Aus der Abteilung für Thorax-, Herz- und Gefäßchirurgie der Medizinischen Hochschule Hannover
Einsatz von Nanopartikeln im Rahmen bildgebender Verfahren zur Darstellung transplantierter
Stammzellen im Myokard
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Friederike Wolf aus Hannover
Hannover 2009
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am: 07.04.2010
Gedruckt mit der Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover Präsident: Prof. Dr. med. Dieter Bitter-Suermann
Betreuer: PD Dr. med. Arjang Ruhparwar Referent: Prof. Dr. Kai Wollert
Korreferent: PD Dr. med. Joachim Lotz Tag der mündlichen Prüfung: 07.04.2010 Promotionsausschussmitglieder:
Prof. Dr. Hermann Haller Prof. Dr. Klaus Otto Prof. Dr. Rainer Nustede
1. Einleitung ... 4
1.1 Zelltherapie als mögliche Behandlungsstrategie der Herz-insuffizienz... 4
1.2 Stammzellen... 7
1.2.1 Embryonale Stammzellen... 8
1.2.2 Adulte Stammzellen... 9
1.2.3 Marker adulter Stammzellen... 10
1.3 Regeneration des Myokards durch Stammzellen... 11
1.4 Bildgebung (Bio-Imaging)... 14
1.4.1 in vitro-Visualisierung... 14
1.4.2 in vivo-Visualisierung... 17
1.5 Ziel... 26
2. Materialien... 27
Markierung der Zellen... 27
2.1 Nanopartikel / CliniMACS® CD 133 Reagenz... 27
2.1 Zellen, Tiere... 29
2.2 Zellkultur... 29
2.2.1 Medien für die Zellkultur... 29
2.2.2 Zusätze für die Zellkultur... 29
2.3 Chemikalien... 29
2.4 Verbrauchsmaterialien... 30
2.5 Geräte... 30
3. Methoden... 31
3.1 TEE-Studie... 31
3.1.1 Stammzellgewinnung und Präparation des Knochenmarks... 31
3.1.2 Selektion der CD 133+Zellen und Stammzellkennzeichnung mit CD 133+ und CD 34+ Antikörpern... 31
3.1.3 Zellanalyse... 33
3.1.4 Chirurgisches Vorgehen und Zellimplantation... 36
3.1.5 Transoesophageale Echokardiographie (TEE)... 36
3.1.6 Immunhistochemie... 37
3.2 MRT-Studie... 37
3.2.1 Stammzellgewinnung und Präparation des Knochenmarks... 37
3.2.2 Selektion der CD 133+Zellen und Stammzellkennzeichnung mit CD 133+
und CD 34+ Antikörpern und Zellanalyse... 38
3.2.3 Chirurgisches Vorgehen... 39
3.2.4 Magnetresonanztomographie (MRT)... 39
3.2.5 Immunhistochemie... 40
4. Ergebnisse ... 40
4.1 TEE-Studie... 41
4.1.1 in vitro-Kennzeichnung der CD 133+ Zellen... 41
4.1.2 Transoesophageale Echokardiographie (TEE)... 41
4.1.3 Histologie / Immunhistochemie... 45
4.2 MRT-Studie... 46
4.2.1 Histologie / Immunhistochemie... 47
5. Diskussion ... 48
5.1 Ausblick... 53
6. Zusammenfassung:... 54
7. Literatur ... 56
1. Einleitung
1.1 Zelltherapie als mögliche Behandlungsstrategie der Herz- insuffizienz
Jährlich sterben in Deutschland ca. 62 000 Menschen an den Folgen eines akuten Myokardinfarktes [1]. Weitere 48 000 erliegen einer Herzinsuffizienz. Mit 30 Prozent stellt die koronare Herzkrankheit in allen Industrieländern die häufigste Todesursache dar (Tabelle 1). Die Herzinsuffizienz ist die dominierende Erkrankung und die ischämische Kardiomyopathie ihre wichtigste Erscheinungsform. Unter dem Begriff Herzinsuffizienz versteht man eine Funktionsstörung des Herzens mit herabgesetztem Herz-Zeit-Volumen, die zu einer Minderperfusion der peripheren Organe führt.
Ursächlich findet man eine Störung der systolischen oder diastolischen myokardialen Funktion. Sie ist gekennzeichnet durch eine regional oder global verminderte Kontraktilität einer oder beider Herzkammern mit entsprechend herabgesetztem Schlagvolumen. Ursache regionaler Kontraktilitätsstörungen ist in aller Regel die koronare Herzkrankheit mit Verlust an kontraktilem Muskelgewebe infolge eines großen oder mehrerer kleiner Infarkte. Ursache globaler Kontraktilitätsstörungen können entzündliche Myokarderkrankungen wie Myokarditis und die idiopathische dilatative Kardiomyopathie sein.
Als sekundäres Phänomen findet sich die systolische myokardiale Funktionsstörung bei langdauernder Druck- und Volumenüberlastung der Ventrikel, so z.B. bei Aorten- oder Pulmonalstenose, bei chronisch erhöhtem Widerstand im großen und kleinen Kreislauf (arterielle oder pulmonale Hypertonie) oder bei schwerer Insuffizienz einer der Herzklappen. Chronische Druckbelastung führt zu einer deutlich konzentrischen Hypertrophie ohne Erweiterung der Herzkammer. Volumenbelastung bewirkt eine Zunahme des Ventrikelvolumens bei leichter bis mäßiggradiger Hypertrophie [2].
Sterbefälle
nach den 10 häufigsten Todesursachen insgesamt und nach Geschlecht
2004
Gestorbene insgesamt ICD-10
Pos.Nr. Todesursache
Anzahl
Anteil an insgesamt
in %
I25 Chronische ischämische Herzkrankheit 84 163 10,3
I21 Akuter Myokardinfarkt 61 736 7,5
I50 Herzinsuffizienz 48 184 5,9
C34 Bösartige Neubildung der Bronchien und der Lunge 39 798 4,9 l64 Schlaganfall, nicht als Blutung oder Infarkt bezeichnet 32 241 3,9
C18 Bösartige Neubildung des Dickdarmes 19 420 2,4
J44 Sonstige chronische obstruktive Lungenkrankheit 19 390 2,4
J18 Pneumonie, Erreger nicht näher bezeichnet 18 395 2,2
C50 Bösartige Neubildung der Brustdrüse (Mamma) 17 768 2,2
E14 Nicht näher bezeichneter Diabetes mellitus 15 952 1,9
Tabelle 1: Todesursachen 2004 des Statistischen Bundesamtes Deutschland
Ein wesentliches gemeinsames Merkmal aller kardialen Erkrankungen ist der Untergang von Herzmuskelzellen mit Verlust kontraktiler Substanz und damit verbundener Verschlechterung der Ventrikelfunktion. Das Gewebe ist nicht in der Lage, sich selbst zu regenerieren, da adulte Kardiomyozyten terminal ausdifferenzieren und ihre Fähigkeit zur Zellteilung verlieren [3]. Eine signifikante Regeneration durch teilungsfähige Vorläuferzellen findet nicht statt. Auf den Gewebeverlust wird mit einer Hypertrophie der Herzmuskelzellen reagiert, jedoch kommt es zu keiner adäquaten Zunahme der Kapillaren. Folge ist eine verschlechterte Versorgung der Kardiomyozyten. Durch Regulationsmechanismen humoraler und neuraler Art kommt es über einen Circulus vitiosus zu einer Defektheilung mit pathologischem Remodelling und Ersatz des Herzmuskelgewebes durch Narbengewebe, was häufig zu linksventrikulärer Dilatation und Herzinsuffizienz führt. Beim Remodelling handelt es sich um einen Prozess, bei dem mechanische,
neurohumorale und möglicherweise genetische Faktoren die Größe, Form und Funktion des linken Ventrikels verändern. Dies geschieht unter unterschiedlichen klinischen Bedingungen, u.a. beim Myokardinfarkt, Kardiomyopathie, hypertensiver Herzerkrankung und Herzklappenfehler. Zu den wichtigsten Merkmalen des Remodelings gehören Hypertrophie, Verlust von Kardiomyozyten und erhöhte interstitielle Fibrose [4,5].
Einteilung der Herzinsuffizienz [2]:
Die klinische Klassifizierung der Herzinsuffizienz erfolgt nach den Richtlinien der New York Heart Association in vier Stadien (NYHA I-IV)
NYHA I: uneingeschränkte Belastbarkeit, keine Symptome
NYHA II: in Ruhe Symptomfreiheit, unter starker körperlicher Belastung tritt Dyspnoe und vorzeitige Erschöpfung auf
NYHA III: bei leichter körperlicher Belastung kommt es zu Luftnot und vorzeitiger Erschöpfung
NYHA IV: bereits in Ruhe, ohne körperliche Belastung treten Symptome der Herzinsuffizienz auf
Ziel der Herzinsuffizienz-Therapie ist die Wiederherstellung der verminderten Kontraktilität des Myokards. Die pharmakologisch-therapeutischen Konzepte gehen davon aus, dass die intravasale Volumenvermehrung und die Steigerung des peripheren Widerstandes reduziert werden sollen. Hierzu werden “Angiotensin- Converting-Enzym-Hemmer“ (ACE-Hemmer), Angiotensin-Rezeptor-Antagonisten, Beta-Blocker und Spironolacton eingesetzt. Auch moderne invasive Verfahren wie Ballondilatation, Stent-Implantation oder die biventrikuläre Stimulation des Herzens und Koronarbypasschirurgie, durch die eine Reversibilität einer Myokardischämie erreicht werden kann, konnten die Zahl stationärer Behandlungen der Patienten und die Mortalität signifikant reduzieren sowie die Funktion des Herzens verbessern [6].
Trotz dieser Erfolge, sowohl bei Prävention als auch bei medikamentöser und interventioneller Behandlung der Herzinsuffizienz, bleibt die Organtransplantation oft die einzige Möglichkeit, das Leben der betroffenen Patienten zu verlängern. Die Verfügbarkeit der Organe ist jedoch ein limitierender Faktor dieses Therapieverfahrens bei gleichzeitigem Anstieg der Patientenzahlen.
Die Transplantation von Zellen als Gewebeersatz wurde seit den Anfängen der 90er Jahre zunehmend als vielversprechende Therapieoption diskutiert. Ziel der Zelltherapie war es, nicht regenerierendes Gewebe nach degenerativen Prozessen durch eine Erhöhung der Anzahl intakter Kardiomyozyten zu ersetzen und damit eine Wiederherstellung der Funktion des Herzmuskels zu erreichen.
Die erste erfolgreiche Zelltransplantation ins Myokard gelang Soonpaa et al. im Jahre 1994. Die Arbeitsgruppe konnte im Mausmodell stabile Grafts fötaler Kardiomyozyten im Empfängermyokard nachweisen. Elektronenmikroskopisch konnten sie zeigen, dass sich zwischen Empfänger- und Spenderzellen Disci intercalares ausgebildet hatten, d.h. eine gut differenzierte Zell-zu-Zell-Verbindung mit Desmosomen und Fascia adhaerens bestand. Elektronenmikroskopische Bilder zeigten gut ausdifferenzierte Zellen mit Myofibrillen, Disci intercalares, Gap junctions, Mitochondrien und einer normalen Kern-Plasma-Relation [7]. In den letzten Jahren ist die Anwendung pluripotenter Stammzellen zur Behandlung der Herzinsuffizienz zunehmend in den Mittelpunkt gerückt.
Der Einsatz von Stammzellen zur Geweberegeneration eröffnet in der langfristigen Therapie von Myokardischämien bzw. chronisch degenerativen Myokarderkrankungen neue Perspektiven. Während sich die etablierten konservativen Therapiestrategien bislang auf eine Verminderung des pathologischen Remodellings beschränken, würde die Zelltransplantation die Möglichkeit einer kausalen Therapie eines ausgedehnten Gewebeverlusts bieten.
1.2 Stammzellen
Embryonale Stammzellen und verschiedene Subtypen adulter Stammzellen wie Knochenmarksstammzellen wurden in den letzten Jahren in zahlreichen präklinischen Studien bezüglich ihrer Eignung als Spenderzellen zur myokardialen Regeneration untersucht.
Stammzellen sind undifferenzierte Zellen, die unbegrenzt teilungsfähig sind. Durch asymmetrische Zellteilung entsteht jeweils wiederum eine Stammzelle und eine zur Differenzierung fähige Zelle. Stammzellen stellen das Ausgangsmaterial aller regenerationsfähigen Gewebe des Erwachsenen. Pluripotente Stammzellen können
verschieden ausdifferenzierte Zellen eines Gewebes bilden. Pluripotente Stammzellen werden in embryonale Stammzellen (ES-Zellen), welche während der Embryonalentwicklung gewonnen werden, und in adulte Stammzellen, auch somatische Stammzellen genannt, welche aus bestimmten Kompartimenten oder Organen des Körpers gewonnen werden, unterteilt.
1.2.1 Embryonale Stammzellen
Embryonale Stammzellen können wegen ihrer Pluripotenz in Zellen aller drei Keimblätter, sowie in Zellen der Keimbahn ausdifferenzieren. Sie werden aus der inneren Zellmasse einer Eizelle im Blastozystenstadium isoliert und können in undifferenziertem Zustand kultiviert werden.
Abbildung 1 zeigt die schematische Darstellung der Isolation embryonaler Stammzellen.
In vitro können ES-Zellen mehr oder weniger gezielt in definierte Zelltypen differenziert werden, so z.B. in Zellen des Myokards.
Abb. 1 : Gewinnung pluripotenter
embryonaler Stammzellen
Die Isolation erfolgt im Embryogenesestadium der Blastozyste aus deren innerer Zellmasse.
http://www.dfg.de/aktuelles_pr esse/themen_dokumentatione n/stammzellen/was_sind_stam mzellen.html
Klug et al. konnten 1996 mit einer Aufreinigunsstrategie zeigen, dass die durch kardiale Differenzierung aus ES-Zellen gewonnenen Kardiomyozyten auf 99,6%
aufgereinigt werden können. Die Aufreinigungsstrategie basiert auf der Transfektion der ES-Zellen mit einem Antibiotikum-Resistenzgen zur gezielten antibiotischen Selektion von Subpopulationen. Nach Transplantation dieser Zellen konnte die Expression von Connexin-43 zwischen Spender- und Empfängerkardiomyozyten nachgewiesen werden. Connexin-43 ist ein wesentlicher Bestandteil der Gap junctions, welche die morphologische Grundvoraussetzung für eine Erregungsweiterleitung von Zelle zu Zelle und somit aufgrund der elektromechanischen Kopplung auch für die Kontraktion verantwortlich sind [8].
Roell et al. konnten wiederum nachweisen, dass die intramyokardiale Transplantation der aus kardialer Differenzierung von ES-Zellen hervorgegangenen Kardiomyozyten in einem Infarktmodell an der Maus die linksventrikuläre Funktion verbessert [9].
Embryonale Stammzellen sind in hoher Zahl verfügbar und können in gefrorenem Zustand über lange Zeit aufbewahrt werden.
Wichtige Nachteile der ES-Zellen jedoch sind der allogene Ursprung der Zellen mit der Notwendigkeit der Immunsuppression wegen der Gefahr einer Transplantatabstoßung und die Neigung undifferenzierter, proliferierender Zellen zur Bildung von Teratomen nach Transplantation [10].
Gegen eine Therapie zur Geweberegeneration („tissue engineering“) mit ES-Zellen sprechen außerdem ethische Gründe. In Deutschland verbietet das Embryonenschutzgesetz, menschliche Embryonen, also auch Blastozysten, für Forschungszwecke zu zerstören.
1.2.2 Adulte Stammzellen
Adulte Stammzellen haben ihren Ursprung im adulten Organismus. Sie weisen nur geringe Differenzierung auf und sind damit noch nicht endgültig hinsichtlich ihrer späteren Funktion im Organismus determiniert. Aus adulten Stammzellen können sich entweder durch mitotische Teilung weitere Stammzellen oder durch Differenzierung spezialisierte Zellen entwickeln. Dabei haben adulte Stammzellen gegenüber embryonalen Zellen ein eingeschränktes Differenzierungspotential. Sie
sind nicht mehr pluripotent, d.h. sie können nicht wie die ES-Zellen Zellen aller drei Keimblätter hervorbringen. Sie besitzen jedoch noch die Fähigkeit, in mehrere verschiedene Zelltypen zu differenzieren. Man spricht hierbei von Multipotenz.
Die Neigung zur malignen Entartung scheint bei Implantation adulter Stammzellen geringer zu sein als bei embryonalen Stammzellen. Eine Entartung konnte bei der klinischen Verwendung von adulten Stammzellen bisher nicht beobachtet werden.
Durch die Möglichkeit der autologen Transplantation findet keine Abstoßungsreaktion statt, eine Immunsuppression ist folglich nicht erforderlich.
Ethische Bedenken sind nicht vorhanden, da, anders als bei den embryonalen Stammzellforschungen, nicht in die Embryonalentwicklung eingegriffen wird. Die klinisch bedeutendste Quelle für adulte Stammzellen stellt das Knochenmark dar, das seit Jahren erfolgreich zur Therapie leukämischer Erkrankungen eingesetzt wird.
Dieses enthält verschiedene Subtypen von Progenitorzellen wie die hämatopoietischen Stammzellen, die sog. „Side Population“, mesenchymale Stammzellen (MSCs) und multipotente adulte Progenitorzellen (MAPCs), eine Subpopulation der mesenchymalen Stammzellen. Endotheliale Progenitorzellen (EPCs) stammen aus dem peripheren Blut und werden aus mononukleären Zellen isoliert.
Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Darstellung unterschiedlicher Bildgebungstechniken zur Visualisierung transplantierter Stammzellen, ohne besondere Berücksichtigung der unterschiedlichen Stammzellarten.
.
1.2.3 Marker adulter Stammzellen
Unterschiedliche Stammzelltypen werden über ihre verschiedenen Oberflächenmarker charakterisiert. Unter Verwendung der FACS-Zellsortierung (Fluorescence-Activated Cell Sorter) ist es möglich, die Zellen mit einer Spezifität von 98% aufzureinigen.
Hämatopoietische Stammzellen (HSC), oft mit mononukleären Zellen gleichgesetzt, exprimieren das CD 34+ Merkmal (Cluster of Differentiation), welches wahrscheinlich eine Signalfunktion bei der Zell-zu-Zell-Adhäsion besitzt. Ihr Anteil an der Zellpopulation des Knochenmarks macht weniger als 0.01% aus. Asahara et al.
identifizierten die CD 34+ Zellen im peripheren Blut und Knochenmark als
hämatopoietische Stammzellen und endotheliale Vorläuferzellen (EPC) [11].
Unterteilen kann man die CD 34+ Zellen je nach ihrer fluoreszierenden Eigenschaft im FACS in zwei Subtypen: CD 34bright und CD 34dim. Da die Identifizierung der Übergänge zwischen den beiden Markern sich relativ schwierig gestaltete, wurde ein weiteres Antigen gesucht, denn nur die CD 34bright entsprechen den realen Stammzellen. Gefunden wurde der CD 133+ Antikörper, welcher ausschließlich an CD 34bright bindet [12] und somit ausschließlich Stammzellen markiert.
1.3 Regeneration des Myokards durch Stammzellen
Wie bereits unter 1.1. beschrieben, führt ein akuter Myokardinfarkt zum Untergang von Kardiomyozyten mit Verlust kontraktiler Substanz und damit zu einer Abnahme der Herzfunktion. Eine Regeneration des zerstörten Gewebes durch teilungsfähige Vorläuferzellen findet nicht statt. Die Stammzelltherapie ist eine vielversprechende Behandlungsmethode.
Die erste erfolgreiche Zelltransplantation ins Myokard gelang Soonpaa et al. im Jahre 1994.
Bis dahin war es nicht möglich, mikroskopisch eindeutig zwischen Spender- und Empfängermyozyten zu unterscheiden. Um eine Unterscheidung von den Empfängerzellen und einen morphologische Nachweis der Integration transplantierter Zellen zu gewährleisten, erfolgte durch Anzüchtung einer transgenen Mauslinie, welche in allen Herzmuskelzellen das Reportergen n-LAC enthielt. N-LAC kodiert für eine an nukleäre Transportprotein gekoppelte ß-Galactosidase. Dadurch wurde die β-Galactosidase in den Zellkernen der transplantierten Zellen angereichert. Dies ermöglichte eine lichtmikroskopische Blaufärbung der Zellen und produzierte intrazelluläre kristalloide Ablagerungen, die im Elektronenmikroskop sichtbar sind (Abbildung 2). Dadurch gelang eine eindeutige Differenzierung zwischen Spender- und Empfängerzellen.
Jüngste Forschungen von Orlic D, Kajstura J, Chimenti S et al. [13] ergaben, dass Stammzellen regeneratives Potential besitzen. Humane CD-34+ Zellen induzieren im infarzierten Myokardareal nach intravenöser Verabreichung eine Neoangiogenese und Vaskulogenese. Licht- und elektronenmikroskopisch konnte im Bereich der transplantierten Zellen eine erhöhte Dichte von Blutgefäßen im Vergleich zum umgebenden Narbengewebe festgestellt werden. Die verbesserte Perfusion gewährleist eine verbesserte Blutversorgung und damit eine erhöhte LV-Funktion.
Die Behauptung hämatopoietische Stammzellen würden kardial ausdifferenzieren wurde durch Experimente von Balsam et al. und Murry et al. später wiederlegt. Eine kardiale Transdifferenzierung der genannten Zellen findet nicht statt [14,15].
Nygren et al. [16] konnten in ihrer Studie zeigen, dass Stammzellen des Knochenmarks zwar nicht in der Lage sind, sich zu Myozyten zu differenzieren, jedoch mit Empfängerkardiomyozyten fusionieren und nachweislich die Funktion des Herzens verbessern.
Abbildung 2:
Erste erfolgreiche Zelltransplantation im Myokard mit morphologischem Nachweis der Integration
transplantierter Zellen in einem Mausmodell, Soonpaa et al.; Science 1994
Stamm et al. zeigten in der ersten klinisch-chirurgischen Studie, in der sie Knochenmarkstammzellen ins Myokard transplantierten, dass es bei vier von sechs Patienten zu einer verstärkten linksventrikulären Funktion kam und sich die Gewebeperfusion bei fünf Patienten deutlich verbesserte. Sie führen dies auf eine Induktion der Neoangiogenese zurück, wodurch es zu einer Verbesserung der Perfusion des infarzierten Myokards kommt [17].
Strauer et al. konnten Auswirkungen der Stammzelltransplantation auf Ventrikelfunktion, Infarktgröße, Ventrikelgeometrie und Myokardperfusion zeigen. Sie fanden heraus, dass es unter Anwendung der Zelltransplantation zu einer Abnahme der Infarktgröße und zu einer Zunahme des Cardiac Index’ und der Ejektionsfraktion zwischen 20-30% kommt [18].
Wodurch diese Verbesserung zustande kommt, ist noch nicht erwiesen. Ursächlich hierfür ist möglicherweise eine stammzellassoziierte Angiogenese. Vermutet wird auch ein parakriner Effekt, durch den die transplantierten Zellen zur Produktion von Wachstumsfaktoren, Zytokinen und anderer zellprotektiver Faktoren angeregt werden, welche einen positiven Effekt auf das Infarktgebiet auslösen. Ein möglicher Mechanismus ist die verbesserte Perfusion durch Angiogenese und Arteriogenese, welche das Überleben der Zellen erhöht. Dies führt zu einer Unterbrechung der nicht-ischämischen Ausdehnung des ischämischen Infarktes und des Remodelings [19].
Wollert et al. führten eine prospektive randomisierte Studie durch, die den Einfluss einer intrakoronaren Gabe autologer Knochenmarkszellen auf die linksventrikuläre Funktion nach akutem Myokardinfarkt untersuchte (BOOST–I). In der BOOST-Studie wurden 60 Patienten randomisiert entweder der Knochenmarkszellgruppe (n = 30) oder der Kontrollgruppe (n = 30) zugeordnet. Die Kontrollgruppe erhielt keine Koronarinjektion, sie wurde konventionell behandelt. Die Knochenmarkszelltherapie wurde im Mittel 5 Tage nach primärer Katheterintervention durchgeführt. Nach 6 Monaten zeigte sich in der kardialen Magnetresonanztomographie im Vergleich zur initialen Untersuchung in der Kontrollgruppe eine signifikante Verbesserung der Ejektionsfraktion von 0,7% im Vergleich zu 6,7% in der Knochenmarkszellgruppe.
Die Verbesserung war vorwiegend bedingt durch eine verbesserte Kontraktilität im Infarktrandbereich, begleitet von einem nicht-signifikanten Trend zu verbessertem endsystolischen und enddiastolischen Volumen [20].
In bisher durchgeführten klinischen Studien konnte das weitere Schicksal der transplantierten Zellen nicht verfolgt werden. Grund ist der Mangel an Möglichkeiten, diese in vivo darzustellen. Die Bildgebung der ins Myokard transplantierten Zellen hinsichtlich des Überlebens, der Integration und Ausdehnung bzw. Verteilung ist von größter Bedeutung für die Bewertung des Therapieerfolges.
1.4 Bildgebung (Bio-Imaging)
Für die wissenschaftliche Erfolgskontrolle ist die Verlaufsbeobachtung transplantierter Zellen in vivo von größter Wichtigkeit. Die Bildgebung der in das Myokard transplantierten Zellen hinsichtlich des Überlebens und der Integration ist von großer Bedeutung für die Bewertung des Therapieerfolges. Entscheidend für die Lokalisation der Zellen sowie für den Nachweis der Integration und des Überlebens ist die Zellmarkierung. Einige Verfahren können die transplantierten Zellen histologisch post mortem vom Empfängergewebe unterscheiden und deren Verteilung und die Vitalität nachvollziehen. Neuere Versuche beschäftigen sich auch mit der in vivo-Darstellung der injizierten Zellen.
Zu diesem Zweck sind unterschiedliche Studien erschienen:
1.4.1 in vitro-Visualisierung
Reportergene: ß-Galactosidase und enhanced green fluorescent protein eGFP:
Reportergene wie die ß-Galactosidase und das eGFP verursachen eine Färbung der Zellen, welche die Darstellung und histologische Unterscheidung transplantierter Zellen ermöglicht.
Im Tierexperiment wurde eine transgene MHC-nLAC Mauslinie angezüchtet, die Zellmarkierungen durch Reportergene wie β-Galactosidase (blauer Kanal) [21] oder dem eGFP (grüner Kanal) [22] exprimierten (Abbildung 3). Der Nachweis von β- Galactosidase ist im Lebenden nicht möglich. Er erfolgt histologisch am explantierten Herzen, also post-mortem [21; 23]. EGFP erlaubt eine in vivo- Visualisierung mittels Fluoreszenzlicht. Aufgrund der geringen Intensität eignet sich dieses Verfahren jedoch nur für Kleintiermodelle, nicht für den Einsatz im Menschen.
Histologische Unterscheidung: Dystrophin und Y-Chromosom:
Ruhparwar et al. zogen in ihrer Arbeitsgruppe zum histologischen Nachweis der transplantierten Zellen und zur Unterscheidung zwischen Spender- und Empfängerkardiomyozyten histologische Unterschiede heran. Sie verwendeten Hunde, deren Gen für das Protein Dystrophin, ein Protein der Muskulatur, des Sarkolemms, ausgeschaltet war, als Empfängertiere. Das Fehlen von Dystrophin ermöglichte eine immunhistochemische Differenzierung zwischen Empfänger- und dystrophinpositiver Spenderzellen, da gesunde Muskelzellen dieses Gen exprimieren [25]. Der Einsatz dieser Methode im Menschen ist jedoch stark limitiert, weil dieser das Vorliegen der Grundkrankheit einer Muskeldystrophie voraussetzt und erscheint deshalb nicht sinnvoll.
Eine ebenfalls von dieser Arbeitsgruppe genutzte Methode ist die Verwendung von Geschlechtsunterschieden zwischen Spender- und Empfängerzellen durch in situ- Hybridisierung (FisH) zum Nachweis des Y-Chromosoms (Abbildung 4) [26]. Hierzu wurden weiblichen Schweinen post Infarkt aus Nabelschnurblut gewonnene USSCs in die Wand des linken Ventrikel injiziert. Detektiert werden konnten die injizierten Stammzellen über den Nachweis des Y-Chromosoms mittels FisH. Diese Methode ist jedoch für den klinischen Einsatz zu aufwändig.
Abbildung 3:
MHC- n-LAC transgene Mäuse exprimieren β- Galactosidase in Kardiomyozyten
Soonpaa et al.; Science 1994
Abbildung 4: zweifarbige Fluoreszenz in situ-Hybridisierung (FisH) von Kardiomyozyten (X- und Y- Chromosom), die roten und grünen Signale weisen auf humane Zellen hin (A und B), die in C und D nicht sichtbar sind
A: weibliche Zellen ( zwei rote Signale - X-Chromosomen)
B: männliche Zellen (ein rotes und ein grünes Signal - X/Y-Chromosom) C + D: keine humanen Zellen erkennbar
Die Fortschritte im Bereich der Stammzellforschung und Zelltransplantation haben zu einer zunehmenden Anzahl klinischer Studien auf der Basis der intrakoronaren und intramyokardialen Zellinjektion geführt [17,18,20]. Mehrere Studien zeigten die funktionelle Verbesserung der Ejektionsfraktion ischämischen Myokards nach Kardiomyoplastie mittels Echokardiographie oder Magnetresonanztomographie. Die fehlende in vivo-Objektivierung des funktionellen und morphologischen Schicksals der Zellen hinsichtlich Überleben und Integration bleibt jedoch eine wesentliche Schwäche aller genannten Studien. Eine visuelle Verifizierung persistierender Zellen am Ort der Injektion würde die Verbesserung der linksventrikulären Ejektionsfraktion objektivieren.
1.4.2 in vivo-Visualisierung
Biopsie:
Die Entnahme von Gewebeproben an der Stelle der Zellinjektion zur histologischen Untersuchung ist beim Menschen nicht geeignet, da sie zu hohe Risiken bergen und ethisch nicht vertretbar sind. Zusätzlich garantiert eine Biopsie keinen Zugang zu den transplantierten Zellen und trifft auch keine Aussage über deren Verteilung. Daher ist die Entwicklung einer Technologie, welche den in vivo-Nachweis transplantierter Zellen ermöglicht, von großer Bedeutung.
Ferromagnetische Mikropartikel:
Eine potentielle Lösung kann die in Abbildung 5 gezeigte Zellmarkierung mittels ferromagnetischen Mikropartikeln sein. Kraitchman et al. [27] und Dick et al. [28]
detektierten auf diese Weise mit Mikropartikeln markierte mesenchymale Stammzellen. In einem porcinen Myokardinfarktmodell stellen sie die injizierten Zellen mit Hilfe der Magnetresonanztomographie (MRT) am schlagenden Herzen dar [29]. Der hohe intrazelluläre Gehalt an Eisen kann zu einer durch freie Radikale verursachte Zytotoxizität führen. Auch die Größe und die Anzahl der Partikel beeinträchtigen die intra- und extrazelluläre Funktion der Zelle.
Tiwari et al. zeigten jedoch in ihrer Studie, dass ferromagnetische Partikel mit einem großen Durchmesser einen toxischen Effekt auf die Differenzierungsfähigkeit der Knochenmarkstammzellen haben [31].
Abbildung 5: In vitro Markierung, Hill JM et al.; Circulation 2003;108:1009-1014 blau: Zellkern; grün: Mikropartikel
Van der Bos et al. reduzierten die Toxizität der Eisenoxid-Markierung mit Hilfe von Lipofectin als Applikationsmittel [30], welche an die DNA binden und sie mit einer kationischen Schicht bedecken. Solche Komplexe adsorbieren an die Zelloberfläche, fusionieren mit der Zellmembran oder werden durch Endozytose aufgenommen und transportieren so die DNA ins Zytoplasma. Das Problem bestand aber weiterhin in der Größe der magnetischen Partikel. Zusätzlich bleibt das Signal, welches von den Zellen ausgeht, auch nach deren Zelltod bestehen. Es erlaubt also ausschließlich die Detektion der Partikel ohne Berücksichtigung der Vitalität und Integration transplantierter Zellen.
Biolumineszenz:
Die Biolumineszenz bezeichnet eine chemische Reaktion in lebenden Organismen, bei der Licht erzeugt wird. Die Lichtproduktion ist katalysiert durch das Enzym Luciferase, welches Luciferin unter Entstehung von Licht in Oxyluciferin umwandelt.
Die Aktivität der Luciferase wird in der Biolumineszenz-Reaktion gemessen. Das emittierte Licht mit einer Wellenlänge von 562nm kann in einem Luminometer
gemessen werden und ist der Aktivität der Luciferase proportional [42].
Wu et al. demonstrierten den Nachweis von mittels Adenoviren mit dem Luciferase Gen transduzierten Kardiomyoblasten nach Transplantation. Sie nutzten dazu die optische Biolumineszenz und Mikro-Positronen-Emissions-Tomographie (PET) in einem Rattenmodell [32] (Abbildung 6). Durch virale Transduktion wurden embryonalen Stammzellen Reportergene der Luciferase von Glühwürmchen oder der Thymidinkinase des Herpes simplex Typ I eingebracht. Anschließend können diese non-invasiv mit dem PET bis zu vier Wochen nach Transfektion dargestellt werden.
Die Biolumineszenz ist eine elegante Methode, die ausschließlich lebende Zellen erkennen lässt. Falsch positive Signale von bereits zu Grunde gegangenen Zellen sind ausgeschlossen. Aufgrund einer eingeschränkten Gewebepenetranz und schwacher Signalverstärkung ist diese Methode in größeren Tieren jedoch limitiert und eignet sich nur für Kleintiermodelle.
Abbildung 6: Molekulare Bildgebung kardialer Zelltransplantation in lebenden Tieren mittels Biolumineszenz [32]
Radioaktive Zellmarkierung: 18F-FDG:
Eine andere Möglichkeit zur in vivo-Darstellung transplantierter Zellen ist deren radioaktive Markierung. Die Zellmarkierung mittels 18F-FDG dient dem Nachweis der injizierten Stammzellen und der Einschätzung deren prozentualer Verteilung in den verschiedenen Organen (Abbildung 7).
Zur Energiegewinnung in der Zelle mittels Glykolyse befördert der Na-Glukose-Co- Transporter der Zellmembran Glukosemoleküle entgegen den Konzentrations- gradienten in die Zelle. Das radioaktiv markierte Zuckermolekül 2-(18F)-fluro-2- deoxy-D-glucose (18F-FDG) wird über dieselben Glukose-Transporter in die Zelle aufgenommen. Da diese Transporter nur im lebenden Organismus funktionieren, ist diese Methode begrenzt auf die Darstellung lebender Zellen. Hofmann et al.
publizierten eine Methode, bei der die durch Intrakoronarinjektion zu transplantierenden Knochenmarkstammzellen mit der radioaktiven 18F-FDG gekennzeichnet wurden. In einer 3D PET-Bildgebung konnte die Verteilung und die tatsächliche Anreicherung autologer Knochenmarkzellen nach therapeutischer Verabreichung an Patienten im Herzen beobachtet werden. Über 90% der applizierten Zellen sind wenige Stunden nach der Injektion in Leber und Milz zu finden (Abbildung 7). Dobert et al. zeigten, dass die Transplantation von 18F-FDG markierten Vorläuferzellen, gemessen von PET und SPECT, eine signifikante Zunahme der myokardialen Lebensfähigkeit und Perfusion hervorrief [33].
Die Methode erlaubt zwar den anschließenden Nachweis lebender Zellen im Myokard, ist jedoch aufgrund der kurzen physikalischen Halbwertszeit dieses Radioisotopes nur für wenige Stunden möglich und belastet den Patienten mit radioaktiver Strahlung [34].
Abbildung 7:Myocardial Homing und Verteilung von 18F-FDG-markierten Knochenmarkstammzellen;
Über 90% der applizierten Zellen sind wenige Stunden nach Injektion in der Leber und Milz zu finden [39].
Intra vital-Mikroskopie:
Ruhparwar et al. publizierten kürzlich eine Studie, in der in einem Hundemodell die zu transplantierenden fötalen Kardiomyozyten mit nicht toxischen membranspezifischen fluoreszierenden Farbstoffen markiert wurden. Sie verwendeten hierzu CM-Di-I und Carboxyfluorescein-Diacetat-Succinimidylester (CFDA-SE), ein Substrat, aus welchem spezielle Esterasen den fluoreszierenden Farbstoff CFDA freisetzen. Die markierten Zellen wurden per anterolateraler Thorakotomie in die Wand des Ventrikels injiziert.
Zur direkten Darstellung der Spender- und Empfängerzellen und zur Dokumentation von Integration und Überleben der Zellen, erfolgte eine intra vital-Mikroskopie bei erneuter Thorakotomie (Abbildung 8) [24]. Durch Anwendung einer speziell hierfür
entwickelten Software waren die fluoreszierenden Areale bis zu acht Wochen nach Transplantation am schlagenden Herzen nachweisbar.
Abbildung 8: intra vital-Mikroskopie erlaubt die in situ-Detektion transplantierter Zellen:
A: Die 10x Vergrößerung ohne Softwarebearbeitung der Bilder zeigt ein unscharfes fluoreszierendes Myokardareal um die Injektionsstelle (Pfeile)
B: Nach Bildverarbeitung und Entfernung der durch die Systole und Diastole bedingten Artefakte zeigen die einzelnen Bilder scharf begrenzte fluoreszierende Areale um zwei Injektionsstellen (Pfeile), welche durch ein nicht fluoreszierendes Areal getrennt werden (Maßpfeile).
C: Analoges Bild bei einem zweiten Tier (Pfeile). Eine benachbarte Kontrollinjektionsstelle (Mediuminjektion) zeigt keine Fluoreszenz (Stern). Auch hier zeigen Maßpfeile ein nicht behandeltes Myokard.
Histologisch konnten die CM-Di-I markierten transplantierten Zellen im Empfängermyokard nachgewiesen werden. Abbildung 9 zeigt die Di-I markierten Zellen um den gesamten Injektionskanal lokalisiert. Die Gegenfärbung der Zellkerne mit 4’,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) zeigte, dass die Di-I-positive Zellen gut in Empfängerkardiomyozyten, welche nicht rot färben, eingebettet waren. Darüber
B A
C
*
hinaus konnte Connexin 43, ein wichtiger Baustein der Gap junctions, welche für die Weiterleitung der elektrischen Erregung von Zelle zu Zelle wichtig sind, als Marker der funktionellen Integration zwischen Spender- und Empfängerkardiomyozyten nachgewiesen werden.
Diese invasive Darstellung in Form der intra vital-Mikroskopie ist ein Eingriff, der für den klinischen Alltag ungeeignet ist.
Abbildung 9:
Histologischer Nachweis Di-I-markierter transplantierter Kardiomyozyten im Empfängermyokard.
a: Ansammlung Di-I-markierter Zellen (rot) entlang des Injektionskanals zwei Monate nach Transplantation (40x). Das Empfängermyokard ist durch die gestrichelten Linien abgegrenzt.
b: Vergrößerung des Ausschnittes (400x)
c: Die korrespondierenden DAPI-Signale (Zellkerne) des selben Schnittes.
d: Überlagerte Bilder der Di-I-markierten Zellen und der DAPI-markierten Zellen.
Die bildgebenden Verfahren zur Beurteilung der Herzfunktion vor und nach Zelltransplantation zielen auf eine quantitative Beurteilung der linksventrikulären Ejektionsfraktion, des linksventrikulären Volumens und der Wandbewegung des Herzens ab, um eine Erfolgskontrolle der Zelltransplantation durchzuführen. Hier haben sich die transthorakale und die genauere transösophageale Echokardiographie sehr bewährt, weil sie kostengünstig mit relativ geringem Aufwand und hoher Verfügbarkeit durchzuführen sind. Aufgrund der zweidimensionalen Bildgebung sind jedoch mehrere Untersuchungen in verschiedenen Achsen für eine Gesamtbeurteilung notwendig. Die dreidimensionale MRT-Ventrikulographie stellt zur Zeit den Goldstandard zur Beurteilung der Ejektionsfraktion beider Herzkammern dar und ist bereits in einigen klinischen Studien eingesetzt worden [35]. Sie ist jedoch deutlich aufwändiger und nicht universell einsetzbar.
Eine der größten Beschränkungen der bisher durchgeführten Zelltransplantationsstudien ist das Unvermögen, das Schicksal von transplantierten Zellen hinsichtlich des Zellüberlebens und ihrer Integration zu verfolgen.
Tabelle 2 zeigt eine Zusammenfassung aller bisher durchgeführten Studien, welche sich mit der Bildgebung transplantierter Zellen ins Myokard befassen:
Methode der Darstellung Darstellung Detektionsmethode Darstellung beschränkt spez. Eigenschaften,
in vivo / in vitro auf lebende Zellen Vor- und Nachteile
Reportergene: eGFP + in vitro Histologie - wg. geringer Intensität ist e GFP
ß-Galactosidase Fluoreszenz nur histologisch nachweisbar
Histologie: Dystrophin + in vitro Immunhistologie - im Menschen nicht anwendbar
X-/ Y-Chromosom FisH kostenintensiv
Biopsie in vivo Histologie - keine Aussage über Verteilung,
keine garantierte Biopsie von Tx-Zellen, risikoreich
Intra-vital Mikroskopie in vivo intra-vital Mikroskopie - hohe Invasivität, keine Toxizität, bis zu
CM-Di-I + CFDA-SE Fluoreszenz 8 Wochen nach Injektion darstellbar
MRT / Mikropartikel in vivo MRT - Signalpersistenz nach Zelltod, zyto-
toxisch, Beeinträchtigung der intra- und extrazellulären Funktion Echokardiographie in vivo Echokardiographie (TEE) - simultan zur Injetion anwendbar,
Nanopartikel keine Toxizität, hohe Verfügbarkeit
MRT Nanopartikel in vivo MRT - keine Toxizität, hohe Verfügbarkeit
Biolumineszenz in vivo opt. Biolumineszenz + PET + ausschließlich Detektion vitaler Zellen,
Luciferase wg geringer Gewebepenetranz
nicht im Menschen anwendbar
radioaktive in vivo PET, SPECT + kurze HWZ, Strahlenbelastung
Zellmarkierung 18F-FDG ausschließlich Detektion vitaler Zellen
Tabelle 2: Studien zur Darstellung transplantierter Zellen ins Myokard
Echokardiographie- und MRT-Befunde mit Nachweis der persistierenden Spenderzellen am Ort der Transplantation würden Untersuchungen über den Einfluss der Zeitpunkte der Implantation sowie Titrationsstudien bezüglich der Zellzahl erleichtern und die Kontrolle klinischer Interventionen deutlich verbessern.
Es ist daher unbedingt erforderlich, Technologien zu entwickeln, die die in vivo- Detektion transplantierter Zellen ohne eine myokardiale Biopsie ermöglichen.
Auf dem Weg zur intravitalen Darstellung transplantierter Zellen im Myokard standen zunächst folgende Kriterien im Vordergrund:
1. geringe Invasivität des bildgebenden Verfahrens und damit Schonung für den Patienten
2. eine Toxizität für den Patienten muss ausgeschlossen werden und die Methode der Detektion und die Art der Markierung der Zellen sollten bereits in klinischen Studien geprüft worden sein
3. kurzfristige klinische Applizierbarkeit durch Einsatz klinisch bewährter Materialien und Methoden unter GLP- und GMP-Standard (Good Laboratory- und Manufacture Practice)
4. nur lebende Zellen sollen dargestellt werden, denn mehrere Studien berichten über ein Zellsterben nach intramyokardialer Transplantation [40, 41]
5. geringe apparative Ausstattung und somit breite Anwendungsmöglichkeit
Die Echokardiographie und die Magnetresonanztomographie würden eine ideale Lösung darstellen, da sie über alle oben genannten Eigenschaften verfügen.
Ziel der hier im Folgenden vorgestellten Studien war die Evaluation der Durchführbarkeit einer klinisch applizierbaren Detektion transplantierter Zellen im Empfängermyokard in einem präklinischen Großtiermodell eines akuten Myokardinfarktes mit Hilfe der Echokardiographie und der Magnetresonanztomographie. Hierzu wurden beide Verfahren in getrennten Versuchsansätzen am Großtier (TEE-Studie; MRT-Studie) geprüft.
1.5 Ziel
Ziel unserer Studien war die Implementierung einer Methode zum in vivo-Nachweis transplantierter Zellen im Myokard mit Hilfe von MRT und Echokardiographie.
Wir machten uns die Anwesenheit von Nanopartikeln für die Visualisierung mittels Echokardiographie und MRT zu nutze. Diese sind, wie unter 2.1. beschrieben, für die Zellselektion mit dem CliniMACS®-Gerät über Antikörper gegen CD133 an die Zielzellen gekoppelt.
2. Materialien
Markierung der Zellen
Bei der Wahl der Markierung müssen gewisse Kriterien berücksichtigt werden. So muss eine Toxizität für die Zellen und den Patienten ausgeschlossen werden und die Methode der Bildgebung sollte leicht praktizierbar sein. Es ist wichtig, dass sowohl die Art der Markierung, als auch die Detektion der Zellen bereits in klinischen Studien geprüft wurde.
Die Anwendung radioaktiver Stoffe scheint wegen der Strahlenbelastung nur begrenzt sinnvoll zu sein.
Die Verwendung von eGFP, einem Fluoreszenzfarbstoff, hat sich zwar in Kleintierexperimenten bewährt, ist aber wegen geringer Intensität ist für den Einsatz im Menschen ungeeignet.
Die Zellmarkierung mittels Nanopartikeln erfüllt die unter 1.4 genannten Anforderungen. Sie sind physiologisch funktionslos und bewirken keine pathologische Antwort der Zelle. Nanopartikel in Form von Eisen-Dextran wurden bereits in klinischen Studien erforscht und werden zur Behandlung von Anämien eingesetzt, sind also lang erprobt und für den Patienten unbedenklich. Auch die Möglichkeit der schnellen und einfachen Detektion der markierten Zellen mittels MRT oder Echokardiographie ist ein Vorteil dieser Methode. Zudem ist dies eine preiswerte Methode mit hoher Verfügbarkeit.
2.1 Nanopartikel / CliniMACS® CD 133 Reagenz
Die Nanopartikel sind Teil von CliniMACS® Reagenzien der Firma Miltenyi Biotec.
Diese nicht viskösen, kolloidalen Lösungen, enthalten zellspezifische Antikörperkonjugate in Pufferlösung. Die Konjugate bestehen aus Antikörpern, die chemisch an paramagnetische Partikel gekoppelt sind. Die Antikörper sind in hohem
Maße zellspezifisch, so dass das Markieren seltener Zielzellen möglich ist (Abbildung 10, Abbildung 11). Die Antigene belegen nur 20-30% der Bindungsstellen. Dies bewahrt die Möglichkeit, Zellen mit anderen Antikörpern zu analysieren.
Das sterile CliniMACS® CD 133 Reagenz besteht aus einem monoklonalen Maus- Antikörper und einer Eisen-Dextran-Einheit. Das Reagenz wird zur in vitro-Selektion von CD 133+ humanen Zellen verwendet.
Bei den Nanopartikeln handelt es sich um Eisen-Dextran Mikropartikel von einer Größe von 50 nm, welche auf der Zelloberfläche an entsprechenden Rezeptoren haften. Die Zellfunktion wird dadurch nicht negativ beeinflusst. Die ferromagnetischen Strukturen sind nicht toxisch und werden schon seit Jahren zur Behandlung von Anämien eingesetzt. Die verwendete Dosis ist jedoch 200 - 300 mal geringer, als die der klinisch eingesetzten Produkte. Außerdem werden die Nanopartikel nach gewisser Zeit abgebaut, sind also biodegradabel [36].
Abbildung 10: magnetische Markierung der Zellen
A B
Abbildung 11:
A: MACS NanoBead®, kovalent gebunden an CD133+Antikörper
B: Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme einer adulten Stammzelle: Die Nanopartikel sind auf der Zelloberfläche erkennbar
2.1 Zellen, Tiere
Hausschweine
Humane CD 133+-Zellen Nanopartikel
2.2 Zellkultur
2.2.1 Medien für die Zellkultur
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)
2.2.2 Zusätze für die Zellkultur
Bovines Serum
2.3 Chemikalien
Anästhesie:
Propofol (0,17-0,42 mg/kg/min), Isofluran und Fentanyl (5µg/kgKg)
Immunsuppression:
Cyclosporinen A (15 mg / kg KG / d) und Prednison (2,5 mg / kg KG / d) Methylprednisolon 1000 mg i.v. (einmalig)
histologische Färbung:
Anti-humanes nukleares Antigen-Antikörper
DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindol) (Zellkernfärbung) Propidiumjodid-Färbung (Reinheit der Zellen)
Preußisch Blau (Überprüfung der magnetischen Markierung)
Antikörper Cy-2 (Dianova, green channel), grünfluoreszierendes Carbocyanin
CliniMacs®-Reagenz
2.4 Verbrauchsmaterialien
Spritze, heparinbeschichtet Desinfektionsmittel
OP-Abdecktücher
Polypropylennaht (4-0 Prolene) Titanclips
Stickstoff Objektträger
2.5 Geräte
FACS-Gerät (Fluoreszenz Activated Cell Sorter)
CliniMACS® Zell-Sortierer (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach) SysMex®
Inkubator Zentrifuge Mikrotom
MRT: 7-Tesla (Siemens AG Medical Solutions, Germany) TEE: T 6210, Agilent Technologies
3. Methoden
3.1 TEE-Studie
Der Genehmigungsantrag G52-2004 für die folgenden Experimente wurde von dem Regierungspräsidium Halle genehmigt.
Die Versuchstiere wurden nach den Standardvorschriften der Bezirksregierung Halle gehalten.
Die Versuche wurden in den Laboratorien der IMTM-GmbH (Immune Technologies and Medicine) in Rottmersleben durchgeführt.
Alle Methoden, die Knochenmarkspunktion und Stammzellisolation beinhalteten, wurden im Operationssaal gemäß den GLP und GMP Standards durchgeführt. Sie ermöglichen den unmittelbaren Gebrauch auch am Patienten.
3.1.1 Stammzellgewinnung und Präparation des Knochenmarks
Männliche Patienten unterzogen sich einer Knochenmarkspunktion (60-330 ml), nachdem sie ihr Einverständnis erteilt hatten. Die Knochenmarksbiopsie wurde aus dem Beckenkamm unter Vollnarkose entnommen. Das Punktat wurde mit einer heparinbeschichteten Spritze entnommen, in eine Blutkonserve überführt und gewaschen wie unter 3.1.2 beschrieben.
Als Zellkandidat fungierten die auch als endotheliale Vorläuferzellen bekannten CD- 133+ Zellen.
3.1.2 Selektion der CD 133+ Zellen und Stammzellkennzeichnung mit CD 133+ und CD 34+ Antikörpern
Zur Selektion der CD 133+ Zellen aus dem humanen Knochenmark wurden Antikörper gegen CD 133+, welche an magnetische Nanopartikel gebunden sind, unter Zuhilfenahme der CliniMACS®-Technik angewendet (siehe auch 2.1). Diese Technik erlaubt es, ausschließlich die markierten Zellen aus der gesamten Zellpopulation mit Hilfe von Magneten herauszuselektieren.
Die CD 133+ Zellen wurden markiert, indem das gewonnene Zellgemisch mit dem Inhalt eines Fläschchens CliniMACS® CD 133 Reagenz ( Miltenyi Biotec), welches Antikörper/Nanopartikel-Komplexe enthält, 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert
wurde. Nachdem der Überschuss an ungebundenem Reagenz durch Zentrifugation entfernt wurde, wurde die automatische Separation mit dem MACS® (Magnetic Activated Cell Sorting) gestartet (Abbildung 12). Die markierte Zellsuspension wurde über das CliniMACS® Tubing Set mit der Selektionssäule, die sich im Feld des Permanentmagneten befindet, prozessiert. Die Säule mit den Hochgradient- Magnetfeldern bindet die magnetisch markierten CD 133+ Zielzellen und lässt die unmarkierten Zellen durchfließen, die im Negative Fraction Bag gesammelt werden.
Das System führt mehrere Waschschritte durch und fängt die Waschflüssigkeit im Buffer Waste Bag auf. Die gereinigten CD 133+ Zellen werden aus der Säule in den Cell Collection Bag gespült, nachdem die Selektionssäule aus dem Magnetfeld entfernt wurde.
Abbildung 12: MACS® (Magnetic Activated Cell Sorting): Separationsprinzip eines Anreicherungsprogrammes
1. Separation: Der Magnet ist eingeschaltet. Die magnetisch markierten Zellen werden in der Selektionssäule zurückgehalten, während die nicht markierten Zellen durchfließen.
2. Elution: Der Magnet ist ausgeschaltet. Die magnetisch markierten Zellen werden aus dem Magnetfeld der Säule befreit.
3. Anreicherungsstrategie: Das Anreicherungsprogramm hält die magnetisch markierten Zellen in der Selektionssäule zurück, die nicht markierten Zellen fließen durch und werden im Negative Fraction
Bag aufgefangen. Wenn der Magnet dann ausgeschaltet wird, werden sie magnetisch markierten Zielzellen freigelassen und im Cell Collection Bag gesammelt. [36]
Ein Bruchteil der selektierten CD 133+ Zellfraktion wurde abgenommen, um diese in unserer gegenwärtigen präklinischen großen Tierstudie zu verwenden. Dieser Teil wurde zusätzlich mit einem Fläschchen CliniMACS® CD 34+ Reagenz (Miltenyi Biotec) inkubiert, zweimalig in eine Waschlösung (Miltenyi-Biotec) resuspendiert und zentrifugiert. Nach der dritten Zentrifugation wurden die Zellen zur Injektion in Tierherzen in 3-5 ml Nährmedium resuspendiert.
Das CliniMACS® CD 133+ / CD 34+ Reagenz erreicht seine Wirkung nur durch eine physikalische Interaktion mit der Zelloberfläche. Es gibt keinen Beweis für eine dadurch bedingte Funktionsstörung der Zellen. Beispielsweise hat die CD 34+
Antikörper/Antigen-Interaktion keinen Effekt auf das klonogene Potential von selektierten CD 34+ Zellen [37].
3.1.3 Zellanalyse
Die Anzahl und die Reinheit der CD133+ Zellen wurden mit einem FACS-Gerät (Fluorescence Activated Cell Sorting) (Miltenyi Biotec) mittels CD 133/2-PE
(Phycoeryrthrin) und CD34-APC (Allophycocyanin) verifiziert. Das Prinzip dieser Untersuchung beruht auf Emission von optischen Signalen der Zellen in Form von Streulicht, wenn diese den Laserstrahl passieren (Abbildung 13). An hochspezifische monoklonale Antikörper gekoppelte fluoreszierende Farbstoffe emittieren Fluoreszenzimpulse, aus denen unterschiedliche Eigenschaften der Zellen abgeleitet werden können. Dieses erlaubt eine erneute Fraktionierung der Zellen.
Die Qualitätskontrolle der aufgereinigten Zellen zeigte eine Reinheit der CD133+
Zellen von über 95% (Abbildung 14). Die Bestimmung der Lebensfähigkeit durch einen Propidiumjodid-Test ergab ein mindestens 90%-iges Überleben der Zellen.
Die Anzahl der Zellen wurde von einem Zellzähler (SysMex®) registriert.
Die magnetische Markierung wurde histologisch mit Preussisch Blau verifiziert.
Abbildung 13: Prinzip der FACS- Analyse
The National Institutes of Health resource for stem cell research, Stem Cell Information, Appendix E.i. How Do Researchers Use Markers to Identify Stem Cells?
http://www.stemcells.nih.gov/info/scireport/appendixE.asp
Abbildung 14:
Zellanalyse des
Knochenmarkpunktats mittels FACS:
A:
vor dem Processing:
geringe Konzentration von CD133+ Zellen (eingerahmter Bereich)
B:
nach FACS-Sortierung: hohe Konzentration von CD133+
Zellen (> 95%; eingerahmter Bereich)
3.1.4 Chirurgisches Vorgehen und Zellimplantation
Zunächst wurde unter Vollnarkose mit Propofol (0,17-0,42 mg/kg/min), Isofluran und Fentanyl (5µg/kgKg), nach sterilem Abwaschen und Abdecken, eine anterolaterale Thorakotomie durchgeführt. Nach Perikarderöffnung wurde durch eine permanente Ligatur des Ramus marginalis des Ramus circumflexus der Arteria coronaria sinistra unter transoesophagealer Echokardiographie-Kontrolle ein akuter Myokardinfarkt induziert. 5-8 x 106 an Nanopartikel gekoppelte humane CD 133+ Zellen, gelöst in 5 ml Medium, wurden in den ischämischen Bereich des linken Ventrikels von Hausschweinen (Gewicht: 14-16 kg, n=6) injiziert. Der Injektionsvorgang von 5 mm Tiefe wurde mit einem TEE dokumentiert. Die Kontrolltiere erhielten entweder nur Zellkulturmedium (DMEM) (n= 5), nur mesenchymale Stammzellen (n=2) oder nur Nanopartikel in der selben Konzentration, wie sie zur Kennzeichnung genutzt wurden (n=2) als Injektion in die ischämische Wand des linken Ventrikels. Um eine nachfolgende Relokalisation zu ermöglichen, wurden die Injektionsstellen mit einer Polypropylennaht (4-0 Prolene) markiert. Um einer Abstoßungsreaktion des Transplantats vorzubeugen, wurden die Empfängertiere bereits einen Tag vor der OP bis zur Herzexplantation mit einer Kombinationstherapie aus Cyclosporinen A (15 mg / kg KG / d) und Prednison (2,5 mg / kg KG / d) immunsupprimiert. Zusätzlich wurde jedem Tier unmittelbar vor der Operation 1000 mg Methylprednisolon i.v. verabreicht.
3.1.5 Transoesophageale Echokardiographie (TEE)
Vor, während und nach der Zellinjektion, sowie vier bis sechs Wochen nach dem Eingriff untersuchten wir alle Tiere mit Hilfe eines multiplanen TEE. Multiplane TEE (T 6210, Agilent Technologies) wurden mit einem 5-MHz multiplanen Transducer (Wandler) durchgeführt. Alle Daten wurden auf eine magnet-optische Disk aufgezeichnet, um diese nachfolgend analysieren zu können. Alle Untersuchungen erfolgten unter standardisierter Projektion in langer Achse (2- und 4-Kammerblick) sowie kurzer Achse (Mitralklappen-, Papillarmuskel- und Apikalebene).
3.1.6 Immunhistochemie
Vier bis sechs Wochen nach der Transplantation erfolgte in Narkose die Explantation der Herzen über denselben operativen Zugang. Ziel war der immunhistochemische Nachweis von Überleben und morphologischer Integration der injizierten Zellen.
Gewebeproben wurden sowohl von der Versuchs- als auch von den Kontrollgruppen an der Stelle der Zellinjektion entnommen.
Die Biopsien wurden unmittelbar in flüssigem Stickstoff bei -196°C schockgefroren.
Mit einem Kryomikrotom wurden serielle Gefrierschnitte mit einer Dicke von 4µm angefertigt, bei 4°C in Paraformaldehyd fixiert, m it phosphatpufferhaltiger Kochsalzlösung gewaschen und anschließend in Blockserum geblockt. Eine Immunfärbung wurde durch eine Inkubation mit anti-humanem nuklearem Antigen (HuNA)-Antikörper (Chemicon®) für eine Stunde durchgeführt, um nachfolgend die transplantierten Zellen zu identifizieren. Nach dem Waschen werden die Schnitte mit einem zweiten Antikörper, einem grün fluoreszierenden Carbocyanin, Cy-2 (Dianova, grüner Kanal), erneut inkubiert. Zellkerne bzw. deren DNA werden mit DAPI (4’,6- diamidino-2-phenylindol), blauer Kanal, gegengefärbt.
3.2 MRT-Studie
Auch die folgenden Experimente wurden von dem Regierungspräsidium Halle genehmigt (Genehmigungsantrag G52-2004).
Wie bereits unter 3.1 beschrieben wurden die Versuchstiere nach den Standardvorschriften der Bezirksregierung Halle gehalten.
Die Versuche wurden in den Laboratorien der IMTM-GmbH (Rottmersleben) durchgeführt.
Alle Methoden, die Knochenmarkspunktion und Stammzellisolation beinhalteten, fanden unter GLP- und GMP-Bedingungen statt, welche auch einen klinischen Einsatz erlauben.
3.2.1 Stammzellgewinnung und Präparation des Knochenmarks
Im Rahmen einer multizentrischen klinischen Studie unterzogen sich männliche Patienten einer Knochenmarkspunktion (60-330 ml), nachdem sie ihr Einverständnis erteilt hatten. Die Knochenmarksbiopsie wurde aus dem Beckenkamm unter
Vollnarkose, unmittelbar vor einer koronaren Bypass-Operation entnommen. Ein Teil des Aspirates wurde uns freundlicherweise für unsere Studie zur Verfügung gestellt.
Das Knochenmark wurde mit einer heparinbeschichteten Spritze entnommen, in eine Blutkonserve überführt und prozessiert wie nachfolgend beschrieben.
3.2.2 Selektion der CD 133+ Zellen und Stammzellkennzeichnung mit CD 133+ und CD 34+ Antikörpern und Zellanalyse
Zunächst wurden CD133+ Zellen, wie im Abschnitt 3.1.2 beschrieben, unter Zuhilfenahme der CliniMACS®–Technologie (Abbildung 12, Kapitel 3.1.2) selektiert und aufgereinigt.
Die Reinheit und die Anzahl der Zellen wurde mit einem FACS-Gerät (Abbildung 13, Kapitel 3.1.3) (Miltenyi Biotec) mittels CD 133/2-PE (Phycoeryrthrin) und CD34-APC (Allophycocyanin) verifiziert.
Abbildung 15: FACS-Analyse: A: vor dem Processing: geringe Anzahl an CD 133+ Zellen
B: nach der Aufreinigung: hoher Reinheitsgrad an CD 133+ Zellen
Die Qualitätskontrolle der Zellen nach Aufreinigung zeigte eine 97%-ige Reinheit der CD133+ Zellen (Abbildung 15). Eine Beeinträchtigung der Zellen durch die Markierung konnte durch den Propidiumjodid-Test ausgeschlossen werden. Es
zeigte sich ein Überleben der Zellen größer 90%. Die Anzahl der Zellen wurde von einem Zellzähler (SysMex®) registriert. Die Bestimmung von CD 133+
Vorläuferzellen wurde vor und nach der automatischen Trennung ausgeführt.
Die magnetische Markierung wurde histologisch mit Preussisch Blau verifiziert.
3.2.3 Chirurgisches Vorgehen
Als Erstes wurden Hausschweine (Gewicht: 14-16 Kg) mit Propofol (0,17-0,42 mg/kg/min), Isofluran und Fentanyl (5µg/kgKg) narkotisiert. Nach sterilem Abwaschen und Abdecken wurde eine anterolaterale Thorakotomie durchgeführt.
Nach Freilegung des Herzens wurde ein akuter Myokardinfarkt durch eine permanente Ligatur des Ramus marginalis des Ramus circumflexus der Arteria coronaria sinistra induziert. Unmittelbar danach injizierten wir 5-8 x 106 humane CD 133+ Zellen, gelöst in 5 ml Medium und gekoppelt an Nanopartikel, in das Infarktareal des linken Ventrikels der Tiere (n=6). Der Injektionsvorgang von 5 mm Tiefe wurde mit einem transoesophagealen Echokardiogramm dokumentiert. Die Kontrolltiere (n=2) erhielten nur Zellkulturmedium (DMEM) als Injektion in die ischämische Wand des linken Ventrikels. Um eine nachfolgende Relokalisation zu ermöglichen, wurden die Injektionsstellen mit einer Polypropylennaht (4-0 Prolene) und daran befestigten Titanclips markiert.
Auch hier erfolgte unser bewährtes Schema der Immunsuppression, um einer Abstoßungsreaktion des Transplantats vorzubeugen. Die Empfängertiere erhielten, wie unter 3.1.4 beschrieben, eine Kombinationstherapie aus Cyclosporinen A und Prednison. Zusätzlich wurde jedem Tier unmittelbar vor der Operation 1000 mg Methylprednisolon i.v. verabreicht.
3.2.4 Magnetresonanztomographie (MRT)
Vier Wochen nach der Transplantation erfolgte in Vollnarkose eine Magnetresonanztomographie. Die Tests wurden an dem „Leibniz-Institut für Neurobiologie“ an der „Otto-von-Guericke Universität“ in Magdeburg, durchgeführt.
Dafür wurde ein hochmodernes, weltweit leistungsstärkstes MRT (Siemens AG Medical Solutions, Germany), mit einer Magnetfeldintensität von 7 Tesla (7T) eingesetzt. Die resultierenden Bilder wurden T1-gewichtet und als CINE-2D-
TurboFlash-Sequenzen evaluiert, um das Gebiet der injizierten Zellen am schlagenden Herzen sichtbar zu machen.
3.2.5 Immunhistochemie
Zum immunhistochemischen Nachweis von Überleben und morphologischer Integration der injizierten Zellen erfolgte vier bis sechs Wochen nach Transplantation die Explantation der Herzen über denselben operativen Zugangsweg.
Gewebeproben wurden sowohl von der Versuchs- als auch von der Kontrollgruppe an der Stelle der Zellinjektion entnommen.
Die Biopsien wurden, wie unter 3.1.6 beschrieben bearbeitet. Die transplantierten Zellen wurden immunhistochemisch mit Hilfe des HuNA-Antikörpers identifiziert.
4. Ergebnisse
Alle Tiere überlebten die Operation und die diagnostischen Verfahren.
Die Detektion transplantierten Zellen bzw. Nanopartikel mittels Echokardiographie konnten in der simultan zur Injektion durchgeführten TEE-Untersuchung als hyperdense Areale identifiziert werden. Darüber hinaus war es möglich, die Zunahme des Signals während der laufenden Injektion sowie die Anzahl der separaten Injektionen mittels TEE zu dokumentieren. In den Kontrollgruppen, welche entweder nur Medium oder Zellen erhielten, konnte das hyperdense Signal nicht beobachtet werden. Nur in der Kontrollgruppe, welche ausschließlich Nanopartikel als Injektion erhielt, konnte das Signal beobachtet werden. Daraus folgerten wir, dass die Nanopartikel für das hyperdense Signal und für die Identifizierung der Zellen verantwortlich sind. Nach 4-6 Wochen konnte in der erneuten TEE-Untersuchung kein Signal mehr festgestellt werden. Grund hierfür ist wahrscheinlich die Verteilung der Zellen weg vom Injektionskanal über das gesamte Myokard, ein Phänomen, welches aus anderen Tierversuchen bekannt ist [21]. Die Präsenz transplantierter Zellen im Myokard konnte immunhistochemisch mit Hilfe von HuNA-Antikörper nachgewiesen werden.
Die Detektion transplantierter Zellen mittels MRT-Untersuchungen der langen und kurzen Herzachse zeigten hypodense Areale, welche an der Injektionsstelle als
schmaler Streifen in der posterolateralen Herzwand begannen und nach apikal hin die gesamte Wandstärke der Lateralwand des linken Ventrikels durchsetzten. Die flächenhafte Expansion des Fluoreszenzsignals deutet in Übereinstimmung mit der ersten Zelltransplantationsstudie von Soonpaa et al. [21] auf Zellmigration oder passive Verteilung der Zellen zwischen den kontrahierenden Muskelschichten.
Histologisch konnten die transplantierten Zellen mit Hilfe des HuNA-Antikörpers nachgewiesen werden, wobei nur noch eine geringe Zahl lebender Zellen nachweisbar waren.
4.1 TEE-Studie
4.1.1 in vitro-Kennzeichnung der CD 133+ Zellen
Die Zellen wurden durch das Markieren nicht beeinflusst. Das Überleben und die Reinheit der Zellen nach der Markierung wurde vor der Injektion mit Propidiumjodid- Färbung und FACS-Analyse verifiziert (Abbildung 14) und betrug jeweils > 90 %. Die magnetische Markierung wurde histologisch mit Preußisch Blau überprüft.
4.1.2 Transoesophageale Echokardiographie (TEE)
Die intraoperative TEE wurde simultan zu der Zellinjektion durchgeführt. Die injizierten Zellkolonien bzw. Nanopartikel waren deutlich als hyperdense Areale sichtbar. Die Zunahme ihres intramyokardialen Volumens und des Signals während der laufenden Injektion konnte als sichtbare Zellanhäufungen mittels TEE dokumentiert werden. Außerdem konnte die Ausbreitung der Zellen unmittelbar nach der Zellinjektion dargestellt werden (Abbildung 16, Abbildung 17). Dieses Phänomen der flächenhaften Expansion der Zellen, bekannt durch histologische Studien von Soonpaa et al., weist entweder auf aktive Zellmigration oder passive Verteilung zwischen den unterschiedlichen Schichten des Herzmuskels hin. Das Signal nahm vor der Herzexplantation, welche acht Wochen nach Transplantation stattfand, ab.
In den Kontrollgruppen, die entweder nur Medium oder Zellen erhielten, konnten auch unmittelbar nach Injektion keine intramyokardialen echokardiographischen Signale im Sinne eines hyperdensen Signals nachgewiesen werden (Abbildung 18 B). Bei der Kontrollgruppe, welche nur Nanopartikel erhalten hat, war im TEE ein
deutlich hyperdenses Areal in der lateralen Wand des linken Ventrikels sichtbar (Abbildung 18 A). Daraus folgerten wir, dass die Nanopartikel und nicht die Zellen als Effektoren des zu beobachtenden hyperdensen Signals und für die Identifizierung der Zellen verantwortlich sind. In einer erneuten TEE-Untersuchung, die vier bis sechs Wochen später stattfand, konnte kein Signal mehr festgestellt werden. Dies beruht wahrscheinlich auf der weiteren Verteilung der Zellen innerhalb des Myokards, welches zu einem Signalverlust führt. Immunhistochemisch konnte die Präsenz transplantierter Zellen mit Hilfe von HuNA-Antikörpern nachgewiesen werden (Abbildung 19, Kapitel 4.1.3).
Abbildung 16:
Echokardiographische Darstellung der transplantierten Zellen
unmittelbar bevor und nach Zelltransplantation.
A: Posterolaterale Apex vor der Transplantation (grüner Pfeil)
B: das selbe Areal nach der Zelltransplantation zeigt ein hyperdenses Areal (grüner Pfeil), wodurch eine Zunahme des intramyokardialen Volumen während der Injektion dokumentiert werden konnte
C: Minuten nach der Injektion hat sich die Form der Zellanhäufung aufgrund von aktiver oder passiver Ausbreitung verändert
