Bortezomib in der Therapie des Pankreaskarzinoms
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades
einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
( Dr. med. vet. )
vorgelegt von Nina Zeiss aus Lindenfels
Hannover 2010
Prof. Dr. Angela Märten, Chirurgische Universitätsklinik, Heidelberg
1. Gutachter: Prof. Dr. Michael Fehr
2. Gutachter: Prof. Dr. Manfred Kietzmann
Tag der mündlichen Prüfung: 06.05.2010
1 Einleitung ... 1
2 Literaturübersicht ... 3
2.1 Pankreaskarzinom... 3
2.1.1 Pathophysiologische Grundlagen... 4
2.1.2 Symptome und Diagnostik ... 4
2.1.3 Therapie ... 5
2.1.4 Pankreaskarzinome beim Tier... 7
2.2 Ubiquitin-Proteasom-System ... 9
2.2.1 Aufbau des 26S Proteasoms ... 10
2.2.2 Ubiquitinierung der Proteine ... 12
2.3 Proteasominhibition als neues Therapiekonzept ... 12
2.3.1 Bortezomib ... 14
2.3.2 Bortezomib beim Multiplen Myelom ... 15
2.3.3. Bortezomib bei soliden Tumoren... 17
2.4 Tumorangiogenese ... 18
2.5 Ziele der vorliegenden Arbeit... 20
3 Versuchsgut und Methoden ... 21
3.1 Versuchsgut ... 21
3.1.1 Chemikalien und Reagenzien... 21
3.1.1.1 Arzneimittel...21
3.1.1.2 Fluoreszenzgelabelte Peptidsubstrate ...22
3.1.2 Antikörper ... 22
3.1.3 Zelllinien... 22
3.1.4 Lösungen und Puffer... 23
3.1.4.1 Proteasomaktivitätsbestimmung ...23
3.1.4.2 SDS-PAGE Gelelektrophorese ...23
3.1.4.3 Silberfärbung ...24
3.1.5 Kulturmedium ... 25
3.1.6 Geräte ... 25
3.1.7 Versuchstiere... 25
3.2.1.2 Behandlung der Zellkulturen...26
3.2.2 In-vivo-Experimente ... 27
3.2.2.1 Subkutane Tumorzellimplantation ...27
3.2.2.2 Orthotope Tumorzellimplantation in das Pankreas...27
3.2.2.3 Behandlung der Versuchstiere...28
3.2.3 Analytik... 29
3.2.3.1 Durchflusszytometrie und AnnexinV/PI...29
3.2.3.2 Bestimmung der Zellvitalität...30
3.2.3.3 Proteasomaktivitätsbestimmung der CAPAN-2 Zellen...30
3.2.3.4 Proteasomaktivitätsbestimmung der aus den Tierversuchen gewonnenen Tumoren...31
3.2.3.5 Qualitative Isolierung des 20S Proteasoms durch Gelelektrophorese 32 3.2.3.6 Immunhistochemie ...34
3.2.3.7 VEGF Bestimmung...34
3.2.3.8 Quantifizierung der m-RNA...35
3.2.3.9 Statistische Auswertung ...35
4 Ergebnisse ... 36
4.1 In-vitro-Analyse ... 36
4.1.1 Apoptoseinduktion... 36
4.1.2 Effekte auf die Zellproliferation ... 42
4.1.3 Proteasomaktivität ... 43
4.2 In-vivo-Analyse... 45
4.2.1 Subkutanes Tumormodell ... 46
4.2.2 Orthotopes Tumormodell ... 47
4.2.3 Bestimmung der Proteasomaktivität aus den Tumorlysaten... 49
4.2.4 Immundefiziente Mäuse... 51
4.3 Analyse der Angiogenese ... 54
4.3.1 Gefäßdichtebestimmung ... 54
4.3.2 Serum-VEGF Bestimmung ... 57
4.3.3 RGS-5 mRNA Bestimmung ... 58
5.1.1 Subkutane Tumormodelle... 59
5.1.2 Orthotope Tumormodelle ... 60
5.2 Diskussion der Ergebnisse ... 61
6 Zusammenfassung... 67
7 Summary... 69
8 Literaturverzeichnis ... 71
9 Anhang... 81
Abbildungsverzeichnis... 81
Abkürzungsverzeichnis ... 82
Publikation von Teilergebnissen... 85
Danksagung ... 86
1 Einleitung
Tumorerkrankungen stellen in Europa und den USA nach den Herz- Kreislauferkrankungen die zweithäufigste Todesursache dar und sind somit für zirca ein Viertel aller Sterbefälle verantwortlich. 6% der beim Menschen auftretenden Tumoren sind Neoplasien der Bauchspeicheldrüse.
Jährlich erkranken am Adenokarzinom des Pankreas in den USA 30.000 und in Europa mehr als 60.000 Menschen, von denen die meisten innerhalb eines Jahres versterben, da die mittlere Überlebenszeit nach Diagnosestellung ohne Therapie bei nur 3,5 Monaten liegt. Eine chirurgische Resektion des kompletten Tumorgewebes ist in der Regel nicht mehr möglich, die Diagnosestellung erfolgt in den meisten Fällen erst im fortgeschrittenem Stadium. Zytostatikagaben, Immuntherapien oder strahlentherapeutische Interventionen führen bisher bestenfalls zu einer Verlangsamung des Pankreaskarzinomwachstums, so dass die Prognose trotz der Anwendung aller klinisch genutzten kurativen Behandlungsoptionen als infaust zu beurteilen ist.
Chemotherapeutische Ansätze zielen z.B. auf Schädigung der DNA-Replikation der Tumorzellen, Apoptoseinduktion, Proliferationshemmung oder auch auf Hemmung des Proteasoms. Das Proteasom ist die wichtigste extralysosomale Protease der Zelle, deren Aufgabe es ist Ubiquitin markierte intrazelluläre Proteine abzubauen. Die Proteine sind oftmals für die Zellproliferation, das Zellwachstum, die Zelldifferenzierung, die Regulation der Apoptose und für die Zellzykluskontrolle essentiell.
Eine Hemmung des Proteasoms unterbricht die Proteolyse und somit eine Vielzahl der Signalkaskaden innerhalb einer Zelle, dies führt zu einem Stillstand im Zellzyklus und schließlich zum programmierten Zelltod (Apoptose). Da Tumorzellen sensitiver als gesunde Körperzellen auf die Proteasomhemmung reagieren, stellt dieser Wirkmechanismus eine interessante Therapieoption für die Behandlung neoplastischer Erkrankungen dar.
Der Proteasominhibitor Bortezomib bindet hochselektiv an das 26S-Proteasom und ist dabei in seiner Wirkung dosisabhängig und reversibel. Die Nebenwirkungen sind im Regelfall mild und durch supportive Maßnahmen zu beherrschen.
In der Therapie des Multiplen Myeloms wird Bortezomib bereits seit einigen Jahren erfolgreich eingesetzt. Aufgrund dessen erscheint Bortezomib auch bei soliden Tumoren als eine vielversprechende Therapieoption. Es wurde gezeigt, dass Bortezomib auch bei verschiedenen, aus soliden Tumoren gewonnenen Zelllinien, Wachstumsinhibition und Apoptose induziert. Da jedoch die bisherigen Ergebnisse zahlreicher In-vitro- und In-vivo-Studien bei soliden Tumoren stark differieren, herrscht hier großer Forschungsbedarf.
2 Literaturübersicht
2.1 Pankreaskarzinom
Beim Pankreaskarzinom handelt es sich um eine bösartige und höchstgradig aggressive Neoplasie der Bauchspeicheldrüse.
Das Pankreaskarzinom gehört dabei eher zu den seltenen Krebsarten und liegt bei den Neuerkrankungen auf Rang neun, jedoch auf Rang vier bei den Krebstodesfällen. Durchschnittlich sind etwa 17 von 100.000 Menschen pro Jahr betroffen. Dies entspricht einem Anteil von 6% aller Krebserkrankungen. Die mediane Überlebenszeit ab dem Zeitpunkt der Diagnosestellung ist die kürzeste überhaupt bei allen Tumoren. Ohne Behandlung liegt sie beim fortgeschrittenen Pankreaskarzinom bei 3,5 Monaten, bei adäquater Behandlung kann sie auf sechs Monate ansteigen (LI et al., 2004).
Die Inzidenz des Pankreaskarzinoms zeigt geographisch große Unterschiede und hat mit steigender mittlerer Lebenserwartung stark zugenommen, der Häufigkeitsgipfel liegt zwischen dem 60. und dem 80. Lebensjahr (LOWENFELS und MAISONNEUVE, 2005).
Beim Menschen gibt es eine Vielzahl verschiedener Tumoren, die vom Gewebe der Bauchspeicheldrüse ausgehen. Sie können ihren Ursprung sowohl im exokrinen als auch im endokrinen Gewebeanteil der Drüse nehmen. Der häufigste Tumor ist mit 85-90% das Adenokarzinom, es geht vom duktualen Gewebe des exokrinen Pankreasanteils aus und stellt somit das typische Pankreaskarzinom dar. Es kommen außerdem Ampullen-, Papillenkarzinome und Karzinome der Azinuszellen vor. Insgesamt sind fast alle Neubildungen an der Bauchspeicheldrüse bösartig.
Der Sitz des Primärtumors ist zu 70% der Pankreaskopf, danach folgen Corpus (20%) und Cauda (10%) (KELLY und BENJAMIN, 1995).
2.1.1 Pathophysiologische Grundlagen
Pankreaskarzinome entstehen schrittweise durch zunehmende genetische und morphologische Veränderungen der Pankreasgangzellen. Die sequenziellen Veränderungen beginnen mit der pankreatischen intraepithelialen Neoplasie (PanIN), die lediglich einer Dysplasie entspricht. Es handelt sich hierbei um Läsionen in den Epithelien der kleinen Ausführungsgänge des Pankreas, welche sich aus variierenden Stadien zytologischer Atypien zusammensetzen. Die Zellproliferationsrate steigt dann mit zunehmenden PanIN Stadium (BARDEESY und DE PINHO, 2002; YEO et al., 2002).
Eine Mutation des Onkogens K-ras wurde in bis zu 95% des duktalen Adenokarzinoms gefunden (QUENEAU et al., 2001). K-ras wird durch den Tyrosin- Kinase-Rezeptor aktiviert und aktiviert wiederum im weiteren Signalweg die Gene für das Zellwachstum und die Initiation des Zellzyklus. Durch die Mutation bleiben diese Gene aktiviert. Die bekanntesten Tumorsuppressorgene, die im Pankreas mutieren können, sind die Gene p53 und p16 (MOSKALUK et al., 1997). So ist zum Beispiel in mehr als 70% aller Fälle des Pankreaskarzinoms p53 inaktiv, die Zellproliferation wird dadurch nicht mehr hemmend beeinflusst, zudem kommt es durch die Mutationen zur Entwicklung von Resistenzen gegen verschiedene Chemotherapeutika (PELLEGATA et al., 1994).
2.1.2 Symptome und Diagnostik
Die Diagnose eines Pankreaskarzinoms hat im Allgemeinen eine sehr ungünstige Prognose, dies ist vor allem damit zu begründen, dass eine Erkennung meist erst im fortgeschrittenen Stadium gelingt. Die Symptome in der Frühphase sind uncharakteristisch und werden oft fehlgedeutet (KÄCHELE et al., 2004).
Die klinische Symptomatik wird zudem stark von der Lokalisation des Tumors im Pankreas bestimmt. Im Gegensatz zum papillennahen Tumor, der sich in der Regel mit einem schmerzlosen Ikterus manifestiert, führt das Karzinom im Korpus- oder Kaudabereich zu uncharakteristischen Beschwerden. Die Patienten beklagen ein
reduziertes Allgemeinbefinden, Schmerzen im Oberbauch, Gewichtsverlust, Appetitlosigkeit und unspezifische Rückenschmerzen. Außerdem beobachtet man häufig, teilweise auch als Erstsymptom, einen neuauftretenden Diabetes mellitus (HOLLERBACH et al. 2001). Bei periampullären Karzinomen kommt es als häufigstes Zeichen zu einer Störung des Gallenabflusses, mit einem schmerzlosen Ikterus, acholischen Stühlen, dunklem Urin und Pruritus. Vor allem duodenale Obstruktion führt zu Übelkeit und Erbrechen. Bei einem Viertel der Patienten ist im fortgeschrittenen Stadium die große, harte Tumormasse im Oberbauch zu palpieren.
Ebenso muss bei akuter oder chronischer Pankreatitis unklarer Herkunft immer ein Pankreaskarzinom in Betracht gezogen werden (CLASSEN et al., 2003).
Die transkutane Sonographie stellt den ersten Schritt der weiterführenden Diagnostik dar, 70% der Karzinome können auf diese Weise erkannt werden.
Die wichtigste Untersuchungsmethode zur Feststellung eines Pankreaskarzinoms stellt die Dünnschicht-Computertomographie mit Kontrastmittel dar. Sie ist neben der Diagnosestellung wichtig für das Staging des Tumors und somit für die Beurteilung dessen Operabilität. Die CT zeigt neben der lokalen Ausdehnung des Karzinoms, die eventuelle Infiltration von Gefäßen und gibt Information über das Vorhandensein von Metastasen. Die Metastasierung erfolgt regelmäßig portogen in die Leber, aber auch lymphogen in die regionären Lymphknoten, sowie ins Peritoneum und in die Lunge.
Außerdem kommt es häufig zur Entwicklung von Implantationsmetastasen im Bauchraum, die oft von der Bildung eines Aszites begleitet wird (LI et al., 2004).
Eine Laboruntersuchung ist wenig aussagekräftig, da keine ausreichende Sensitivität und Spezifität vorhanden ist. Vor allem die sogenannten Tumormarker wie CEA, CA 19-9, DU-PAN 2 oder CA 125 sind für die Diagnosestellung nicht sensitiv genug.
Bei Verlegung des Ductus choledochus ist mit Erhöhung der Cholestaseparameter Bilirubin oder der alkalischen Phosphatase zu rechnen. Die Leberenzyme ALT und AST können durch eine obstruktionsbedingte Leberzellzytolyse ebenfalls erhöht sein.
2.1.3 Therapie
Nur für eine geringe Anzahl der Patienten besteht zum Zeitpunkt der Diagnosestellung die Möglichkeit eines kurativen Ansatzes, der durch eine radikale
Resektion erfolgen muss. Für den größten Teil der Patienten (85-90%) besteht nur die Möglichkeit einer palliativen Behandlung, die eine weitere Progression des Tumors verhindern soll, um eine Krankheitsstabilisierung zu erreichen. Neben der Lebensverlängerung wird auch zunehmend die Lebensqualität als Parameter untersucht („Quality of Life“ = QoL) (CASCINU et al., 2001).
Für die Karzinome, die zu 60-70% im Pankreaskopf lokalisiert sind, kommen als kurative Behandlung nur die Pylorus-erhaltende Whipple-Operation oder der klassische Kausch-Whipple infrage. Bei dem klassischen Kausch-Whipple werden der Pankreaskopf, das Duodenum, die Gallenblase mit dem distalen Choledochus, die peripankreatischen Lymphknoten, die Lymphknoten im Bereich des Ligamentum hepatoduodenale und die distale Hälfte des Magens entfernt. Bei Tumoren im Korpus- oder Kaudabereich stellt die Pankreaslinksresektion mit Splenektomie das probate operative Vorgehen dar.
Die Fünfjahresüberlebensrate liegt trotz der Radikalität der Operationen auch hier bei nur 25%, da bei der Mehrzahl der Patienten Lokalrezidive und Fernmetastasen auftreten (YEO et al., 2002).
Durch ausschließlichen Einsatz von Strahlentherapie konnte keine signifikante Erhöhung der medianen Überlebenszeit erreicht werden (KREMPIEN et al., 2004).
Das seit 1996 als Zytostatikum zugelassene Gemcitabine wird standardmäßig als Monotherapie beim Pankreaskarzinom eingesetzt, es zeigt bisher die größte palliative Wirksamkeit. Die mediane Überlebenszeit der mit Gemcitabine behandelten Patienten liegt bei ca. 6 Monaten. Die objektive Responsrate liegt bei nur 10%, jedoch profitieren ca. 24% der Patienten von einem subjektiven klinischen Nutzen (Verbesserung der QoL).
Damit ist Gemcitabine dem vor 1997 als Standardtherapeutikum eingesetzten 5- Fluorouracil (5-FU) deutlich überlegen, dieses konnte nur bei 4,8% der Patienten die klinischen Symptome mildern. Die mediane Überlebenszeit der Pankreaskarzinompatienten betrug unter Einsatz von 5-FU nur 4,4 Monate (BURRIS und STRONIOLO, 1997).
Neben diesen Standardverfahren (Operation, Chemotherapie mit Zytostatika) werden in klinischen Studien neue, ergänzende Therapieansätze wie z.B. die Immuntherapie
erprobt, mit deren Hilfe die Effizienz der bisherigen Behandlungsstrategien verbessert werden soll (KNAEBEL et al., 2005).
2.1.4 Pankreaskarzinome beim Tier
Das Pankreas beim Kleintier wird anatomisch gesehen nicht wie beim Menschen in Caput, Corpus und Cauda gegliedert, sondern zu dem zentral gelegenen Corpus pancreatis kommen noch zwei Schenkel, der Lobus pancreatis dexter und der Lobus pancreatis sinister. Der rechte Schenkel liegt dem Duodenum bis zum Zäkum verlaufend an. Der linke Schenkel wird von den Serosablätten des Netzes umschlossen und verläuft dem Magen benachbart bis fast zur Milz (NICKEL et al., 2004). Wie auch beim Menschen kommen vor allem bei Hunden und Katzen Erkrankungen des exokrinen Pankreas häufig vor, sie werden jedoch in der tierärztlichen Praxis selten festgestellt, welches wohl in den diagnostischen Schwierigkeiten zu begründen ist. In einer retrospektiven, pathologischen Studie zu den Erkrankungen des exokrinen Pankreas wurden 9342 Bauchspeicheldrüsen von an verschiedenen Primärerkrankungen verstorbenen Hunden untersucht, davon waren 192 pathologisch verändert (1,73%). Mit 93 Fällen (1,03 % der 9342 untersuchten Tiere) war die Pankreatitis die am häufigsten festgestellte Veränderung. Der Befund eines Pankreaskarzinoms wurde bei immerhin 40 Tieren (0,43%) erhoben, während bei 20 Hunden (0,21%) eine Pankreasatrophie vorlag, welche wiederum auf eine exokrine Pankreasinsuffizienz hinweist. Im Konflikt zu diesen Daten stehen die klinischen Beobachtungen, dort werden Pankreaskarzinome nur selten und weit weniger häufig als die Pankreasatrophie diagnostiziert. Bei weitern 0,06% der untersuchten Hunde wurden andere, nicht näher beschriebene pathologische Veränderungen des exokrinen Pankreas festgestellt. Im Rahmen der selben Studie wurden auch 6504 Katzenpankreata untersucht. Mit 0,6% war auch hier die Pankreatitis die am häufigsten aufgetretene pathologische Veränderung, es folgte mit 0,4% das Pankreaskarzinom (HÄNICHEN und MINKUS, 1990). Eine neuere Studie, mit mehr als 200 an verschiedenen Primärerkrankungen verstorbenen Hunden zeigte zudem, dass nur 8% aller untersuchten Bauchspeicheldrüsen keinerlei mikroskopische Veränderungen des exokrinen
Pankreas zeigten (STEINER et al., 2007). Nicht alle histopathologischen Veränderungen haben somit eine klinische Relevanz.
Tumoren des Pankreas scheinen bei Hund und Katze zunehmend häufig vorzukommen, beim Hund machen sie zirka 3% aller abdominalen Tumore aus. Die am häufigsten vorkommenden Tumoren des exokrinen Pankreas sind Adenokarzinome, welche von den azinären oder duktalen Zellen der Bauchspeicheldrüse ausgehen. Es treten jedoch auch benigne epitheliale Tumoren und seltener Adenome auf, diese sind klinisch oft unauffällig und finden sich vor allem bei Katzen verhältnismäßig häufig als Zufallsbefund bei Obduktionen (KESSLER, 2005).
Bei den selteneren Tumoren des endokrinen Pankreas bleiben vor allem die Insulin- produzierenden Beta-Zelltumoren (Insulinome) zu nennen, sie kommen beim Hund selten, bei der Katze sehr selten vor. Anders und erwähnenswert sieht die Situation beim Frettchen aus, bei dieser Spezies leiden die meisten Tiere ab einem Alter von fünf Jahren an Insulinomen. Im Falle einer andauernden Hypoglykämie muss immer ein Insulinom in Betracht gezogen werden. Histologisch können entweder β-Zell- Karzinome, -Adenome oder -Hyperplasien vorliegen (GABRISCH et al, 2008).
Die Prognose von Tieren, die am Adenokarzinom des exokrinen Pankreas erkrankt sind, ist schlecht. Die Überlebenszeiten von Beginn der klinischen Symptome an liegen bei Hund und Katze zwischen drei und maximal 90 Tagen. Betroffen sind vor allem ältere Tiere, das durchschnittliche Alter der daran erkrankten Hunde liegt beispielsweise bei 10,5 Jahren. Hündinnen scheinen häufiger betroffen zu sein, außerdem wird vermutet, dass Cocker Spaniel prädisponiert sind (KESSLER, 2005).
Im Gegensatz zum Menschen ist beim Tier meist der zentrale Teil des Pankreas (Corpus) betroffen (DAHME et al., 2007). Pankreaskarzinome metastasieren früh, bevorzugt in Lymphknoten, Leber, Omentum, Zwerchfell, Lunge und Knochen. Auch beim Tier sind die Symptome nicht spezifisch. Neben starkem Gewichtsverlust und Inappetenz zeigen die Tiere Vomitus und Aszites. Ikterus kann infolge der Verlegung des Ductus choledochus oder nach Metastasierung in die Leber auftreten. Die Tumormasse ist selten zu palpieren, jedoch ist das Abdomen oftmals schmerzhaft angespannt. In den wenigsten Fällen ist mit einer exokrinen Pankreasinsuffizienz zu
rechnen. Die Untersuchung der Blutparameter ist auch beim Tier wenig aussagekräftig, unter Umständen können die Amylase und die Lipase erhöht sein.
Ebenso sind in nicht wenigen Fällen die alkalische Phosphatase und die Bilirubinwerte infolge einer Cholestase erhöht. Auch liegen häufig neben einer Leukozytose, Anämie und Azotämie vor. Bei der röntgenologischen Untersuchung können im fortgeschrittenen Stadium, Tumormassen im kranialen Abdomen erkannt werden. Das Pankreas ist im gesunden Zustand sonographisch nicht darzustellen, hypoechogene Strukturen zwischen Magen und Duodenum können auf pathologische Veränderungen hinweisen, wobei mittels Ultraschall normalerweise Pankreastumoren nicht von einer Pankreatitis unterschieden werden können (KESSLER, 2005).
Da eine Tumorerkrankung des exokrinen Pankreas zum Zeitpunkt der Diagnosestellung meist weit fortgeschritten ist, sind chirurgische Maßnahmen oft nicht indiziert. Eine komplette Pankreatektomie eventuell in Zusammenhang mit einer Duodenektomie kann als lebensverlängernde Maßnahme durchgeführt werden, sofern der Tumor auf das Pankreas beschränkt bleibt. Postoperativ muss die entstehende exokrine und endokrine Pankreasinsuffizienz durch eine Substitutiontherapie dauerhaft behandelt werden. Von der in der Humanmedizin palliativ eingesetzten Chemotherapie wird in der Tiermedizin aufgrund der geringen Effizienz abgesehen (KESSLER, 2005).
2.2 Ubiquitin-Proteasom-System
Die Zelle verfügt über unzählige, verschiedenste Mechanismen, den intrazellulären Proteinhaushalt zu regulieren. Die zwei Hauptwege der Degradierung zytosolischer Proteine sind bekannt, die jeweils dafür verantwortlichen Zellorganellen sind zum einen das Lysosom und zum anderen das Proteasom.
Das Lysosom ist vor allem für den Abbau von extrazellulären oder transmembranellen Proteinen zuständig. Lysosomen sind zytoplasmatische, membrangebundenen Vesikel, die Proteasen und andere hydrolytische Enzyme
enthalten. Da diese Enzyme im Vesikel eingeschlossen sind, sind intrazelluläre Proteine weitgehend vor dem lysosomalen Abbau geschützt.
Das Proteasom ist die wichtigste extralysosomale Protease der Zelle und es degradiert Ubiquitin markierte, intrazelluläre Proteine (CIECHANOVER, 1994).
Das Proteasom ist somit für die Zelle von größter Wichtigkeit, da es selektiv intrazelluläre Proteine abbaut, die essentiell sind für die Zellproliferation, das Zellwachstum, die Zelldifferenzierung, die Regulation der Apoptose und für die Zellzykluskontrolle (MATTHEWS et al., 1989).
Proteasomen konnten sowohl im Zytoplasma als auch im Kern eukaryontischer Zellen identifiziert werden. Die Verteilung hängt von der jeweiligen Zellart bzw. der Art des Gewebes ab. Experimente mit fluoreszenzmarkiertem Proteasomen konnten zeigen, dass diese durch die Poren in der Kernmembran in den Nukleus gelangen können. Insbesondere während der Mitose, also während der Neuordnung des genetischen Materials kommt es zu einer Anreicherung der Proteasomen im Kern.
Welche Mechanismen die Verteilung der Proteasomen in der Zelle regulieren, wird noch untersucht. Es konnte beobachtet werden, dass sich Proteasomen im Zytoplasma immer in der Nähe der Zentrosomen, an der äußeren Oberfläche des Endoplasmatischen Retikulums befinden (REITS et al.,1997).
2.2.1 Aufbau des 26S Proteasoms
Bei dem Proteasom handelt es sich um einen Multienzymkomplex, welcher die wichtigste extralysosomale Protease der Zelle darstellt. Das 26S Proteasom ist mit 2,4MDa ein sehr großer, proteolytischer Komplex. Er besteht aus dem 20S Proteasom, einem zylinderförmigen katalytisch arbeitenden Kernkomplex, sowie aus einem 19S Cap-Partikel, der an die Enden des 20S Kernpartikels andockt (ADAMS, 2003; GLICKMAN und CIECHANOVER, 2002).
Das 20S Proteasom alleine ist lediglich in der Lage kurze Peptide zu spalten, während der regulatorische 19S Komplex ubiquitinierte Proteine erkennt. Die zylindrische Form des 20S Kernkomplexes wird durch vier Polypeptidringe gebildet.
Die beiden äußeren Ringe bestehen aus je sieben Polypeptiden, sie sind sich
strukturell sehr ähnlich und werden auch als α-Untereinheiten bezeichnet. Sie verschließen mit ihren N-Termini das 20S Proteasom solange kein weiterer Faktor, wie zum Beispiel der 19S Komplex gebunden wird. Die beiden inneren Ringe bilden aus je sieben β-Untereinheiten eine zentrale Kammer. Es handelt sich hierbei um den enzymatisch aktiven Teil des Proteasoms. Jede Untereinheit hat eine Masse von 21-31kDa (ADAMS, 2004). Das Proteasom besitzt drei verschiedene, katalytische Aktivitäten: eine Chymotrypsin-ähnliche, eine Trypsin-ähnliche und eine Peptidylglutamylpeptid-spaltende Aktivität. Es konnte gezeigt werden, dass drei verschiedene β-Untereinheiten für die drei verschiedenen Aktivitäten des Enzymkomplexes verantwortlich sind. Von den sieben β-Untereinheiten, spielen vor allem die β5, β2 und die β1 Untereinheiten eine entscheidende Rolle. Die katalytisch wirksame Aminosäure dieser drei β-Untereinheiten ist ein aminoterminales Threonin, dieses kann prinzipiell Peptidbindungen nach jeder Aminosäure spalten. Aufgrund der unterschiedlichen Strukturumgebung der aktiven Untereinheiten werden jedoch Schnitte nach bestimmten Aminosäuren bevorzugt (GROLL und HUBER, 2003). Die β1-Untereinheiten schneidet bevorzugt nach sauren Aminosäuren wie z.B. Aspartat oder Glutamat (Peptidylglutamylpeptid-spaltende Aktivität), β2 nach basischen Aminosäuren wie z.B. Arginin oder Lysin (Trypsin-ähnliche Aktivität) und β5 nach hydrophoben Aminosäuren wie z.B. Tyrosin oder Phenylalanin (Chymotrypsin- ähnliche Aktivität) (ORLOWSKI, 1990; HEINEMEYER et al., 1994). Die genaue Funktion der anderen vier β-Untereinheiten ist noch nicht geklärt.
Durch Induktion mit dem Zytokin Interferon-γ wird das Proteasom gegen das Immunoproteasom ausgetauscht, dieses trägt die nicht essentiellen, katalytischen Immunountereinheiten β1i, β2i und β5i (FRENTZEL et al., 1994). Durch Anwesenheit des Immunoproteasoms werden die Peptidfragmente effizienter an der Zelloberfläche von MHC Klasse Ι Rezeptoren präsentiert.
Um die große Spezifität beim Proteinabbau zu gewähren wird ein regelnder Komplex benötigt. Dieser ist im Falle des Proteasoms der 19S Regulator Komplex, der in der Lage ist an beide Enden des 20S Kernkomplexes zu binden. Der 700kDa große Komplex besteht aus je ca. 20 Untereinheiten. Der 19S Regulator Komplex setzt sich
zusammen aus dem 19S Base Subkomplex und dem 19S Lid Subkomplex (SAEKI et al., 2000). Die Lid-Region erkennt Ubiquitin markierte Proteine, während die Base- Region sechs ATPasen enthält, sie reguliert den Umbau der Proteinsubstrate und lenkt diese in den 20S Kernkomplex.
2.2.2 Ubiquitinierung der Proteine
Für den Proteinabbau wird das Polypeptid Ubiquitin kovalent an die Lysinreste des zellulären Proteins gebunden. Für diese Markierung des Proteins sind drei verschiedene Enzyme nötig. Im ersten Schritt, bindet sich das Ubiquitin-aktivierende Enzym (E1; UBA= ubiquitin activating enzyme) in Gegenwart von ATP an Ubiquitin.
Im nächsten Schritt wird das nun aktivierte Ubiquitin auf das Ubiquitin konjugierende Enzym (E2; UBC= ubiquitin conjugating enzyme) übertragen, dieses transferiert den aktivierten Ubiquitinrest unter Anwesenheit einer, das Substrat bindenden Ubiquitin- Ligase (E3) auf das abzubauende Protein (HERESHKO und CIECHANOVER, 1998).
Die Ubiquitin-Ligasen nehmen in diesem System eine Schlüsselposition ein, da sie die zu degradierenden Proteine erkennen und damit den Abbau einleiten.
Als Ubiquitinierungssignale dienen den Ubiquitin-Ligasen einzelne N-terminale Aminosäuren, kurze Sequenzen in Cyklinen oder stark hydrophobe Bereiche (GILON et al., 1998)
2.3 Proteasominhibition als neues Therapiekonzept
Die Hemmung des Proteasoms unterbricht die Proteolyse und eine Vielzahl von Signalkaskaden innerhalb der Zelle, dies führt zu einem Stillstand im Zellzyklus und schließlich zum programmierten Zelltod (Apoptose).
Es konnte gezeigt werden, dass maligne Zellen sensibler als normale Zellen auf die Proteasomhemmung reagieren. Zum Beispiel reagierten ras/c-myc-transformierte Fibroblasten oder c-myc-transformierte Lymphoblasten bis zu 40-mal sensibler auf die Proteasominhibition als normale Fibroblasten und Lymphoblasten (ORLOWSKI et
al., 1998). Auch konnten HIDESHIMA et al., (2001) zeigen, dass maligne Plasmazellen von Plasmozytom Patienten 20-40fach sensitiver auf durch den Proteasomhemmer Bortezomib induzierte Apoptose reagierten als mononukleäre Zellen aus dem peripheren Blut.
Die unterschiedliche Sensitivität von Tumorzellen und normalen Zellen auf Proteasominhibition kann durch verschiedene Mechanismen erklärt werden.
Tumorzellen proliferieren schneller, dadurch kommt es vermehrt zur Akkumulation fehlerhafter Proteine, die dann proteasomabhängig abgebaut werden (ADAMS, 2004). Zudem kann die Hemmung der Proteasomaktivität zur Umkehrung von Effekten nach Mutationen führen, welche sonst die Zellzyklus- oder Apoptose- Kontrolle negativ beeinträchtigen und zur malignen Entartung führen.
Des Weiteren führt der Einsatz vieler Chemotherapeutika zur Bildung des Transkriptionsfaktors NF-κB und induzieren dadurch ein Antiapoptose-Programm.
Die Proteasominhibition inaktiviert NF-κB und kann somit die Entwicklung einer Chemo- und Radioresistenz der Tumorzellen unterdrücken.
Einige Untersuchungen deuten darauf hin, dass Funktionen des Ubiquitin- Proteasom-Systems bei einer malignen Veränderung gestört werden. Es konnte gezeigt werden, dass CLL-Zellen eine dreifach höhere Proteasomaktivität besitzen als normale Lymphozyten (MASDEHORS et al., 2000). Der verstärkte Abbau des Zellzyklusinhibitors p27 durch das Proteasom geht einher mit einer schlechteren Prognose bei Patienten mit Kolonkarzinomen (LODA et al., 1997).
Das Ubiquitin-Proteasom-System spielt scheinbar eine Rolle bei der Entstehung von Tumorerkrankungen und stellt somit ein Ziel für die Tumortherapie dar.
Der natürliche Inhibitor Lactacystin und die synthetischen Peptidaldehyde waren die ersten Wirkstoffe, die als Proteasomhemmer entdeckt wurden. Zurzeit werden nur zwei Substanzen klinisch geprüft und eingesetzt, Bortezomib (PS-341) wegen seiner antineoplastischen Wirkung und PS-519 wegen seiner antiinflammatorischen Wirkung.
2.3.1 Bortezomib
Bortezomib ist ein Borsäure-haltiges Dipeptid (Dipeptidylborsäure). Das Borsäuremolekül ist für die hochselektive Bindung von Bortezomib an das 26S- Proteasom verantwortlich. Dabei ist die Proteasomhemmung dosisabhängig und reversibel, eine bis zu achtzigprozentige Hemmung wurde in Studien gut vertragen, höhere Dosen sind toxisch. Die maximal tolerierte Dosis (MTD) liegt bei 1 mg/kg. Es wurde gezeigt, dass Bortezomib das Proteasom jedoch auch in der sehr niedrigen Konzentration von 7nM hemmt. Bortezomib verteilt sich sehr gleichmäßig im gesamten Organismus, nur das zentrale Nervensystem, die Hoden und die Augen werden nicht erreicht. Die Halbwertszeit von Bortezomib beträgt mehr als 40 Stunden, maximal wird das Proteasom innerhalb der ersten Stunde nach der Applikation gehemmt, bis sich seine Funktion nach 72 bis 96 Stunden wieder erholt.
Bortezomib wird sowohl renal, als auch biliär ausgeschieden (TEICHER et al.,1999;
ADAMS, 2001).
Im toxikologischen Tierversuch wurde gezeigt, dass in erster Linie gastrointestinale Nebenwirkungen zu erwarten sind. Auch beim Menschen sind die Nebenwirkungen im Regelfall mild und durch supportive Maßnahmen zu beherrschen.
Bortezomib hat verschiedene Einflüsse auf regulatorische Proteine, die den Zellzyklus beeinflussen. Durch die Hemmung des Proteasoms kommt es zur Anhäufung des Proteins IκB, einem NF-κB Inhibitor. Die Hemmung von NF-κB führt zur Proliferationshemmung, es steigert dadurch die Apoptoserate und vermindert die Expression angiogener Zytokine und Adhäsionsmoleküle (HIDESHIMA et al., 2002).
Die Apoptose wird zudem durch weitere Mechanismen induziert, so führen die Aktivierung der Caspase-9, der c-jun-terminal-Kinase (JNK) und der Fas-caspase-8 zum programmierten Zelltod (HIDESHIMA et al., 2001).
Bei p21, p27, p15, p16, p18 und p19 handelt es sich um Cyclin-abhängige Kinase- Inhibitoren, welche zum Arrest des Zellzyklus in der G1-S-Phase führen, was schließlich die Apoptose der Zelle bedingt.
Der kurzlebige Tumor-Suppressor p53 liegt in normalen Zellen geringen Mengen vor.
Nach Schädigung der DNS oder deren onkogener Aktivierung kommt es zur
Anreicherung von p53, wodurch der Zellzyklus gestoppt wird, sofern die Schäden nicht repariert werden können, wird die Apoptose eingeleitet.
Es konnte außerdem gezeigt werden, dass Bortezomib bei Myelomzellen die, durch Interleukin-6 (IL-6) induzierte, Zellproliferation hemmt (LE BLANC et al., 2002).
Viele Tumoren entwickeln Resistenzmechanismen gegen die Chemo- und Radiotherapie, insbesondere indem sie die Bildung des Wachstums- und Antiapoptosefaktor NF-κB induzieren. Bortezomib hemmt NF-κB und erhöht somit die Sensitivität der Tumorzellen für Chemothrepeutika und wirkt der Entwicklung von Chemoresistenzen entgegen (ADAMS, 2004).
2.3.2 Bortezomib beim Multiplen Myelom
Bei dem Multiplen Myelom (MM, Plasmozytom) handelt es sich um eine maligne Veränderung, mit klonaler Vermehrung der terminal differenzierten B-Lymphozyten (Plasmazellen). Es gehört zu der Gruppe der Non-Hodgkin Lymphome (NHL) und zur Untergruppe der niedermalignen B-Zell-Lymphome.
Die Inzidenz beträgt 4/100000 Einwohner/Jahr bei einem mittlern Erkrankungsalter von 68 Jahren und einem Geschlechtsverhältnis von 3:2 Männern zu Frauen. Beim MM kommt es zur charakteristischen Bildung eines monoklonalen Immunglobulins.
Als weitere Symptome des Multiplen Myeloms können neben der Osteolyse, Immundefizienz, Anämie, Nierenfunktionsstörungen und Hyperkalzämie auftreten.
Ohne Therapie beträgt die mittlere Lebenserwartung 12 Monate, mit konservativer Chemotherapie konnte die mittlere Lebenszeit auf drei Jahre verlängert werden.
Langanhaltende Remissionen sind möglich, eine Heilung erfolgt jedoch nur in Einzelfällen.
Bortezomib stellt als erster Proteasominhibitor ein neues Behandlungskonzept dar.
Da das Proteasom eine große physiologische Bedeutung für gesunde Zellen hat, erschien die Proteasominhibition als Therapiekonzept zunächst bedenklich.
Bei In-vitro-Versuchen mit Leukämiezellen konnte gezeigt werden, dass der natürlich gewonnene Proteasominhibitor Lactacystin Apoptose induziert (IMAJOH-OHMI et al., 1995).
Andere Studien belegten die erhöhte Sensitivität von Tumorzellen gegenüber der proapoptotischen Effekte von Proteasominhibitoren (ORLOWSKI et al., 1998). In verschiedenen Mausmodellen konnten ähnliche Effekte bezüglich der gesteigerten Apoptoserate und dem damit verbundenen verzögertem Tumorwachstum gezeigt werden. Hoffnungsvoll stimmte dabei auch, dass es bei den Versuchstieren zu keinen sichtbaren Nebenwirkungen kam (ORLOWSKI et al., 1998).
Aufgrund dieser Ergebnisse wurden selektivere Proteasominhibitoren entwickelt, wobei sich Bortezomib als effektivste erwies. Es konnte gezeigt werden, dass Bortezomib große Aktivität in Multiplen Myelom (MM) Zelllinien zeigte und sich auch in primären Patienten Proben als effektiv erwies (HIDESHIMA et al., 2001). In einer Phase-Ι-Studie sprachen alle MM-Patienten auf Bortezomib an, einschließlich einer kompletten Remission (CR) (ORLOWSKI et al., 2002). In der SUMMIT-Studie (Phase ΙΙ) wurde Bortezomib bei therapierefraktärem MM eingesetzt. Neben einer Besserung der Zytopenie, der Nierenfunktion und der Lebensqualität wurde bei 27%
der Patienten nach maximal 8 Zyklen (1,3mg/m² an Tag (d) 1,4,8,11; Wiederholung d22) eine partielle Remission (PR) erreicht. 4% zeigten eine komplette Remission.
Die Remissionsdauer betrug 12 Monate, die Mediane Überlebenszeit 16 Monate (RICHARDSON et al., 2003). Die Ergebnisse der Studie führten 2003 zur Zulassung der Substanz beim fortgeschrittenen MM.
In der nachfolgenden CREST-Studie wurden bei therapierefraktären MM-Patienten ähnliche Remissionsraten erreicht, wobei in dieser Studie, wie auch in der SUMMIT- Studie der Therapieerfolg in Kombination mit Dexamethason weiter gesteigert werden konnte. In der CREST-Studie wurden zwei verschiedene Behandlungsdosen miteinander verglichen wobei festgestellt wurde, dass eine Dosis von 1mg/m² bei 30% der Patienten zu einer Remission (PR und CR) führte, gegenüber 38% (PR und CR) bei einer Dosis von 1,3mg/m² (JAGANNATH et al., 2004).
In der sich anschließenden APEX Phase-ΙΙΙ-Studie wurden 669 refraktäre oder rezidivierte Patienten in einem Bortezomib versus hoch dosiertem Dexamethason randomisiert. Das krankheitsfreie Überleben zeigte sich unter dem Einsatz von Bortezomib mit 6,2 Monaten gegenüber dem Standardtherapeutikum Dexamethason mit 3,5 Monaten signifikant verlängert (RICHARDSON et al.,2005).
2.3.3. Bortezomib bei soliden Tumoren
Bortezomib wurde an einer Vielzahl verschiedener, aus soliden Tumoren gewonnener Zelllinien getestet, wobei die Wachstumsinhibition und die Induktion der Apoptose auch hier beobachtet werden konnte.
In-vivo konnte mittels verschiedener Xenograft-Modelle, die Aktivität von Bortezomib in diversen soliden Tumoren nachgewiesen werden. Durch intravenöse Gabe von 1mg/kg Bortezomib, der maximal tolerierten Dosis (MDT), wurde bei Nacktmäusen das Wachstum von Prostata Tumoren um 50-80% reduziert. Es konnte gezeigt werden, dass sich bei soliden Tumoren vor allem die Kombinationstherapie von Bortezomib und anderen Chemotherapeutika positiv auf den Krankheitsverlauf auswirken kann (WILLIAMS et al., 2003). Bei einem Pankreaskarzinom-Xenograft- Modell mit BxPC3 Zellen die subkutan injiziert wurden konnte gezeigt werden, dass die Kombination von Bortezomib und Irinotecan einem Topoisomerase-Ι-Inhibitor sich sehr effektiv auf die Induktion der Apoptose, die Hemmung der Zellproliferation und die Blockierung der NFκB Aktivierung auswirkt. Irinotecan allein reduzierte das Tumorwachstum um 43% während die Kombinationstherapie mit Bortezomib eine Tumorregression um 89% bewirkte. Der Resistenzentwicklung gegen Irinotecan konnte mit Bortezomib entgegengewirkt werden (SHAH et al., 2001). Gleichermaßen konnte die Kombination von Bortezomib und Gemcitabine die Hemmung des Tumorwachstums in einem Mia-PaCa-2 Pankreaskarzinom-Xenograft-Modell signifikant verbessern (BOLD et al., 2001).
Auch in verschiedenen Phase Ι und ΙΙ Studien wurde Bortezomib bei soliden Tumoren mit unterschiedlicher Effektivität getestet. In einer Phase-Ι-Studie bei 15 Patientinnen mit rezidiviertem oder progredientem Ovarialkarzinom zeigte die Kombination von Carboplatin und Bortezomib bemerkenswerte Ergebnisse mit einem Gesamtansprechen von 47%, zwei CR und fünf PR, davon eine CR bei einer Patientin mit platin-resistenter Erkrankung (AGHAJANIAN et al., 2005). In einer Phase-ΙΙ-Studie der North Central Cancer Treatment Group (NCCTG) wurden bei Patienten mit metastasiertem Pankreaskarzinom die Effektivität von Bortezomib Monotherapie vs. Bortzomib in Kombination mit Gemcitabine verglichen, wobei die
mediane Überlebenszeit von den Patienten die eine Bortezomib Monotherapie erhielten bei nur 2,4 Monaten lag, während sie 4,8 Monate betrug, wenn Gemcitabine zusätzlich verabreicht wurde (ALBERTS et al., 2005). Die Studie wurde wegen Nichtwirksamkeit vorzeitig gestoppt.
2.4 Tumorangiogenese
Die physiologische, embryonale Gefäßneubildung kann über zwei verschiedene Wege erfolge. Bei der Vaskulogenese entstehen Endothelzellen aus nicht differenzierten Zellen, den Hämangioblasten, die sich Schrittweise zu Endothelzellen ausdifferenzieren. Die Angiogenese hingegen stellt eine Neubildung von Gefäßkapillaren aus bereits existierenden Blutgefäßen dar. Die Gefäßwandbildenden Endothelzellen gehören zu den sich am schnellsten teilenden Zellen des Körpers.
Sie stehen unter enger Kontrolle endogener Angiogenesestimulatoren (wie z.B.
Fibroblast growth factor (FGF); Vascular endothelial growth factor (VEGF);
Angiopoetin; Interleukin-8 und Tumor necrosis factor α (TNF-α)) und endogener Angiogeneseinhibitoren (wie z.B. Endostatin; Angiostatin und Interferone α, β, γ).
Unter physiologischen Bedingungen befinden sich diese Faktoren im Gleichgewicht (angiogene Balance). Dieses Gleichgewichts gewährleistet einen zum Erhalt der funktionellen Gefäßwand notwendigen Zellumsatz, jedoch findet kein quantitativer Zuwachs an Endothelzellen statt (DENEKAMP, 1993). Demzufolge findet unter physiologischen Bedingungen in den meisten Geweben keine Angiogenese statt.
Eine Ausnahme bildet das Endometrium, das monatlich neu aufgebaut und abgestoßen wird oder kurzzeitige, kontrollierte Prozesse wie z.B. die Wundheilung.
Im Rahmen von Tumorerkrankungen findet eine pathologische Gefäßneubildung zumeist in Form von Angiogenese statt. Wobei deren Ausmaß in der Regel mit Wachstum, lokaler Ausdehnung und Metastasierung der Tumoren korreliert (FOLKMAN, 1992).
Die Entartung normaler Körperzellen in maligne Tumorzellen ist nicht angioneseabhängig (HANAHAN und FOLKMAN, 1996). Nach der Initiation des
malignen Zellklons wächst dieser zunächst angiogeneseunabhängig (avaskuläre Phase). Der Tumor befindet sich zu diesem Zeitpunkt der Progression noch im angiogenen Gleichgewicht und die Versorgung der Tumorzellen wird durch Diffusion aufrechterhalten. Wächst der Tumor über mikroskopische Dimensionen hinaus ist eine Versorgung durch Diffusion nicht mehr möglich (DENEKAMP, 1993). Eine weitere Größenzunahme des Tumors ist nur möglich, wenn er in der Lage ist die Angiogenese zu induzieren, dieser Zeitpunkt wird als „angiogener Switch“
bezeichnet. Diese Verschiebung des „angiogenen Gleichgewichts“ kann auf zwei verschiedene Arten erreicht werden: entweder durch gesteigerte Sekretion von Angiogenesestimulatoren oder durch die Hemmung der Freisetzung von Angiogeneseinhibitoren (HANAHAN und FOLKMAN, 1996). Im Rahmen der angiogenen Kaskade kommt es zunächst zur Auflösung der extrazellulären Matrix und der vaskulären Basalmembran durch Proteasen. Durch die eröffnete Basalmembran wandern Endothelzellen aus ihrem Verbund in Richtung des angiogenen Stimulus. Die proliferierenden Endothelzellen bilden Gefäßähnliche Strukturen.
Die Angiogenese ermöglicht die Sauerstoff- und Nährstoffversorgung bis ins Tumorzentrum. Zudem produzieren die Endothelzellen eine Vielzahl von Wachstumsfaktoren und haben so einen parakrinen, stimulierenden Effekt auf die Tumorzellproliferation (RAK et al., 1995). Die lokale Stimulation von Gefäßwachstum bedingt im Tumor eine erhöhte Dichte von Blutgefäßen im Vergleich zu dem Normalgewebe. Die Ausprägung der Gefäßdichte konnte bei verschiedenen Tumoren mit der Prognose der Erkrankung korreliert werden (WEIDNER et al., 1991;
LISSBRANT et al., 1997). Auch erhöhte Werte für Angiogenesestimulatoren wie FGF und VEGF zeigten bei vielen Tumoren eine Korrelation mit einer schlechteren Prognose der Erkrankung (FOLKMAN et al., 1971).
2.5 Ziele der vorliegenden Arbeit
Sowohl beim Menschen, als auch beim Tier sind die Erfolge der therapeutischen Vorgehensweise (OP, Chemotherapie) beim Pankreaskarzinom wenig zufriedenstellend.
In der Studie sollte die Wirkung von Bortezomib auf Pankreaskarzinomzellen In-vitro und in Tierversuchen untersucht werden.
Mittels der Proteasomaktivitätsbestimmung sollte der Effekt der Proteasomhemmung sowohl qualitativ, als auch quantitativ dargestellt werden.
Außerdem sollte das für das Pankreaskarzinom optimale Behandlungsschema einer Kombinationstherapie bestehend aus Bortezomib und Gemcitabine ausgetestet werden. Im Rahmen der In-vitro-Versuche stand hierbei die Untersuchung der Apoptose und Nekroseinduktion und der Effekt auf die Zellproliferation als Ziel fest.
In den In-vivo-Versuchen sollte das Tumorwachstum im subkutanen und orthotopen Tumormodell nach verschiedenen Kombinationen von Bortezomib und Gemcitabine verglichen werden.
Im Laufe der Dissertation stellte sich zunehmend die Frage, weshalb insbesondere die Bortezomib Monotherapie In-vivo keine bzw. negative Effekte auf das Tumorwachstum beim Pankreaskarzinom hatte. Die Untersuchung der Wirkung von Bortezomib auf die Angiogenese im Tumor wurde zu einem neuen Ziel der vorliegenden Dissertation formuliert.
3 Versuchsgut und Methoden
3.1 Versuchsgut
Es wurden Einwegmaterialien der Firma Falcon® (Becton Dickinson, Heidelberg, D) verwendet.
3.1.1 Chemikalien und Reagenzien
Es wurden Chemikalien der Firma Sigma-Aldrich (Steinheim, D) verwendet.
3.1.1.1 Arzneimittel
Bortezomib, PS-341 (Velcade®)
Janssen-Cilag International NV (Beerse, B)
Gemcitabine (Gemzar®)
Lilly (Fegersheim, F)
Interferon alfa-2b (IntronA®)
SP Europe (Brüssel, B)
Esketaminhydrochlorid 25mg/ml (Ketanest S.)
Pfizer (Karlsruhe,D)
Xylazinhydrochlorid 2%
(Rompun)
Bayer (Leverkusen, D)
Buprenorphin (Temgesic) Essex-Tierarznei (München, D)
3.1.1.2 Fluoreszenzgelabelte Peptidsubstrate
Chymotrypsin Aktivität Z-Suc-Leu-Leu-Val-Tyr- MCA
Bachem
(Weil am Rhein, D) Caspase Aktivität Z-Leu-Leu-Glu-ßna Bachem
(Weil am Rhein, D)
3.1.2 Antikörper
Proteasomenisolierung Proteasom 20S α +β antibody (ab226773) Kanninchen anti-Maus und anti-Human, polyclonal
Abcam (Cambridge, GB)
Immunhistologie • CD4 (Klon L3T4) Ratte anti-Maus
• CD 8 (Klon LY-2) Ratte anti-Maus
• anti-CD31
PharMingen (San Diego, USA)
3.1.3 Zelllinien
Capan-2
(humane Pankreaskarzinomzelllinie, aus Metastase)
DSMZ (Braunschweig, D)
ASPC-1
(humane Pankreaskarzinomzelllinie, aus Aszites)
ATCC (Manassas, USA)
Panc-1
(humane Pankreaskarzinomzelllinie aus Primärtumor)
ATCC (Manassas, USA)
Panc O2
(murine Pankreaskarzinomzelllinie, aus Primärtumor)
DSMZ (Braunschweig, D)
3.1.4 Lösungen und Puffer
3.1.4.1 Proteasomaktivitätsbestimmung
Lyse Puffer 50mM Tris/HCl, pH8,0; 150mM NaCl;
1mM EDTA; 0,5% NP-40;
0,75mM Aprotinin; 10mM Leupeptin;
2,8mM Pepstatin;
0,85mM Phenylmethylsulfonyl Fluorid NET-TON Puffer 650mM Tris/HCl, pH8,0; 650mM NaCl;
5mM EDTA; 0,5% TritonX-100;
0,05% NaN3
NET-T Puffer 150mM Tris/HCl, pH8,0; 650mM NaCl;
5mM EDTA; 0,5% TritonX-100;
0,05% NaN3
Digestitions Puffer 50mM Tris/HCl, pH7,5; 25mM KCl;
10mM NaCl; 0,1mM EDTA
3.1.4.2 SDS-PAGE Gelelektrophorese
SDS-Elektrophorese Laufpuffer 25mM Tris/Base, pH8,3;
0,1% SDS; 192mM Glycin
Sammelgelpuffer 0,5M Tris/HCl, pH6,8
Trenngelpuffer 1,5M Tris/HCl, pH8,8
Sammelgel 5% Pro Gel: 1,25ml Aqua dest.;
250µl Acrylamid;
0,5ml Sammelgelpuffer;
18µl SDS; 2,5µl TEMED;
7,5µl APS
Trenngel 12% Pro Gel: 1,8ml Aqua dest.;
1,2µl Acrylamid; 1ml Trenngelpuffer;
45µl SDS; 5µl TEMED;
15µl APS
3.1.4.3 Silberfärbung
Fixationslösung 1 50% Methanol; 12% Eisessig Fixationslösung 2 10% Ethanol; 5% Eisessig
Fixationslösung 3 10% Ethanol
Imprägnierungslösung 500ml Aqua dest.;
250µl Formaldehyd (37%);
210µl Natriumthiosulfat (43%)
Färbelösung 500ml Silbernitrat (0,2%);
250µl Formaldehyd (37%) Entwicklungslösung 250ml Aqua dest.;
250ml Natriumcarbonat;
250µl Formaldehyd (37%) 3µl Natriumthiosulfat (43%)
3.1.5 Kulturmedium
RPMI 1640 Fetales Kälberserum 10%
(30min bei 56°C hitzeinaktiviert) Penicillin 105U/L;
105µg/L Streptomycin in RPMI 1640 mit Glutamin
PAA (Pasching, A)
3.1.6 Geräte
Durchflusszytometer, Epics XL Beckman Coulter (Krefeld, D) Mikroskop, Leica DMRB Leica GmbH (Wetzlar, D) Kamera, CF 20/4DX Kappa GmbH (Gleichen, D) µMACS-Seperator und µ-MACS-Säulen Miltenyi Biotec GmbH (Bergisch
Gladbach, Deutschland) Photometer, Victor 1420 Multilabel
Counter
Wallac Oy (Turku, Finnland)
3.1.7 Versuchstiere
C57Bl6 Mäuse, männlich Charles River (Sulzbach, D) CB/Scid/CrL Mäuse, weiblich,
immundefizient
Charles River (Sulzbach, D)
3.2 Methoden
3.2.1 In-vitro-Experimente
3.2.1.1 Kultivierung der verschiedenen Zelllinien
Die humanen Pankreaskarzinomzelllinien Panc-1, Capan-1 und ASPC-1, sowie die murine Pankreaskarzinomzelllinie Panc 02 wurden in RPMI 1640 mit 10% FCS bei 37°C in wassergesättigter Atmosphäre (95% Luftfeuchte) mit 5% CO2 kultiviert.
Das Wechseln des Mediums erfolgte nach Erreichen eines konfluenten Bewuchses.
Hierzu wurden die adhärenten Zellen mittels dreiminütiger Inkubation in Trypsin- EDTA gelöst und bei 400rpm, sieben Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Das Pellet wurde in frischem Medium resuspendiert und im Verhältnis 1:2 gesplittet. Bei den mit Bortezomib und Gemcitabine behandelten Zellkulturen konnte in der zweiten Behandlungswoche, aufgrund der geringen Zellzahl auf das Splitten der Zellen verzichtet werden, hier wurde ausschließlich das Medium gewechselt.
Das Einfrieren und Auftauen der Zellen erfolgte im Einfriermedium (40% RPMI 1640, 40% FCS, 20% DMSO) gemäß der allgemein üblichen Methode.
Zur Zellzahlbestimmung wurden 20µl Zellsuspension mit 180µl Trypanblau 0,5%
(Biochrom, Berlin, D) versetzt und so gefärbt. Die Zellen wurden schließlich in einer Neubauerzählkammer lichtmikroskopisch in vier Quadranten ausgezählt. Um daraus die Zellzahl pro Milliliter Zellsuspension zu berechnen, wurde der Mittelwert der ausgezählten Quadranten mit dem Verdünnungsfaktor und 104 multipliziert.
3.2.1.2 Behandlung der Zellkulturen
In der In-vitro-Zellkultur wurden die Zellen über zwei Zyklen entweder mit 20nM Bortezomib an den Tagen 1 und 3 oder mit 20µM Gemcitabine am Tag 1 behandelt.
Ebenso wurden verschiedenen Kombinationen von Bortezomib und Gemcitabine
getestet. Die Zyklen dauerten jeweils eine Woche. Zur Durchführung der Analysen wurden die Zellen einen Tag nach der letzten Behandlung geerntet.
3.2.2 In-vivo-Experimente
Die männlichen C57BL/6 Mäuse oder wo angebracht, die weiblichen CB/Scid/CrL Mäuse wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Tierschutzkommission gehalten und behandelt. Genehmigt und überwacht wurden die Tierversuche von den zuständigen lokalen Stellen (Aktenzeichen: 35-9185.81/G-125/04).
Die Tiere waren zum Beginn der Versuchsdurchführung acht Wochen alt und wogen zwischen 18 bis 24g, sie wurden unter standardisierten Umweltbedingungen im IBF der Universität Heidelberg eingestellt. Die maximale Gruppegröße pro Käfig betrug fünf Tiere. Die Fütterung erfolgte ad libitum mit einem pelletiertem Haltungsfutter, der freie Zugang zum Trinkwasser war stets gewährleistet.
3.2.2.1 Subkutane Tumorzellimplantation
Zur Durchführung des subkutanen Tumormodells wurden syngenetische Panc 02 Zellen auf dem Rücken der C57Bl/6 Mäuse, in einer Menge von 5×105 Zellen in 200µl physiologischer Kochsalzlösung s.c. injiziert. Um den Einfluss des Immunsystems auf die Wirksamkeit von Bortezomib zu überprüfen wurden immundefizienten weiblichen CB/Scid/CrL Mäusen gleichermaßen Panc O2 Zellen subkutan implantiert.
Die Tumorgröße wurde dreimal wöchentlich mit einer Schieblehre in drei Dimensionen vermessen. Die Berechnung erfolgte gemäß der Formel: Länge × Höhe
× Breite/6.
3.2.2.2 Orthotope Tumorzellimplantation in das Pankreas
Die Mäuse wurden durch intraperitoneale (i.p.) Injektionen von Xylazinhydrochlorid (8 mg/kg) und Esketaminhydrochlorid (40 mg/kg) anästhesiert. Sie wurden in
Rückenlage fixiert und das Abdomen nach substernaler und abdomineller Rasur durch einen Schnitt in der Linea alba eröffnet.
Das Duodenum mit dem ihm anhaftenden Pankreaskopf wurde vorgelagert und fünf Mikroliter der Panc O2 Zellen, in einer Konzentration von 1*106/ml 0,9% NaCl in das Pankreas injiziert. Hierzu wurde eine 25µl Injektionsspritze (Hamilton, Reno, USA) verwendet. Die Injektionsstelle wurde für 30 Sekunden durch klemmen mit einer Pinzette verschlossen und anschließend vorsichtig reponiert. Der Verschluss der Bauchdecke erfolgte in einer Schicht (Peritoneum, Muskel und Haut) mit synthetischem, resorbierbaren Nahtmaterial (Polysorb 6-0, Tyco Healthcare). Die Tiere wurden nach der Laparotomie mit Temgesic® (0,1mg/kg entspricht 8µL in 20µL Wasser für Injektionszwecke/25g Maus s.c.) über 48 h analgetisch behandelt.
3.2.2.3 Behandlung der Versuchstiere
Der erste Behandlungstag, an dem sowohl Gemcitabine als auch Bortezomib appliziert wurden, war der fünfte nach der Implantation der Tumorzellen. Bortezomib wurde in einer Menge von 325µg/kg gelöst in 200µl NaCl intraperitoneal injiziert, die intraperitoneale Applikationsmenge des in ebenfalls in 200µl NaCl gelösten Gemcitabins betrug 150µg/g. Bortezomib wurde zweimal wöchentlich, Gemcitabine nur einmal wöchentlich verabreicht. An allen Behandlungstagen wurde den Mäusen der Kontrollgruppe 200µl physiologische Kochsalzlösung i.p. appliziert. Am Tag 14 wurde der Zustand der Bauchhöhle laparoskopisch überprüft, die Tumorgröße mit einer Schieblehre vermessen und nach der Formel: Länge×Höhe×Breite/6 berechnet. Die Kontrolle wurde wöchentlich wiederholt. Die Tiere wurden nach jeder Laparotomie mit Temgesic® über 48 Stunden analgetisch behandelt. Sobald die Mäuse moribund wurden oder Zeichen wie struppiges Fell, Aszites oder Bewegungsunlust zeigten wurden sie schmerzfrei mittels CO2 getötet.
3.2.3 Analytik
3.2.3.1 Durchflusszytometrie und AnnexinV/PI
Bei der Durchflusszytometrie handelt es sich um ein Messverfahren bei dem einzelne markierte Zellen in einer Lösung befindlich, gescannt und so dargestellt werden.
Durch Färben mit fluoreszierenden Substanzen lassen sich dadurch biochemische, biophysikalische oder antigene Eigenschaften von Zellen quantifizieren. Für die Analyse wurde ein EPICS XL Durchflußzytometer (Beckman Coulter, Krefeld, D) verwendet.
AnnexinV bindet an das Membranphospholipid Phosphatidylserin, das früh während der Apoptose von der inneren auf die äußere Seite der Plasmamembran transloziert wird. Durch Kopplung des Fluoreszenzfarbstoffes FITC können die apoptotischen Zellen im FACScan gemessen werden. Die Propidiumiodid (PI) Färbung wird mit dieser Färbung kombiniert da auch nekrotische Zellen Phosphatidylserin exponieren. PI kann als Zeichen der Nekrose, durch den Verlust der Membranintegrität, in die Zellen eindringen. Auch dieses Signal wird vom Durchflußzytometer gemessen.
Um apoptotischen und nekrotischen Zellen zu markieren wurde das AnnexinV/PI Färbekit (BD Pharmingen, Heidelberg, D) in Übereinstimmung mit den Herstellerangaben eingesetzt. Die Zellen wurden unmittelbar nach Abschluss der Färbung analysiert. Ungefärbte Zellen wurden zur Kontrolle eingesetzt.
Die Zellen wurden geerntet, zentrifugiert und das Pellet in 1ml RPMI Medium resuspendiert. Die Zellkonzentration wurde mittels Zellzählung in der Neubauer Zählkammer bestimmt und die Konzentration aller Proben durch weitere Zugabe von RPMI Medium auf 1*106 Zellen eingestellt. Von den nun konzentrationsgleichen Zellsuspensionen wurde jeweils 1 ml mit der gleichen Menge eiskalten PBS durch Zentrifugation gewaschen, das Zellpellet anschließend in 100µl Binding buffer gelöst und jeweils 5µl AnnexinV-FITC und 5µl PI zugegeben. Nach anschließendem vortexen folgte eine Inkubationszeit von 15 Minuten bei Raumtemperatur (RT).
Danach wurde das Volumen im Röhrchen mit Binding Buffer ad 500µl erhöht und die Messung durchgeführt.
3.2.3.2 Bestimmung der Zellvitalität
Als Vitalitätstest verwendeten wir den MTT-Test. Hierbei handelte es sich um eine kolorimetrische Methode, die die Umsetzung eines gelben Tetrazoliumsalzes in einen orangefarbenen Formazan-Farbstoff durch mitochondriale Dehydrogenasen stoffwechselaktiver Zellen misst. Die quantitative Messung erfolgt im ELISA-Reader und ist direkt proportional zur Anzahl vitaler Zellen, die dann Rückschlüsse auf die Zellproliferationsrate der Zellen erlaubt. In unseren Versuchen wurde gemäß der Herstellerangaben vorgegangen. Nach der Ernte der Zellen wurden diese zentrifugiert und das Pellet in 1ml RPMI 1640 resuspendiert. Die Zellkonzentration wurde mittels Zellzählung in einer Neubauer Zählkammer bestimmt und die Konzentration aller Proben durch weitere Zugabe von RPMI Medium auf 2*104 Zellen/ml eingestellt. Pro Ansatz, wurden drei Wells einer 96-Well Flachbodenplatte mit 100µl Zellsuspension befüllt und im Anschluss jedes Well mit RPMI Medium ad 200µl aufgefüllt. Die Reaktion wurde schließlich durch Zugabe der Starterlösung ausgelöst. Nach fünfstündiger Inkubation folgte die indirekte Bestimmung der Zellvitalität mittels eines ELISA-Readers bei 450 und 630nm. Der Proliferationsindex konnte berechnet werden, nachdem die Proliferationsaktivität der unbehandelten Zellen gleich Null gesetzt wurde.
3.2.3.3 Proteasomaktivitätsbestimmung der CAPAN-2 Zellen
Nach dem Ernten der Zellen mit Hilfe von Trypsin EDTA und dem zweimaligen Waschen der Pellets mit PBS wurden die Zellen jedes Ansatzes 30 Minuten bei 4°C in Lysepuffer lysiert.
Nach vollständiger Lysis und deren lichtmikroskopischen Kontrolle folgte eine dreißigminütige hochtourige Zentrifugation bei 13,2rpm und 4°C, um Zelltrümmer zu entfernen. Der Proteingehalt der Lysate wurde mittels BCA ermittelt, die
Proteinkonzentrationen dann, durch Zugabe der entsprechenden Menge Lysepuffer, normalisiert. Die nun normalisierten Lysate wurden bis zur Proteasomaktivitätsbestimmung bei –80°C kryokonserviert.
Um das 20S Proteasom zu isolieren wurde dieses, nach dem auftauen auf Eis, zunächst mit Proteasom 20Sα+β Antikörpern markiert, dies erfolgte indem 5µl dieses Antikörpers zu je 1ml Lysat gegeben und für 30 Minuten bei 4°C inkubiert wurden. Es folgte die Inkubation von 50µl Protein A Microbeats (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, D) pro ml Lysat, für ebenfalls 30 Minuten bei 4°C.
Für jeden Ansatz wurden drei µMACS-Säulen im µMACS- Seperator (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, D) platziert und mit 200µl Lysepuffer äquillibriert. Jede µMACS-Säule wurde dann mit einer 100µg Protein enthaltenden Menge des antikörpermarkierten Zelllysats versehen und im Anschluss 2mal mit 1ml NET-TON Puffer und 3mal mit 1ml NET-T Puffer gewaschen. Nach dem Waschen folgte die Zugabe von 50µl des fluoreszezgelabelten Peptidsubstrates, dessen Stammlösung mit Digestitionspuffer auf 200µM verdünnt wurde. Die Säulen wurden nun aus dem Magnetfeld des µMACS-Seperators genommen, für 30 Minuten bei 37°C im Brutschrank inkubiert und anschließend erneut im µMACS-Seperator platziert um sie dann in dessen Magnetfeld mit 100µl Digestitionspuffer zu spülen. Die Spüllösung, die nun das isolierte 20S Proteasom enthielt wurde in einem Eppendorfgefäß aufgefangen und auf eine schwarze 96-Well Flachbodenplatte übertragen. Die Messung der Fluoreszenzaktivität erfolgte in einem Photometer bei einer Excitationswellenlänge von 360nm und einer Emissionswellenlänge von 465nm.
3.2.3.4 Proteasomaktivitätsbestimmung der aus den Tierversuchen gewonnenen Tumoren
Die Tumoren wurden den getöteten Mäusen entnommen und bis zur Lyse auf Eis gelagert. Ein 0,5g schweres Tumorstück wurde durch ein feinmaschigen Nylonsieb zerkleinert und in 3ml Tumorlysepuffer verflüssigt. Um gewünschte Zytolyse zu erreichen wurde die so gewonnene Zellsuspension mit einem 5ml Dounce Homogenisator bearbeitet und anschließend 30 Minuten auf Eis inkubiert. Der Erfolg
der Zytolyse wurde mikroskopisch überprüft. Durch zehnminütige Zentrifugation bei 4°C und 10000g konnten schließlich die Zelldebris entfernt werden. Der direkt im Anschluss durchgeführte BCA ermöglichte die Ermittlung des Proteingehaltes und somit das Normalisieren der Proben durch Zugabe von Tumorlysepuffer. Den nun konzentrationsgleichen Lysaten wurde jeweils 5µl/ml Proteasom 20Sα+β Antikörper zugegeben, die Inkubationszeit betrug 30 Minuten bei 4°C. Es folgte die Zugabe von 50µl/ml Protein-A-Microbeats (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, D), auch diese wurden 30 Minuten bei 4°C inkubiert.
Die Isolation des so markierten 20S Proteasoms erfolgte dann mit Hilfe von µMACS- Säulen im magnetischen Feld des µMACS-Seperators. Pro Tumorlysat bzw. pro Versuchstier wurden drei Säulen im Seperator platziert und zunächst mit 200µl Tumorlysepuffer äquillibriert. Jede Säule wurde nun mit 1ml des markierten Tumorlysats versehen und im Anschluss je zweimal mit 1ml NET-TON Puffer und dreimal mit 1ml NET-T Puffer gewaschen. Es folgte die Zugabe von 50µl des fluoreszenzgelabelten Peptidsubstrates in einer Konzentration von 200nM gelöst in Digestitionspuffer. Die so behandelten Säulen wurden dann aus dem Seperator entnommen und 30 Minuten bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Nach der Replatzierung der Säulen im Seperator erfolgte das Spülen dieser mit jeweils 100µl Digestitionspuffer. Die Spüllösung wurde im Eppendorfgefäß aufgefangen und im Anschluss auf eine schwarze 96-Well Flachbodenplatten übertragen.
Die Messung der Fluoreszenzaktivität erfolgte in einem Photometer bei einer Excitationswellenlänge von 360nm und einer Emissionswellenlänge von 465nm.
3.2.3.5 Qualitative Isolierung des 20S Proteasoms durch Gelelektrophorese
Von den Lysaten der In-vitro- bzw. der In-vivo-Versuchen zur Proteasomaktivitätsbestimmung wurden je Probe 100µl Capan-2 Zelllysat bzw.
Tumorlysat direkt nach der Lyse entnommen und mit jeweils 2µl Proteasom 20Sα +β Antikörper 30 Minuten bei 4°C inkubiert. Es folgte dann die Inkubation von 20µl Protein A Microbeats (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, D) pro 100µl Lysat ebenfalls für 30 Minuten bei 4°C.
Die µMACS-Säulen wurden im µMACS-Seperator platziert und mit 200µl Lysepuffer (im Falle der In-vitro-Zelllysate) bzw. mit 200µl Tumorlysepuffer (im Falle der In-vivo- Tumorlysate) äquilibriert. Je Probe wurde nun eine Säule mit 100µl Lysat versehen und im Anschluss dreimal mit je 200µl NET-TON Puffer und zweimal mit je 200µl NET-T Puffer gewaschen. Inzwischen wurde der Laemmli sample buffer (Sigma- Aldrich, Steinheim, D) auf 95°C erhitzt. Nach dem Waschvorgang konnte jede Säule mit 20µl des erhitzten Laemmli sample buffer bestückt und fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubiert werden. Das Spülen der Säulen erfolgte mit je 50µl des erhitzten Laemmli sample buffers im Magnetfeld. Das so gewonnene Isolat des 20S Proteasoms konnte in diesem Zustand bis zur Gelelektrophorese bei –80°C eingefroren werden.
Die SDS-PAGE Gele wurden standardmäßig gegossen. Sie wurden in die Elektrophoresebox eingebaut und diese mit Laufpuffer befüllt. 16µl der Proben wurden in die Geltaschen gefüllt und die Elektrophorese gestartet. Die eingestellte Spannung betrug 75V solange bis die Banden die Grenzlinie zwischen Sammel- und Trenngel erreichten, danach wurde sie auf 200V erhöht. Als Marker wurden 3µl eines Low Range Standards eingesetzt der verschiedene Proteine einer Größe zwischen 21,5kD und 113kD enthält.
Nach Abschluss der Elektrophorese wurden die Gele 24 Stunden in der Fixationslösung-1 fixiert. Das Sichtbarmachen der Banden erfolgte am nächsten Tag durch eine Silberfärbung der Gele. Zunächst mussten die Gele dazu mit zwei weiteren Lösungen fixiert werden, die Behandlung mit Fixationslösung-2 dauerte 30 Minuten, die mit Fixationslösung-3 zwei mal 15 Minuten. Im Anschluss folgte das Imprägnieren mit der Imprägnierungslösung, in dieser verblieben die Gele zwei Minuten, bevor sie drei mal 60 Sekunden mit Aqua dest. gewaschen wurden. Das Färben mit der Silbernitrat enthaltenden Färbelösung dauerte dann weitere zwölf Minuten, auch nach diesem Vorgang wurden die Gele zweimal 30 Sekunden mit Aqua dest. gewaschen. Das Entwickeln und somit die Sichtbarmachung der Banden mit der Entwicklungslösung dauerte ungefähr zwei Minuten und wurde schließlich durch Zugabe von Eisessig abgestoppt. Die Gele konnten nun eingescannt und mit dem PC bearbeitet werden.
3.2.3.6 Immunhistochemie
Mittels der Immunhistologie werden Proteine in Gewebeschnitten durch Antikörperbindung nachgewiesen. Durch die Kopplung des Antikörpers an ein spezifisches Enzym wird ein farbloses Substrat in situ in ein farbiges Produkt umgewandelt, diese Produkte sind unlöslich und präzipitieren an der Stelle, an der sie entstehen und können dann mikroskopisch analysiert werden.
Für die Untersuchungen wurden die Milzen und das Tumorgewebe der Versuchstiere sofort nach der Entnahme in vorgekühltes Isopentan überführt und in Stickstoff schockgefroren.
Für die Immunhistologische Analyse wurden 7µm dicke Gefrierschnitte mit einem Cryotom bei –20°C geschnitten, mit kaltem Aceton fixiert und bei –20°C bis zur Färbung gelagert. Die Schnitte wurden mit einem Anti-Ratte Ig HPR detection kit im indirekten, dreischrittigem Immunhistochemischen Verfahren gefärbt. Wobei der Primärantikörper in einer 1:50 Verdünnung 90 Minuten inkubiert wurde. Die weiteren Schritte wurden dem Protokoll des Herstellers übernommen.
Die quantitative Analyse wurde dann mittels einer Bildanalyse am Computer durchgeführt. Zu diesem Zweck wurden vier mikroskopische Areale (à 0,75 mm²) aus den aktivsten Bereichen mit dem Lichtmikroskop in hoher Auflösung (×250, Leica DMRB, Leica GmbH, Wetzlar, D) ausgewählt und mit einer Farbvideokamera (CF 20/4DX, Kappa GmbH, Gleichen, D) digitalisiert, um dann die histologischen Bilder mit einer speziellen Software auszuwerten und zu speichern.
3.2.3.7 VEGF Bestimmung
Das im Serum der Versuchstiere enthaltene VEGF wurde am 21. Tag nach der Tumorinokulation quantitativ bestimmt. Hierzu wurde das Quantikine Immunoassay Maus VEGF Kit (R&D Systems, Wiesbaden, Deutschland) verwendet. Es wurde hierbei in Übereinstimmung mit den Herstellerangaben vorgegangen. Pro Ansatz wurden Duplets ausgewertet.
3.2.3.8 Quantifizierung der m-RNA
Die zuvor schockgefrorenen Tumoren wurden homogenisiert und die komplette RNA mittels dem RNeasy® Mini Kit 50 (Qiagen) extrahiert, dabei wurde nach Herstellerangaben vorgegangen. Ein Aliquot der extrahierten RNA wurde zur Generierung der cDNA genutzt. Hierzu wurde ein Transcriptor 1st Strand cDNA Syntese Kit benutzt, dieses erzeugt die cDNA aus mRNA Fragmenten mittels Oligo- dT Startern, welche die Synthesereaktion beginnen. Genutzt wurde hierzu der LightCycler® FastStar DNA MasterPLUS SYBR Green I (Roche, Mannheim, Deutschland) für RT-PCR. Die real-time PCR wurde in LightCycler Kapilaren ausgeführt, dies geschah im LightCycler® FastStar DNA MasterPLUS SYBR Green I Kit (alle Geräte von Roche, Mannheim, Deutschland) und die spezifischen Primer für RGS-5 (MWG-Biotech AG) (F-5´-GCT TTG ACT TGG CCC AGA AA-3´; R 5´-CCT GAC CAG ATG ACT ACT TGA TTA GCT-3´). Die Schmelzkurven wurden dann wie in der LightCycler Angabe angezeigt gezeichnet. Für die Quantifizierung nutzten wir ein GAPDH housekeeping gene set (QuantiTect®Primer Assays, Qiagen) mit den gleichen PCR Einstellungen wie beschrieben.
3.2.3.9 Statistische Auswertung
Die Statistische Auswertung erfolgte mit dem Student’s T-test und dem Fisher’s exact-test von SPSS 11.5. p<0.05 wurde als statistisch signifikant definiert. Die Abbildungen wurden mit Hilfe von Microsoft Excel 2003 erstellt.
4 Ergebnisse
4.1 In-vitro-Analyse
Im Rahmen der In-vitro-Untersuchungen wurden drei verschiedene humane Zelllinien (Panc-1, Capan-2 und ASPC-1) und die murine Panc 02 Zelllinie mit Bortezomib und/oder Gemcitabine über zwei, jeweils einwöchige Zyklen behandelt und bezüglich der Proliferationsrate und der Apoptoseinduktion untersucht. Bei den Capan-2 Zellen wurden zudem nach den zwei Behandlungszyklen die Proteasomaktivität analysiert.
4.1.1 Apoptoseinduktion
Im Rahmen dieser Untersuchung wurde der durch Bortezomib und Gemcitabine induzierte Zelltod untersucht. Hierbei wurde zwischen der frühen und der späten Apoptose sowie der Nekrose unterschieden. Alle vier Zelllinien, die entsprechend dem Versuchsprotokoll behandelt wurden, zeigten sowohl mit Gemcitabine als auch mit Bortezomib nach zwei Behandlungszyklen eine deutliche Induktion der Apoptose.
Die höchsten Werte wurden hierbei in der Bortezomib-basierten Behandlungsgruppe gemessen.
4.1.1.1 Apoptose- und Nekroseinduktion bei humanen Zelllinien
Im Rahmen dieser Untersuchungen sollten Bortezomib und Gemcitabine in verschiedenen Kombinationen innerhalb von zwei Behandlungszyklen, in ihrer Wirkung auf den induzierten Zelltod bei drei verschiedenen humanen Pankreaskarzinomzelllinien verglichen werden. Bei der zunächst untersuchten humanen Primärtumorzelllinie Panc-1 induzierten sowohl das etablierte Gemcitabine als auch Bortezomib eine signifikant höhere Apoptose- und Nekroserate, als sie bei den unbehandelten Kontrolltieren gemessen werden konnte (40,8 ± 5,5% bei den
Kontrolltieren vs. 88,7 ± 1% bei den Gemcitabine-mono Tieren, p<0,05 und 99,6 ± 0,3% bei den Bortezomib-mono Tieren, p<0,01). Das Standardtherapeutikum Gemcitabine war dem Proteasominhibitor Bortezomib im direkten Vergleich signifikant unterlegen. Bei den meisten Kombinationsvarianten der beiden Medikamente zeigten sich ebenso signifikant bessere Werte als beim alleinigen Einsatz von Gemcitabine (88,7 ± 1% bei den Gemcitabine-mono Tieren v.s. 99,6 ± 0,3% bei den Bortezomib-mono Tieren, p<0,01; 94,8 ± 1,0% nach zwei Zyklen Gemcitabine und einem Zyklus Bortezomib, p<0,05; 99,8 ± 0,2% nach zwei Zyklen Bortezomib und einem Zyklus Gemcitabine, p<0,01 und 99,1 ± 0,4% nach zwei Zyklen Gemcitabine und zeitgleich zwei Zyklen Bortezomib, p<0,01; siehe Abbildung 1: Apoptoseinduktion bei Panc-1 Zellen, In-vitro).
0 20 40 60 80 100 120
Gemcitabine -mono 1 Zykl. Gem., 1 Zykl. Borte. 2 Zykl. Gem., 1 Zykl. Borte. Bortezomib -mono 2 Zykl. Borte., 1 Zykl. Gem. 2 Zykl. Gem., 2 Zykl. Borte. 1 Zykl. Borte., 1 Zykl. Gem.
[%]
frühe Apoptose späte Apoptose Nekrose
* * * *
Abbildung 1: Apoptoseinduktion bei Panc-1 Zellen, In-vitro
Prozentuale Änderung der Apoptose- bzw. Nekroserate bei der humanen Panc-1 Zelllinie, nach zweiwöchiger Behandlung mit Bortezomib und/oder Gemcitabine in Vergleich zu den Kontrolltieren. Die Messwerte der unbehandelten Tiere wurden als Kontrolle auf Null festgelegt. (∗ = statistisch signifikanter Unterschied zu Gemcitabine-mono; p<0,05)
