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Structure-function analysis of microtubule plus-end tracking protein complexes
Doctoral Thesis Author(s):
Manatschal, Cristina Publication date:
2013
Permanent link:
https://doi.org/10.3929/ethz-a-010088928 Rights / license:
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DISS. ETH NO. 21563
Structure-function analysis of microtubule plus-end tracking protein complexes
A thesis submitted to attain the degree of DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH
(Dr. sc. ETH Zurich)
presented by Cristina Manatschal
Master of Science in Biology, ETH Zurich
born August the 3
th1984 from Santa Maria Val Müstair GR
accepted on the recommendation of
Prof. Gebhard F.X. Schertler Prof. Michel O. Steinmetz
Prof. Yves Barral Prof. Andrea Musacchio
2013
Summary
Microtubules are key cytoskeletal components involved in numerous essential cellular functions.
Many of these functions are regulated by so called microtubule plus-end tracking proteins (+TIPs), a divers group of proteins that specifically associate with one end of microtubules, the microtubule plus-ends. At the microtubule plus-ends these proteins are perfectly located to modulate microtubule dynamics and attach microtubule plus-ends to different cellular sites. These activities are important for many cellular processes like cell migration, mitosis and intracellular transport and organisation. Recent work has shown that the evolutionary highly conserved end binding proteins (EBs) are able to autonomously tip track and to recruit most of the other +TIPs to the microtubule plus-end. So far, two main EB dependent recruitment mechanisms have been described: +TIPs can either bind to the acidic C-terminal tail of EBs via a cytoskeleton-associated protein glycine- rich (CAP-Gly) domain or to a distinct hydrophobic cavity of EBs via a short linear Ser-x-Ile-Pro (SxIP) motif. However, our knowledge about the exact molecular function and cooperation of +TIP complexes at this cellular site is lagging behind. The work presented in this thesis therefore addresses the questions on how +TIP networks are setup and regulated and how +TIPs cooperate to perform a specific task.
In a first project (chapter 2) we identified SLAIN proteins as new EB dependent +TIPs (SLAIN1 and SLAIN2 in vertebrates). SLAIN proteins also exhibit the unique property to also interact with many other well known +TIPs; CLIP-170 (cytoplasmic linker protein), CLASP (clip associated proteins) and ch-TOG, the mammalian homologue of the microtubule polymerase XMAP215. We found that the C-terminus of SLAIN2 binds to the CAP-Gly domains of CLIP-170 and the crystal structure of this complex revealed a new CAP-Gly domain binding mode. The N-terminal part of SLAIN2 interacts with ch-TOG and thereby SLAIN2 enhances ch-TOG accumulation at microtubule plus-ends. The triple complex EB-SLAIN2-ch-TOG promotes persistent microtubule grow in interphase. In mitosis, however, SLAIN2 is phosphorylated which disrupts its association with EBs and ch-TOG. This probably contributes to the dramatic increase in microtubule catastrophe frequency observed at the onset of mitosis. We concluded that SLAIN proteins are key components of +TIP networks and therefore they will remain of high interest in the field.
In a second project (chapter 3) we characterized in detail the S.cerevisiae protein Kar9 and its interaction with the EB protein Bim1. Together with the myosin Myo2, these proteins link microtubules to actin filaments to orient the mitotic spindle relative to the cleavage plane in S.cerevisiae. We found that Kar9 and Bim1 form a complex with a dissociation constant in the low nanomolar range. This tight association might be functionally important for a faithful execution of the spindle positioning process. In addition, we found that Kar9 binds to EB proteins via an SxIP
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motif but also via a novel linear motif Leu-x-x-Pro-Thr-Pro-Leu (LxxPTPL). Using biophysical methods we show that the EB-LxxPTPL interaction is specific. Moreover the LxxPTPL motif can mediate the recruitment of proteins to microtubule plus-ends in cells on its own and thus it is a novel microtubule tip localization signal.
In conclusions, in the first part of this thesis we present new insides in how mammalian microtubule networks are organized and regulated with respect to the cell cycle. Our findings presented in the second part of this thesis represent the groundwork for understanding how the molecular Bim1- Kar9-Myo2 machine works to perform its specific cellular function in S.cerevisiae. This project also led to the discovery of the novel EB binding motif LxxPTPL. Future structural work on the LxxPTPL-EB interaction will certainly improve our understanding of how linear motifs bind to EB proteins and could even help to predict or design additional sequences that can bind to EB proteins.
Zusammenfassung
Mikrotubuli sind ein wichtiger Bestandteil des Zellskeletts und spielen bei zahlreichen essentiellen Zellfunktionen eine wichtige Rolle. Viele dieser Funktionen werden von einer diversen Gruppe von Proteinen reguliert, so genannte „microtubule plus-end tracking“ Proteine (+TIPs), die sich spezifisch an einem Ende von Mikrotubuli ansammeln, dem Mikrotubuli plus-Ende. Am Mikrotubuli plus-Ende sind diese Proteine gut positioniert, um die Dynamik von Mikrotubuli zu modulieren und um Mikrotubuli mit unterschiedlichsten anderen Zellstrukturen zu verlinken. Diese Aktivitäten sind von grosser Bedeutung für viele wichtige zelluläre Prozesse wie Zellmigration, Zellteilung, intrazellulärer Transport und intrazelluläre Organisation. Jüngste Forschungsergebnisse haben gezeigt, dass die evolutionär hoch konservierten EB Proteine das Mikrotubuli plus-Ende autonom erkennen, und die meisten anderen +TIPs dahin rekrutieren können. Bis jetzt wurden zwei EB abhängige Rekrutierungsmechanismen beschrieben: +TIPs können entweder anhand von sogenannten CAP-Gly (cytoskeleton associated protein–glycine-rich) Domänen an den sauren C- terminus von EB Proteinen binden, oder anhand eines linearen Ser-x-Ile-Pro (SxIP) Motivs mit einer spezifischen hydrophoben Tasche von EB Proteinen interagieren. Unser Wissen über die genaue molekulare Funktion und Kooperation von +TIP Komplexen ist allerdings noch sehr limitiert. Deswegen beschäftigt sich diese Arbeit mit den Fragen, wie +TIP Netzwerke aussehen und reguliert werden, und wie +TIPs kooperieren um eine bestimmte zelluläre Funktion auszuüben.
In einem ersten Projekt (Kapitel 2) haben wir SLAIN Proteine als neue EB abhängige +TIPs identifiziert (SLAIN1 und SLAIN2 in Wirbeltieren). Zusätzlich haben wir entdeckt, dass SLAIN Proteine die einzigartige Eigenschaft besitzen, auch mit vielen anderen bekannten +TIPs zu interagieren; nämlich mit CLIP-170 (ctyoplasmic linker protein), CLASP (clip associated proteins) und ch-TOG, dem Säugetier Homolog der Mikrotubuli Polymerase XMAP215. Der C-Terminus von SLAIN2 bindet die CAP-Gly Domänen von CLIP-170. Die Kristallstruktur dieses Komplexes hat zur Entdeckung eines neuen GAP-Gly Domäne Interaktionsmodus geführt. Der N-terminale Teil von SLAIN2 interagiert mit ch-TOG und dadurch fördert SLAIN2 die Lokalisation von ch-TOG an das Mikrotubuli plus-Ende. Der Komplex, bestehend aus EB, SLAIN und ch-TOG, fördert darüber hinaus das anhaltende Wachstum von Mikrotubuli in der Interphase. Im Gegensatz dazu ist SLAIN2 in der Mitose phosphoryliert, was dazu führt, dass es nicht mehr mit EB Proteinen und ch- TOG interagieren kann. Dies trägt wahrscheinlich dazu bei, dass Mikrotubuli beim Start der Mitose viel mehr Katastrophen erfahren. Zusammenfassend können wir schlussfolgern, dass SLAIN Proteine Schlüsselelemente von +TIP Netzwerken sind, und dass SLAIN Proteine deshalb im diesem Forschungsbereich von hohem Interesse bleiben werden.
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In einem zweiten Projekt (Kapitel 3) haben wir die S.cerevisiae Hefe Proteine Kar9 und dessen Interaktion mit dem EB protein Bim1 im Detail untersucht. Zusammen mit dem Motorprotein Myo2 verlinken diese Proteine die Mikrotubuli und das Aktin Zellskelett, um die mitotische Spindel relativ zur Teilungsfurche an die richtige Position zu ziehen. Wir haben herausgefunden, dass Kar9 und Bim1 einen sehr stabilen Komplex mit einer Dissoziationskonstante im nanomolaren Bereich bilden. Diese stabile Assoziation könnte wichtig sein, damit diese Proteine ihre Funktion in der Spindel Positionierung richtig ausführen können. Zusätzlich haben wir entdeckt, dass Kar9 die EB Proteine über ein SxIP Motiv und auch über ein neuartiges Motiv, bestehend aus Leu-x-x-Pro-Thr- Pro-Leu (LxxPTPL) bindet. Mit biophysikalischen Methoden konnten wir zeigen, dass die EB - LxxPTPL Interaction spezifisch ist. Ausserdem kann das LxxPTPL Motiv andere Proteine zu dem plus-Ende von Mikrotubuli in Zellen rekrutieren und repräsentiert deshalb ein neues Mikrotubuli Lokalisationssignal.
Zusammenfassend beschreibt die Arbeit im ersten Teil dieser Doktorarbeit neue Erkenntnisse wie Mikrotubuli Netzwerke in Säugerzellen organisiert sind und im Verlauf des Zellzyklus reguliert werden. Die Resultate im zweiten Teil dieser Arbeit sind die Grundpfeiler um besser verstehen zu können, wie die molekulare Maschine, bestehend aus den +TIPs Bim1, Kar9 und Myo2 funktioniert, um dessen spezifische zelluläre Funktion in der Hefe S.cerevisiae auszuüben. Dieses Projekt hat auch zur Entdeckung des neuen EB Bindungsmotivs, LxxPTPL, geführt.
Weiterführende strukturelle Arbeit an der LxxPTPL - EB Protein Interaction wird darüber hinaus zu einem besseren Verständnis führen, wie EB Proteine lineare Sequenz-Motive erkennen können und könnte auch dazu beitragen, weitere Sequenz-Motive die EB Proteine binden können vorauszusagen oder rational zu entwerfen.
