1. Einleitung
1.4 Bildgebung (Bio-Imaging)
1.4.2 in vivo-Visualisierung
Biopsie:
Die Entnahme von Gewebeproben an der Stelle der Zellinjektion zur histologischen Untersuchung ist beim Menschen nicht geeignet, da sie zu hohe Risiken bergen und ethisch nicht vertretbar sind. Zusätzlich garantiert eine Biopsie keinen Zugang zu den transplantierten Zellen und trifft auch keine Aussage über deren Verteilung. Daher ist die Entwicklung einer Technologie, welche den in vivo-Nachweis transplantierter Zellen ermöglicht, von großer Bedeutung.
Ferromagnetische Mikropartikel:
Eine potentielle Lösung kann die in Abbildung 5 gezeigte Zellmarkierung mittels ferromagnetischen Mikropartikeln sein. Kraitchman et al. [27] und Dick et al. [28]
detektierten auf diese Weise mit Mikropartikeln markierte mesenchymale Stammzellen. In einem porcinen Myokardinfarktmodell stellen sie die injizierten Zellen mit Hilfe der Magnetresonanztomographie (MRT) am schlagenden Herzen dar [29]. Der hohe intrazelluläre Gehalt an Eisen kann zu einer durch freie Radikale verursachte Zytotoxizität führen. Auch die Größe und die Anzahl der Partikel beeinträchtigen die intra- und extrazelluläre Funktion der Zelle.
Tiwari et al. zeigten jedoch in ihrer Studie, dass ferromagnetische Partikel mit einem großen Durchmesser einen toxischen Effekt auf die Differenzierungsfähigkeit der Knochenmarkstammzellen haben [31].
Abbildung 5: In vitro Markierung, Hill JM et al.; Circulation 2003;108:1009-1014 blau: Zellkern; grün: Mikropartikel
Van der Bos et al. reduzierten die Toxizität der Eisenoxid-Markierung mit Hilfe von Lipofectin als Applikationsmittel [30], welche an die DNA binden und sie mit einer kationischen Schicht bedecken. Solche Komplexe adsorbieren an die Zelloberfläche, fusionieren mit der Zellmembran oder werden durch Endozytose aufgenommen und transportieren so die DNA ins Zytoplasma. Das Problem bestand aber weiterhin in der Größe der magnetischen Partikel. Zusätzlich bleibt das Signal, welches von den Zellen ausgeht, auch nach deren Zelltod bestehen. Es erlaubt also ausschließlich die Detektion der Partikel ohne Berücksichtigung der Vitalität und Integration transplantierter Zellen.
Biolumineszenz:
Die Biolumineszenz bezeichnet eine chemische Reaktion in lebenden Organismen, bei der Licht erzeugt wird. Die Lichtproduktion ist katalysiert durch das Enzym Luciferase, welches Luciferin unter Entstehung von Licht in Oxyluciferin umwandelt.
Die Aktivität der Luciferase wird in der Biolumineszenz-Reaktion gemessen. Das emittierte Licht mit einer Wellenlänge von 562nm kann in einem Luminometer
gemessen werden und ist der Aktivität der Luciferase proportional [42].
Wu et al. demonstrierten den Nachweis von mittels Adenoviren mit dem Luciferase Gen transduzierten Kardiomyoblasten nach Transplantation. Sie nutzten dazu die optische Biolumineszenz und Mikro-Positronen-Emissions-Tomographie (PET) in einem Rattenmodell [32] (Abbildung 6). Durch virale Transduktion wurden embryonalen Stammzellen Reportergene der Luciferase von Glühwürmchen oder der Thymidinkinase des Herpes simplex Typ I eingebracht. Anschließend können diese non-invasiv mit dem PET bis zu vier Wochen nach Transfektion dargestellt werden.
Die Biolumineszenz ist eine elegante Methode, die ausschließlich lebende Zellen erkennen lässt. Falsch positive Signale von bereits zu Grunde gegangenen Zellen sind ausgeschlossen. Aufgrund einer eingeschränkten Gewebepenetranz und schwacher Signalverstärkung ist diese Methode in größeren Tieren jedoch limitiert und eignet sich nur für Kleintiermodelle.
Abbildung 6: Molekulare Bildgebung kardialer Zelltransplantation in lebenden Tieren mittels Biolumineszenz [32]
Radioaktive Zellmarkierung: 18F-FDG:
Eine andere Möglichkeit zur in vivo-Darstellung transplantierter Zellen ist deren radioaktive Markierung. Die Zellmarkierung mittels 18F-FDG dient dem Nachweis der injizierten Stammzellen und der Einschätzung deren prozentualer Verteilung in den verschiedenen Organen (Abbildung 7).
Zur Energiegewinnung in der Zelle mittels Glykolyse befördert der Na-Glukose-Co- Transporter der Zellmembran Glukosemoleküle entgegen den Konzentrations-gradienten in die Zelle. Das radioaktiv markierte Zuckermolekül 2-(18F)-fluro-2-deoxy-D-glucose (18F-FDG) wird über dieselben Glukose-Transporter in die Zelle aufgenommen. Da diese Transporter nur im lebenden Organismus funktionieren, ist diese Methode begrenzt auf die Darstellung lebender Zellen. Hofmann et al.
publizierten eine Methode, bei der die durch Intrakoronarinjektion zu transplantierenden Knochenmarkstammzellen mit der radioaktiven 18F-FDG gekennzeichnet wurden. In einer 3D PET-Bildgebung konnte die Verteilung und die tatsächliche Anreicherung autologer Knochenmarkzellen nach therapeutischer Verabreichung an Patienten im Herzen beobachtet werden. Über 90% der applizierten Zellen sind wenige Stunden nach der Injektion in Leber und Milz zu finden (Abbildung 7). Dobert et al. zeigten, dass die Transplantation von 18F-FDG markierten Vorläuferzellen, gemessen von PET und SPECT, eine signifikante Zunahme der myokardialen Lebensfähigkeit und Perfusion hervorrief [33].
Die Methode erlaubt zwar den anschließenden Nachweis lebender Zellen im Myokard, ist jedoch aufgrund der kurzen physikalischen Halbwertszeit dieses Radioisotopes nur für wenige Stunden möglich und belastet den Patienten mit radioaktiver Strahlung [34].
Abbildung 7:Myocardial Homing und Verteilung von 18F-FDG-markierten Knochenmarkstammzellen;
Über 90% der applizierten Zellen sind wenige Stunden nach Injektion in der Leber und Milz zu finden [39].
Intra vital-Mikroskopie:
Ruhparwar et al. publizierten kürzlich eine Studie, in der in einem Hundemodell die zu transplantierenden fötalen Kardiomyozyten mit nicht toxischen membranspezifischen fluoreszierenden Farbstoffen markiert wurden. Sie verwendeten hierzu CM-Di-I und Carboxyfluorescein-Diacetat-Succinimidylester (CFDA-SE), ein Substrat, aus welchem spezielle Esterasen den fluoreszierenden Farbstoff CFDA freisetzen. Die markierten Zellen wurden per anterolateraler Thorakotomie in die Wand des Ventrikels injiziert.
Zur direkten Darstellung der Spender- und Empfängerzellen und zur Dokumentation von Integration und Überleben der Zellen, erfolgte eine intra vital-Mikroskopie bei erneuter Thorakotomie (Abbildung 8) [24]. Durch Anwendung einer speziell hierfür
entwickelten Software waren die fluoreszierenden Areale bis zu acht Wochen nach Transplantation am schlagenden Herzen nachweisbar.
Abbildung 8: intra vital-Mikroskopie erlaubt die in situ-Detektion transplantierter Zellen:
A: Die 10x Vergrößerung ohne Softwarebearbeitung der Bilder zeigt ein unscharfes fluoreszierendes Myokardareal um die Injektionsstelle (Pfeile)
B: Nach Bildverarbeitung und Entfernung der durch die Systole und Diastole bedingten Artefakte zeigen die einzelnen Bilder scharf begrenzte fluoreszierende Areale um zwei Injektionsstellen (Pfeile), welche durch ein nicht fluoreszierendes Areal getrennt werden (Maßpfeile).
C: Analoges Bild bei einem zweiten Tier (Pfeile). Eine benachbarte Kontrollinjektionsstelle (Mediuminjektion) zeigt keine Fluoreszenz (Stern). Auch hier zeigen Maßpfeile ein nicht behandeltes Myokard.
Histologisch konnten die CM-Di-I markierten transplantierten Zellen im Empfängermyokard nachgewiesen werden. Abbildung 9 zeigt die Di-I markierten Zellen um den gesamten Injektionskanal lokalisiert. Die Gegenfärbung der Zellkerne mit 4’,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) zeigte, dass die Di-I-positive Zellen gut in Empfängerkardiomyozyten, welche nicht rot färben, eingebettet waren. Darüber
B A
C
*
hinaus konnte Connexin 43, ein wichtiger Baustein der Gap junctions, welche für die Weiterleitung der elektrischen Erregung von Zelle zu Zelle wichtig sind, als Marker der funktionellen Integration zwischen Spender- und Empfängerkardiomyozyten nachgewiesen werden.
Diese invasive Darstellung in Form der intra vital-Mikroskopie ist ein Eingriff, der für den klinischen Alltag ungeeignet ist.
Abbildung 9:
Histologischer Nachweis Di-I-markierter transplantierter Kardiomyozyten im Empfängermyokard.
a: Ansammlung Di-I-markierter Zellen (rot) entlang des Injektionskanals zwei Monate nach Transplantation (40x). Das Empfängermyokard ist durch die gestrichelten Linien abgegrenzt.
b: Vergrößerung des Ausschnittes (400x)
c: Die korrespondierenden DAPI-Signale (Zellkerne) des selben Schnittes.
d: Überlagerte Bilder der Di-I-markierten Zellen und der DAPI-markierten Zellen.
Die bildgebenden Verfahren zur Beurteilung der Herzfunktion vor und nach Zelltransplantation zielen auf eine quantitative Beurteilung der linksventrikulären Ejektionsfraktion, des linksventrikulären Volumens und der Wandbewegung des Herzens ab, um eine Erfolgskontrolle der Zelltransplantation durchzuführen. Hier haben sich die transthorakale und die genauere transösophageale Echokardiographie sehr bewährt, weil sie kostengünstig mit relativ geringem Aufwand und hoher Verfügbarkeit durchzuführen sind. Aufgrund der zweidimensionalen Bildgebung sind jedoch mehrere Untersuchungen in verschiedenen Achsen für eine Gesamtbeurteilung notwendig. Die dreidimensionale MRT-Ventrikulographie stellt zur Zeit den Goldstandard zur Beurteilung der Ejektionsfraktion beider Herzkammern dar und ist bereits in einigen klinischen Studien eingesetzt worden [35]. Sie ist jedoch deutlich aufwändiger und nicht universell einsetzbar.
Eine der größten Beschränkungen der bisher durchgeführten Zelltransplantationsstudien ist das Unvermögen, das Schicksal von transplantierten Zellen hinsichtlich des Zellüberlebens und ihrer Integration zu verfolgen.
Tabelle 2 zeigt eine Zusammenfassung aller bisher durchgeführten Studien, welche sich mit der Bildgebung transplantierter Zellen ins Myokard befassen:
Methode der Darstellung Darstellung Detektionsmethode Darstellung beschränkt spez. Eigenschaften,
in vivo / in vitro auf lebende Zellen Vor- und Nachteile
Reportergene: eGFP + in vitro Histologie - wg. geringer Intensität ist e GFP
ß-Galactosidase Fluoreszenz nur histologisch nachweisbar
Histologie: Dystrophin + in vitro Immunhistologie - im Menschen nicht anwendbar
X-/ Y-Chromosom FisH kostenintensiv
Biopsie in vivo Histologie - keine Aussage über Verteilung,
keine garantierte Biopsie von Tx-Zellen, risikoreich
Intra-vital Mikroskopie in vivo intra-vital Mikroskopie - hohe Invasivität, keine Toxizität, bis zu
CM-Di-I + CFDA-SE Fluoreszenz 8 Wochen nach Injektion darstellbar
MRT / Mikropartikel in vivo MRT - Signalpersistenz nach Zelltod,
zyto-toxisch, Beeinträchtigung der intra- und extrazellulären Funktion Echokardiographie in vivo Echokardiographie (TEE) - simultan zur Injetion anwendbar,
Nanopartikel keine Toxizität, hohe Verfügbarkeit
MRT Nanopartikel in vivo MRT - keine Toxizität, hohe Verfügbarkeit
Biolumineszenz in vivo opt. Biolumineszenz + PET + ausschließlich Detektion vitaler Zellen,
Luciferase wg geringer Gewebepenetranz
nicht im Menschen anwendbar
radioaktive in vivo PET, SPECT + kurze HWZ, Strahlenbelastung
Zellmarkierung 18F-FDG ausschließlich Detektion vitaler Zellen
Tabelle 2: Studien zur Darstellung transplantierter Zellen ins Myokard
Echokardiographie- und MRT-Befunde mit Nachweis der persistierenden Spenderzellen am Ort der Transplantation würden Untersuchungen über den Einfluss der Zeitpunkte der Implantation sowie Titrationsstudien bezüglich der Zellzahl erleichtern und die Kontrolle klinischer Interventionen deutlich verbessern.
Es ist daher unbedingt erforderlich, Technologien zu entwickeln, die die in vivo-Detektion transplantierter Zellen ohne eine myokardiale Biopsie ermöglichen.
Auf dem Weg zur intravitalen Darstellung transplantierter Zellen im Myokard standen zunächst folgende Kriterien im Vordergrund:
1. geringe Invasivität des bildgebenden Verfahrens und damit Schonung für den Patienten
2. eine Toxizität für den Patienten muss ausgeschlossen werden und die Methode der Detektion und die Art der Markierung der Zellen sollten bereits in klinischen Studien geprüft worden sein
3. kurzfristige klinische Applizierbarkeit durch Einsatz klinisch bewährter Materialien und Methoden unter GLP- und GMP-Standard (Good Laboratory- und Manufacture Practice)
4. nur lebende Zellen sollen dargestellt werden, denn mehrere Studien berichten über ein Zellsterben nach intramyokardialer Transplantation [40, 41]
5. geringe apparative Ausstattung und somit breite Anwendungsmöglichkeit
Die Echokardiographie und die Magnetresonanztomographie würden eine ideale Lösung darstellen, da sie über alle oben genannten Eigenschaften verfügen.
Ziel der hier im Folgenden vorgestellten Studien war die Evaluation der Durchführbarkeit einer klinisch applizierbaren Detektion transplantierter Zellen im Empfängermyokard in einem präklinischen Großtiermodell eines akuten Myokardinfarktes mit Hilfe der Echokardiographie und der Magnetresonanztomographie. Hierzu wurden beide Verfahren in getrennten Versuchsansätzen am Großtier (TEE-Studie; MRT-Studie) geprüft.