Hämatologie, Hämostaseologie und Onkologie Direktor: Prof. Dr. med. Arnold Ganser
Zentrum Innere Medizin Medizinische Hochschule Hannover
Untersuchungen zur Bedeutung des frühen T-Zell-Rezeptors prä-TCR in
akuten lymphatischen Leukämien
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin an der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Philipp Ivanyi aus Frankfurt am Main
Hannover 2006
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am: 27.03.2007 Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover
Präsident: Prof. Dr. med. Dieter Bitter-Suermann Betreuerin: PD Dr. med. Anke Franzke
Referent: Prof. Dr. med. Karl-Walter Sykora Korreferent: Prof. Dr. med. Thomas Buhr Tag der mündlichen Prüfung: 27.03.2007
Promotionsausschussmitglieder: Prof. Dr. med. Helmut Drexler Prof. Dr. med. Anke Schwarz Prof. Dr. med. Bettina Wedi
...gewidmet meiner Mutter und meinem Vater
und denen, die zur Seite standen…
INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG……….… 1
1.1 Hintergrund……….. 1
1.2 Stadien der T-Zellentwicklung………. 2
1.3 Die β-Selektion und pTα im Mittelpunkt der frühen thymischen T-Zellreifung……….. 3
1.4 Die frühe T-Zellreifung und der prä-TCR im Kontext der malignen Transformation…..……... 7
1.5 Fragestellung……… 8
2 MATERIAL UND METHODEN……….. 9
2.1 Probenmaterial……….. 9
2.1.1 Zelllinien………...9
2.1.2 Patienten und gesunde Spender……… 10
2.2 Zellbiologische Methoden……… 11
2.2.1 Kulturbedingungen, Einfrieren und Auftauen von Zellen………11
2.2.2 Isolierung von PBMC………...11
2.3 Molekularbiologische Methoden……….. 12
2.3.1 Agarosegelelektrophorese……… 12
2.3.2 Photometrische Messung von RNA und cDNA………... 12
2.3.3 Gewinnung zellulärer RNA……….. 13
2.3.4 Reverse Transkription (RT) mit Verdau genomischer DNA………...13
2.3.5 RT-Polymerase-Ketten-Reaktion (RT-PCR)………14
2.3.5.1 Auswahl der Oligonukleotid-Primer zur RT-PCR………..………...14
2.3.5.2 Standardisierung und Optimierung der RT-PCR………...15
2.3.5.3 Praktische Durchführung der RT-PCR……….. 16
2.3.6 Die Real-Time PCR mittels Taqman™ (RQ-RT-PCR)………... 16
2.3.6.1 Auswahl der Oligonukleotid-Primer und Sonden für die Real-Time PCR………... 17
2.3.6.2 Standardisierung und Optimierung der Real-Time PCR………..…. 17
2.3.6.3 Quantifizierung der Genexpression………... 18
2.3.6.4 Praktische Durchführung der Real-Time PCR………..… 18
2.3.7 Sequenzierung……….. 19
2.3.8 Klonierung……… 20
2.3.8.1 Herstellung und Ligation eines PCR-Produktes……… 20
2.3.8.2 Transformation………...21
2.3.8.3 Isolierung und Präparation von Plasmid-DNA……….. 21
2.4 Proteinchemie………... 22
2.4.1 Westernblotanalyse………...22
2.4.1.1 Herstellung von zellulärem Proteinlysat………22
2.4.1.2 Natrium-Duodecyl-Sulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und Proteintransfer………23
2.4.1.3 Immunblotting und Chemielumineszens………... 24
2.4.1.4 Quantifizierung der Proteinmenge……….25
2.4.1.5 Kompetitiver Spezifitätsassay………25
2.4.1.6 Immunpräzipitation………26
2.5 Zelluläre Immunologie………. 26
2.5.1 Positivselektion von CD3+ T-Zellen mittels MACS……….………… 26
2.5.2 Durchflußzytometrische Analyse (FACS)……….27
2.5.3 Proliferations-Inhibitionstest………...………. 27
2.5.4 Zellzyklusanalyse………...…. 28
2.5.5 Apoptosefärbung mittels Hoechst 33258………..……… 30
2.6 Statistik und Abbildungen……… 30
3 ERGEBNISSE………31
3.1 Ergebnisse der Zelllinien Analysen……….. 31
3.1.1 Etablierung der Real-Time PCR zur Quantifizierung der pTα Wildtyp-Genexpression………. 31
3.1.2 Quantitative Genexpressionsanalyse des pTα Wildtyps in humanen Leukämie-Zelllinien………... 36
3.1.3 Qualitative Expressionsanalyse der pTα Isoformen in humanen Leukämie-Zelllinien mittels RT-PCR……… 37
3.1.4 Etablierung des pTα Proteinnachweises………... 40
3.1.5 Analyse der pTα- und pTα/TCRβ Heterodimer-Proteinexpression in humanen Zelllinien…..……... 40
3.1.6 Proliferations-Inhibitionsassay………...……….. 43
3.1.7 Analyse des Mechanismus der PP1-vermittelten Inhibition in T-Zell-Leukämien……….. 48
3.2 Ergebnisse der Analysen von gesunden Spendern und Leukämiepatienten……….…... 52
3.2.1 Quantitative Genexpressionsanalyse des pTα Wildtyps in Leukämie-Patienten und gesunden Spendern………...…… 52
3.2.2 Qualitative Expressionsanalyse der pTα Splicingvariante in Leukämie-Patienten und gesunden Spendern………….………..……… 54
3.2.3 Analyse der pTα mRNA-Expression in MNC-Fraktionen……….……….. 55
4 DISKUSSION ……….………...……… 57
5 ZUSAMMENFASSUNG………71
6 ANHANG……… 72
6.1 Verzeichnis der Zelllinien………....… 72
6.2 EGIL-Kriterien……….…… 73
6.3 Gegenüberstellung humaner und muriner T-Zellentwicklung………...……….…… 74
6.4 Metaphasenanalyse der Zelllinie Hsb-2 und Isogramm von Chromosom und 7 …………...…. 75
7 ABKÜRZUNGEN……….. 76
8 LITERATURVERZEICHNIS………... 79
9 DANKSAGUNG……….… 95
10 LEBENSLAUF………...…… 96
11 ERKLÄRUNG……… 98
1 EINLEITUNG
1.1 Hintergrund
Bei den akuten Leukämien unterscheidet man zwischen lymphatischen (ALL) und myeloischen (AML) Leukämien. In Deutschland erkranken pro Jahr 1.4 von 106 Einwohner an akuten lympha- tischen Leukämien.1 In Abhängigkeit der transformierten lymphatischen Zellreihe wird zwischen B- Vorläuferzell-(B-ALL) und T-Vorläuferzell-Leukämien (T-ALL) unterschieden. Anhand bestimmter Oberflächenmerkmale der Zellen, sogenannter „cluster of differentiation“ (CD), werden die T-ALL im Wesentlichen in die unreiferen, die thymischen und die reifen T-ALL eingeteilt (s. 6.2).2 Durch intensive Chemotherapien können bei bis zu 80% der T-ALL-Patienten Remissionen erzielt werden.2 Jedoch beträgt trotz Hochdosistherapieansätzen mit autologer und allogener Stammzelltransplantation das leukämiefreie Überleben im Erwachsenenalter nur ca. 30%.2 Im Hinblick auf Subentitäten der T- ALL ist die Langzeitprognose sowohl bei den unreifen als auch bei den reifen T-ALL deutlich schlechter. Zudem wird durch therapieassoziierte Komplikationen als auch durch das Auftreten von Zweitneoplasien die Morbidität und die Mortalität im Gesamtkollektiv der T-ALL-Patienten erhöht.2-6 Neuere Therapiestrategien, die aus dem zunehmenden Verständnis pathophysiologischer Zusammen- hänge resultieren, liefern selektivere Therapien. Diese molekularen Therapiestrategien, wie z.B. der bereits klinisch eingesetzte Tyrosinkinase-Inhibitor STI571 (Glivec), scheinen vielversprechende Perspektiven im Hinblick auf reduzierte Toxizität und Erhöhung der Ansprechraten bei Philadelphia- Chromosom tragenden Leukämien zu bieten.2,7-11
Das lymphopoetische System ist ein Zellpool mit hoher proliferativer Aktivität. Bei rund 1 x 1011 Zellteilungen pro Tag mit einer statistischen Häufigkeit von 1 x 10-6 Replikationsfehlern pro Zellteil- ung wären zahlreiche pathologische Prozesse vorprogrammiert, wenn das Gleichgewicht zwischen Differenzierung, Proliferation und Apoptose nicht durch komplexe Mechanismen gesteuert würde.11-
14 Physiologische Entwicklungsschritte, die sich durch ein Zusammenspiel verschiedener Mechanis- men zur Aufrechterhaltung der Zellhomöostase kennzeichnen, können bei Dysregulation, z.B. durch Mutationen oder strukturelle Chromosomenaberrationen, zu Apoptoseresistenz und unkontrollierter Proliferation führen. Nach gegenwärtigem Verständnis sind bei der ALL Vorläuferzellen durch die maligne Transformation betroffen. Dabei arretieren diese Vorläuferzellen zum Einen in ihrer Entwicklung und zeigen zum Anderen eine deutliche Störung der Zellhomöostase. Hierdurch erlangen die malignen Zellen einen Überlebensvorteil der eine verdrängende klonale Expansion ermöglicht und so letztlich zum klinischen Bild der ALL führt.12-17
EINLEITUNG
1.2 Stadien der T-Zellentwicklung
Die T-Zellentwicklung beginnt bei der hämatolymphopoetischen Stammzelle (HLSC) im Knochen- mark (KM) und erstreckt sich über die thymische Reifung bis hin zu funktionellen T-Lymphozyten in sekundär lymphatischen Organen. Anhand von Selektionsprozessen kann die T-Zellreifung in eine frühe und eine späte Phase unterteilt werden. Thymozyten müssen auf dem Weg zu reifen T-Zellen drei wesentliche Selektionspunkte passieren, wobei jedes Mal zwischen Weiterreifung und apopto- tischem Zelltod entschieden wird (s. Abb. 1).18-21 Sinn und Zweck dieser komplexen Entwicklung ist die Sicherstellung einer Vielfalt von Antigenrezeptoren zur Erkennung fremder Antigene. Die Expression dieser sogenannten T-Zell-Rezeptoren (TCR), die aus verschiedenen Untereinheiten bestehen, stellen darüber hinaus Schlüsselereignisse in der T-Zellentwicklung dar.
Die frühe Entwicklungsphase, die sich von der HLSC im KM bis in den Thymus erstreckt, ist von Antigenen und dem reifen T-Zell-Rezeptor (TCR) unabhängig. Im murinen System migrieren von HLSC abstammende Vorläuferzellen je nach Entwicklungsalter aus dem Dottersack, der Leber oder dem KM in den Thymus, in dem sich aus jeder einzelnen Zelle rund 1 x 106 reifere Zellen entwickeln.22-23 Im Thymus reifen diese Vorläuferzellen überwiegend zu T-Lymphozyten, wobei das Thymusstroma als spezialisiertes Umfeld durch Zell-Zell-Interaktionen und Zytokinwirkung eine essentielle Rolle spielt.20,22-26 Der früheste und kritischste Selektionsschritt auf dem Weg zu reifen TCRα/β+ T-Zellen ist die sogenannte β-Selektion, die maßgeblich durch den Antigen-unabhängigen
DP
γδ
1
2
CD8+
V V DN
DN
CD4+
MHC Klasse II Erkennung MHC Klasse I Erkennung
3 Apoptose
Apoptose Apoptose
Emigration in die Peripherie Cortex
Medulla
frühe - späte - T-Zellentwicklung
Abb. 1: Überblick über die T-Zell- entwicklung (modifiziert nach Germain 18 ). Dargestellt ist der Thymus, in dem sich Vorläufer- zellen (V) durch Passage dreier wesentlicher Selektionspunkte (1-3) zu reifen T-Lymphozyten entwickeln. Quantitativ domi- nante Entwicklungswege sind durch schwarze, qualitativ do- minante Entwicklungswege sind durch graue Pfeile gekennzei- chnet. 18,20-21 Legende: (V) Vorläuferzellen; (DN) doppelt negative Thymozyten; (γ/δ) TCRγ/δ T-Zellreihe; (α/β) TCRα/β T-Zellreihe (1) β- Selektion; (DP) doppelt positive Thymozyten;(2) Positivselektion;
(3) Negativselektion; (graue Zellen) thymische epitheliale und dendritische Zellen.
α/β
prä-TCR gesteuert wird.20,27-30 Der prä-TCR ermöglicht Thymozyten eine weitere Differenzierung und massive Proliferation, wenn eine Expression einer funktionellen TCRβ Kette nach somatischer Rekombination der T-Zell-Rezeptorgene erfolgt ist, dem sogenannten TCRβ „rearrangement“.
Die spätere Entwicklungsphase, die sich vom Thymus bis in die sekundär lymphatischen Organe erstreckt, ist von Antigenstrukturen und dem TCR abhängig.18,20 Bei der Positivselektion werden T- Zellen mit mittlerer MHC-Affinität ausgewählt und bei der Negativselektion werden T-Zellen, die körpereigene Antigene erkennen, deletiert.18,21,31-32 Nach drei Selektionsschritten, bei denen ein Großteil der Thymozyten in Apoptose geht, verlassen nicht einmal 10% der generierten Thymozyten als überwiegend TCRα/β+ reife Lymphozyten den Thymus.18,21,33 Ein kleiner Teil der Thymozyten verlässt den Thymus als TCRγ/δ+ T-Zellen (s. Abb. 1-2). Neben der thymischen T-Zellreifung wird eine extrathymische T-Zellentwicklung postuliert, die jedoch unzureichend verstanden ist.14, 34-35
1.3 Die β-Selektion und pTα im Mittelpunkt der frühen thymischen T-Zellreifung
Thymozyten bestehen überwiegend aus unreifen T-Zellen (d.h. CD3- und TCRα/β-). Diese entwickeln sich im Thymus zu reifen, einfach positiven (SP; d.h. CD3+, TCRα/β+, CD4+ oder CD8+) T-Zellen.33 Die unreifen Thymozyten lassen sich in die doppelt negativen (DN; d.h. CD4-/CD8-) und in die zahlenmäßig dominanten, reiferen doppelt positiven (DP; d.h.CD4+/CD8+) Thymozyten unterteilen.
Die aus vier Subpopulationen bestehenden DN Thymozyten (DN1-4) bilden mit Abstand die dyna- mischste Zellpopulation im Thymus (s. Abb. 2).24,36-38 Während DN1 Thymozyten zu DN4 Thymozyten reifen findet eine Vielzahl von phänotypischen Veränderungen statt, wie z.B. das stringent regulierte „rearrangement“ unterschiedlicher T-Zell-Rezeptorgene (s. Abb. 6.3).
DN1 Zellen zeigen die geringste T-Zell-Linien Restriktion und die TCRβ Loci befinden sich noch in Keimzellkonfiguration (s. 6.3).20,33,43 Während der weiteren Entwicklung zum DN3 Stadium kommt es zunehmend zur Restriktion zur T-Zellreihe wobei die Thymozyten an Pluripotenz einbüßen.20,38,42 Mit Entwicklung zu DN3 Thymozyten kommt es zu einer deutlichen Expansion der Zellen.20,44-45 Die DN3 Zellen, die eine funktionelle TCRβ Kette exprimieren, passieren die β-Selektion und entwickeln sich zu DN4 Thymozyten, wohingegen die DN3 Zellen ohne funktionelle TCRβ Ketten-Expression in Apoptose übergehen (s. Abb.2). Im DN4 Stadium beginnt das „rearrangement“ der TCRα Loci, gefolgt von einer spontanen Weiterentwicklung über das ISP Stadium („intermediate single positive“) zu DP Thymozyten. Somit entscheidet die β-Selektion über Weiterreifung von DN zu DP Thymozyten.43,46-48 Mit den DP Thymozyten ist die Antigen-unabhängige Entwicklungsphase abge- schlossen, und die Antigen-abhängige Entwicklungsphase zu reifen TCRα/β+ einfach positiven T- Zellen (SP; d.h. CD4+ oder CD8+) beginnt.
EINLEITUNG
Die β-Selektion, die im DN3 Stadium stattfindet, ist maßgeblich vom prä-TCR abhängig, der aus der pTα-, der TCRβ Kette und dem CD3 Komplex besteht (s. Abb. 3). Die Expression des prä-TCR bewahrt Thymozyten mit einem funktionellen TCRβ „rearrangement“ vor dem apoptotischen Zelltod und ermöglicht weitere Differenzierung sowie massive Expansion, so dass aus wenigen DN Thymozyten eine große Anzahl von DP Thymozyten entstehen kann.28,44-45,49-51 Ebenso entscheidet der prä-TCR in diesem Zeitfenster zugunsten einer weiteren Entwicklung in Richtung TCRα/β+ Zellreihe, durch die Beeinflussung des „rearrangements“ der TCRβ, TCRα als auch TCRγ/δ Loci;
dem sogenannten „lineage commitment“.28,33,52-59 Mit Passage der β-Selektion erfolgt wahrscheinlich die stärkste Proliferation in der T-Zell-Ontogenese, und jede Zelle amplifiziert sich ca. um den Faktor 500.20,29,44-45,60-61 Bei präselektionären DN3 Thymozyten liegt der proliferative Anteil (S/G2/M-Phase)
Abb. 2: Vereinfachte Darstellung der frühen T-Zellentwicklung und β-Selektion (modifiziert n. Fehling und von Boehmer 20)
Dargestellt ist die Entwicklung von Vorläuferzellen (TAV) über das DN, ISP und DP Stadium zu reifen SP T-Zellen, mit entsprechenden Immuncharakteristika der Maus und des Menschen (s. 6.3). Nach Reifung zu DN2 Thymozyten (B) kommt es mit Übergang zu DN3 Zellen (C) zur vollständigen Restriktion zur TCRα/β+ Linie. Wenige DN3 Thymozyten (C) die den prä-TCR exprimieren passieren die β-Selektion und proliferieren, wohingegen der Großteil der Zellen ohne prä-TCR-Expression in Apoptose geht. Charakteristika der β-Selektion finden sich im Humansystem zwischen dem DN4 und ISP Stadium. Die Prozentangaben geben den jeweiligen Anteil an den DN Thymozyten wieder. Schwarze Pfeile kennzeichnen Hauptentwicklungswege, gestrichelte Pfeile alternative Entwicklungsschritte. 20, 24 ,37-43, 62 Legende: (CD) „cluster of differentiation“; (sca-1) ly6a, Lymphozyten-Antigen 6 Komplex; (c-kit) „steam cell factor receptor“; (mRNA) Verlauf der „messenger“ RNA-Expression der beiden pTα Isoformen; (DN) doppelt negative Thymozyten; (DP) doppelt positive Thymozyten; (ISP) intermediär einfach positive Thymozyten; (SP) einfach positive Thymozyten; (B-Zellen) B-Lymphozyten; (TDC-Zellen) Thymische dentritische Zellen; (γ/δ) TCRγ/δ+ Thymozyten; (*) essentielle Kofaktoren die im „knock out“ Modell zur Blockade der β- Selektion führen; (pTα) prä-T-Zell-Rezeptor-α-Kette; (RAG) „recombination activating genes“; (Lck/Fyn/Zap70/Syk) Proteintyrosinkna- sen der src-Familie; (SLP76/LAT) Substrat-/Adapterproteine der src-Kinasen.
Migration aus
dem KM TAV DN1 DN2 DN3 DN4 ISP DP
SP
SP CD 34+38-
4-8-3- Sca-1+ 4lowc-kit+/-
B-Zellen NK- Zellen Thymus
β- Selektion
DP Thymozyten
„large-sized“, hochproliferativ (A) (B) (C) (D)
(A) (B) (C) (D)
<5% <5% ~45% ~45%
4-5x numerische
Zunahme
Apoptose CD 34+38+
4-8-3-1a- CD 45+ 25- 4-8-3-
CD 44+25+ c-kit+ 3- CD 34+38+ 4-8-3-1a+/-
CD 34-38 + 4-8-1a+ 3ε+ CD 44-25+
5+3-
CD 44-25- 5+ 3- CD 1a+ 4-/+8-3-/+
CD 4+8- 1a+3+/- CD 4-8+ 3-/+
CD 4+8+ 3+
CD 4+8-3+
<5% 80%
15%
TDC- Zellen mRNA pTαWildtyp
mRNA pTαSplicingvariante
γ/ δ-T- Zellen
∗ pTα, RAG1/2, CD3ε,γ, TCRβ, Lck/Fyn, Zap70/Syk, SLP-76, LAT
CD 3+ 8+ oder CD 3+4+
unter 30%, wohingegen dieser bei den postselektionierten DN4 Thymozyten bei über 60% liegt.44,54 Bevor selektionierte DN3 Zellen proliferieren, durchlaufen diese eine Ruhephase. Die zeitlich versetzte Proliferation resultiert aus p53 regulierten Reparaturprozessen, die aufgrund von DNA- Defekten nach „rearrangement“ erforderlich sind. Wurden diese DNA-Defekte behoben, wird die Zellzyklus-progression durch die prä-TCR-Expression reaktiviert.62-63
Die Bedeutung der TCRβ Kette wurde bei der β-Selektion mehrfach gezeigt.28,65 Anfänglich wurde als Rezeptor der Initiierung der β-Selektion ein TCRβ Homodimer postuliert.66 Es stellte sich jedoch im Folgenden heraus, daß dem prä-TCR diese essentielle Steuerungsfunktion zwischen Reifung und apoptotischem Zelltod zukommt.28-29,60,67-71 Im pTα -/- „knock out“ Modell wurde insbesondere die essentielle Rolle der pTα Kette für die T-Zellentwicklung deutlich.20,28-29 Im Vergleich zum normalen Thymus ist in diesem Modell die Thymozytenzellularität um 90%-99%
reduziert, einhergehend mit einem Fehlen von DN4-, DP- und SP- sowie Akkumulation von DN2 Thymozyten. Nicht nur die Quantität der Thymozyten, auch die Qualität ist bei Abwesenheit der pTα Kette beeinflusst. Die allelische Exklusion des TCRβ Locus als auch die Isotypenexklusion der TCRγ/δ Loci ist direkt von der Expression der pTα Kette abhängig.70-72 Ebenso scheint die Initiation des „rearrangement“ des TCRα Locus in Anwesenheit von pTα effizienter.71,73 Somit ist pTα auch Lenker des „lineage commitment“, also der Entwicklungsentscheidung zwischen der TCRα/β+ und TCRγ/δ+ T-Zellreihe.52 Darüber hinaus ist pTα direkt über seinen zytoplasmatischen Anteil an der Initiierung proliferativer und apoptoseprotektiver Signale beteiligt.41,60,74-75,200 PTα ist somit essentieller Bestandteil des prä-TCR, der als molekularer Sensor der Zelle das erfolgreiche TCRβ
„rearrangement“ signalisiert und sowohl indirekt als Bestandteil des prä-TCR als auch direkt mit seiner zytoplasmatischen Region entscheidende Signale zum Überleben der β-Selektion liefert. Prä- und postselektionierte Zellen erreichen mittels prä-TCR, bzw. pTα-Expression einen Selektions- vorteil. Dabei scheinen die zellulären Folgen der pTα-Expression nicht primär durch besondere Eigenschaften der reifenden Zelle determiniert zu sein, sondern vielmehr durch einen instruktiven Mechanismus, induziert durch den ligandenunabhängigen prä-TCR bzw. durch die pTα Kette.27,50,60,76
PTα ist ein Transmembranprotein mit hoher Homologie zwischen murinem und humanem System.28,77-80 Die extrazelluläre Domäne gleicht der konstanten Domäne der Immunglobulin-Familie mit zwei Cysteinen für intramolekulare Disulfidbrückenbildung. Ebenso wie die TCRα- und TCRδ Kette besitzt pTα Bereiche mit basischen Aminosäuren, die der Assoziation mit dem CD3 Komplex dienen (s. Abb. 3). Apikal der transmembranären Region befindet sich ein weiteres Cystein zwecks intermolekularer Disulfidbrückenbindung mit der TCRβ Kette, die im Vergleich der Disulfidbürcken- bindung von TCRα mit TCRβ eher instabil ist.46 Vom pTα Locus werden im humanen als auch im murinen zwei Transkripte geschrieben.78 Dabei handelt es sich um den pTα Wildtyp und die trunkierte kürzere Splicingvariante bei dem das Exon 2, welches die extrazelluläre Domäne kodiert,
EINLEITUNG
alternativ „gespliced“ ist. Beide Isoformen werden maßgeblich während der thymischen T-Zellent- wicklung exprimiert (s. Abb.2 u. 6.3).36,78,81-83 Nach der Translation bleibt pTα hauptsächlich, aufgrund eines vom zytoplasmatischem Anteil ausgehenden Retentionssignales im Bereich des endoplasmatischen Retikulums (ER) lokalisiert.84 Der Anteil des pTα Proteins, der weiter Richtung Membran wandert, formiert in sogenannten GEM Bereichen („glycolipid enriched region“) der Mem- bran, an denen sich auch Signalkomponenten formieren, zusammen mit der TCRβ Kette und dem CD3 Komplex den prä-TCR (s. Abb. 3).85 Im prä-TCR ist die pTα Kette essentiell für die Stabilität und vermutlich auch limitierender Faktor bei der Formierung des prä-TCR.85-87 Unklarheit herrscht gegenwärtig, ob der prä-TCR intrazellulär zur Formation kommt oder auch schon hier funktionell aktiv ist. Allerdings scheint eine Signalinitiation ab Verlassen des trans-Golgi-Netzwerkes möglich.88 Die Expression wird unter anderem durch das Protoonkogen c-cbl-Ubiquitin-Ligase reguliert, das zu einer proteosomale Degradation von pTα führt, in Rückkoppelung mit Tyrosinkinasen des proximalen Signalweges (s. Abb. 3).89 Proteosomale Degradation als auch ER-Retentionssignal scheinen eine im Vergleich mit dem TCRα/β 50-100 mal geringere Oberflächenexpression von pTα zu begründen.46
Der vom prä-TCR aktivierte Signalweg ist komplex und bisher nur ansatzweise verstanden. Nach einem gemeinsamen juxtamembranären Signalweg, maßgeblich über die Proteintyrosinkinase (PTK) p56Lck vermittelt, kommt es weiter abwärts zu einer Verzweigung unterschiedlicher Signalwege mit verschiedenen Effekten (s. Abb. 3).27,89
Die vom prä-TCR involvierten Signalmoleküle gleichen denen des antigenaktivierten TCRα/β- Signalweges, mit dem entscheidenden Unterschied, daß der prä-TCR ein konstitutiv aktives, ligan- denunabhängiges Signal initiiert.76,88 Zwischen dem prä-TCR und dem TCRα/β Komplex bestehen
Abb. 3: Schematische Darstellung des prä-TCR -Signalweges (modifiziert n.
Michie u. Zungia-Pflucker 46)
In GEM Bereichen der Zellmembran (hell- blau) kommt es zur Formation des prä-TCR.
Der prä-TCR vermittelt ein ligandenunab- hängiges Signal, was über die zytoplas- matischen Anteile von pTα bzw. dem CD3 Komplex zur Autophosphorylierung der src- Proteintyrosinkinasen (PTK), v.a. von p56Lck führt und damit aktiviert. Es folgt eine Rekrutierung und Aktivierung von ZAP 70/Syk an den Rezeptorkomplex gefolgt von Phosphorylierung und Rekrutierung von
„downstream“ Substraten (LAT,SLP-76), die im Folgenden weitere Signalkaskaden
initiieren. Über Roh, Ras, PLCγ1 und Rac werden weitere Signalwege initiiert. Letztlich werden über Effektoren wie NFAT, NFκB, c-jun- und fos-Gene Apoptose, Proliferation und Differenzierung geregelt. Als Inhibitoren des prä-TCR-Signals fungieren Csk und das Protoonkogen c-cbl. Die Rolle von p53 und FADD („Fas activated death domain“) wird diskutiert . 20,27,46,60,63,87
c-cbl
Csk
p53 FADD
p56Lck
Zap70/Syk
Vav LAT
Grb SLP-76
Sos
Roh RAS PLCγ1 RAC
Apoptose Proliferation Differenzierung allelische Exklusion VDJ
rearrangement prä-TCR pTαTCRβ
ε δ γ ε ς ς CD3 Komplex
Ähnlichkeiten zwischen Struktur und biologischem Resultat. Beide induzieren Proliferation und Apoptoseschutz, wobei der prä-TCR ligandenunabhängig Differenzierung und der TCRα/β liganden- abhängig Effektorfunktion induziert.46 Im Vergleich zwischen prä-TCR und TCRα/β wird die besondere Rolle der frühen α Kette (pTα) im Vergleich zur reifen TCRα Kette offensichtlich. Die TCRα Kette hat eine kurze zytoplasmatische Region und das Signal des TCRα/β ist auf mehrere Komponenten des CD3 Komplexes essentiell angewiesen. Hingegen hat pTα eine lange zytoplasma- tische Region mit Signalinitiierungsrolle und bedarf zur Funktionalität im Wesentlichen nur die ε- und γ Ketten des CD3 Komplexes.30,54,88,90-95 Zusammenfassend ist die pTα Kette für die Initiierung der β-selektionsassoziierten Proliferation, Differenzierung und Apoptoseprotektion von übergeordnet- er Bedeutung.60,50
1.4 Die frühe T-Zellreifung und der prä-TCR im Kontext der malignen Transformation Die Pathogenese der T-ALL ist bisher weitestgehend unklar. Vielfach wird eine aberrante Genex- pression als Folge eines genetischen Defektes ursächlich für die maligne Transformation beschrie- ben.11,96 Viele aberrante Genprodukte, die im Zusammenhang mit der T-ALL gefunden wurden, sind aus der pyhsiologischen T-Zellentwicklung bekannt. So ist z.B. der Notch1 Signalweg, der essentiell an der Entscheidung zur T-Zell-Liniendifferenzierung bei frühen HLSC beteiligt ist, durch eine Translokation (TAN-1), oder bestimmte Mutationen an der malignen Transformation einiger T-ALL Entitäten beteiligt.98-101 Ebenso ist die aberrante Aktivierung von SCL („steam cell leukemia“) in kindlichen T-ALL ein häufiges Phänomen. Dieser ist unter physiologischen Bedingungen essentiell an der Regulation der thymischen T-Zellentwicklung sowie der Generierung der hämatopoetischen Linie beteiligt. 102-104 Somit wird oftmals als einer der möglichen Transformationsmechanismen die Dysregulierung von physiologischen Entwicklungsschritten betrachtet, wodurch eine lymphatische Vorläuferzelle zu entsprechenden Reifungszeitpunkten arretiert und gleichzeitig massiv expandiert.
Die Entwicklungsarretierung der transformierten Zellen erklärt die immunphänotypische Ähnlich- keit reifender Zellen zu maligne transformierten Zellen.11,15,96
Im Hinblick auf pTα finden sich bereits 1996 erste Hinweise auf ein mögliches onkogenes Potential des prä-TCR in transgenen Mäusen.105 Mit einer Latenzzeit von ca. 200 Tagen entwickel- ten transgene Mäuse mit mutierten variablen Domänen der TCRβ Kette T-Zell-Lymphome. Die ma- lignen Zellen zeigten einen Reifungsarrest im doppelt positiven Kompartiment. Die Inzidenz der Lymphome zeigte eine gewisse Abhängigkeit von der quantitativen Expression der mutierten TCRβ Kette innerhalb des prä-TCR Komplexes, wobei der Großteil des prä-TCR nicht an der Zelloberfläche exprimiert wurde.105 In einem anderen transgenen Modell, mit leicht vermehrter pTα-Expression im Vergleich zur physiologischen T-Zellreifung, wurde ein erhöhter proliferativer Anteil an DN3 Zellen sowie eine beschleunigter Übergang von DN3 zu DN4 Thymozyten mit erhöhter Apoptoseresistenz gefunden.106 Ebenso finden sich in der Literatur Hinweise auf onkogenes Potential von Signalkompo-
EINLEITUNG
nenten prä-TCR-Signalweges. Mäuse mit einem konstitutiv aktiven p56Lck (s. Abb. 3) entwickeln sechs Wochen post partum fulminante lymphoide thymische Tumore, genauso wie transgene CD45-/- Mäuse mit konstitutiv aktivem p56Lck.107-108 Auch sind Mutationen der c-Cbl-Ligase, welche an der Runterregulation von pTα beteiligt ist (s. Abb. 3), bei T-Zell-Lymphomen zu finden.109 Das Protoonkogen p53 ist während der β-Selektion Gegenspieler des pTα-Signals im Hinblick auf die Entscheidung über den Eintritt in die Zellproliferationsphase. 63-64 P53 Verlust ist ein bekanntes Phänomen bei Leukämien, was eine mögliche Rolle von pTα unterstreichen könnte.110-111 Interessant ist darüber hinaus erneut die Beziehung zum Entwicklungsgen Notch, welches häufig in der T-ALL mutiert ist. 99-101, 112 Der Notch Rezeptor führt in Kombination mit seinem Liganden Deltex-1 zu einer Zellstoffwechselaktivierung der Zelle, was eine wichtige Grundlage der starken prä-TCR vermittelten Proliferation während der β-Selektion darstellt.112 Gleichzeitig scheint von Notch eine Suppression der p53 Aktivität auszugehen.113 Ebenso induziert ein transgenes pTα in reifen T-Zellen vermehrte Apoptoseresistenz.75 Auch auf Transkriptionsebene gibt es Hinweise, die eine Rolle einer dysregu- lierten β-Selektion bei der Leukämogenese unterstreichen. So führt eine Überexpression von c-myb, einem Transkriptionsfaktor, der die β-Selektion mitreguliert, zu lymphoiden Neoplasien.114-117 Bellavia et al. konnten eine direkte Beteiligung von pTα an der Lymphomgenese in Notch3+/+
transgenen Mäusen zeigen.96, 118-119 Diese Arbeitsgruppe konnte ebenso wie Asanfi et al. in humanen T-ALL die RNA-Expression von pTα nachweisen.15,74
1.5 Fragestellung
In der T-Zellentwicklung nimmt der frühe T-Zell-Rezeptor prä-TCR eine bedeutende Schlüsselstel- lung ein, indem er Zellproliferation, Differenzierung und Apoptoseprotektion vermittelt. Gegenstand aktueller Forschung ist die Analyse seiner möglichen Relevanz für die Entstehung von T-Zell- Neoplasien. Dabei ist zum jetzigen Zeitpunkt unklar, ob es sich im Humansystem lediglich um eine aberrante Expression des Rezeptors handelt oder der prä-TCR eine funktionelle Rolle in lympha- tischen Leukämien einnimmt. In dieser Dissertationsarbeit wurden folgende Fragestellungen experimentellbearbeitet:
1) Unterscheiden sich T-ALL-Subtypen im pTα-Expressionsprofil bzw. wie stellt sich die pTα- Expression in Abhängigkeit des Immunphänotyps im Vergleich zur physiologischen T-Zell- entwicklung dar?
2) Handelt es sich bei pTα bzw. der Splicingvariante um einen pathognomonischen Marker der T- ALL?
3) Liegt eine funktionelle Relevanz des frühen T-Zell-Signalweges in T-Zell-Neoplasien vor?
Anhand der hier gewonnenen Daten soll eine Unterscheidung zwischen neoplastischem Epiphänomen und funktioneller Relevanz des frühen T-Zell-Signalweges ermöglicht werden. Die Bedeutung des frühen T-Zell-Signalweges soll u.a. im Hinblick auf die auf eine klinische Verwertbarkeit als Zielstruktur neuer Therapieansätze diskutiert werden.
2 MATERIAL UND METHODEN
2.1 Probenmaterial 2.1.1 Zelllinien
Humane Zelllinien (s. Tab. 1) wurden freundlicherweise vom DSMZ in Braunschweig, sowie der Abteilung Hämatologie, Hämostaseologie und Onkologie und der Abteilung Gastroenterologie, Hepa- tologie und Endokrinologie der MHH zur Verfügung gestellt. Murine Zelllinien (s. Tab. 2) stammen von Herrn Prof. Dr. von Boehmer (Dana-Faber-Cancer Institute, Harvard Medical School, Boston, MA, USA), sowie von Herrn Prof. Dr. Buer (GBF, Braunschweig). Die Klassifizierung der T-ALL erfolgte in Anlehnung an die EGIL-Kriterien (s. 6.1 u. 6.2).120 Aufgrund der geringen Probenanzahl werden pre- und pro-T-ALL zur Gruppe der unreifen T-ALL zusammengefasst.
Zelllinien Klassifikation Be13 1, 3 thymische T-ALL CCRF-CEM 1, 3 thymische T-ALL Hsb-2 1, 3 unreife T-ALL Jurkat 1, 3 thymische T-ALL Karpas-45 1, 3 unreife T-ALL Karpas-299 1, 3 CD30+ großzelliges
anaplstisches Lymphom KE-37 1, 3 thymische T-ALL LOUCY 1, 3 reife γ/δ+ T-ALL MOLT-4 1, 3 thymische T-ALL MOLT-14 1, 3 reife γ/δ+ T-ALL MOLT-16 1, 3 reife α/β+ T-ALL P12/Ichikawa 1, 3 thymische T-ALL PEER 1, 3 reife γ/δ+ T- ALL PF-382 1, 3 thymische+ T- ALL RPMI 8402 1, 3 unreife T-ALL SUB-T1 1, 3 T-lymphoblastisches
Lymphom (thymischer Immunphänotyp) HL-60 1, 3 AML FAB M2 Kasumi-1 1, 3 AML FAB M2
KG1 1, 3 AML
U-937 1, 3 AML
MN-60 1, 2, 3 B-ALL FAB L3 Tanoue 1, 2 B-ALL FAB L2
AGS 1,2,4 Adenokarzinom
Das bereits etablierte transgene murine Zellsystem wird zur Überprüfung der Funktionalität des prä- TCR verwendet. Dieses stammt von der Zelllinie SCIET.27 ab.85,122 Hierbei handelt es sich um eine Thymom-Zelllinie, etabliert aus einer RAG-/- x SCID Maus. Aufgrund des „knock out“ des
„recombination activating“ Genes („RAG“) findet kein „rearrangement“ des TCRβ Locus statt,
Zelllinie Beschreibung
SCB.29 1,2 TCRβ V8.2J2.3 transgene SCIET.27 Zellen (transgen wird unter Selektions- zusatz G418 exprimiert)
SCIET.28γδ 1,2 TCRγ/δ transgene SCIET.27 Zellen (transgen wird unter Selektionszusatz G418 exprimiert)
Tab. 1: Verzeichnis der verwendeten humanen Zelllinien
Zu Grunde liegende immunphänotypische Angaben stammen vom DMSZ und dem „Leukemia-Lymphoma-Cell-Line - Fact Book“.121 Indices: (1) Kultiviert in 10 % FCS RPMI-1640 (s. 2.2.1); (2) Kultiviert in 20 % FCS RPMI-1640 (s.2.2.1); (3) Suspensionszellen;
(4) Adhärente Zellen.
Tab. 2: Verzeichnis der verwendeten murinen Zelllinien 85, 122 Indices: (1) Kultiviert in 10 % FCS DMEM + Glutamax+ 2-ME (s.
2.2.1 ; (2) Zusatz von G418 (s. 2.2.1)
woraus eine TCRβ Ketten-defiziente und somit auch prä-TCR-defiziente, vor der β-Selektion arretierte Zelllinie resultiert. Nach Transfektion dieser Zell-Linie mit TCRβV8.2J2.3 resultiert die Zelllinie SCB.29, welche unter G418 Selektionsdruck das Transgen exprimiert und so Funktionsana- lysen des pTα/prä-TCR-Signals ermöglicht. Transduktion der SCIET.27 Zelllinie mit dem TCRγ/δ führt zu der Zelllinie SCIET.28γ/δ mit funktionellem TCRγ/δ Rezeptor.85,122
2.1.2 Patienten und gesunde Spender
Die untersuchten anonymisierten Patientenproben wurden von Frau Dr. B. Hoechstmann (Abteilung Hämatologie und Onkologie, Universität Ulm) zur Verfügung gestellt (s. Tab. 3). Bei den kryokon- servierten Proben handelt es sich um mononukleäre Zellen (MNC) aus peripherem Blut (pB, P1-12) und Knochenmark (KM, K1-4). Bis auf Probe P6 und P12 erfolgte die Entnahme zum Zeitpunkt der Erstdiagnose (ED) einer Leukämie. Die uns vorliegende Einteilung der T-ALL-Patientenproben unterteilt die T-ALL lediglich in unreife und reife T-ALL.
Tab. 3: Verzeichnis der untersuchten Patientenproben. Legende: (WBC) absolute Leukozytenzahl; (LDH) Serum Laktat-Dehydrogenase;
(ED) Erstdiagnose; (CR) Komplette Remission; (Ph. neg./pos.) Philadelphia-Chromosom negativ/ positiv; (RZ) Rezidiv; (SR) Standard- Risiko; (HR) Hoch-Risiko.
Probe Patientendaten Klinik Klassifikation K1 KM, 21. J., männlich WBC: 108000/µl; LDH: 603 U/l; ED 4.7.88; 1.CR 9.8.88 unreife T-ALL K2 KM, 16. J., weiblich Ph. neg.; SR; WBC: 3100/µl; LDH: 215 U/l; ED 20.8.93;1.CR 01.10.93; unreife T-ALL K3 KM, 19. J., männlich WBC: 10600/µl; LDH: 135U/l; ED 03.7.87; 1.CR 24.8.87, 1.RZ 15.1.91;
Exitus letales im Rezidiv 30.11.91
reife T-ALL K4 KM, 18. J., männlich Ph. neg.; HR; WBC: 35700/µl; LDH: 1805 U/l; ED 24.6.93; 1.CR 28.7.93;
Exitus letales in Aplasie 25.9.93
reife T-ALL P1 pB, 38. J., männlich WBC: 42000/µl; LDH: 694 U/l; ED 30.04.92; 1.CR 03.11.92; 1.RZ
28.05.93; Exitus letales im Rezidiv 08.11.93;
unreife T-ALL P2 pB, 43. J., männlich Ph. pos; WBC: 47000/µl; ED 08.04.86; CR 23.05.86; 1.RZ: 16.08.87;
Exitus letales im Rezidiv 16.08.87
reife T-ALL P3 pB, 38. J., männlich WBC: 27000/µl; SR; LDH: 428 U/l; ED 11.04.89; 1.CR 18.05.89;
1.RZ:17.10.89; 2.CR: 19.01.90
reife T-ALL P4 pB, 18. J., männlich WBC: 367000/µl; LDH: 7770 U/l; ED 05.07.90; 1.CR 06.08.90; Exitus
letales in Aplasie 15.09.90
reife T-ALL P5 pB, 24. J., männlich WBC 84200/µl; ED 14.5.86; 1.CR 11.6.86, 1.RZ 21.09.88; Exitus letales
im Rezidiv 02.04.88
reife T-ALL P6 pB, 18. J., männlich Ph. pos.; HR; WBC: 242700/µl; ED 22.06.95; 1.CR 07.08.95; T- ALL vor
Reininduktion
reife T-ALL P7 pB, 17. J., männlich Ph. neg.; HR; WBC: 47000/µl; LDH: 2084 U/l; ED 11.09.95; 1.CR
30.09.95
reife T-ALL
P8 pB, 60. J. ---- pro B-ALL
P9 pB, 40. J., männlich Ph. neg.; SR; WBC: 18.000/µl; LDH: 1930 U/l; ED 24.07.95;
Therapierefraktär und Exitus letalis23.04.96;
prä B-ALL
P10 pB, 32. J., männlich ---- AUL
P11 pB, 28. J., weiblich ---- AML
P12 pB, 56. J., männlich ---- Regenerations-
kontrolle, AML
Probe Spenderdaten Probe Spenderdaten Probe Spenderdaten P1 pB, 22 J., weiblich P2 pB, 21 J., männlich P3 pB, 21 J., männlich P4 pB, 25 J., männlich P5 pB, 22 J., männlich P6 pB, 21 J., männlich P7 pB, 21 J., weiblich P8 pB, 24 J., männlich P9 pB, 33 J., weiblich P10 pB, 23 J., männlich KM1 KM, 30 J., männlich KM2 KM, 31 J., männlich KM3 KM, 31 J., weiblich
Tab. 4: Verzeichnis der unter- suchten gesunden Spender
Als Kontrollen wurden MNC aus heparinisiertem pB (P1-10; n=10) und KM-Aspiraten (KM1-3; n=
3) gesunder Spender herangezogen (s. Tab. 4).
2.2 Zellbiologische Methoden
2.2.1 Kulturbedingungen, Einfrieren und Auftauen von Zellen
Rz: 0.5% Trypan Blau (Biochrom KG, Deutschland)
1 x Trypsin-EDTA in HBSS, ohne Ca2+ u. Mg2+ (Gibco, Deutschland) 2-Mercaptoethanol, 2 mM (Sigma-Aldrich Chemie, Deutschland) DMEM kompl. Medium mit Glutamax (Gibco)
DMSO, Dimethylsulfid (Merk, Deutschland)
FCS, Fötales Kälber Serum, (Seromed, Deutschland); Komplementinaktivierung: 56°C, 45 min G418, 0.6 mg/ml in PBS (Amersham Bioscience, Deutschland)
Isopropanol, 99% (Sigma-Aldrich Chemie)
PBS, „Dulbecco´s phosphate buffered saline“, Ca2+ und Mg2+frei (Gibco) Penicillin/ Streptomycin, 5 mg/ml (Gibco)
RPMI 1640 Medium (Gibco, Schottland)
Die Zellkultur erfolgt unter semisterilen Bedingungen (HERA-Flow, Deutschland). Geräte, Medien und Puffer, die mit Zellen in direkte Berührung kommen, werden bei 180°C hitzesterilisiert, autokla- viert oder sterilfiltriert (Milivex, PVDF, 0.45mm, Irland). Die Zellkultivierung erfolgt in einem Inku- bator bei 5% CO2 und 37°C (HERACell, Deutschland) in Zellmedium (s. Tab. 1 u. 2) unter Zusatz von FCS und Streptomycin/Penicillin in 25 ml oder 50 ml Zellkulturflaschen (NUNC, Nuncolon Surface, Dänemark). Medium für murine Zellen wird mit 1:100 verdünntem 2-Mercaptoethanol (2- ME) bzw. mit dem Selektionszusatz G418 supplementiert (s. Tab. 2). Ein Mediumwechsel erfolgt je nach Wachstumsgeschwindigkeit etwa alle 3 Tage nach vorheriger Zentrifugation (5 min 300 x g).
Adhärente Zelllinien werden zusätzlich mittels Trypsinierung (2 ml EDTA-Trypsin, 37°C, 2 min) aus den Zellkulturflaschen gelöst. Zur Kryokonservierung werden Zellen geerntet, bei 300 x g 10 min zentrifugiert, 1x mit PBS gewaschen, um anschließend ca. 1-2 x 107 Zellen in 1ml Medium 1:1 mit RPMI1640 (20% FKS und 20% DMSO) gemischt, resuspendiert und in Kryoröhrchen (Cryo Tube Vials, NUNC, Dänemark) überführt zu werden. Eine Dauerlagerung erfolgt in Flüssigstickstofftanks (-173°C). Zum Auftauen werden Zellen in einem Wasserbad (37°C) geschwenkt und nach zwei- maligem waschen mit Zellkulturmedium in Kultur gebracht. Eine Zellzahl- und Vitalitätsbestim- mung erfolgt mittels Hämozytometer (Neubauer, 0.1mm, Assistent, Deutschland) und Avitalitäts- farbstoff Trypanblau unter einem Durchlichtmikroskop (Olympus, CK40, Japan).
2.2.2 Isolierung von PBMC
Rz: Ficoll-Separationslösung, Dichte 1.077 g/ml (Biochrom KG) PBS, „Dulbecco´s phosphate buffered saline“, Ca2+ und Mg2+frei (Gibco)
MNC werden aus pB mittels Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation gewonnen. Grundlage der Separa- tion bildet der Dichteunterschied von Leukozyten gegenüber anderen Blutbestandteilen. 20 ml
heparinisiertes pB werden mit 15 ml PBS gemischt, anschließend auf 15 ml Ficoll-Lösung in 50 ml konischen PP-Röhrchen (Greiner, Labortechnik, Deutschland) aufgeschichtet und bei 800 x g bei Raumtemperatur (Rt) für 20 min zentrifugiert. In der Mitte bildet sich eine leukozyten- und thrombo- zytenreiche Grenzschicht, oberhalb derer sich das Plasma, unterhalb derer sich aggregierte Granulo- zyten und Erythrozyten sammeln. Zwecks Eliminierung der Thrombozyten wird der weiße, leuko- zytenreiche Mittelsaum in ein frisches konisches Röhrchen überführt, mit PBS gewaschen und erneut für 20 min bei 800 x g zentrifugiert. Das Leukozytenpellet wird erneut mit PBS gewaschen und 10 min bei 250 x g zentrifugiert.
2.3 Molekularbiologische Methoden 2.3.1 Agarosegelelektrophorese
Rz: Bromphenolblau, BpB, 10% (Sigma-Aldrich Chemie) Borat (Sigma-Aldrich Chemie)
EDTA, Ethylenediamintetraacetat, (Sigma-Aldrich Chemie) Ethidiumbromid, 10 mg/ml (Sigma-Aldrich Chemie) Invitrogene 50 bp DNA-Marker (Invitrogene, Deutschland) Metaphore Agarose (Biozym, Deutschland)
Roche DNA MWM-1350 bp-DNA (Roche Diagnostics, GmBH, Deutschland) Sucrose (Sigma-Aldrich Chemie)
TriZma, Tris[hydroxymethyl]aminomethan (Sigma-Aldrich Chemie)
10 x TBE-Puffer: 89 mM Tris, 89 mM Borat, 2 mM EDTA, pH=8.3, Lagerung: Rt 5 x Ladepuffer (LP): Sucrose 11 g, 0.1 M EDTA, 1:40 10% BpB, Lagerung: 4°C
Die Agarosematrix bildet ein lineares Polymer, welches in Kombination mit einer Elektrophorese eine Separation von DNA-Fragmenten unterschiedlicher Größe (0.5- 2.5 Kb) ermöglicht. Im elek- trischen Feld bewegen sich DNA-Moleküle aufgrund ihrer negativen Phosphatreste durch die Matrix in Anodenrichtung mit einer Geschwindigkeit, die dem Logarithmus der Größe umgekehrt proportio- nal ist. DNA-Fragmente werden mittels Interkalator Ethidiumbromid (EtBr) und UV-Licht visuali- siert. Entsprechend der Größe des erwarteten DNA-Fragments werden 1.5-2.5 % Agarose in TBE (1x) zum Sieden gebracht, worin anschließend 1.5 µl/100 ml EtBr gelöst werden. Die zum Elektro- phoresepuffer (1xTBE) isodense Probe wird mit 5 x LP gemischt und in die Geltaschen des polymerisierten Gels geschichtet. Der Gelgröße entsprechend wird an die Gelkammer (Agargel midi- wide, Biometra, Deutschland) eine konstante Feldstärke angelegt (Standard Power Pack P25, Biometra). Nach Größenseparation erfolgt die Visualisierung auf einem UV-Illuminator (Trans- illuminator TI 4, Biometra) mit anschließender Dokumentation (CRT instant Kamera, TA40, ORMAF, Italien).
2.3.2 Photometrische Messung von RNA und cDNA
Rz: DEPC, Diethylpyrocarbonat (Sigma-Aldrich Chemie)
Tris-EDTA (TE)-Lösung.: 2 M TriZam (pH=7.4), 0.5 M EDTA (pH=8.0), Lagerung: 4°C DEPC-Lösung.: 0.5 ml DEPC dH2O ad 500 ml, 20 min Autoklavierung, Lagerung: 4°C
Die Konzentration von RNA bzw. cDNA wird photometrisch (BioPhoto 1631, Eppendorf, Deutsch- land) über eine OD-Messung bei 260 nm bestimmt. Hierzu wird RNA mit DEPC-Lösung und cDNA mit TE-Lösung 1:50 verdünnt. Zur Überprüfung der Reinheit der Probe wird bei RNA-Messungen der Quotient OD260/OD280 bestimmt.
2.3.3 Gewinnung zellulärer RNA
Rz: TRIzol R (Gibco)
Chlorofom (Sigma-Aldrich Chemie) Ethanol (EtOH), 70% (Sigma-Aldrich Chemie) Isopropanol, 99.9% (Sigma-Aldrich Chemie) DEPC-Lösung (s. 2.3.2)
Zelluläre RNA wird mittels TRIzol, einer modifizierten Guanidin-Isothiocyanat-Phenol-Chloroform- RNA-Extraktion, gewonnen.123 In einer monophasischen Phenol/Guanidin-Lösung werden Zellen de- naturiert, die im Folgenden eine organische Phase bilden, in der sich zelluläre Proteine lösen; in der sich bildenden wässrigen Phase löst sich die RNA, die über Isopropanol präzipitiert wird. Die Thio- zyanatverbindung schützt die RNA durch RNAsen Inaktivation. 5x106 - 1x107 pelletierte Zellen werden in 1ml TRIzol resuspendiert, 15 min (Rt) inkubiert, anschließend kryokonserviert (-80°C) oder direkt weiterbearbeitet. Nach Mischung mit 200 µl Chloroform und 15 min Zentrifugation bei 15000 x g (4°C) resultiert eine Phasengrenze. Die obere, wässrige RNA-haltige Phase wird in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen überführt und mit 500 µl Isopropanol gemischt. Zwecks RNA- Präzipitation erfolgt eine Inkubation über 10 min (Rt) und erneute Zentrifugation bei 15000 x g (4°C).
Das sichtbare RNA-Pellet wird nach Verwerfen des Überstandes mit 200 µl EtOH (70%) gewaschen und 5 min bei 12000 x g (Rt) zentrifugiert. Nach erneutem Verwerfen des Überstandes wird das Pellet ca. 20 min (37°C) getrocknet (Thermomixer Compact, Eppendorf). Anschließend folgt eine Resus- pension in 50 µl DEPC-Lösung (56°C). Vor Lagerung (-80 °C) wird die RNA-Konzentration photo- metrisch bestimmt (s. 2.3.2).
2.3.4 Reverse Transkription (RT) mit Verdau genomischer DNA
Rz: DNAse 10 x Puffer: 200mM Tris HCl, pH= 8.4, 500 mM KCl, 20 mM MgCl2 (Gibco) DNAse I, 1 U (Gibco)
EDTA, 25 mM (Gibco) 5 x „First Strand buffer” (Gibco)
100 mM dNTP Set, „PCR grade”, 25 mM (Gibco) DTT, Dithioreitol, 0.1 M (Gibco)
RNAse Block Ribonuklease Inhibitor, 40 U/µl, 26000 U (Stratagene, USA) BSA, RNAse, DNAse frei, 2.5 mg/ml (Amersham Pharmacia Biotech, Deutschland) Pd(N)6 primer, Random Primer, 0.18 µg/µl (Amersham Pharmacia Biotech)
M-MLV Reverse Transkriptase, 200 Units/µl (Gibco)
Nach vorherigem Verdau genomischer DNA (s. Protokoll 1) erfolgt eine RT mit der präparierten RNA (s. Protokoll 2).
Reagenz Volumen/ Reaktionsschritt
DNAse I 1 µl
DNAse I Puffer 1 µl
RNA + entsprechendes Volumen für 1.5 µg RNA DEPC H2O + ad 10 µl
⇒ 15 min Inkubation bei Raumtemperatur (Rt) EDTA [25 mM] + 1 µl
⇒ 10 min Inkubation (64°C) zur DNAse I Inaktivierung
Mittels einer stabileren Kopie der RNA, der so genannten cDNA („complementary DNA“), herge- stellt durch die RNA abhängige DNA M-MLV-Reverse-Transkriptase (s. Protokoll 2), kann eine PCR-Anylase der RNA-Expression erfolgen.
Reagenz Volumen/ Reaktionsschritt Genomisch verdaute RNA 9 µl (≈1.5µg RNA)
⇒ 10 min Denaturierung bei 72°C 5 x “First Strand Buffer” +4 µl
DTT [0.1M] +2 µl
dNTP [25mM] +1 µl
BSA [2.5mg/ mL] +1 µl
RNAse Inhibitor [40U] +1 µl Random Primer [0.18µg/µl] +1 µl M-MLV Reverse Transkriptase +1 µl
∑Volumen 20 µl ⇒ 3min 72°C+1h 37°C (T-3 Cycler, Biometra, Deutschland)
2.3.5 RT-Polymerase-Ketten-Reaktion (RT-PCR)
Bei der RT-PCR wird in einem ersten Schritt eine cDNA-Matritze generiert (s. 2.3.4), die im Folgen- den mittels einer PCR amplifiziert wird. Die PCR, ein Verfahren zur Amplifizierung von Nukleinsäu- ren, setzt sich aus drei Grundschritten zusammen. Doppelstränge Nukleinsäuren werden in einem ersten Schritt denaturiert. In einem zweiten Schritt, dem sogenannten „annealing“, hybridisieren sequenzspezifische Primer bei spezifischen Temperaturen (Tm) mit den einzelsträngigen Nuklein- säuren, was letztlich die „elongation“, also die Generierung von matritzenkomplementären Strängen durch thermostabile DNA-Polymerasen ermöglicht, so daß wieder doppelsträngige Nukleotidstränge entstehen.
2.3.5.1 Auswahl der Oligonukleotid-Primer zur RT-PCR
Die hier verwendeten Oligonukleotid-Primer (s. Tab. 5 u. 6) werden nach Vorlage der publizierten cDNA-Sequenzen (NCBI-Gendatenbank) mit Hilfe der Software „Generunner“ (V. 3.05) unter Be- achtung allgemeiner Grundregeln erstellt.124-126
Primer Sequenz /Tm
pTα 1 („sense“) 5´-CTGCAGCTGGGTCCTGCCTC-´3 (65,5°C)
pTα 3 („sense“) 5´-GGCACACCCTTTCCCTTCTCT-´3 (61,8°C) pTα 4 („antisense“) 5´-CAGGTCCTGGCTGTAGAAGC-´3 (63,7°C) pTα b1 („sense“) 5´-CCTACCCACAGGAGAGGCTT-´3 (61,4°C) pTα b2 („antisense“) 5´-AGATCTTGAGCACCAGGCCT-´3 (59,4°C) p56-1 („sense“) 5´-CACTGCAAGACAACCTGGTTA´-3 (62,7°C) p56-2 („antisense“) 5´-AGATGTAGAAGCCACCACCGTTGT´-3 (63,2°C) β-Aktin 0 („sense“) 5´-GCATCGTGATGGACTCCGGTAGTTTCG-´3 (63,7°C) β
Protokoll 2: Reaktionsansatz zur Reversen Trans- kription zur Herstellung von cDNA.
Tab. 5: RT-PCR Primer zur Untersuch- ung humaner cDNA
Humane Zielgene: pTα: prä-TCRα Kette (Wildtyp und Splicingvariante), p56:
Proteintyrosinkinase p56Lck; β-Aktin: zyto- skelettales „house-keeping-gene“.
Protokoll 1: Reaktionsansatz zum DNAse I Verdau genomischer DNA.
2.3.5.2 Standardisierung und Optimierung der RT-PCR
Der Gradienten-Cycler (T-Gradientcycler, Biometra) ermöglicht den Gebrauch unterschiedlicher
„annealing“ Temperaturen in einer PCR-Reaktion und somit eine schnelle PCR-Etablierung und Optimierung. PCR-Bedingungen für unterschiedliche Primer-Paarungen (s. Tab. 7 u. 8) werden mittels Gradienten-PCR bezüglich der MgCl2 Konzentration und der „annealing“ Temperatur zwecks Erreichung höchstmöglicher Sensitivität optimiert (s. Tab. 6 und 7). Hierzu wird ein Konzen- trationsbereich von 1.5 mM MgCl2 - 4.5 mM MgCl2 in 1 mM Schritten jeweils bei 6 - 8 verschieden- en Temperaturen getestet. Im Weiteren werden die Zielgenbanden der acht unterschiedlichen Trans- kripte amplifiziert, aus dem Agarosegel aufgereinigt und anschließend die Spezifität der entsprechen- den Amplifikationsbande über Sequenzierung jeweils vom 3´- und 5´- Ende überprüft (Daten nicht gezeigt; s. 2.3.6).
PCR Name
Primer Paarung
Amplikon (Länge in bp)
MgCl 2 [mM]
PCR-Bedingung PCR p1 pTα1/ pTα4 pTα Wildtyp (438)
pTα Splicingform (118)
1.5 94°C 2′ +
40 x (94°C 45” + 64.0°C 1′ +72°C 1′20”) + 72°C 10′ PCR p2 pTα3/ pTα4 pTα wildtyp (338) 2.0 94°C 2′ +
40 x (94°C 45” + 64.0°C 1′ +72°C 1′20”) + 72°C 10′
PCR p3 pTαb1/ pTαb2 pTα Splicingform (379) 1.5 94°C 2′ +
35 x (94°C 45” + 64.5°C 1′ +72°C 1′20”) + 72°C 10′
PCR t1 p56-1/ p56-2 p56Lck (271) 1.5 94°C 2′ +
35 x (94°C 45” + 62.0°C 1′ +72°C 1′20”) + 72°C 10′
PCR b1 β-0 / β-2 β-Aktin (350) 1.6 94°C 3′ +
35 x (94°C 30” + 64.0°C 45” +72°C 1′20”)+ 72°C 10′
PCR Name
Primer Paarung
Amplikon (Länge in bp)
MgCl 2
[mM]
PCR-Bedingung PCR mp1 mpTα1/ mpTα 4 mpTα Wildtyp (315) 1.6 94°C 3′ +
35 x (94°C 30” + 63.5°C 1′ + 72°C 1′00”) + 72°C 10′
PCR mt2 mpTα b1/ mpTα b2
mpTα Splicingform (273)
1.6 94°C 3′ +
35 x (94°C 30” + 64.5°C 45”+72°C 1′20”) + 72°C 10′
PCR mr1 RSP-9a/ RSP-9s RSP-9 (143) 1.5 94°C 3′ +
35 x (94°C 45” + 63.5°C 1′ +72°C 1′20”) + 72°C 10′
Variationen der RNA-Isolation und die Variabilität der RT-Effizienz machen die Kontrolle der RNA- bzw. cDNA-Qualität mittels „house-keeping-gene“ nötig. Im humanen System wird die Zytoskelett-
Primer Sequenz /Tm
mpTα 1 („sense“) 5´-TAGGACATGGCTGCTGCTG-´3 (58,8°C) mpTα 4 („antisense“) 5´-GCTCCTGGCTGTCGAAGATT-´3 (59,4°C) mpTα b1 („sense“) 5´-CTACCATCAGGGGAATCTTCG-´3 (59,8°C) mpTα b2 („antisense“) 5´-GGCTCAGAGGGGTGGGTAA-´3 (61,0°C) RSP9 („sense“) 5´-CTGGACGAAGGGCAAGATGAAGC-´3 (61,8°C) RSP9 („antisense“) 5´-TGACGTTGGCGGATGAGCACA-´3 (64,0°C)
Tab. 8: Etablierte RT-PCR zum Nachweis muriner Transkripte
Dargestellt sind Primer-Paarungen und etablierte Reaktionsbedingungen zur Amplifikation folgender muriner Transkripte: PCR mp1:
Wildtyp Variante der prä-TCRα Kette, PCR mp2:Splicingvariante der prä-TCRα Kette, PCR mr1:Amplifikation des „house-keeping-genes“
RSP 9 (ribosomales Protein - S90 Untereinheit).
Tab. 7: Etablierte RT-PCR zum Nachweis humaner Transkripte
Dargestellt sind Primer-Paarungen und etablierte Reaktionsbedingungen zur Amplifikation folgender humanen Transkripte: PCR p1:
Wildtyp und Splicingvariante der prä-TCRα Kette, PCR p2: Wildtyp der prä-TCRα Kette (semi-nested-PCR in Kombination mit PCR p1), PCR p3: Splicingvariante der prä-TCRα Kette, PCR t1: Proteintyrosinkinase p56Lck der src-Familie, PCR b1:Amplifikation des „house- keeping-genes“ β-Aktin.
Tab. 6: RT-PCR Primer zur Untersuchung muriner cDNA
Murine Zielgene: pTα: prä-TCRα Kette (Wildtyp und Splicingvariante), RSP-9:
ribosmales „hous-keeping-gen“.53, 122 ,127
