OEFZS BER, No. 4168 BL-390/82 JUNI 1982
Österreichisches
Forschungszentrum Seibersdorf GesmbH
Ganzkörperautoradiographien der Maus unter Verwendung von Thymidin
Abteilung Toxikologie
GANZKORPERAUTORADIOGRAPHIEN DER MAUS UNTER VERWENDUNG VON THYMIDIN
Abteilung Toxikologie
Arbeitsbericht
österreichisches
Forschungszentrum Seibersdorf Ges.m.b.H.
Lenaugasse 10 A-1082 Wien INSTITUT FÜR BIOLOGIE Forschungszentrum Seibersdorf
GA
Beteiligte Mitarbeiter;
Versuchsleiter: Dr, H. Hofer Versuchsdurchführende: E. Reindl Assistenz; R. Paar
Versuchskurzbezeichnunq; GA
Kostenträgernummer; 6204
Versuchsort und Archiv; ÖFZS
Versuchsbeginn; Februar 1981
Umfang des Berichtes; Seite 1 , 1 - 5
GANZKÖRPERAUTORADIOGRAPHIEN DER MAUS UNTER VERWENDUNG VON THYMIDIN
ZUSAMMENFASSUNG
Es wurde mit einer üblichen Histologie-Ausrüstung versucht, Ganzkörperautoradiographien herzustellen. Bedingt brauchbare Ergebnisse wurden erhalten. 14C-Thymidin bzw. dessen Metaboliten werden in Geweben mit hoher Zellteilungsrate erwartungsgemäß
gefunden.
SCHLÜSSELWORTE
Ganzkörperautoradiographie, Thymidin.
WHOLE BODY AUTORADIOGRAPHY WITH MICE USING 14C-THYMIDINE
SUMMARY
Whole body autoradiography was performed using common histology equipment. Results were useful with some restrictions. 14C-thymi- dine and/or its metabolites were found in those tissues with
high rate of mitosis.
KEY WORDS
Whole body autoradiography, thymidine.
GA
GANZKÖRPERAUTORADIOGRAPHIEN DER MAUS UNTER VERWENDUNG VON THYMIDIN
1. EINLEITUNG
Ziel des Versuchs war, zu erproben, wie weit eine Ganzkörper- autoradiographie mit einer üblichen Histologie-Ausrüstung, also ohne ein großes Gefriermikrotom, durchführbar ist.
Die Methode der Ganzkörperautoradiographie wird angewandt, um einen überblick über die Verteilung der - radioaktiv mar- kierten - Prüfsubstanz im Körper eines Versuchstieres zu er- halten. Gegenüber der herkömmlichen Methode, das ist die Messung der Radioaktivität einzelner Organe und Gewebe mit z.B. Szintillationzählern, können mit der Autoradiographie Gewebe erfaßt werden, die aus präparativen Gründen sonst nicht untersucht werden, so z.B. die Anreicherung im Knor- pelgewebe oder in der Retina, oder die ungleiche Verteilung
im Mark und Rinde von Organen, oder der Übergang der Sub- stanz auf'die Foeten.
2. MATERIAL UND METHODIK
2.1. Prüfsubstanz
r 1 4 l Aus praktischen Gründen wurde vorrätiges Thymidinimethyl- CJ, NEC-568, in WasserrÄthanol 2:1 gelöst, verwendet.
2.2. Versuchstiere
3 männliche Him:OF1(Swiss)Mäuse, 7-9 Wochen alt.
Einzelhaltung bis zur Verabreichung in Makroionkäfigen
Typ II unter verbessert konventionellen Bedingungen.
Altromin-Futter und Wasser ad libitum.
2.3. Verabreichung
An Tier 1 und 2 wurden 150p,l der Thymidinlösung intravenös in eine Schwanzvene verabreicht. Dies entsprach etwa
5nCi 14C je Tier. Das Tier 3, die Kontrolle, erhielt 150p,l 33 prozentigen Alkohol.
2.4. Tötung/ Vorbehandlung für Einbettung
Tier 1 wurde 2 Stunden nach der Verabreichung, Tier 2 7 Stunden und Kontrolltier Nr.3 1 Tag nach der Verab- reichung mit A'ther getötet. Die Tiere wurden für 24 Stun- den in einer Tiefkühltruhe (etwa -24°C) gelegt und danach in flüssige Luft gebracht, wodurch die Haare leicht ent- fernt werden konnten. Extremitäten und Schwanz wurden mit einer Knochenschere abgesetzt.
2.5. Einbettung
Die tiefgefrorenen Mäuse wurden in einer 3,2%igen wäßrigen Relatinquellung (Relatin 25.000, Henkel AG) eingebettet und auf einem eigens angefertigten Gefriertisch so aufge- blockt, daß die linke Seite der Tiere nach oben zu liegen kam. Vor dem Schneiden lagerten die eingebetteten Tier- körper mindestens 12 Stunden in der Tiefkühltruhe bei -25°C.
2.6. Schneiden
2.6.1. Mikrotom: Die Gefrierschnitte wurden auf einem OmE-
Schlittenmikrotom (Fa. Reichert) angefertigt, das in eine gewöhnliche Tiefkühltruhe gestellt worden war. Das Schnei- den erfolgte bei einer Temperatur zwischen -18 und -22°C.
2.6.2. Lage der Schnitte: Um einen möglichst guten Überblick von der Verteilung des 14C-Thymidins in den einzelnen Organen zu erhalten, wurden in je 3 Ebenen Sagittal-
schnitte angefertigt, wobei eine Ebene durch ein Auge verlief.
GA
2.6.3. Schneidetechnik: Mit einem Einwegmesser wurde zunächst bis annähernd in die gewünschte Ebene geschnitten. Erst dann kam ein Hartmetallmesser (d-Schliff, Fa. Jung) zur Verwendung. Der Neigungswinkel auf der Merkteilung des
OmE Schlittenmikrotoms betrug 18°.
Die Dicke der Gefrierschnitte betrug 50nm. Abgenommen wurden sie mit dem Klebeband Scotch Tape No. 635.
2.6.4. Trocknung: Die Schnitte wurden auf eine vorgekühlte Glas- platte aufgeklebt und zwar je 1 Schnitt pro Ebene. Eine Gefriertrocknung erfolgte durch Lagerung in der Tiefkühl- truhe über etwa 2 Tage.
2.7. Autoradiographie
2.7.1. Film: In der Dunkelkammer wurde bei -25°C der Definix medical Röntgenfilm (Kodak) auf die Schnitte aufgebracht und mit einer Glasplatte bedeckt. Die so angefertigten Proben wurden mit Alu-Fix lichtdicht verpackt und während der Dauer der Belichtung in der Tiefkühltruhe mit einem Bleiziegel beschwert.
2.7.2. Belichtung: Um die günstigste Expositionszeit zu finden, wurden zu folgenden Zeiten Filme entwickelt: 1., 2., 4., 8., 16. und 32. Tag. Als 0. Tag wird jener Tag bezeichnet, an dem die Filme auf die Schnitte aufgebracht wurden.
2.7.3. Entwicklung: Die Entwicklung erfolgte in einem Kodak DX-80 Entwickler, als Unterbrecher diente 1%ige Essig- säure, als Fixierer wurde Kodak Schnellfixierbad benützt.
Die Gefrierschnitte wurden nach Entfernung der Filme in einem Cryo-Cut (American Optical) bei -25°C aufbewahrt und zur Orientierung bei den autoradiographischen Bildern herangezogen.
3. ERGEBNISSE
Die angewandte Methode liefert brauchbare Ganzkörperauto- radiographien von Mäusen. Sie ist dennoch nur bedingt anwend- bar, vor allem auf Grund der geringen Stabilität der Messer- führung des Mikrotoms (welches ja auch nicht für diese An- wendung konstruiert ist). Die händische Führung des Messers erfordert viel Übung und Geduld. Größere Tiere als Mäuse können mit dem verwendeten Mikrotom sicher nicht geschnitten werden.
Autoradiogramme vom Kontrolltier Nr. 3 zeigten in keinem Fall eine Schwärzung, sodaß mit Artefakten, z.B. durch chemische Reaktionen mit der Filmemulsion nicht gerechnet werden mußte.
16 und 32 Tage Belichtungsdauer ergaben gute Ergebnisse. Als Beispiel werden Autoradiogramme von verschiedenen Schnitt- ebenen durch Tier Nr. 2 (Abb. 1) gezeigt. Man erkennt hohe Konzentrationen von 14C-Thymidin oder dessen Metaboliten in den sich rasch teilenden Geweben, wie dies für eine Nuklein- säurevorstufe zu erwarten ist.
Die intensivste Schwärzung fand sich in Knochenmark, Milz
und den Schleimhäuten des Magen-Darm-Traktes. Etwas schwächere Schwärzungen fanden sich im Bereich/ von Drüsen, äußerer Haut und in der Leber.
Dr. H. Hofer \ - Dr. H. Altmann Versuchsleiter \ / Institutsleiter
G e h i r n
Abbildung 1: Beispiele von Ganzkörperautoradiographien mit 14C-Thymidin.
