreicherung dieser verhindern. Bei den Substanzen handelt es sich nicht nur um Ionen, die bei den Aktionspotentialen freigesetzt werden, sondern auch um Transmitter wie GABA und Glutamat. Diese werden von den Astrozyten aufgenommen und metabolisiert, um eine Akkumulation, die neurotoxisch wirkt, zu verhindern (Schousboe et al., 2004).

Astrozyten umgeben alle Blutgefäße im ZNS, v.a. die prekapillären Arteriolen, mit ih- ren Fortsätzen und nehmen somit an der Ausbildung der Blut-Hirn-Schranke eine ent- scheidende Rolle ein. Es wird angenommen, dass sie den Blutfluss kontrollieren können (Reichenbach & Wolburg, 2009; Zonta et al., 2002; Anderson & Nedergaard, 2003).

Durch neuronale Aktivität werden Astrozyten, dank ihrer unmittelbaren Nähe zu Synap- sen, depolarisiert, wodurch die Fortsätze um die Blutgefäße K⁺freisetzen, was durch die Hyperpolarisation von glatten Muskelzellen den Ca²⁺-Einstrom in diese verhindert und somit die Gefäße dilatiert (Knot et al., 1996; Attwell et al., 2010).

Astrozyten sind sternförmige Zellen, deren Fortsätze mit 300-600 Dendriten in Kontakt treten können (Halassa et al., 2007). Durch diese enorme Ausbreitung steht eine Zelle mit bis zu 100000 Synapsen in Kontakt (Bushong et al., 2002). Verschiedene Arbeits- gruppen wiesen nach, dass Astrozyten den Vorgang der Synaptogenese regulieren und kontrollieren (Slezak & Pfrieger, 2003; Ullian et al., 2004), sodass in Abwesenheit die- ser die Anzahl reduziert ist und die Funktion der Synapsen eingeschränkt ist (Ullian et al., 2001).

Bis heute ist allerdings nur wenig über den Einfluss von Astrozyten bei der Demyelini- sierung und Remyelinisierung bekannt. Es sind sowohl positive als auch negative Effek-

6 te diskutiert worden (Moore et al., 2011; De Keyser et al., 2010; Williams et al., 2007).

Es wird angenommen, dass Astrozyten durch die Ausschüttung von Zytokinen und Chemokinen T-Lymphozyten, Makrophagen und Mikroglia anlocken und somit die Demyelinisierung fördern. Es konnte aber auch gezeigt werden, dass Astrozyten nach Defekten im zentralen Nervensystem eine Glianarbe bilden, die als Barriere für Entzün- dungszellen fungiert, sodass diese nicht mehr in die vulnerablen, demyelinisierten Area- le eintreten können (Nair et al., 2008). Dieser Effekt wird auch als Folge der Sekretion von antiinflammatorischen Zytokinen, wie IL-10, TGF-ß und IL-27 diskutiert (ebd.).

Bei diesen Arbeiten handelt es sich überwiegend um in vitro Experimente und entspre- chende in vivo Arbeiten fehlen. Arbeiten zur Funktion von Astrozyten bei der Remyeli- nisierung fehlen gänzlich.

1.4. Zielsetzung

Die folgende Arbeit dient dazu Erkenntnisse über die Rolle von Astrozyten bei der Remyelinisierung im ZNS zu gewinnen. Es sollte überprüft werden, in welchem Aus- maß Astrozyten eine die Remyelinisierung fördernde oder hemmende Rolle einnehmen.

Um eine Demyelinisierung zu erreichen, wurde das toxische Cuprizone-Mausmodell eingesetzt, bei dem nach 5-wöchiger Behandlung ein nahezu vollständiger Abbau von Myelin, sowohl in der weißen als auch der grauen Substanz im Großhirn, auftritt. Im Anschluss erfolgt eine spontane Remyelinisierung. Die Rolle von Astrozyten bei der Remyelinisierung wurde nach deren Funktionsverlust untersucht. Hierfür wurde ein transgener Mausstamm (B6.Cg-Tg(Gfap-Tk)7.1Mvs/J) eingesetzt, bei dem durch die Behandlung mit der Substanz Ganciclovir eine Ablation von GFAP positiven Astrozy- ten auftritt.

Die hieraus gewonnenen Daten sollen Erkenntnisse über die Funktion von Astrozyten bei den komplexen Vorgängen der Remyelinisierung liefern. Die Kenntnis dieser Me- chanismen ist Voraussetzung für die Entwicklung zukünftiger therapeutischer Ansätze.

7

2. Material und Methoden

Die unten beschriebenen Versuche basieren auf dem Cuprizone-Modell. Bei Cuprizone (bis-cyclohexanone oxaldihydrazone, Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, USA) handelt es sich um einen Kupfer-Chelator, der als Toxin zu einem selektiven Absterben von reifen Oligodendrozyten im zentralen Nervensystem führt. Nach fünfwöchiger Fütte- rung kommt es zu einer kompletten Demyelinisierung der Axone im Corpus callosum, nach sechswöchiger Fütterung demyelinisiert der Kortex vollständig (Matsushima &

Morell, 2001; Skripuletz et al, 2008). Stellt man die Mäuse wieder auf normales Futter um, so wandern neue Oligodendrozytenvorläuferzellen (OPCs) in die demyelinisierten Läsionen ein und die Remyelinisierung wird eingeleitet (Skripuletz et al, 2008). Die Erstanwendung von Cuprizone geht bereits bis in die 60er Jahre zurück (Carlton, 1966).

Zahlreiche Versuche befassten sich seither mit der Optimierung und Standardisierung dieses Modells, sodass seit wenigen Jahren bekannt ist, dass Mäuse des Stammes C57BL/6 besonders empfindlich auf das Cuprizone ansprechen und den gewünschten Effekt einer vollständigen Demyelinisierung des Corpus callosum zeigen (Skripuletz et al., 2011). Nach den Ergebnissen von Hiremath et al. (1998) ist die Cuprizone- Konzentration von 0,2% optimal, da die gewünschte Wirkung erzielt wird, aber die to- xischen Nebenwirkungen, vor allem auf die Leber und das Gewicht, gering sind.

2.2. Versuchstiere

Um die Rolle von Astrozyten bei der Remyelinisierung zu untersuchen, wurde der transgene Mausstamm B6.Cg-Tg(Gfap-Tk)7.1Mvs/J eingesetzt. Bei diesen transgenen Mäusen ist die Thymidin-Kinase aus dem Herpes-simplex-Virus an den Maus-Promoter für das glial fibrillary acid Protein (GFAP) gebunden (Bush et al., 1998). Dieses Protein wird im ZNS von Astrozyten produziert. Bei Gabe des Virostatikums Ganciclovir (GCV) werden bei diesen Mäusen selektiv und spezifisch GFAP-TK-produzierende Astrozyten in die Apoptose geleitet, was sowohl in vitro, als auch in vivo nachzuvoll- ziehen ist (Bush et al., 1998; Bush et al., 1999). Dies passiert durch Phosphorylierung des Ganciclovirs (pGCV), welches die DNA-Synthese unterbricht und somit die Zelle in den Zelltod leitet.

8 Für die Versuche wurden männliche GFAP-TK transgene Mäuse sowie männliche Wildtypmäuse (C57Bl/6J) eingesetzt. Die Mäuse waren zu Beginn des Versuches 8 Wochen alt, dieses Alter wurde als Zeitpunkt 0 definiert. Die Tiere wurden zu dritt oder zu viert in 42 x 26 x 15 cm großen Käfigen bei konstanter Raumtemperatur von 25°C und einem Hell-Dunkel-Zyklus von 12 Stunden gehalten. Die Käfige wurden ein Mal pro Woche gereinigt und alle Tiere hatten freien Zugang zur Nahrung. Die geltenden Tierschutzbestimmungen wurden eingehalten und die Durchführung der Versuche ist vom Niedersächsischen Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit, Oldenburg, genehmigt worden (33.9-42502-04-07/1309 und -12/0866).

2.3. Versuchsaufbau

Die Mäuse wurden 5 Wochen lang mit Cuprizone gefüttert, um eine vollständige Demyelinisierung des Corpus callosum zu erreichen. Ab der 5. Woche erhielten alle Mäuse Normalfutter, um die Remyelinisierung einzuleiten.

Im Versuch wurden die Mäuse in 3 unterschiedliche Behandlungsgruppen aufgeteilt, die sich nach dem Injektionsschema des Ganciclovirs unterschieden. In der Gruppe A wur- de transgenen Mäusen Ganciclovir ab der dritten Woche nach Beginn der Cuprizone- Fütterung intraperitoneal (i.p.) injiziert. Als Kontrolle wurden drei Gruppen behandelt:

transgene Mäuse bekamen statt Ganciclovir PBS (phosphate buffered saline, Gibco) injiziert. Zwei Gruppen Wildtyp-Mäuse wurden je mit Ganciclovir oder PBS behandelt.

Die Gruppe B bekam Ganciclovir ab der vierten Woche nach Beginn der Cuprizone- Fütterung und die Gruppe C ab der fünften Woche. Auch bei den Versuchsgruppen B und C wurden entsprechende Kontrollen mitgeführt. Von den ersten 2 Gruppen (Beginn mit Ganciclovir ab Woche 3 und 4) und deren Kontrollgruppen wurden zu dem Zeit- punkt Woche 5 nach Beginn der Cuprizone-Gabe jeweils 6 Mäuse getötet und deren Gehirne zur Untersuchung entnommen. Von den Gruppen mit Ganciclovir Behandlun- gen ab Woche 4 und 5 und deren Kontrollgruppen wurden jeweils 6 Gehirne zu den Zeitpunkten Wochen 5,5, 6 und 7 nach Beginn der Cuprizone-Gabe analysiert (Abb.1).

9

Abb. 1: Schema des Versuchsaufbaus

Die Abbildung zeigt das Schema des Versuchsaufbaus. Alle Tiere wurden insgesamt über 5 Wochen mit Cuprizone gefüttert. Die jeweiligen Untersuchungsgruppen unterscheiden sich durch den Zeitpunkt des Beginns der Astrozyten-Ablation. In jeder Untersuchungsgruppe wurden jeweils eine Versuchsgruppe sowie drei Kontrollgruppen verglichen und die Gehirne zu den angegeben Zeitpunkten verglichen.

2.4. Versuchsdurchführung

Die Versuche fanden im zentralen Tierlabor der Medizinischen Hochschule Hannover statt und wurden durch PD Dr. Thomas Skripuletz aus der Arbeitsgruppe für Neuroim- munologie der Neurologischen Klinik der Medizinischen Hochschule Hannover durch- geführt. Nach einer Gewöhnungsphase an gemahlenes Trockenfutter bekamen die Mäu- se für 5 Wochen 0,2 % Cuprizone enthaltendes Futter. Die Nahrung wurde dabei so- wohl über Futterautomaten, als auch über Petrischalen bereitgestellt, um zu gewährleis- ten, dass auch Toxin-geschwächte Mäuse freien Zugang zum Futter hatten.

2.5. Materialgewinnung

Zu den ausgewählten Zeitpunkten wurden die Mäuse mittels 10% Ketamin (Albrecht, Aulendorf, Deutschland) und 2% Xylazin (Rompun®, Bayer, Leverkusen, Deutschland) anästhesiert. Anschließend erfolgte durch den linken Ventrikel eine Perfusion mit 10 ml 4% Paraformaldehyd (Sigma-Aldrich, Deutschland). Die Entnahme der Gehirne erfolgte nach Eröffnung der Schädelkalotte durch einen Längsschnitt und zwei Transversal-

10 schnitte, mittels Pinzette. Anschließend wurden diese in 4% Paraformaldehyd über Nacht konserviert. Mit Hilfe von dem Einbettautomaten in der Pathologie der Medizini- schen Hochschule Hannover wurden die Gehirne in Paraffinblöcke gebettet, um die Aufbereitung für immunhistochemische und histologische Färbungen möglich zu ma- chen.

Die Aufbereitung begann mit der Anfertigung von 7 µm dünnen Feingewebsschnitten mit einem Mikrotom (Leica RM2245, Leica Mikrosysteme, Deutschland). Dabei wur- den jeweils zwei Schnitte auf einen Objektträger (Menzel Gläser) aus dem Bereich Bregma – 0,82 mm bis Bregma – 1,82 mm platziert. Die Benennung der Gehirnab- schnitte erfolgte nach der Klassifikation aus dem Atlas „The Mouse Brain In Stereota- xic Coordinates“ (Paxinos G & Franklin KBJ, 2001). Über Nacht trockneten die Schnit- te bei 40°C.

2.6. Färbungen

2.6.1. Allgemeines Prinzip

Für die Beurteilung der De- und Remyelinisierung sowie Veränderungen der Zellen durch die Astrozytenablation, wurden immunhistochemische Färbungen mittels einer indirekten Methode durchgeführt. Dabei bindet ein nicht-markierter Antikörper an das zu untersuchende Antigen und wird anschließend mit einem sekundären Antikörper, der an den primären Antikörper bindet, sichtbar gemacht. Dies geschieht mit Hilfe der Avi- din-Biotin-Peroxidase-Methode: an den sekundären Antikörper ist das Enzym Biotin gekoppelt. Man inkubiert mit dem Avidin-Biotin-Komplex, dessen Biotin mit Peroxi- dase markiert ist. Wird anschließend das Chromogen DAB (3,3'-Diaminobenzidin) mit dem Substrat und gleichzeitigen Katalysator Wasserstoffperoxid dazugegeben, kommt es zu einer Substrat-Enzym-Reaktion und gleichzeitigen Verfärbung der Schnitte. Die Peroxidaseaktivität des Avidin-Biotin-Komplexes wandelt das phenolische Substrat in dessen unlösliche Form um, was durch eine Braunfärbung sichtbar wird.

2.6.2. Verwendete Färbungen

Für die Immunhistochemie wurden Antikörper gegen die Myelinproteine PLP (Proteo- lipid-Protein), MBP (Myelin-basisches Protein), MOG (Myelin-Oligodendrozyten Gly- koprotein), MAG (Myelin-assoziiertes Glykoprotein) und CNPase (cyclic nucleotide 3'

11 phosphodiesterase) eingesetzt. Gegen Strukturen spezifischer Gewebezellen wurden primäre Antikörper gegen Nogo-A (Anti-Neurite Outgrowth Inhibitor Protein A, Mar- ker für reife Oligodendrozyten), APC (Anti-adenomatus polyposis coli, Marker für reife Oligodendrozyten), Olig2 (Marker für Oligodendrozytenvorläuferzellen) und GFAP (Glial fibrillary acidic protein, Marker für Astrozyten) und Vimentin (Marker für Astro- zyten) verwendet. Mikroglia wurden durch Antikörper gegen RCA-1 (Ricinus- communis-Agglutinin-1) und IBA-1 (Ionized calcium binding adaptor molecule 1) dar- gestellt. In Tab. 1 findet sich eine Übersicht über die verwendeten primären Antikörper, die zugehörigen sekundären Antikörper sind in Tab. 2 aufgeführt. Die Färbung mit RCA-1 stellt eine Besonderheit dar, da der primäre Antikörper bereits in biotinylierter Form vorhanden ist, und somit das Avidin direkt an das biotinylierte Lektin binden kann und folglich kein sekundärer Antikörper benötigt wird.

Antikörper Eingesetzte Verdünnung

Firma Spezifische Färbung Referenz

Maus-anti- PLP-IgG

1:500 Serotec, Puch-

heim, Germany

Myelinprotein Hartmann &

Kluge, 1982 Maus-anti-

MBP-IgG

1:500 Covance, Frei-

burg, Germany

Myelinprotein Budka, 1983

Maus-anti- MOG-IgG

1:2 Hybridom-

Überstand, Ge- schenk von Prof.

C. Linington

Myelinprotein Piddlesden,

et al. 1993

Maus-anti- MAG-IgG

1:1000 Abcam,

Cambridge, Eng- land

Myelinprotein Quarles,

2007

Maus-anti- CNPase-IgG

1:200 Millipore, Mols- heim, France

Myelinprotein Kimoto et

al., 2009 Kaninchen-

anti-NogoA- IgG

1:500 Millipore, Mols- heim, France

Adulte Oligodendrozyten Kuhlmann et al., 2007

Maus-anti- 1:200 Calbiochem, Reife Oligodendrozyten Lang et al.,

12

APC-IgG Darmstadt, Ger-

many

2013

Maus-anti- Olig2-IgG

1:500 Millipore, Mols- heim, France

Oligodendrozytenvorläuferzellen, OPC

Mitew et al., 2013

Kaninchen- anti-GFAP- IgG

1:750 DakoCytomation, Glostrup, Den- mark

Astrozyten Ludwin et

al., 1976

Maus-anti- Vimentin-IgG

1:500 Epitomics, Bur- lingame, USA

Astrozyten Skripuletz et

al., 2013 RCA-1 (bioti-

nyliert)

1:1000 Vector labarato- ries, Burlingame, USA

Aktivierte Mikrog-

lia/Makrophagen

Andjelkovic et al., 1998

RCA-1 (Flu- orescein- gekoppelt)

1:1000 Vector laborato- ries, Burlingame, USA

Aktivierte Mikrog-

lia/Makrophagen

Andjelkovic et al., 1998

Maus-anti- IBA-1-IgG

1:1000 Wako, Neuss,

Germany

Alle Mikroglia Sasaki et al.,

2001

Tab.1: Eingesetzte Primärantikörper

13 Antikörper Eingesetzte Ver-

dünnung

Firma Referenz

Ziege-anti-Maus-IgG (biotinyliert)

1:500 Vector laboratories,

Burlingame, USA

Carpino et al., 2004

Ziege-anti-

Kaninchen-IgG (bio- tinyliert)

1:500 Vector laboratories,

Burlingame, USA

Ahmed et al., 2010

Ziege-anti-Maus-IgG Alexa fluor 555 (rot)

1:500 Invitrogen, Darmstadt,

Germany

Gudi et al., 2009

Ziege-anti-Maus-IgG Alexa fluor 488 (grün)

1:500 Invitrogen, Darmstadt,

Germany

Skirpuletz et al., 2013

Ziege-anti- Kaninchen-IgG Alexa fluor 555 (rot)

1:500 Invitrogen, Darmstadt,

Germany

Skripuletz et al., 2013

Ziege-Anti- Kaninchen-IgG Alexa fluor 488 (grün)

1:500 Invitrogen, Darmstadt,

Germany

Skripuletz et al., 2013

Tab. 2: Eingesetzte Sekundärantikörper

2.6.3. Immunhistochemie

Es wurden immer 36 Schnitte von verschiedenen Gehirnen gleichzeitig gefärbt. Damit die Schnitte den Antikörpern und Farbstoffen zugänglich gemacht werden konnten, wurden sie zuerst entparaffiniert und rehydratisiert. Dafür wurden sie zunächst zwei Mal für 10 Minuten in Xylol und in 100% Alkohol gestellt. Anschließend durchliefen sie für jeweils 5 Minuten eine absteigende Alkoholreihe in 90%-, 80%- und 70%-igen Alkohol. Zum Abschluss tauchte man sie für 5 Minuten in PBS. Um eventuell durch unzureichende Entparaffinierung noch maskierte Antigene zu demaskieren wurden die Schnitte in einer Citratpufferlösung (9ml 0,1 M Citronensäuremonohydrat und 41ml 0,1 M Citronensäuretrinatriumdihydrat verdünnt auf 500ml aqua dest.) in der Mikrowelle (Euronet MW4270, HTS Haustechnik-Service GmbH, Deutschland) auf höchster Stufe zum kochen gebracht, was anhand von Luftbläschenbildung verifiziert wurde, und an-

14 schließend auf einer Stufe niedriger für 5 Minuten gekocht. Nach 20-minütiger Abküh- lung und einer Spülung in PBS folgte eine Behandlung mit 1%-iger H2O2-Lösung (7,5ml 30%-ige Stammlösung, Merck, Deutschland, auf 250ml PBS) in einer Dunkel- kammer, um eine photogene Inaktivierung der lichtsensiblen Substanz zu verhindern.

Dies geschah, um endogene Peroxidase zu hemmen und somit eine Hintergrundfärbung zu verhindern. Beendet wurde diese Reaktion mit dreimaligem Spülen in PBS.

Um ein Austrocknen der Präparate und damit eine Zerstörung der Antigenstrukturen im Gewebe zu verhindern, wurden die Schnitte für alle folgenden Schritte in dunklen Feuchtkammern gelagert. Als erstes wurde jeder Schnitt mit einem Liquid Blocker-Pen (PAP-Pen, SCI Science Services, Deutschland) umkreist. Es bildete sich ein grünlicher hydrophober Film, der ein Zerlaufen der Flüssigkeiten verhinderte, und somit eine gleichmäßige und sparsame Benetzung der Präparate garantierte. Danach wurden die Schnitte für eine Stunde bei Raumtemperatur mit 3%-igem Serum (normal goat serum, Vector Labs, verdünnt mit PBS mit 0,1% TritonX-100) inkubiert. Dieses stammt aus derselben Spezies, in der auch der sekundäre Antikörper hergestellt wurde. Dieser Schritt dient der Blockierung von unerwünschten Antigen-Antikörper-Komplex- Bildungen, da sonst eine unspezifische Hintergrundfärbung entstehen würde. Das Se- rum wurde nicht mit PBS gespült, sondern lediglich abgeklopft. Anschließend wurde der primäre Antikörper mit PBS mit 0,1% TritonX-100 verdünnt und auf die Schnitte pipettiert. Das Triton X-100 ist ein nichtionisches Detergenz, das die Zellmembran- Permeabilität erhöht und so eine ausreichende Penetration der Antikörper durch die Zellmembran in das zytoplasmatische Kompartiment ermöglicht. Die Inkubation für diesen Schritt lief über Nacht bei 4°C.

Am darauf folgenden Tag wurde nach dreimaliger Spülung mit PBS der biotinylierte sekundäre Antikörper, gelöst in PBS/0,1% TritonX-100 auf die Objektträger gegeben und für eine Stunde bei Raumtemperatur belassen. Eine Verstärkung des Sekundäranti- körpers erfolgte für eine Stunde bei Raumtemperatur mit dem Avidin-Biotin- Enzymkonjugat (ABC Kit, Vector Laboratories, Deutschland), das im Verhältnis von 1:800 in PBS verdünnt aufgetragen wurde. Die Aufbereitung des Avidin-Biotin- Komplexes musste bereits mindestens 20 Minuten vor Auftragung erfolgen. Anschlie- ßend geschah über 10 Minuten die Entwicklung mit dem Chromogen DAB (3,3´-

15 Diaminobenzin; DAB-Kit: 2 Tropfen Buffer stock sol., 4 Tropfen DAB stock sol., 2 Tropfen Hydrogen Peroxid auf 5 ml aqua dest.; Vector Laboratories, Deutschland), wo- bei vor und nach diesem Schritt jeweils 3 Mal mit PBS gespült wurde. Bei allen Fär- bungen, die kein Myelin färbten (alle außer MBP, PLP, MOG, MAG, CNPase), wurde im Anschluss immer ein Schnitt pro Objektträger 15 Sekunden mit Hämalaun (Meyers Hämalaunlösung, Merck, Darmstadt, Deutschland), welches die Kerne darstellt, gegen- gefärbt. Zuletzt durchliefen die Schnitte eine aufsteigende Alkoholreihe mit je 5 Minu- ten in 70%, 80% und 90% sowie zwei Mal 10 Minuten in 100% und in Xylol, bevor sie mit Deckgläschen und dem Kunstharz Eukitt (Kindler GmbH und Co., Freiburg, Deutschland) eingedeckt wurden.

2.6.4. Immunfluoreszenz a) Allgemeines Prinzip

Die Grundlage der Immunfluoreszenz sind Antikörper, die mit einem Fluoreszenzfarb- stoff markiert sind. Wie auch in der Immunhistochemie wurde hier die indirekte Metho- de angewandt, also ein sekundärer Antikörper an den Primärantikörper gebunden, um diesen sichtbar zu machen. Der Vorteil dieser Methode ist, dass man bei Verwenden von Farbstoffen mit verschiedenen Emissionsmaxima Doppelfärbungen machen kann, und somit in einem Präparat mehrere Antigene untersuchen kann.

b) Durchführung

Die Vorgehensweise bei der Immunfluoreszenz stimmte am ersten Färbetag mit der Immunhistochemie überein, außer, dass der Schritt mit dem Wasserstoffperoxid ausfiel, da keine Peroxidase verwendet wurde und folglich auch keine Hintergrundfärbung zu erwarten war. Als erstes wurde meist ein intrazellulärer Antikörper aufgetragen und bei 4°C über Nacht gelagert. Da alle Immunfluoreszenzfärbungen als Doppelfärbungen durchgeführt wurden, musste am zweiten Tag nach dreimaligen Spülen mit PBS ein zweiter, jetzt zellwandständiger primärer Antikörper, verdünnt mit PBS/0,1% TritonX- 100 aufgebracht und für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert werden. Beide spe- zifische Fluorescein-markierte Sekundärantikörper wurden ebenfalls in PBS/0,1% Tri- tonX-100 angesetzt, gleichzeitig auf die Schnitte pipettiert und ebenfalls für eine Stunde bei Raumtemperatur belassen. Nach erneutem dreimaligen Spülen in PBS wurden die Objektträger sofort in Mowiol (Calbiochem, San Diego, CA, USA) zusammen mit 1 µl

16 DAPI (4'-6-Diamidino-2-phenylindole, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) eingedeckt.

Das DAPI diente der gleichzeitigen Kernfärbung. Bei der RCA-1 Färbung ist kein Se- kundärantikörper nötig, da Fluorescein-markiertes Lektin verfügbar ist.

2.6.5. Die Luxol-Fast-Blue (LFB)/Periodic-Acid-Schiff (PAS)-Färbung a) Wirkungsweise

Dies ist eine spezifische histochemische Myelinfärbung, mit der man den Myelinisie- rungsgrad einschätzen kann. Myelinisierte Areale werden blau gefärbt und Areale mit Abbauprodukten des Myelins, also demyelinisierte, rosa. LFB ist ein basisches Kupfer- Phthalocyanin, das eine Affinität zu Neurokeratin besitzt. Es bindet über Bestandteile der Phospholipide an das Myelin. In einem sauren, ethanolischen Milieu bilden die Aminogruppen des LFB mit Gewebebestandteilen Polymerisationsaggregate, die durch Lithiumcarbonat differenziert werden. Das Schiff’sche Reagenz bindet an Aldehyd- gruppen, welche durch die Periodsäure aus Glykolgruppen oxidiert wurden. Dadurch wird das Molekül umgebaut und eine Rotfärbung entsteht. Zur Differenzierung und Ent- fernung überschüssiger Säure des Schiff-Reagenz sowie zur Stabilisierung der Farbe wird eine Sulfit-Behandlung durchgeführt.

b) Durchführung

Das Schema der Entparaffinierung und Entwässerung unterscheidet sich zu dem in der Immunhistochemie verwendeten. Und zwar werden nach den 2 Mal für 10 Minuten Eintauchen in Xylol und in 100% Alkohol nur noch 2 Mal 10 Minuten in 96% Alkohol angeschlossen. Danach folgte die Färbung mit Luxol-Fast-Blue (0,5 g Solvent blue 38 in 500 ml 96% Ethanol, 2,5 ml filtrierte 10% Essigsäure) in einem Wärmeschrank über eine Stunde bei 60°C. Das anschließende Spülen mit zweimal 96% Alkohol und zwei- mal mit destilliertem Wasser diente dem Entfernen von überschüssiger Farbe. Zur Dif- ferenzierung der Präparate wurden sie zweimal kurz in Lithiumcarbonat (Sigma-Aldrich, Deutschland) eingetaucht und anschließend in 70% Ethanol gelagert, bis die graue und weiße Substanz gut zu unterscheiden war. Zum Abschluss wurden die Schnitte in destil- liertem Wasser gespült.

Die Periodic-acid-Schiff-Färbung begann mit dem Eintauchen der Präparate für 8 Minu- ten in Periodsäure (Fluka, Deutschland). Bevor die Schnitte für 15 Minuten mit dem

17 Schiff-Reagenz (Sigma-Aldrich, Deutschland) behandelt wurden, spülte man sie mit Aqua dest.. Die spezifischen Bereiche färbten sich zunächst rosa. Die Präparate wurden anschließend für 6 Minuten in Sulfitwasser (400 ml aqua dest. + 20 ml 1M HCl + 26 ml 10% Natriumdisulfit) und dann für 10 Minuten mit fließendem Leitungswasser gespült, was eine Blaufärbung bewirkte. Es folgte noch ein kurzes Eintauchen in destilliertes Wasser, nach welchem eine aufsteigende Alkoholreihe durchlaufen wurde und an- schließend die Schnitte für 2 Mal 10 Minuten in Xylol gestellt wurden. Zum Schluss wurden die Objektträger mit Eukitt (Kindler GmbH & Co, Deutschland) eingedeckt.

2.7. Auswertung

Diese Arbeit hat den Anspruch eine Aussage über die Funktion von Astrozyten für die Remyelinisierung im ZNS zu treffen. Dafür ist es wichtig den Myelinisierungsgrad so- wie die Aktivität von an der Re- und Demyelinisierung beteiligten Zellen objektiv be- stimmen zu können. Im Folgenden wird das Vorgehen dabei erörtert

2.7.1. Myelinauswertung

Um das Ausmaß der De- und Remyelinisierung im Corpus callosum zu beurteilen wur- den die Schnitte mit immunhistochemischen Färbungen mit den Antikörpern CNPase, MBP, MOG, MAG und PLP sowie die histochemische Färbung mit LFB verblindet, von 3 unabhängigen Prüfern unter dem Lichtmikroskop (Leica DMLB, Wetzlar, Ger- many) bei 200-facher Vergrößerung untersucht und nach einem bewährten Scoring- System, dessen Skala von 0 (vollständig demyelinisiert) – 3 (normale Myelinisierung) reicht, beurteilt. Dieses System ermöglicht eine Reproduzierbarkeit der Ergebnisse ohne auf ein Elektronenmikroskop zurückgreifen zu müssen, was weniger Zeit in Anspruch nimmt. Die Ergebnisse sind, im Vergleich mit der elektronenmikroskopischen Auswer- tung reproduzierbar (Lindner et al. 2009). 0 Punkte wurden vergeben, wenn gar kein Myelin im Corpus callosum zu sehen war, einen Punkt bekam das Präparat, wenn ver- einzelte Myelinfasern aufzufinden waren. Sah man nur wenige Defekte bei sonst norma- ler Myelinstruktur wurden 2 Punkte zugeteilt, fehlten jegliche Defekte bekam das Prä- parat die volle Punktzahl.

18

Abb. 2.: Scoring-System zur Beurteilung des Ausmaßes der Myelinisierung

In der vorliegenden Abbildung werden die Ausmaße der Myelinisierung anhand eines Scoringsystems dargestellt. Gezeigt wird das Corpus callosum. Der Score 3 entspricht der normalen Myelinisierung mit einem dichten Myelinnetz. Der Score 2 zeigt vereinzelt Lücken in dem Myelinnetz sowie eine körnige Struktur des Myelins. Der Score 1 zeigt eine nahezu vollkommene Demyelinisierung, es sind nur verein- zelt Myelinfasern nachweisbar. Der Score 0 zeigt einen kompletten Verlust von Myelinfasern.

2.7.2. Zellquantifizierung im Corpus callosum

Die Beurteilung der Zellfärbungen fand anhand von definierten Arealen im Corpus cal- losum mit Hilfe des Mikroskops (Olympus BX61) statt. Die Vergrößerung betrug bei der Auswertung des Corpus callosum 400-fach. Im Corpus callosum wurden 3 Flächen ausgewertet, was eine Gesamtfläche von 0,1875 mm² ergibt. Die gewählten Flächen orientierten sich am Interhemisphärenspalt: eine wurde zentral darunter platziert und die beiden übrigen rechts und links von dieser. Gezählt wurden nur die Zellen, die eine deutliche Braunfärbung zeigten und deren Kerne durch Hämalaun, beziehungsweise in der Immunfluoreszenz durch DAPI, gut erkennbar waren. Untersucht wurden durch Immunhistochemie Mikroglia (RCA-1, IBA-1), adulte Oligodendrozyten (Nogo-A, APC) und Astrozyten (GFAP, Vimentin). In der Immunfluoreszenz wurden in den Doppelfärbungen proliferierende OPC (Olig2/Ki-67) und proliferierende Astrozyten

19 (GFAP/Ki-67) ausgewertet. Mit der Doppelfärbung APC und Olig2 konnten Oli- godendrozytenvorläuferzellen dargestellt werden.

2.7.3. Statistische Analyse

Die statistische Analyse der Ergebnisse erfolgte mit Hilfe des Programms StatView 5.0 für Windows (SAS Inistitute Inc., Cary, USA). Statistisch signifikante Unterschiede wurden durch die ANOVA (analysis of variance) und anschließendem Fisher-PLSD- Test für den post hoc Vergleich nachgewiesen. Die Ergebnisse wurden als Mittelwert ± Standardfehler (SEM = Standard Error of the Mean) dargestellt. Die signifikanten post hoc Effekte, die im Vergleich mit den Kontrollgruppen aufkamen wurden mit Sternchen versehen (* p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001).

20

3. Ergebnisse

3.1. Etablierung des geeigneten Zeitpunktes zur Untersuchung der Remyelinisierung im Cuprizone-Modell

Für die Festlegung eines geeigneten Zeitpunktes zur Untersuchung der Remyelinisie- rung im Cuprizone-Modell wurden 3 verschiedene Injektionsschemata ausgeführt. Wie bereits in dem Abschnitt Material und Methoden beschrieben, begann man in der ersten Gruppe ab der dritten Woche der Cuprizone-Fütterung die Injektionen mit Ganciclovir, in der zweiten Gruppe ab der vierten Woche und in der letzten Gruppe ab der fünften Woche. Die Cuprizone-Fütterung wurde nach 5 Wochen beendet (Abb.1).

Das Ausmaß der Demyelinisierung bei Woche 5 wurde mittels histochemischer und immunhistochemischer Färbungen untersucht. Zur besseren Verifizierung der Ergebnis- se wurden verschiedene Myelinfärbungen eingesetzt: PLP, MBP, MAG, MOG, CNPase und LFB. Hierbei galt die besondere Aufmerksamkeit dem Corpus callosum als größtes Kommissurensystem im Gehirn mit einem enorm hohen und dichten Anteil an myelini- sierten Nervenfasern, auf das sich auch die im Folgenden beschriebenen Ergebnisse beziehen.

In der ersten Gruppe, die bereits nach 3 Wochen Cuprizone-Gabe Ganciclovir- Injektionen erhielt, war zu erkennen, dass dieser Zeitpunkt zu früh gewählt wurde, denn hier war eine vollständige Demyelinisierung nicht erkennbar (Abb.1, A) und B)). Es lag noch eine große Menge an nicht abgeräumtem Myelin in dem Interzellularraum, sodass diese Gruppe nicht für Untersuchungen der Remyelinisierung weiter verwendet werden konnte.

In der zweiten Gruppe sah man dagegen in allen Myelinfärbungen bei Woche 5 eine deutliche Entmarkung im Corpus callosum in den transgenen Mausstämmen und in den Wildtypmäusen sowohl unter Ganciclovir-Injektion als auch unter Injektion von PBS (Abb.3, C) und D)). Der Myelindebris ist durch Mikroglia und Makrophagen abgebaut worden, sodass die Voraussetzungen für die Remyelinisierung gegeben waren. Im Fol- genden wurden somit nur die zweite (Ganciclovir-Injektionen ab Woche 4) und dritte Gruppe (Ganciclovir-Injektionen erst ab Woche 5) weiter verfolgt.

21

Abb. 3: Mangelnde Demyelinisierung bei Astrozytenablation in der 3. Woche der Cuprizone-Gabe In A) und B) sieht man die unzureichende Demyelinisierung anhand der Proteolipid Protein (PLP) Fär- bung nach Astrozytenablation in der 3. Woche nach Beginn der Cuprizone-Fütterung. Man erkennt große Mengen an Myelindebris in den mit Ganciclovir (GCV) behandelten transgenen Mäusen. Die Astrozyten- ablation zum späteren Zeitpunkt, nach 4 Wochen Cuprizone-Fütterung (C) und D)), stört dagegen die Demyelinisierung nicht. Signifikante Unterschiede sind mit Sternchen gekennzeichnet (*** p<0,001).

3.2. Astrozytenablation in GFAP-TK transgenen Mäusen während der Remyelinisierung

Mit Hilfe der immunhistochemischen Färbungen mit den Markern GFAP und Vimentin wurden Astrozyten dargestellt und im Corpus callosum ausgezählt. Es zeigte sich eine deutliche Reduktion der Anzahl sowohl GFAP positiver Astrozyten (Abb. 4A, p<0,0001) als auch Vimentin positiver Astrozyten (Abb. 4C, p<0,0001) bei GFAP-TK-transgenen Mäusen, die mit Ganciclovir ab Woche 4 behandelt wurden. Bei der täglichen Injektion von Ganciclovir ab der vierten Woche in einer Dosierung von 25mg/kg KG wurde eine Ablation von Astrozyten von 50-60% während aller untersuchten Zeitpunkten festge- stellt. In diesen Gruppen betrug die Zahl der Astrozyten zwischen 200 und 300 Zellen pro mm².

22 In den drei Kontrollgruppen, also den Wildtyptieren, die entweder mit PBS oder mit GCV behandelt waren sowie den transgenen Tieren, die PBS injiziert bekamen, gab es keine statistisch signifikante Reduktion der Astrozytenzahl. Zu allen Zeitpunkten lag die Anzahl etwa doppelt so hoch wie bei der Untersuchungsgruppe (600-700 Zellen/mm²).

Somit konnte nachgewiesen werden, dass die Ablation mittels Ganciclovir in GFAP-TK transgenen Mäusen funktioniert.

Mit Hilfe der Doppelfärbung mit GFAP (Astrozytenmarker) und Ki-67 (Proliferations- marker) wurden proliferierende Astrozyten dargestellt. Zu Beginn des Untersuchungs- zeitraumes betrug die Zahl dieser knapp ein Drittel im Vergleich zu den Kontrollgrup- pen und glich sich im Verlauf an sie an (Abb. 4B, p<0,0001). In der Woche 5 fanden sich in der Untersuchungsgruppe etwa 10 proliferierende Zellen pro mm², in den Kon- trollgruppen dagegen 30 Zellen pro mm². Bis zur Woche 6 halbierte sich die Anzahl sowohl in der Untersuchungs- als auch in den Kontrollgruppen und lag nun bei 5 Zellen bzw. 15 Zellen pro mm². In der Woche 7 waren in allen Gruppen 5 Zellen pro mm² zu zählen.

23

Abb. 4: Astrozyten im Verlauf

Die Grafiken A) und C) stellen die Astrozytenanzahl in der Untersuchungsgruppe im Vergleich zu den Kontrollgruppen zu den untersuchten Zeitpunkten mittels GFAP bzw. Vimentin dar. Die Behandlung mit Ganciclovir (GCV) ab Woche 4 der Cuprizone-Fütterung bei transgenen GFAP-TK Mäusen führte zu einer Ablation von Astrozyten. In der Grafik B) wird mittels der Doppelfärbung mit GFAP und Ki-67 gezeigt, dass die Behandlung mit GCV die Anzahl der proliferierenden Astrozyten verminderte. Signifi- kante Unterschiede sind mit Sternchen gekennzeichnet (* p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001).

24 3.3. Auswirkung der Astrozytenablation zum Zeitpunkt der beginnenden Rekrutierung von Oligodendrozytenvorläuferzellen

Im Folgenden werden die Ergebnisse der Gruppe beschrieben, bei der die Ganciclovir- Injektionen ab Woche 4 begonnen wurden. Im Cuprizone-Modell beginnen zu diesem Zeitpunkt Oligodendrozytenvorläuferzellen in das demyelinisierte Corpus callosum einzuwandern, nach Woche 5 reduziert sich die Anzahl der Vorläuferzellen wieder stark (Skripuletz et al., 2011).

3.3.1. Astrozytenablation verhindert Remyelinisierung

Das Ausmaß der Remyelinisierung wurde mittels der immunhistochemischen Myelin- Färbungen MOG, MAG, MBP, CNPase, PLP und der histochemischen LFB Färbung untersucht. Dabei handelt es sich bei MOG, MAG und PLP um Transmembran-Proteine, bei MBP und CNPase um membranständige Proteine. Die Astrozyten ablatierten Tiere wiesen im Vergleich zu den Kontrollgruppen eine statistisch signifikant verminderte und verzögerte Remyelinisierung auf, die in allen Färbungen nachzuvollziehen war (Abb. 5-7, für alle p<0,0001). Alle untersuchten Myelinproteine zeigten zum Zeitpunkt des Absetzens von Cuprizone (Woche 5) bei allen Gruppen keine oder nur eine geringe Expression. Im weiteren Verlauf nahm der Myelinisierungsgrad, der mit Hilfe eines Score-Systems von 0 − 3 objektiviert wurde, in den 3 Kontrollgruppen zu. Der Verlauf der Remyelinisierung hat zwischen den Kontrollgruppen keine Unterschiede ergeben:

zum Zeitpunkt Woche 5 wurde ein Score von 0 − 0,5 nachgewiesen, nach einer halben Woche lag bereits ein Score von 1 vor, nach einer Woche 1 − 1,5 und nach 2 Wochen lag der Remyelinisierungsgrad bereits bei 2. Im Gegensatz dazu wiesen die Astrozyten ablatierten Tiere eine deutlich reduzierte Expression aller untersuchten Myelinproteine auf und erreichten zu keinem Zeitpunkt einen Score von ≥ 1.

25

Abb. 5: Verlauf des Myelinisierungsgrades anhand der MOG-Färbung

In A) ist der Verlauf der Myelinisierung zu den verschiedenen Untersuchungszeitpunkten und unter den verschiedenen Untersuchungsgruppen in der MOG-Färbung gezeigt. Alle Gruppen wurden über 5 Wo- chen mit Cuprizone gefüttert. Ab Woche 4 erfolgten Behandlungen mit Ganciclovir oder PBS. Die Aus- wertung erfolgte verblindet durch drei unabhängige Untersucher nach dem oben beschriebenen etablierten Score-System. In B) wird auszugsweise der Zeitpunkt Woche 7 demonstriert. Man sieht die deutlich ein- geschränkte Remyelinisierung bei den GFAP-TK transgenen Mäusen, die mit Ganciclovir (GCV) behan- delt wurden. Signifikante Unterschiede sind mit Sternchen gekennzeichnet (* p<0,05, ** p<0,01, ***

p<0,001).

26

Abb. 6: Vergleich des Verlaufes des Myelinisierungsgrades in den Myelin-Färbungen PLP, CNPase und LFB

In A) ist der Verlauf der Myelinisierung zu den 4 Untersuchungszeitpunkten in den jeweiligen Untersu- chungsgruppen in der PLP-Färbung gezeigt. Alle Gruppen wurden 5 Wochen mit Cuprizone gefüttert. Ab Woche 4 erfolgten Behandlungen mit Ganciclovir oder PBS. In Woche 6 und 7 ist die Myelinisierung bei diesen GFAP-TK transgenen Tieren signifikant eingeschränkt. B) zeigt den Verlauf der Myelinisierung in der CNPase-Färbung. Hier ist bereits in der 5,5 Woche bei GFAP-TK transgenen Mäusen nach Astrozy- tenablation die Myelinisierung signifikant eingeschränkt. C) zeigt den Verlauf der Myelinisierung in der LFB-Färbung. Die Myelinisierung ist bei GFAP-TK transgenen Tieren ab Woche 6 signifikant einge- schränkt. Signifikante Unterschiede sind mit Sternchen gekennzeichnet (** p<0,01, *** p<0,001).

27

Abb. 7: Vergleich des Verlaufes des Myelinisierungsgrades in den Myelin-Färbungen MAG und MBP

Die Grafik zeigt den Grad der Myelinisierung in den 4 Untersuchungsgruppen zu den 4 Untersuchungs- zeitpunkten mittels der Färbungen MAG A) und MBP B). Alle Gruppen wurden 5 Wochen mit Cuprizone gefüttert. Ab Woche 4 erfolgten Behandlungen mit Ganciclovir oder PBS. Es fallen in dieser Gruppe signifikant eingeschränkte Myelinisierungsgrade bereits ab der 5,5 Woche auf. Signifikante Unterschiede sind mit Sternchen gekennzeichnet (** p<0,01, *** p<0,001).

28 3.3.2. Astrozytenablation führt zu geringerer Anzahl an Oligodendrozyten

Oligodendrozyten, die das Myelin im ZNS bilden, wurden mit den Antikörpern Nogo-A und APC immunhistochemisch nachgewiesen. Passend zu der Zunahme des Remyelini- sierungsgrades in den 3 Kontrollgruppen stieg die Anzahl der Oligodendrozyten zu je- dem Zeitpunkt, ähnlich wie die Myelinisierung auch, an. Auch hier zeigten sich inner- halb der 3 Kontrollgruppen keine signifikanten Unterschiede.

In den Astrozyten ablatierten Mäusen zeigte sich eine sehr niedrige und im Vergleich zu den Kontrollmäusen signifikant reduzierte Anzahl an Nogo-A positiven (Abb. 8A, p<0,0001) und APC positiven Oligodendrozyten (Abb. 8B und C, p<0,0001) eine halbe Woche, eine Woche sowie 2 Wochen nach Absetzen von Cuprizone. Unmittelbar nach Absetzen von Cuprizone war zwar eine Tendenz zur verminderten Anzahl von Oli- godendrozyten zu erkennen, die Ergebnisse sind jedoch nicht statistisch signifikant.

29

Abb. 8: Verlauf der Oligodendrozyten

In A) und C) ist der Verlauf der Oligodendrozyten zu den verschiedenen Untersuchungszeitpunkten und unter den verschiedenen Untersuchungsgruppen anhand der Nogo-A und APC Färbungen gezeigt. Alle Gruppen wurden 5 Wochen mit Cuprizone behandelt. Ab Woche 4 erfolgten Behandlungen mit Gancic- lovir oder PBS. In B) wird auszugsweise der Zeitpunkt Woche 6 anhand der APC Färbung demonstriert.

Man sieht die deutlich geringere Oligodendozytendichte bei den GFAP-TK transgenen Mäusen, die mit Ganciclovir (GCV) behandelt wurden. Signifikante Unterschiede sind mit Sternchen gekennzeichnet (**

p<0,01, *** p<0,001).

30 3.3.3. Astrozytenablation führt zu verminderter Anzahl an Oligodendrozytenvorläuferzellen

Die verminderte Anzahl an ausgewachsenen myelinbildenden Oligodendrozyten bei Astrozyten ablatierten Mäusen lässt keine Rückschlüsse darauf ziehen, ob sie aufgrund mangelnder Vorläuferzellen oder durch Ausbleiben der Differenzierung dieser zu erklä- ren ist. Es wurden deshalb Immunfluoreszenz-Doppelfärbungen mit den Markern Olig2 und APC durchgeführt. APC ist ein Marker für reife Oligodendrozyten und Olig2 färbt sowohl Oligodendrozytenvorläuferzellen als auch Oligodendrozyten. Mit Hilfe der Doppelfärbung wurden die einfach positiven Zellen für Olig2, also nur die Vorläuferzel- len, die noch nicht differenziert haben, ausgezählt. Bereits in den Übersichtsaufnahmen war zu erkennen, dass die Astrozyten ablatierten transgenen Mäuse eine deutlich gerin- gere Anzahl an Oligodendrozytenvorläuferzellen aufwiesen, was statistisch signifikant war (Abb. 9A)). Die Anzahl der Oligodendrozytenvorläuferzellen blieb über den Unter- suchungszeitraum relativ konstant und lag bei 100 Zellen/mm², sodass in der Woche 7 sich die Untersuchungsgruppe und die Kontrollgruppen anglichen.

In der Doppelfärbung Olig2 und Ki-67, einem Proliferationsmarker, sieht man einen Mangel an proliferierenden Oligodendrozytenvorläuferzellen in der Untersuchungs- gruppe nach Ablation von Astrozyten. Hier ist ein statistisch signifikanter Unterschied jedoch nur bis zur Woche 5,5 zu verzeichnen (Abb. 9B, p<0,0001). Zu Beginn beträgt die absolute Zahl in den Kontrollgruppen zwischen 40 und 60 Zellen/mm², bis zur Wo- che 6 hat sich dieser Wert in den Kontrollgruppen halbiert. In der Untersuchungsgruppe nach Ablation von Astrozyten liegt der Wert zu allen Zeitpunkten konstant bei 10 Zel- len/mm².

31

Abb. 9: Oligodendrozytenvorläuferzellen im Verlauf

Die Oligodendrozytenvorläuferzellen wurden mittels der Färbung Olig2 untersucht. Da Olig2 sowohl Oligodendrozytenvorläuferzellen als auch ausgewachsene Oligodendrozyten färbt, wurden anhand von Doppelfärbungen mit Olig2 und APC nur Olig2 einzeln positive Zellen gezählt (A). Anhand der Doppelfärbung mit Olig2 und Ki-67 wurden proliferierende Oligodendrozytenvorläuferzellen unteruscht (B). In B) wird auszugsweise der Zeitpunkt Woche 5 anhand der Olig2/Ki-67 Doppelfärbung demonstriert. Alle Untersuchungsgruppen wurden über 5 Wochen mit Cuprizone gefüttert. Ab Woche 4 erfolgten Behandlungen mit Ganciclovir oder PBS. Es fällt ein statistisch signifikanter Mangel an Oligodendrozytenvorläuferzellen auf, die auch eine wesentlich geringere Proliferation aufweisen. Signifi- kante Unterschiede sind mit Sternchen gekennzeichnet (* p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001).

32 3.4. Astrozytenablation zum Zeitpunkt der Remyelinisierung hat keinen Einfluss auf die Anzahl von Mikroglia

Eine Vorarbeit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. med. Martin Stangel untersuchte die Bedeutung der Astrozyten für die Demyelinisierung (Skripuletz et al., 2013). Hier kam eine besondere Rolle den Mikroglia zuteil, die bei Astrozytenablation während des Demyelinisierungsprozesses nicht ausreichend rekrutiert wurden. Zur Vervollständi- gung dieser Ergebnisse und zur Antwort auf die Frage, ob die bei uns eruierten Ergeb- nisse durch Veränderungen des Mikroglia-Verteilungsmusters zu erklären sind, wurden in dieser Arbeit Mikroglia mittels Färbungen gegen die Proteine RCA-1 und IBA-1 sichtbar gemacht und ausgezählt. Bei RCA-1 handelt es sich um eine Lectinfärbung, welche aktivierte Mikroglia darstellt, während Iba-1 auch ruhende Mikroglia färbt. Zu- nächst fiel auf, dass sich die Mikroglia antiproportional zu den Oligodendrozyten ver- hielten, also bei zunehmender Anzahl der Oligodendrozyten während der Remyelinisie- rung die Menge an Mikroglia abnahm. Außerdem ist zu vermerken, dass die Untersu- chungsgruppe und die Kontrollgruppen keinen signifikanten Unterschied zeigten (Abb.

10). Auch in den Astrozyten ablatierten Mäusen war eine stetige Abnahme der Mikrog- lia-Zahl zu erkennen. Die Anzahl der Mikroglia fiel sowohl in den Kontrollgruppen als auch in den Astrozyten ablatierten Tieren von 1000-1250 Zellen/mm² auf 250-500 Zel- len/mm² ab.

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Abb. 10: Verlauf der Mikroglia während der Remyelinisierung

Die Anzahl der Mikroglia wurde mittels der immunhistochemischen Färbungen RCA-1 (Darstellung aktivierter Mikroglia) A) und IBA-1 (Darstellung der gesamten Mikroglia) B) untersucht. Alle Untersu- chungsgruppen wurden 5 Wochen mit Cuprizone gefüttert. Ab Woche 4 erfolgten Behandlungen mit Ganciclovir oder PBS. Die Beurteilung erfolgte mittels manueller Zählung der positiv gefärbten Zellen.

Es sind jeweils die Zeitpunkte 5, 5,5, 6 und 7 Wochen nach Beginn der Cuprizone-Gabe dargestellt. Zu jedem Zeitpunkt sind Wildtyptiere und transgene GFAP-TK Mäuse mit PBS oder Ganciclovir (GCV) behandelt worden.

34 3.5. Astrozytenablation ab der Woche 5 zeigt keine Auswirkung auf die Remyelinisierung

Im dritten Versuchsansatz wurde Ganciclovir ab Woche 5 verabreicht. Es zeigte sich eine deutliche Reduktion der Anzahl GFAP positiver Astrozyten (Abb. 11A, p<0,0001) bei GFAP-TK-transgenen Mäusen im Vergleich zu Wildtyp Mäusen, die mit Ganciclo- vir behandelt wurden. Das Ausmaß der Remyelinisierung bei transgenen Mäusen, die Ganciclovir-Injektionen erst ab der Woche 5 bekamen, zeigte keinen statistisch signifi- kanten Unterschied im Vergleich zu der Kontrollgruppe. Dieses Ergebnis zeigte sich sowohl bei den immunhistochemischen Färbungen gegen die Myelinproteine PLP (11B), MOG (11C), MAG (11D), MBP (11E) und CNPase (11F) als auch bei der histologi- schen LFB Färbungen (11G). Auch wurden keine Unterschiede für die Anzahl an reifen Nogo-A (11H) und APC (11I) positiven Oligodendrozyten und IBA-1 (11J) und RCA-1 (11K) positiven Mikroglia festgestellt. Es ließ sich damit feststellen, dass die Astrozy- tenablation zum Zeitpunkt der beginnenden Myelinproteinexpression keinen Einfluss mehr auf die weitere Remyelinisierung nahm.

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Abb. 11: Fehlende Auswirkungen der Astrozytenablation nach 5 Wochen Cuprizone-Fütterung A) zeigt die erfolgreiche Astrozytenablation bei transgenen GFAP-TK Mäusen, die ab der 5 Woche mit Ganciclovir behandelt wurden im Vergleich zu Wildtyp Mäusen. Bei B)-G) zeigt sich kein signifikanter Unterschied bei dem Myelinisierungsgrad zwischen der Untersuchungsgruppe und der Kontrollgruppe, H) und I) stellen die Oligodendrozytenanzahl dar, die ebenfalls keinen signifikanten Unterschied aufweisen, J) und K) zeigen keinen signifikanten Unterschied in der Anzahl der Mikroglia zu den untersuchten Zeit- punkten. Signifikante Unterschiede sind mit Sternchen gekennzeichnet (*** p<0,001).