Aus der Medizinischen Klinik mit Schwerpunkt Hämatologie, Onkologie
und Tumorimmunologie, Campus Virchow-Klinikum der
Medizinischen Fakultät Charité – Universitätsmedizin Berlin
DISSERTATION
Expression und klinische Bedeutung von
Apoptose-Proteinen bei akuten myeloischen Leukämien des
Kindes- und Erwachsenenalters
zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)
vorgelegt der Medizinischen Fakultät
Charité – Universitätsmedizin Berlin
von
Stephan Richter
aus Elsterwerda
INHALTSVERZEICHNIS
I Abstrakt deutsch))))))))))).)))))))))))))))...2
II Abstrakt englisch ))))))))))))).))))))))))))...4
1 EINLEITUNG ... 6
1.1 Einführung in das Thema ... 6
1.2 Akute myeloische Leukämie (AML) ... 7
1.3 Apoptose ... 18
2 MATERIAL UND METHODEN ... 30
2.1 Durchflußzytometrie ... 30
2.2 Immunoblot ... 35
2.3 Klinische, morphologische und zytogenetische Daten - Statistische Analysen ... 45
3 ERGEBNISSE ... 48
3.1 Apoptose ... 48
3.2 Gegenüberstellung: Kinder – Erwachsene ... 59
4 DISKUSSION ... 63
4.1 Apoptoseassoziierte Proteine bei der AML des Erwachsenalters ... 63
4.2 Apoptoseassoziierte Proteine bei der AML des Kindesalters ... 66
4.3 Vergleich der Daten bei der AML des Kindes-und Erwachenalters ... 69
4.4 Methodische Einschränkungen ... 72 5 LITERATURVERZEICHNIS ... 73 6 EIDESSTATTLICHE VERSICHERUNG ... 80 7 LEBENSLAUF ... 82 8 PUBLIKATIONSLISTE... 83 9 DANKSAGUNG ... 84
I. Abstrakt:
Verbesserte diagnostische Methoden - der Zyto- und Molekulargenetik – machen deutlich, dass die akuten myeloischen Leukämien (AML) eine heterogene Gruppe mit unterschiedlicher Empfindlichkeit auf Chemotherapie und Prognose darstellen. Die differenzielle Expression apoptoseassoziierter Proteine spielt hierbei eine entscheidende Rolle.
In dieser Arbeit wurden eine Auswahl pro- und antiapoptotischer Proteine der Familie der „inhibitors of apoptosis proteins (IAP)“ (XIAP, cIAP1, Survivin) und anderer apoptoseassoziierter Proteine (Caspase-3, Bcl-2, Bcl-xL, Bax) an insgesamt 137 kryokonservierten AML-Proben des Kindes- und Erwachsenenalters auf deren Expression und prognostische Bedeutung untersucht. 62 der 92 erwachsenen Patienten wurden im Rahmen der AMLCG-92-Studie behandelt. Alle 45 Kinder mit AML wurden nach dem Protokoll der AMLBFM-93 therapiert. Die Expression der Proteine wurde dabei mittels Immunoblot oder Durchflusszytometrie bestimmt.
Passend zur antiapoptotischen Wirkung von XIAP war eine hohe Expression von XIAP sowohl bei AML des Kindes- als auch des Erwachsenenalters mit einem geringerem mittlerem Gesamtüberleben verbunden: Erwachsene [9 Monate (n=21) vs 19 Monate (n=41), p<0,05]; Kinder [30 Monate (n=10) vs. 41 Monate (n=34), p=0,02].
Zudem korrelierte bei AML des Erwachsenenalters eine hohe XIAP-Expression mit intermediär/schlechtem Karyotyp [mittlere relative optische Dichte (mROD
)
3563; n=69 vs mROD 184; n=5; p=0,011). Bei der AML des Kindesalters korrelierte sowohl eine hohe XIAP-Expression als auch eine hohe Bcl-XL-Expression mit intermediär/schlechtem Karyotyp; XIAP (mROD 2509 ± 503, n=30, p<0,002) und Bcl-xL (mROD 2615 ± 439, p<0,001).Ferner konnte eine Assoziation der XIAP-Expression sowohl mit zytomorphologisch myelomonozytär differenzierten Blasten [French–American–British (FAB) Subtypen M4/M5] (p < 0,05) als auch mit immunphänotypisch monozytärem Markerprofil (CD 14, CD 36; P < 0.05; CD 4, HLA-DR; p < 0.01) nachgewiesen werden.
Für Survivin, als antiapoptotisch wirkendem Protein, konnte bei der AML des Kindesalters ein Zusammenhang zwischen hoher Expression und kürzerem Gesamtüberleben gezeigt werden: [27 Monate (n=10) vs. 41 Monate (n=34); p < 0,026].
Bei der Untersuchung der Expression apoptoseassoziierter Proteine auf altersspezifische Unterschiede zeigte sich für XIAP eine signifikant unterschiedliche Expression (p<0,05) zwischen den Altersgruppen. Passend zur antiapoptotischen Wirkung von XIAP fand sich in der prognostisch ungünstigeren Gruppe der AML Erwachsener im Vergleich zu AML des Kindesalters eine höhere XIAP-Expression. Allerdings konnte auch eine höhere Expression der proapoptotischen Proteine Bax (p<0,001) und Procaspase-3 (p<0,05) in der Gruppe Erwachsener nachgewiesen werden.
Insgesamt wurde in der Untersuchung eine deutliche Variabilität der Expression der verschiedenen IAP in primären AML deutlich, was auf eine differenzierte Regulation dieser Proteine hinweist. Einige IAP scheinen bei der AML eine prognostische Rolle zu spielen und definieren möglicherweise neue prognostische Gruppen.
Ziel der aktuellen Forschung ist es, der Identifikation bestimmter Risikogruppen eine dem Risikoprofil des Patienten angepasste und zielgerichtetere Therapie folgen zu lassen.
II. Abstract:
Improved diagnostic methods of cyto- and molecular genetics illustrate that acute myeloid leukemias (AML) represent a heterogeneous group of different sensitivity to chemotherapy and prognosis. The differential expression of apoptosis-associated proteins plays a major role in this regard.
In this study, a selection of pro-and antiapoptotic proteins of the inhibitors of apoptosis proteins (IAP) family (XIAP, cIAP1, survivin) and other apoptosis- associated proteins (caspase -3, Bcl -2, Bcl -xL , Bax) were examined for their level of expression and prognostic significance in 137 cryopreserved AML samples of children and adults. 62 of the 92 examined adult patients were treated according the AMLCG-92-study-protocol. All examined children (n=45) were treated according the protocol of the AMLBFM-93 study. The expression levels were examined by immunoblot or flowcytometry.
Matching the antiapoptotic effect of XIAP, high expression of XIAP, in both AML of childhood and adulthood, was associated with a lower overall survival: adults [9 months (n=21) vs 19 months (n=41), p<0,05]; children [30 months (n=10) vs. 41 months (n=34), p=0,02].
In addition, a high XIAP expression correlated with intermediate / poor karyotype in AML of adult [mean relative optical density (mROD) 3563; n=69 vs mROD 184; n=5; p=0.011). In AML of childhood a high expression of XIAP (mROD 2509 ± 503, n=30, p<0.002) and Bcl-XL (mROD 2615 ± 439, p<0.001) correlated with intermediate / poor karyotype.
Furthermore, XIAP expression correlated with myelomonocytic French–American– British (FAB) subtypes M4/M5 (p=0.05) and expression of monocytic markers (CD 14, CD 36; p < 0.05; CD 4, HLA-DR; p < 0.01) in AML blasts of adults.
For the antiapototic protein survivin, a shorter overall survival [27 Monate (n=10) vs. 41 Monate (n=34); p < 0.026] was associated with high expression levels for AML in children.
Comparing expression in view of age specific differences, different expression levels were shown for XIAP (p < 0.05). Matching the antiapoptotic function of XIAP the higher expression was detected in the unfavorable group of adult AML. However, a higher expression of pro-apoptotic proteins Bax (p < 0.001) and procaspase-3 (p < 0.05) was detected in the adult group, too.
However, a significant variability in the expression of the different IAP in primary AML was apparent in this study, indicating a differential regulation of these proteins. Some IAP seem to play a prognostic role in AML and probably new prognostic groups of AML can be defined.
The aim of current and future research is the identification of specific patient risk groups, risk adapted and targeted therapies for better responses and outcomes.
1 Einleitung
1.1 Einführung in das Thema
Durch Fortschritte in der chemotherapeutischen Behandlung akuter Leukämien kann heute eine zunehmende Zahl der Patienten geheilt werden. Allerdings zeigt sich aufgrund der immer spezialisierteren Diagnostik, insbesondere mittels zyto- und molekulargenetischer Techniken, dass bestimmte Risikogruppen trotz aller therapeutischen Fortschritte eine schlechte Prognose aufweisen.
In den letzten Jahren wurde deutlich, dass schlechtes Therapieansprechen möglicherweise mit einer reduzierten Empfindlichkeit der Leukämiezellen gegenüber einer durch die Chemotherapie induzierten Apoptose (= programmierter Zelltod) zusammenhängt. Studien deuten an, dass die Expression von pro- und antiapoptotischen Proteinen wichtige Prognosefaktoren bei akuten Leukämien darstellen könnten. Deshalb wurden in der vorliegenden Arbeit Zellproben von Kindern und Erwachsenen mit neu diagnostizierter akuter myeloischer Leukämie (AML) hinsichtlich der Expression wichtiger Apoptose- regulierender Moleküle sowie deren prognostische Bedeutung für das Therapieansprechen und Langzeitüberleben untersucht.
1.2 Akute myeloische Leukämie (AML)
1.2.1 Definition
AML sind Erkrankungen, welche durch eine maligne Expansion- und Reifungsblockierung von hämatopoetischen Zellen des Knochenmarks gekennzeichnet sind. Nahezu immer sind die granulozytäre oder die monozytäre Zellreihe betroffen. Eine zusätzliche Beteiligung der erythrozytären Reihe sowie eine gelegentlich ausschließliche Beteiligung der megakaryozytären Zellreihe sind ebenfalls möglich. Der natürliche akute Verlauf der AML wurde besonders in der Zeit vor Einführung der Chemotherapie deutlich. So betrug die mediane Überlebenszeit von Patienten mit akuter Leukämie, welche zwischen 1926 und 1948 in das Memorial Sloan Kettering Cancer Center von New York aufgenommen wurden, nur 17 Wochen [1].
1.2.2 Epidemiologie und Ätiologie
Etwa 80 % der akuten Leukämien im Erwachsenenalter sind AML. Während die Inzidenz im Kindes-und Jugendalter 2/100.000 nicht überschreitet, wird im Alter von >80 Jahren eine Inzidenz von >20/100.000 erreicht (s. Abb. 1.2.2-1) [2].
Der Anteil an der Gesamtkrebssterblichkeit beträgt für die AML 1-2 % [3]. In den USA geht man heute von einer Heilungsrate von ca. 18 % aus [4]. Die Prognose ist dabei stark altersabhängig. So werden bei Patienten, die jünger als 45 Jahre sind, 5-Jahres-Überlebensraten bis 46,6 % erreicht, während die 5-Jahres-Überlebensrate bei Patienten > 65 Jahre nur noch bei 6,1 % liegt [4].
In der ersten Hälfte des letzten Jahrhunderts stieg sowohl die Inzidenz als auch die Mortalität von Patienten mit AML deutlich an [3, 5]. Ein Grund für die Häufigkeitszunahme der AML liegt sicherlich in der Verbesserung und Erweiterung diagnostischer Techniken. Als weiterer Grund für die Häufigkeitszunahme lässt sich der Altersbezug der AML verbunden mit dem zunehmenden Alter der Bevölkerung nennen. Zudem lassen eine Vielzahl von Beobachtungen an AML-Patienten auf einen Einfluss bestimmter Umweltfaktoren schliessen. Zu den Umweltfaktoren, welche eine AML auslösen können, gehören ionisierende Strahlen, Benzol, und bestimmte Chemotherapeutika. Schon in der ersten Generation von Radiologen beobachtete man das gehäufte Auftreten strahleninduzierter Leukämien. Eine
deutlicher Anstieg der Häufigkeit von AML fand sich auch bei Überlebenden der Atombombenabwürfe von Hiroshima und Nagasaki [6]. Als Folge des Atomunfalls von Tschernobyl rechnet man mit einer Zunahme an Leukämieerkrankungen um 1000 – 4000 Fällen innerhalb von 50 Jahren [7, 8]. Benzol, ein chemischer Stoff, dem vor allem Arbeiter in der Gummi- und Lederindustrie sowie in Raffinerien ausgesetzt waren und sind, ist als auslösender Faktor für Leukämien schon seit 1928 bekannt.
Bis zu 15 % aller Fälle von AML entstehen infolge Radiatio und/oder Chemotherapie einer anderen neoplastischen Erkrankung [9]. Zwei Gruppen von Chemotherapeutika stehen hierbei vor allem im Mittelpunkt. So wurde eine erhöhtes Risiko für Leukämien durch alkylierende Substanzen wie Cyclophosphamid, Chlorambucil oder Busulfan beschrieben. Als zweite wesentliche Substanzgruppe erhöhen DNS-Topoisomerase II Inhibitoren wie Etoposid das Risiko für Leukämien. So wurde eine sekundäre AML häufig bei Kindern mit ALL nach Therapie mit Etoposid beobachtet [10]. Ein AML-Risiko von bis zu 6 % wurde nach einer Therapie des Morbus Hodgkin festgestellt [11]. Eine weitere Risikoerhöhung wird durch die Kombination von Alkylantien mit Strahlentherapie induziert [12].
Zu den ätiologischen Faktoren zählen neben Umweltfaktoren auch genetische Veränderungen. Bei einzelnen Patienten kann man eine familiäre Häufung beobachten. Eine eindeutige Disposition besteht für Patienten mit Down-Syndrom und einige weitere kongenitale Anomalien [13].
Abbildung 1.2.2-1 Inzidenz der AML nach Altersgruppen, USA (1994-2003) [2]
1.2.3 Symptome
Das initiale Beschwerdebild der AML ist vor allem Ausdruck einer Verdrängung der normalen Hämatopoese durch die malignen Blasten. Als Folge der Anämie finden sich Müdigkeit, Abgeschlagenheit, Blässe und Dyspnoe. Eine erhöhte bakterielle Infektanfälligkeit infolge der Granulozytopenie findet sich ebenso wie Pilzinfektionen. Weiterhin besteht eine erhöhte Blutungsneigung aufgrund der Thrombozytopenie. Eine Leukozytose >100 GPT/l kann ferner zu Gefäßverschlüssen im Gehirn und in deren Folge zu Nekrosen und intrazerebralen Blutungen führen. Bei Subtypen mit Beteiligung der monozytären Reihe findet man des Weiteren eine Disposition zu Gewebs- und Organinfiltration mit Hepatosplenomegalie, Hautinfiltraten und Gingivahyperplasie [1].
1.2.4 Diagnostik und Klassifikation
Die Diagnostik der AML erfolgt in erster Linie durch zytomorphologische und zytochemische Untersuchung von Blut- und Knochenmarkausstrichen. Zur genaueren Klassifikation der AML werden zusätzliche Untersuchungen des Immunphänotyps sowie der Zyto- und Molekulargenetik hinzugezogen.
Die AML umfasst eine Vielzahl von Subtypen charakteristischer Zytologie und Biologie. Einige Subtypen lassen sich bereits durch ihre Zellmorphologie und
Zytochemie klassifizieren. Auf dieser Grundlage beruht die von französischen, amerikanischen und britischen Hämatologen erstmalig 1976 vorgenommene FAB-Klassifikation (French Amerikan British) [14] (s. Tabelle 1.2.44-1). Während einige Subtypen morphologisch bereits gut definiert sind, lassen sich andere Subtypen in weitere biologisch unterschiedliche Entitäten unterteilen. Durch bestimmte chromosomale und/oder immunologische Marker (s. Tabelle 1.2.44-2) lassen sich diese Entitäten weiter differenzieren. Die aktuelle von der WHO vorgeschlagene Klassifikation der AML (s. Tabelle 1.2.44-3) berücksichtigt noch stärker die Bedeutung von Genmutationen für die Genese und die Charakterisierung von Subtypen der AML ohne zytogenetische Veränderungen. Die WHO-Klassifikation hat das Ziel, möglichst homogene, biologisch relevante und sich gegenseitig ausschließende Entitäten zu schaffen, welche nicht nur auf den prognostischen Wert einer genetischen Veränderung zurückgehen, sondern auch auf morphologischen, anderen phänotypischen, sowie klinischen und anderen einzigartigen biologischen Eigenschaften beruhen. Dieses Ziel lässt sich heute zum Teil nur schwer realisieren. Eine Vielzahl prognostisch bedeutsamer genetischer Mutationen von zytogenetisch normalen AML kann beispielsweise einzeln oder kombiniert vorliegen mit jeweils unterschiedlicher prognostischer Bedeutung [15], [16]. Eine Mutation von NPM1 (Nucleophosmin) wird beispielsweise bei 50-60 % zytogenetisch normaler AML nachgewiesen und ist mit einer hohen 4-Jahresüberlebensrate von annähernd 50 % assoziiert [17, 18]. Betrachtet man AML mit mutiertem NPM1 und gleichzeitig FLT3-ITD-Negativität (fms-related tyrosinkinase-3-Gen – interne Tandemduplikation) so ergibt sich eine 4-Jahresüberlebensrate von etwa 60 %, während AML mit entweder NPM1-Wildtyp und/oder FLT3-ITD–Positivität nur eine 4-Jahresüberlebensrate von etwa 30 % aufweisen [17, 18].
Tabelle 1.2.44-1 FAB-Klassifikation der akuten myeloischen Leukämien (mod. nach [19])
FAB-Subtyp MPO/SBB NSE Granulozytäre Komponente
Monozytäre
Komponente Häufigkeit M0*
“AML mit minimaler myeloischer Differenzierung“ < 3% < 3% < 10% < 10% 2-10% M1 “Myeloblastenleukämie ohne Ausreifung“ ≥ 3% - (+) < 10% < 10% 15-20% M2 “Myeloblastenleukämie mit Ausreifung“ ≥ 3% - (+) > 10% < 20% 30% M3 / M3v “akute Promyelozytenleukämie / Variantform“ > 3% - (+) abnorme Promyelozyten < 20% 5-10% M4 / M4Eo “myelomonozytäre Leukämie / mit abnormen Eosinophilen“
≥ 3% + > 20% > 20% 15-25% M5a “akute Monoblastenleukämie“ < 3% ++ < 20% > 80% (Monoblasten) 10-15% M5b “akute Monozytenleukämie“ ≥ 3% ++ < 20% > 80% (Pro-, Monozyten > 20%) M6
„akute Erythroleukämie“ ≥ 3% + variabel variabel 3-4% M7*
“akute
Megakaryoblastenleukämie“
< 3% + variabel variabel 3-4%
* diese FAB-Subtypen bedürfen einer weiteren immunologischen Analyse zum Nachweis myeloischer bzw. megakaryozytärer Antigene; MPO, Myeloperoxidase; SBB Sudan-Schwarz-B; NSE, unspezifische Esterase
Tabelle 1.2.44-2 Auswahl von CD-Antigen, die in der Diagnostik akuter myeloischen Leukämien verwendet werden (modifizert aus [20])
CD Antigen Zelluäre Expression Funktion
CD4 Thymozyten, TH 1 und TH 2 T-Zellen, Monozyten, Makrophagen
Co-Rezeptor für MHC-Klasse-II Moleküle Rezeptor für HIV-1 und HIV-2 gp120 CD13 Myelomonozytäre Zellen Zink Metalloproteinase
CD14 Myelomonozytäre Zellen Rezeptor für Komplex von Lipopolysaccharid and Lipopolysaccharid bindendem Protein (LBP)
CD15 Neutrophile, Eosinophile, Monozyten Terminales Trisaccharid von Glycolipiden und vielen Zelloberflächen- Glycoproteinen
CD33 Myeloische Progenitorzellen,
Monozyten Bindet Sialo-Konjugate CD34 Hämatopoetische Vorläuferzellen,
kapilläre Endothelzellen Ligand für CD62L (L-selectin)
CD36 Thrombozyten, Monozyten, Endothelzellen
Thrombozyten-Adhäsions-Molekül; beteiligt an der Erkennung und Phagozytose von
apoptotischen Zellen
CD41 Thrombozyten, Megakaryozyten
IIb Integrin, assoziiert mit CD61 zur Bildung von GPIIb; bindet Fibrinogen, Fibronektin, von Willebrand Faktor, und Thrombospondin
CD54 Hämatopoetische und nichthämatopoetische Zellen
Interzelluläres Adhäsionsmolekül (ICAM)-1 bindet CD11a/CD18 Integrin (LFA-1) and CD11b/CD18 Integrin (Mac-1), Rezeptor für Rhinoviren
CD64 Monozyten, Makrophagen
Hochaffiner Rezeptor für lgG, bindet IgG3>IgG1>IgG4>>>IgG2, vermittelt Phagozytose, Antigen-Bindung,
CD65 Myeloische Zellen Oligosaccharid-Komponente eines Ceramid- dodecasaccharids
Tabelle 1.2.44-3 WHO-Klassifikation der AML 2008 [15]
Akute myeloische Leukämie und verwandte Neoplasien
Akute myeloische Leukämie mit rekurrenten genetischen Aberrationen
AML mit t(8;21)(q22;q22); RUNX1-RUNX1T1
AML mit inv(16)(p13.1q22) or t(16;16)(p13.1;q22); CBFB-MYH11 APL mit t(15;17)(q22;q12); PML-RARA
AML mit t(9;11)(p22;q23); MLLT3-MLL AML mit t(6;9)(p23;q34); DEK-NUP214
AML mit inv(3)(q21q26.2) or t(3;3)(q21;q26.2); RPN1-EVI1 AML (megakaryoblastic) mit t(1;22)(p13;q13); RBM15-MKL1 Vorläufige Entität: AML mit mutiertem NPM1
Vorläufige Entität: AML mit mutiertem CEBPA
Akute myeloische Leukämie mit Myelodysplasie assoziierten Veränderungen Therapie assoziierte myeloische Neoplasien
Akute myeloische Leukämie, nicht weiter klassifiziert
AML mit minimaler Differenzierung AML ohne Ausreifung
AML mit Ausreifung
Akute myelomonozytäre Leukämie
Akute monoblastische/monozytische Leukämie Akute erythroide Leukämie
Pure erythroide Leukämie
Erythrozytenleukämie, erythroide/myeloische Akute Megakaryoblastenleukämie
Akute Basophilenleukämie
Akute Panmyelose mit Myelofibrose
Myelosarkom
Myeloische Proliferationen assoziiert mit Down-Syndrom
Transiente abnormale Myelopoese
Myeloische Leukämie assoziiert mit Down-Syndrom Neoplasie blastisch plasmozytoider dendritischer Zellen
1.2.5 Therapie
Zentraler Bestandteil der Therapie der AML ist seit mehr als 50 Jahren die Chemotherapie. Man unterscheidet 3 Phasen der Chemotherapie: Induktion, Konsolidierung und Erhaltungstherapie. Gegenstand einer Vielzahl multizentrischer, randomisierter Therapiestudien ist die Variierung von Dauer, Dosisintensität und Art der verwendeten Zytostatika innerhalb der verschiedenen Therapiephasen.
Beispielgebend soll hier das Therapieprotokoll der AMLCG92 (Studie der deutschen AML-Cooperative Group) dargestellt werden (s. Abbildung 1.2.55-1).
Wesentliche Erkenntnisse hinsichtlich der Therapie von kindlichen AML lieferten die Ergebnisse der deutschen BFM-Studiengruppe. Durch intensivierte Induktionstherapie, zusätzlicher Schädelbestrahlung und Erhaltungstherapie über 2 Jahre konnten in 80 % Komplettremissionen und in 61% eine Langzeitrezidivfreiheit erreicht werden [21]. Als Beispiel soll hier das Therapieschema der AML-BFM 93-Studie dienen (s. Abbildung 1.2.55-2) [21]. Neben der Chemotherapie stellt die Knochenmarktransplantation (KMT) einen weiteren Bestandteil der AML-Therapie dar. Bei Vorliegen eines histokompatiblen Spenders und prognostisch ungünstigem Subtyp oder nach erstem Rezidiv wird die allogene KMT bei Patienten in Remission nach Reinduktionstherapie durchgeführt.
Abbildung 1.2.55-1 Studiendesign der AMLCG 92 (mod. nach [1])
Studiendesign der AMLCG 92
R TAD TAD HAM HAM TAD TAD AD AT AC AT S-HAM Allo BMT
TAD = Thioguanin, Arabinosid-Cytosin, Daunorubicin HAM = Hochdosiertes Arabinosid-Cytosin, Mitoxantron AD = Arabinosid-Cytosin, Daunorubicin AT = Arabinosid-Cytosin, Thioguanin AC = Arabinosid-Cytosin, Cytoxan CR CR = Komplette Remission R = Randomisierung
Allo BMT = allogene Knochenmarktransplantation, wenn passender Geschwisterspender Induktionstherapie Konsolidierungstherapie Erhaltungstherapie
bis 3 Jahre nach CR Allo BMT
Abbildung 1.2.55-2 Studiendesign der AML-BFM 93 (nach [21])
Studiendesign AML-BFM 93 R1 ADE AIE Ris ik o -S tr a ti fi k a ti o n R2 HAM Konsolidierung Konsolidierung HAM INT INT ZNS-Rx + Erhaltung ZNS-Rx + Erhaltung R1 = 1. Randomisierung
R2 = 2. Randomisierung nur für Hoch-Risiko-Patienten; Standard-Risiko-Patienten erhielten kein HAM ADE = Arabinosid-Cytosin, Daunorubicin, VP16 (Etoposid)
AIE = Arabinosid-Cytosin, Idarubicin, VP16
HAM = Hochdosiertes Arabinosid-Cytosin, Mitoxantron
INT = Intensivierung mit Hochdosis Arabinosid-Cytosin und VP16 ZNS-Rx = Schädelbestrahlung
Konsolidierung: Thioguanin, Prednison, Vincristin, Doxorubicin, Arabinosid-Cytosin, Cyclophosphamid Erhaltung: Thioguanin, Arabinosid-Cytosin
1.2.6 Prognose
Die Prognose der AML bei Kindern und Erwachsenen ist unterschiedlich. So liegt das 5-Jahresüberleben von Kindern bei etwa 60 %, bei Erwachsenen hingegen bei 28,4 % und bei Erwachsenen ≥ 60 Jahre nur bei etwa 6,6 % (s. Tabelle 1.2.66-2). Eine Theorie, welche diese Tatsache erklären könnte, beruht auf der Annahme, dass Progenitorzellen von Erwachsenen und Kindern auf unterschiedlichen Entwicklungsstufen maligne transformieren (s. Abbildung 1.2.66-1) [22]. Kindliche Progenitorzellen könnten demnach von einem reiferen, differenzierteren Klon ausgehen, welcher besser auf Chemotherapeutika reagiert, weniger Resistenz- und Reparaturmechanismen aufweist, somit einer Therapie besser zugänglich ist und eine bessere Prognose der Patienten zur Folge hätte.
Als heute wichtigster Prognoseparameter haben sich zytogenetische, Veränderungen herauskristallisiert. Bei mehr als 50 % aller AML-Patienten lassen sich verschiedene Chromosomenaberrationen nachweisen, welche mit unterschiedlicher Prognose korrelieren. Eine Einteilung in verschiedene Risikogruppen, wie sie auch in die WHO-Klassifikation (s. Tabelle 1.2.64-3) Eingang fand, fasst dabei verschiedenene Aberrationen mit ähnlicher Prognose hinsichtlich des Ansprechens auf Chemotherapie, dem krankheitsfreien Überleben und dem Gesamtüberleben zusammen. Zu den Aberrationen mit niedrigem Risiko, d.h. hoher Anzahl von Patienten mit kompletter Remission (CR) und günstigem Gesamtüberleben, zählt die Core-Binding-Factor (CBF) AML mit den Aberrationen t(8;21)/AML1-ETO und inv(16)/CBFB-MYH11 sowie die mit der Promyelozytenleukämie assoziierten Translokation t(15;17)/PML-RAR-alpha. Dem stehen als Hochrisiko-Leukämien mit ungünstiger Prognose z.B. Aberrationen mit komplexem Karyotyp (≥3 Aberrationen ohne [t(8;21), inv(16)/t(16;16), t(15;17)], t(11q23), inv(3)/t(3;3), t(9;22), t(6;9), 17p-Anomalie und die Aberrationen –5/5q- sowie –7/7q-) gegenüber [23].
Die vorhandenen genetischen Prognosemarker wurden, wie durch verschiedene Arbeiten gezeigt werden konnte, um einige molekulare Marker erweitert. So weisen FLT3-Mutationen [24, 25] und MLL-Mutationen [26] auf eine ungünstige Prognose hin, während beispielsweise Mutationen von CEBPA [27, 28] und NPM1 ohne FLT3 Mutationen [29, 30] eine Assoziation mit einer günstigen Prognose zeigen. Diese molekularen Marker können zur Vorhersage der Prognose gerade bei Leukämien mit normalem Karyotyp verwendet werden. Darüber hinaus gelangten einige für die
Apoptose bedeutsame Proteine wie Bcl-2 oder Bax als mögliche prognostische Marker in den Fokus der Forschung [31, 32].
Einen weiteren Ansatz für die Diagnostik und Neudefinition prognostisch relevanter Subgruppen stellt die Genexpressionsanalyse dar. [33, 34]. So ist in Zukunft vielleicht die genauere Definition prognostisch relevanter Subgruppen und somit eine an das individuelle Riskoprofil des Patienten besser angepasste Therapie möglich.
Abbildung 1.2.66-1 Modell für Ursprung leukämischer Stammzellen (nach [22])
Hierarchischer Ursprung von Stammzellen akuter Leukämien
Keimbahn
Frühe embryonale Stammzelle
Hämatopoetische (lymphatische-myeloische) Stammzellen
Lymphatische Stammzelle Myeloische Stammzelle
T B M H selten AL selten AL ErwachseneAML/ALL, MDS, CML KinderAML KinderALL
Tabelle 1.2.66-2 Übersicht Therapieansprechen der AML in verschiedenen Altersgruppen
Erwachsene [35] Erwachsene ≥ 60 Jahre [36] Kinder [21]
CR 72.6% 48,5% 82%
OS (5 J.) 28,4% 6,6 % 60%
EFS (5 J.) 21,6% 51%
OS - Overall Survival (5-Jahres-Gesamtüberleben), CR - Complete Remission (Komplette Remission), EFS - Event Free Survival (5-Jahres-Ereignisfreies Überleben)
1.3 Apoptose
Bereits Mitte des vorletzten Jahrhunderts erkannte man, dass das Absterben von Zellen ein wichtiger Bestandteil der Entwicklung tierischer Organismen ist. Carl Vogt entdeckte bereits 1842 anhand der Metamorphose von Amphibien, das Zellen durch „programmierten Zelltod“ sterben können [37]. 1951 führte Glücksmann den Tod embryonalen Gewebes auf den Tod einzelner Zellen zurück [38]. In der zweiten Hälfte des letzten Jahrhunderts (1972), zeigten Kerr, Wyllie und Currie morphologische Unterschiede zwischen dem Absterben von Zellen, wie es sich während der Entwicklung oder zur Aufrechterhaltung der Gewebshomöostase darstellt, und dem Zelltod, der durch Traumata oder Ischämien bedingt ist [39]. Die letztgenannte Art des Zelltodes wird Nekrose genannt, welche durch eine Schwellung der Zelle und ihrer Organellen bis zur Ruptur charakterisiert ist. Des Weiteren kommt es hier zur Kernpyknose und Karyorrhexis mit folgender Karyolyse. Schliesslich wird durch den Austritt von Zellinhalt in den Interzellularraum eine Entzündungsreaktion induziert.
Während des programmierten Zelltodes hingegen kommt es zu einer Schrumpfung und Kondensation der Zellen und ihrer Organellen mit Erhalt der Zellmembranintegrität. Membranumhüllte Zellfragmente („apoptotic bodies“) oder die Zelle in toto werden von umgebenden Zellen oder Makrophagen phagozytiert, so dass eine Entzündungsreaktion ausbleibt. Kerr, Wyllie und Currie prägten für diese charakteristischen Vorgänge des programmierten Zelltodes schließlich den Begriff der Apoptose, welcher dem Griechischen entlehnt ist, und das Herabfallen der Blätter von Bäumen beschreibt.
Zur späteren allgemeinen Akzeptanz der Existenz eines programmierten Zelltodes trugen vor allem genetische Untersuchungen des Nematoden Caenorhabditis elegans (C. elegans) bei. Mit der Identifikation von Genen, die für den Zelltod und seine Kontrolle verantwortlich zeichneten [40, 41], und den entdeckten Homologien zu Genen von Säugetieren [42], wurde die Erforschung der Apoptose und der damit verbundenen Mechanismen ein zentraler Bestandteil wissenschaftlicher Forschung. Ein Indiz dafür ist nicht zuletzt die Vergabe des Nobelpreises für Medizin und Physiologie an die drei Wissenschatfler John E. Sulston, Sydney Brenner und H. Robert Horvitz für ihre Entdeckungen hinsichtlich der genetischen Regulation des programmierten Zelltodes.
1.3.1 Die Morphologie der Apoptose
Schon als Kerr, Wyllie und Currie den Begriff der Apoptose prägten gingen sie von morphologischen Veränderungen der Zellen aus. Heute weiß man, dass die morphologischen Veränderungen ein Resultat der Aktivierung von intrazellulären Signaltransduktionwegen sind, die wiederum durch verschiedene Stoffe induziert werden können. So unterschiedlich die Substanzen zur Apoptoseinduktion auch sein mögen, weisen die daraus resultierenden morphologischen Veränderungen letztendlich viele Gemeinsamkeiten auf [43].
Welche Veränderungen lassen sich nun licht– oder elektronenmikroskopisch beobachten? Die sterbende Zelle verliert während der Apoptose ihre Kontakte zu Nachbarzellen sowie zur Extrazellularmatrix und beginnt sich abzurunden. Weiterhin bildet die Zelle blasenartige Austülpungen. Mittels DNA-Markierung kann man eine Kondensation des Zellkerns erkennen, welche als ringförmige Struktur entlang der Kernhülle beginnt und schließlich den gesamten Kern ausfüllt. Der kondensierte Zellkern löst sich in einzelne Fragmente auf. Schließlich kondensiert die gesamte Zelle und es bilden sich sogenannte „apoptotic bodies“. „Apoptotic bodies“ sind membranumhüllte Vesikel von unterschiedlicher Größe und Inhalt [39]. Sie enthalten zytosolische Elemente, Organellen oder Teile des fragmentierten Zellkerns. Mittels Elektronenmikroskopie konnten auch Veränderungen an einzelnen Organellen beobachtet werden. So zeigen Mitochondrien nach einiger Zeit entweder eine Kondensation oder eine Schwellung, während das Endoplasmatische Retikulum (ER) und der Golgiapparat, zumindest in frühen Stadien der Apoptose, morphologisch unauffällig scheinen. Des Weiteren wurde eine Vakuolisierung des Zytoplasmas oder ein Verlust von Mikrovilli während der Apoptose beschrieben [37].
Die Phagozytose von „apoptotic bodies“, als auch der apoptotischen Zellen selbst, wird von Makrophagen und zur Phagozytose fähigen epithelialen Zellen gewährleistet. Die phagozytierten Bestandteile werden schließlich durch lysosomalen Prozesse endgültig abgebaut.
Im Folgenden sollen nun drei Proteinfamilien beschrieben werden, die entscheidenden Anteil an der Ausführung des apoptotischen Programms haben: 1. Caspasen, die sowohl als Initiatoren als auch Effektoren des Apoptoseprogramms fungieren, 2. Moleküle der Bcl-2-Familie als wichtige Regulatoren des programmierten Zelltodes durch Stabilisierung oder Destabilisierung des
mitochondrialen Membranpotentials, sowie 3. Mitglieder der Inhibitor of Apoptosis (IAP)-Proteinfamilie als Blocker des aktivierten Apoptoseprogramms.
1.3.2 Caspasen
Als Caspasen werden die Mitglieder einer Familie von Proteasen bezeichnet, welche Gemeinsamkeiten hinsichtlich ihrer Aminoäuresequenz, Struktur und Substratspezifität aufweisen. Cystein im aktiven Zentrum und die Tatsache, dass die von Caspasen gespaltenen Proteine immer nach einem Aspartat gespalten werden, standen bei der Namensgebung der Caspasen (Cystein-Aspartasen) Pate [44]. Durch die Entdeckung des bei Säugern vorhandenen Interleukin-1-β-converting enzymes (= ICE oder Caspase-1) wurden Caspasen erstmalig in Zusammenhang mit Apoptose gebracht. Caspase-1 ist homolog zu Ced-3 („cell death abnormal“), welches wiederum ein für den Zelltod bei C.elegans verantwortliches Genprodukt darstellt [45, 46]. So wurde das Interleukin-1-β-converting-enzyme zum ersten Mitglied der großen Familie der Caspasen. Caspasen sind sowohl bei der Initiierung der Apoptose als auch an der eigentlichen Zerstörung der Zelle selbst beteiligt. Es erwies sich daher als zweckmäßig, eine Einteilung der Caspasen in sogenannte Initiator-Caspasen, welche als Anwort auf proapoptotische Signale das Todesprogramm in Gang setzen, und die so genannten Effektor-Caspasen (Caspase-3, -6, -7) vorzunehmen, welche durch ihre proteolytische Funktion unmittelbar an der Zerstörung der Zelle beteiligt sind und kurze Prodomänen aufweisen. Initiator-Caspasen besitzen lange Prodomänen, welche eine von zwei wichtigen Protein-Interaktions-Stellen aufweisen: der Death-Effector-Domain (DED) [Caspase-8,-10] und der Caspase-Activation-and-Recruitment-Domain (CARD) [Caspase-1, -2, -4, -5, -9, -11, -12], welche für die Interaktion mit Apoptose auslösenden Proteinen von Bedeutung sind. Eine weitere Möglichkeit der Klassifizierung der Caspasenfamilie besteht in der Unterscheidung hinsichtlich ihrer Substratspezifität. Durch Thornberry et. al wurden mittels in vitro Untersuchungen bevorzugte Tetrapeptide als Substrate für die Caspasen 1-11 definiert [47]. Darüber hinaus können Untersuchungen hinsichtlich der Substratspezifität von Caspasen Informationen bieten, um die unterschiedlichen physiologischen Bedeutungen einzelner Caspasen zu klären, auch wenn dabei stets beachtet werden sollte, dass die Daten anhand synthetischer Substrate und in vitro gewonnen wurden.
Im Folgenden soll nun die Aktivierung und intrazelluläre Wirkung der Caspasen näher beleuchtet werden.
Die als Proenzyme vorliegenden Caspasen werden kaskadenartig durch proteolytische Prozessierung in aktive Proteasen umgewandelt. Erste Erkenntnisse zur Aktiverung und Regulierung von Caspasen lieferten Untersuchungen an C. elegans. Die Aktivierung der Initiatorcaspase Ced-3 von C. elegans wird durch ein Adapterprotein Ced-4 vermittelt, wobei die gegenseitige Erkennung durch die so genannten CARDs (Caspase recruitment domains) und die anschließende Oligomerisierung von Ced-4 von entscheidender Bedeutung sind. Die proapoptotische Wirkung von Ced-4 wiederum wird durch das antiapoptotisch wirkende Protein Ced-9 reguliert. Die hemmende Wirkung von Ced-9 auf Ced-4 kann durch EGL-1 aufgehoben werden. EGL-1 ist ein Mitglied der Bcl-2-Familie, welche später noch Gegenstand der Betrachtung sein soll. Die Interaktion von Ced-3, Ced-4, Ced-9 und EGL-1 hat die genaue Steuerung der Zellentwicklung von C. elegans zur Folge [41]. Schließlich wurden bei Säugern homologe Proteine zu den für die Entwicklung von C. elegans so bedeutenden Proteinen gefunden. Dazu gehören Bid und Bcl-2 als Homologe zu Ced-9 und EGL-1, sowie Caspase-9 und Apaf-1 (apoptosis activating factor 1) als Homologe zu Ced-3 und Ced-4 [48, 49] s. (Abbildung 1.3.2-1.3.2).
Caspase-9 wird durch das so genannte Apoptosom aktiviert. Das Apoptosom, als multimerer Komplex, entsteht aus einem Komplex aus Cytochrom c und Apaf-1 durch die Bindung von ATP. Cytochrom-c (Cyt c), welches sich im Intermembranspalt der Mitochondrien befindet, wird durch verschiedenste apoptotische Stimuli aus den Mitochondrien freigesetzt und bindet im Zytoplasma Apaf-1. Schließlich wird ATP gebunden und das somit entstehende Apoptosom kann Caspase-9 aktivieren. Caspase-9 wiederum aktiviert dann die Effektorcaspase Caspase-3.
Caspase-3 kann dann eine Vielzahl für die Zelle lebenswichtiger Proteine spalten und so den Zelltod induzieren. Dazu gehören unter anderem wichtige Strukturproteine wie Aktin und Enzyme wie DNA abhängige Proteinkinase. Caspase-3 ist damit an der Regulation von Degradationprozessen der Zelle beteiligt, welche einen zentralen Bestandteil der Apoptose darstellen [50]. Bei verschiedenen Zelltypen aus knock-out Tieren konnte eine Inhibierung apoptotischer Veränderungen, wie das Membran-Blebbing, die Fragmentierung des Zellkerns
sowie eine Degradierung der DNA, nachgewiesen werden [51]. So stellt Caspase-3 ein wichtiges Schlüsselprotein bei der Ausführung des Apoptoseprogramms dar.
Abbildung 1.3.2-1.3.2 Homologe apoptoseassoziierte Proteine verschiedener Spezies, modifiziert nach [50]
Legende: gleiche Farben, funktionelle Homologe; aktivierend, inhibierend
C.elegans
SäugerDrosophila
Bid,Bax CED-9 CED-4 CED-3 Apoptose EGL-1 Bcl-2 Smac Cyt c Apaf 1 Caspase 9 Caspase 3 zelluläre Proteine Apoptose Drob1 Cyt c dApaf 1 Initiator-Caspase (Dronc?) Effektor Caspase (drICE?) zelluläre Proteine Hid Grim Reaper DIAP IAPs Apoptose
1.3.3 Die Familie der Bcl-2-Proteine
1.3.3.1 Bcl-2-Proteine - Einteilung und StrukturDie Entdeckung von Bcl-2 als Regulator der Apoptose geht auf die Beobachtung zurück, dass bei follikulären Lymphomen eine Translokation des Gens bcl-2 (breakpoint cluster region lymphoma-2) von Chromosom 18 auf Chromosom 14 auftritt. Diese Translokation hat eine Überexpression von Bcl-2 zur Folge, was wiederum dazu führt, dass diese Zellen länger überleben. Im letzten Jahrzehnt wurde klar, dass Bcl-2 zu einer ganzen Familie von Proteinen gehört zu deren Mitgliedern sowohl pro- als auch antiapoptotisch wirkende Proteine gehören, die die Freisetzung von Caspasen steuern. Allein bei Säugern sind bis jetzt etwa 20 Mitglieder der Bcl-2- Familie bekannt, von denen einige ebenfalls in anderen Organismen wie C. elegans oder Drosophila vorhanden sind.
Die Familie der Bcl-2-Proteine wird heute in eine anti-apoptotische und eine pro-apoptotische Gruppe unterteilt. Alle Mitglieder enthalten bis zu vier hoch konservierte Domänen, welche als Bcl-2 Homologe (BH)-Domänen 1-4 bezeichnet werden [52]. (s. Abbildung 1.3.3-1).
Die anti-apoptotischen Proteine enthalten typischerweise alle 4 Domänen, von denen BH1, BH2 und BH4 für die antiapoptotische Aktivität benötigt werden [53, 54]. Ein weiterer Bestandteil der Proteinstruktur ist eine hydrophobe C-Terminale Domäne, welche für eine Bindung an intrazelluläre Membranen notwendig ist. Die pro-apoptotischen Proteine hingegen können noch in zwei weitere Gruppen unterteilt werden. Die Mitglieder der als Multidomän-Proteine bezeichneten Gruppe, beinhalten die Domänen BH1-3 sowie die C-terminale hydrophobe Domäne. Die zweite pro-apoptotische Gruppe enthält nur die BH3-Domäne (BH3-only). Innerhalb dieser Gruppe finden sich Proteine, welche ausschließlich die BH3-Domäne enthalten, als auch solche, welche noch zusätzlich die hydrophobe C-terminale Domäne besitzen [55].
Des Weiteren lassen sich Unterschiede in der zellulären Lokalisation der antiapoptotischen als auch der proapoptotischen Bcl-2- Proteine feststellen. Während man Bcl-2 vor allem als Bestandteil der äußeren Mitochondrienmembranen, dem endoplasmatischen Retikulum (ER) oder auch der Kernhülle findet, sind Proteine wie Bcl-xl oder Bcl-w vornehmlich an Mitochondrien
lokalisiert. Das proapoptotische Protein Bak ist eher mit Mitochondrien oder ER-Membranen assoziiert, während Bax vornehmlich im Zytosol zu finden ist [55].
Abbildung 1.3.3-1 Mitglieder der Bcl-2-Protein-Familie, modifiziert nach [52]
BH 4 BH 3 BH 1 BH 2 TM Bcl-2 - Subfamilie Bcl-xL Bcl-2 Bcl-w Mcl-1 A1/Bfl-1 CED-9 Bax - Subfamilie BH 3 BH 1 BH 2 TM Bax Bak Bok/Mid BH3 - Subfamilie BH 3 TM Bik/Nbk/Blk Hrk/DP5 BimL Noxa Bad Puma/Bbc3 Bmf EGL-1 BH 3 Bid P ro -s u rv iv a l P ro -a p o p to ti s c h
1.3.3.2 Wirkungsweise und Interaktionen der Bcl-2-Protein-Familie
Proteine der Bcl-2-Familie reagieren auf unterschiedliche zelluläre Stressfaktoren. Wie fördert Bcl-2 das Überleben von Zellen und wie induzieren BH3-only Proteine Apoptose?
Bax-ähnliche Proteine scheinen Membranen beschädigen zu können, so auch die äußere Mitochondrienmembran, was die Freisetzung verschiedener Apoptose-Mediatoren, wie beispielsweise Cytochrom-c zur Folge hat (s. Abbildung 1.3.3-2). Bax und Bak sind ebenfalls an der Apoptoseinitiierung beteiligt, welche als Antwort auf eine gestörte Calcium-Homöostase oder ein Überschuss an ungefaltenen Proteinen vom ER ausgeht. Wie genau allerdings Bax bzw. Bak eine Permeabilisierung der Mitochondrienmembran induzieren ist unklar. Ein Modell beinhaltet die induzierte Schwellung und Ruptur von Mitochondrien, ein weiteres basiert auf dem strukturellen Umbau von Bax und Bcl-2 ähnlichen Proteinen zu Kanal-bildenden Proteinen [55]. Das genaue und komplexe Zusammenspiel der Bcl-2 Protein-Familie bleibt weiterhin Gegenstand aktueller Forschungen.
Abbildung 1.3.3-2 Wirkungsweise von Bcl-2-Proteinen während der Apoptose modifiziert nach [52] BH3 Genotoxizität, Hypoxie Zytokin-Deprivation
Anoikis Taxol, UV, Ca2+
Bcl-2 Bax Membranschäden Mitochondrien ER Cyt-c/Apaf1 Aktivator Caspase 9 Effektor-Caspase 3,6,7 APOPTOSE Caspase 12
Legende: aktivierend, inhibierend
1.3.3.3 Bcl-2 Proteine als Onkogene, Tumorsuppressoren und Proteine mit Einfluss auf den Zellzyklus
Durch Mausmodelle konnte auch eine onkogenetische Bedeutung von Bcl-2 bei der AML nachgewiesen werden. So führt die Koexpression von Bcl-2 mit PML-RAR-α bei der akuten Promyelozytenleukämie (APL) zu einer gesteigerten Zahl unreifer Zellen im Knochenmark und einer beschleunigten Entwicklung der APL [56]. Des Weiteren fördert die Bcl-2-Überexpression die Entwicklung von Leukämien, welche durch ionisierende Strahlung induziert wurde. In Analogie zu Untersuchungen, die eine onkogene Bedeutung von Bcl-2 unterstreichen, existieren auch Erkenntnisse, welche für proapototische Mitglieder der Bcl-2-Familie eine Wirkung als Tumorsuppressoren wahrscheinlich macht. Bei Mäusen, die Myc aber kein Bim exprimieren, konnte eine gesteigerte Leukämieentwicklung festgestellt werden [57]. In einer anderen Arbeit wurde die Entwicklung einer chronischen myelomonozytären Leukämie bei
Bid-defizienten Mäusen gezeigt [58]. Ferner konnte bei einigen humanen Tumorarten Mutationen von Bax und Bak festgestellt werden [59], [60]. Neben der Bedeutung für die Regulation apoptotischer Zellvorgänge bestehen Hinweise aus in-vitro-Versuchen und Studien mit transgenen Mäusen, die auf Einflüsse der Bcl-2-Proteinfamilie auf den Zellzyklus hindeuten.
1.3.3.4 Beeinflussung der Funktion von Bcl-2-Proteinen als Therapiemöglichkeit
Da die gestörte Apoptose eine wesentliche Rolle bei der Entstehung von Tumorerkrankungen zu spielen scheint, ist die Beeinflussung von apoptotischen Vorgängen zu therapeutischen Zwecken ein zentraler Bestandteil gegenwärtiger Forschung. Die Beeinflussung der Bcl-2-Funktion stellt dabei ein vielversprechendes Ziel dar. Verschiedenste Ansätze werden dabei verfolgt. Die am weitesten fortgeschrittenen Studien zielen auf die Beeinflussung der Expression von Bcl-2 mittels antisense-Oligonukleotiden, hier wurden bereits Phase-III-Studien bei verschiedenen malignen Entitäten durchgeführt [61]. Weitere Möglichkeiten der Apoptosebeeinflussung bei maligenen Erkrankungen sind Bax-Adenoviren und Adenoviren, die durch tumorspezifische Targets möglichst nur Veränderungen in Tumorzellen zur Folge haben. Ferner könnte gegebenfalls eine Therapie mit BH3-only-Proteinen oder die Entwicklung von Peptiden, welche die BH3-Bindungsdomäne imitieren und so Bcl-2 inaktivieren, proapoptotische Wirkung an malignen Zellen entfalten. Insgesamt stellen jedoch auch hier eventuelle Toxizitäten oder eine zu ungezielte Therapie Probleme dar, welche in der Zukunft gelöst werden müssen, um die für die Therapie von AML gezielteren und für die Patienten insgesamt weniger toxische Therapien bereitzustellen.
1.3.4 Inhibitor of Apoptosis Proteins (IAP)
IAP gehen auf die erstmalige Entdeckung von Proteinen im Baculovirus zurück, die den Zelltod von infizierten Wirtszellen verhindern können [62, 63]. Die Familie der IAP sind durch so genannte BIR-Domänen (Baculoviral IAP Repeats), eine etwa 70 Aminosäuren umspannende Domäne, gekennzeichnet. Proteine, die BIR-Domänen enthalten, wurden bei einer Vielzahl von Eukaryonten gefunden. Darunter finden sich Hefen, C. elegans oder Drosophila melanogaster ebenso wie verschiedene Säugetiere, so bei Mäusen, Ratten, Schweinen und auch im Menschen.
Struktur-Funktionsanalysen haben die Notwendigkeit des Vorhandenseins von mindestens einer BIR-Domäne zur Apoptose-Hemmung deutlich gemacht [64]. Weiterhin kann die BIR-Domäne bei verschiedenen IAP mit weiteren anderen Leitstrukturen, wie der so genannten Ring-Domäne, CARD-Domänen, einer Ubiquitin-bindenden Domäne oder einer Nukleotid-bindenden Struktur verbunden sein (s. Abbildung 1.3.4-1).
Die IAP stellen eine multifunktionelle Gruppe im Rahmen der Apoptose-Inhibitoren dar. Eine wesentliche Rolle spielt dabei die Beeinflussung von Caspasen, wobei IAPs mit Initiator- und Effektor-Caspasen in Wechselwirkung treten. Der wirksamste Inhibitor von Caspasen und wohl am besten charakterisierte Vertreter innerhalb der IAP-Familie ist XIAP. XIAP hemmt sowohl die Initiator-Caspase-9 als auch die Effektor-Caspasen-3 und -7. XIAP besteht aus drei BIR-Domänen und einer Ringstruktur. Den verschiedenen BIR-Domänen konnten hierbei unterschiedliche Funktionen zugeordnet werden. Die BIR2-Domäne ist für die Hemmung von Caspase-3 und -7 verantwortlich. Die BIR3-Domäne hingegen ist mit der Hemmung der Initiator-Caspase-9 verknüpft.
Survivin, als ein weiteres Mitglied der IAP-Familie, besitzt nur eine BIR-Domäne, eine verlängerte c-Terminale α-Helix [65] und eine dimere Struktur [66]. Durch in vitro Experimente wurde gezeigt, dass Survivin die Effektor-Caspasen-3 und -7 binden kann und ihre Aktivität inhibiert [67]. Survivin-Antisense-Konstrukte führen zu einer stärkeren Caspaseaktivität, Spontanapoptoserate und Hemmung der Zellteilung [68]. Neben seiner antiapoptotischen Wirkung spielt Survivin auch eine wichtige Rolle im Zellzyklus. Erste Hinweise für die direkte Beteiligung Survivins an den Mechanismen der Zellteilung ergaben sich durch die Beobachtung, dass Survivin Zellzyklus-abhängig periodisch exprimiert wird. Die höchste Expressionsstärke ist während der
Mitose nachweisbar. Survivin ist während der Mitosephase an Bestandteilen des Spindelapparates lokalisiert. Bis zu 80 % des Survivinpools ist dabei mit den Mikrotubuli assoziiert. Funktionelle Untersuchungen an C. elegans, Hefen und knock-out-Mäusen führen zu Störungen während der Zellteilung. Eine homozygote Deletion des Survivin-Gens bei Knock-out-Mäusen führte zu Störungen der Mikrotubulizusammensetzung und völligem Fehlen des Spindelapparates, einer daraus folgenden Entstehung multinukleärer Zellen und einer 100 % igen Letalität der Embryonen [69].
Weitere IAPs, die eine wichtige Rolle in der Apoptoseregulation spielen, sind c-IAP1, c-IAP2 und NIAP.
Abbildung 1.3.4-1 Struktur verschiedener IAP, modifiziert nach [70]
BIR CARD RING finger
XIAP (ILP-1, MIHA)
ILP-2, Ts-IAP
c-IAP 1 (HIAP-2, MIHB)
c-IAP 2 (HIAP-1, MIHC)
ML-IAP (Livin, KIAP)
NAIP
Survivin (TIAP)
2 Material und Methoden
2.1 Durchflußzytometrie
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Expression von Apoptose-assoziierten Proteinen in primären Zellen akuter myeloischer Leukämien mittels Durchflusszytometrie und Immunoblot untersucht. Diese beiden Techniken werden zunächst dargestellt.
Die Durchflußzytometrie ist ein Verfahren zur Charakterisierung von Zellen hinsichtlich ihrer physikalischen und biochemischen Eigenschaften mittels optischer Meßprinzipien. Bei der durchflußzytometrischen Analyse von Zellen handelt es sich um die Summe vieler schnell aufeinander folgender Einzelzellmessungen. Die Zellen, welche sich in einer Zellsuspension befinden, werden dafür einzeln hintereinander zu einem Analysepunkt geleitet, an dem sie von einem fokussierten Lichtstrahl einer Lichtquelle beleuchtet werden. Durch das optische Detektionssystem und die Elektronik des Durchflußzytometers erfolgt die Quantifizierung jeder einzelnen Zelle hinsichtlich ihrer Streulicht- und Fluoreszensemission [71].
Die Streuung des Lichts beim Auftreffen eines Lichtstrahls auf eine Zelle ist dabei von verschiedenen Eigenschaften der Zelle abhängig. Hierzu zählen die Größe der Zelle, deren intrazellulären Bestandteile, wie Granula und Vakuolen, sowie die Struktur der Zellmembran. Für die Messung werden zwei Richtungen des gestreuten Lichts berücksichtigt. Das sogenannte Vorwärtsstreulicht (engl. „forward light scatter“[FSC]), welches den größten Anteil des Streulichts darstellt, ist vor allem ein Maß für die Zellgröße. Das so genannte Seitwärtsstreulicht (engl. „side scatter“[SSC]), das seitwärts dazu streut, ist hauptsächlich von der intrazellulären Granularität abhängig. So ergibt sich, aufgrund unterschiedlicher Streulichteigenschaften der Zellen, die Möglichkeit, Rückschlüsse auf ihre Grösse und Granularität zu ziehen [71].
Die Charakterisierung von Zellen mittels Fluoreszensemission hingegen erfolgt durch die Darstellung von mit Fluorochromen konjugierten monoklonalen Antikörpern. Fluorochrome absorbieren Lichtenergie eines für sie charakteristischen Wellenlängenbereichs, dem so genannten Absorptionsspektrum. Die absorbierte Energie bewirkt dabei die temporäre Anhebung der Elektronen auf ein höheres Energieniveau. Beim anschliessenden Zurückfallen auf das energetische Grundniveau emittiert ein Elektron dann ein Photon. Dieser Vorgang wird als
Fluoreszenz bezeichnet. Da allerdings ein Teil der Energie beim Rückfall auf das Grundniveau als Wärmeenergie verloren geht, ist das abgegebene Licht, welches als Emissionsspektrum bezeichnet wird, energieärmer und damit langwelliger als das Anregungslicht.
Als Lichtquelle zur Anregung der Fluochrome kommen in der Durchflußzytometrie vor allem Argonionlaser mit einer Wellenlänge von 488 nm zum Einsatz. Dies hat zur Folge, dass nur Fluoreszenzfarbstoffe verwendet werden können, deren Absorptionsspektren diesen Wellenbereich beinhalten. Eine weitere Anforderung an die benutzten Fluoreszensfarbstoffe besteht in der Unterschiedlichkeit ihrer Emissionsmaxima. Nur dadurch können Emissionen von unterschiedlichen Detektoren erfasst, und somit mehrere Merkmale gleichzeitig analysiert werden. So erlaubt die Verwendung von geeigenten Antikörpern in Verbindung mit bestimmten Fluoreszenzfarbstoffen eine Vielzahl von Charakterisierungs- und Unterscheidungsmöglichkeiten von Zellen. Die Anwendung reicht von der Markierung einzelner Oberflächenstrukturen der Zelle über Markierung intrazellulärer Proteine bis hin zu funktionellen Tests. Die für die Auswertung notwendige Konvertierung der optischen Signale in elektrische Impulse erfolgt mit Hilfe von Photodioden und Photoröhren (photomultiplier tubes). Über eine vorhandende Computersoftware können dann die verschiedenen Eigenschaften der Zellen bildlich dargestellt und statistisch ausgewertet werden.
Die Auswertung der Höhe der entsprechenden Antigenexpression erfolgte als Relativer Fluoreszensindex (RFI), der Quotient aus der mittleren Fluoreszensintensität der mit dem entsprechenden Antigen markierten Zellen und der mittleren Fluoreszensintensität der korrespondierenden Negativkontrolle.
2.1.1 Zellproben
Für die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen wurden ausschließlich kryokonservierte Zellproben verwendet, welche vorher mittels Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation von anderen Blutbestandteilen separiert wurden. Hierbei handelt es sich um Zellproben aus peripherem Blut oder Knochenmark von insgesamt 137 Patienten mit neu diagnostizerter akuter myeloischer Leukämie (92 Erwachsene und 45 Kinder), welche einen Blastengehalt von mindestens 80 % aufwiesen.
Die AML-Diagnosestellung erfolgte anhand immunologischer und morphologischer Kriterien. Die morphologische Diagnostik richtete sich nach den Kriterien der FAB-Klassifikation (s. Abschnitt 1.2.4) Die immunologische Diagnostik mittels Durchflußzytometrie, welche nach den Richtlinien der European Group for the Immunological Characterization of Leukemias (EGIL) [72] durchgeführt wurde, beinhaltet die Färbung bestimmter linien- und reifungsassoziierter CD-Antigene mit monoklonalen Antikörpern (s. Tabelle 1.2.44-2). Mindestens 20 % der Zellen müssen das jeweilige CD-Antigen exprimieren, damit das Merkmal als positiv gewertet werden kann.
2.1.2 Auftauen
Zunächst wurden die Probenröhrchen aufgetaut und die Gesamtzellzahl bestimmt.
Auftauprotokoll:
Schwenken des Probenröhrchens in lauwarmem Wasser bis zur vollständigen Verflüssigung der Zellprobe
Überführung der Zellprobe in ein 10 ml Röhrchen
Zugabe von 5 ml RPMI (Roswell Park Memorial Institute)-Medium (im Abstand von 1 min je 1ml)
Durchmischung der Probe durch leichtes Schwenken Zentrifugieren der Probe für 5 min bei 1000 U/min Aufnahme des Zellpellets in 1ml Medium
2.1.3 Detektion Apoptose-assoziierter Proteine
2.1.3.1 Färbung der intrazytoplasmatischen Proteine Bax und Bcl-2 mittels Durchflusszytometrie
Hierbei wurde die Expression der intrazytoplasmatisch gelegenen Proteine Bax und Bcl-2 untersucht. Dafür erfolgte die Fixierung (Lösung A) der Zellen und anschließend eine Permeabilisierung (Lösung B) (Fix&Perm Cell Permeabilization Kit, An der Grub GmbH, Österreich). Bei der Färbung von Bax (s. Tabelle 2.1.33-2) wurde eine indirekte Färbemethode angewendet. Dafür wurde zunächst der monoklonale primäre Antikörper (α-Bax YTH-2D2, mouse; Trevigen, Gaithersburg, MD, USA) mit der Zellprobe inkubiert. Daran anschließend erfolgte die Inkubation mit dem FITC-konjugierten sekundären Antikörper (α-mouse-FITC, goat; Caltag Laboratories, Burlingame, CA, USA), welcher an den primären bindet und so die Expressionsmessung von intrazytoplasmatischem Bax ermöglicht. Zur Ermittlung des Anteils an unspezifischen Bindungen kam eine IgG1 Antikörper-Isotypenkontrolle
(mouse IgG1; Immunotech, Marseille, France) als Primärantikörper zur Anwendung. Für die Bestimmung der Expression von Bcl-2 (s. Tabelle 2.1.33-1) wurde ein mit FITC konjugierter Antikörper (α-bcl-2-FITC, mouse IgG1; DAKO, Glostrup, Dänemark) benutzt. Bei der verwendeten Negativkontrolle handelte es sich um eine IgG1 Isotypenkontrolle mit konjugiertem FITC und PE (mouse IgG1; Immunotech, Marseille, Frankreich)
Bei der Messung am Durchflusszytometer wurden jeweils 10000 Ereignisse/Zellen aufgenommen und die Auswertung anhand von Histogramm-Plots vorgenommen (s. Beispiel Abbildung 2.1.33-1) .
Tabelle 2.1.33-1 Protokoll Bcl2-Expression Röhrchen 1
(Negativkontrolle)
Röhrchen 2
(mit Antikörper anti-Bcl2)
je 0,5 x 106 Zellen je 1 ml PBS
Zentrifugieren 5 min bei 1000 U/min
je 10 µl Lösung A je 50 µl Lösung B je 10µl RPMI/FKS (20%)
3 µl NK FITC-PE 3 µl α - Bcl2-FITC
Inkubation für 30 min im Dunkeln
2 ml PBS
Zentrifugieren 5 min bei 1000 U/min
je 150 µl RPMI
Tabelle 2.1.33-2 Protokoll Bax-Expression Röhrchen 1 (Negativkontrolle)
Röhrchen 2
(mit Antikörper anti-Bax)
je 0,5 x 106 Zellen je 1 ml PBS
Zentrifugieren 5 min bei 1000 U/min
je 10 µl Lösung A je 50 µl Lösung B je 10µl RPMI/FKS (20%)
3 µl IgG1 1 µl α - Bax
Inkubation für 30 min im Dunkeln
2 ml PBS
Zentrifugieren 5 min bei 1000 U/min
je 40 µl RPMI je 10µl RPMI/FKS (20%) 1 µl goat-αααα-mouse-FITC
Inkubation für 30 min im Dunkeln
2 ml PBS
Zentrifugieren 5 min bei 1000 U/min
je 150 µl RPMI
MESSEN (Aufnahme von 10000 Zellen/Ereignissen)
Abbildung 2.1.33-1 Intrazelluläre Expression von Bax mittels Durchflußzytometrie
100 101 102 103 104 Bax (FL1-Height) 70 60 50 30 40 20 10 0 c o u n ts 80 RFI = 4.69 M1 100 101 102 103 104 Bax (FL1-Height) 70 60 50 30 40 20 10 0 c o u n ts 80 RFI = 7.62 M3 100 101 102 103 104 Bax (FL1-Height) 120 60 90 30 0 c o u n ts 150 RFI = 6.78 M4
Legende: Intrazelluläre Expression von Bax : Antigenexpression als RFI (Relativer FluoreszensIndex); x-Achse: Fluoreszensintensität; y-Achse: registrierte Ereignisse/Zellzahl; M1; M3; M4 verschiedene Patientenproben; ---- Negativkontrolle, ─ Patientenprobe
2.2 Immunoblot
2.2.1 Immunoblot – Methodik
Der Immunoblot ist eine Methode, um Proteine, die durch Gelelektrophorese aufgetrennt wurden, auf einer Membran zu fixieren. Das so genannte Semi-Dry-Verfahren, welches in dieser Arbeit zur Anwendung kam, ist dabei eine schnelle und wenig aufwendige Transfermethode. Die auf die Membran („Blot“) transferierten Proteine stehen dann für weitere Untersuchungen zur Verfügung. Hierfür werden die „Blots“ in einer Lösung mit einem primären Antikörper inkubiert, der gegen das nachzuweisende Protein gerichtet ist. Um die Bindung an das entsprechende Protein zu visualisieren, erfolgt die Inkubation mit einem sekundären Antikörper, der gegen den primären Antikörper gerichtet ist und selbst mit einem Enzym, radioaktiven oder anderen Elementen verbunden ist, um eine Visualisierung der Protein-Antikörperbindung zu ermöglichen. In dieser Arbeit wurde die Methode der Chemoluminiszenz angewandt, bei der eine am sekundären Antikörper gebundene Meerrettich-Peroxidase in Gegenwart von Wasserstoffperoxid Luminol oxidiert und somit für eine Emission von Licht sorgt, welche durch einen weiteren Stoff („Enhancer“) verstärkt wird. Die Lichtemission kann dann durch die Schwärzung eines Fotofilms detektiert werden.
2.2.2 Initiale Bestimmung des Gesamtproteingehaltes
Zunächst erfolgte die Bestimmung des Gesamtproteingehaltes der Zellproben mittels Erstellung einer Eichreihe aus definierten Proteinkonzentrationen und deren photometrischer Extinktionsmessung (s. Reihe A + B Tabelle 2.2.2-1). Hierfür wurden die Zellproben, welche als Zellpellet vorlagen, zunächst mit 100 µl Lysispuffer (LP) pro 1x107 Zellen lysiert. Nach Zugabe des Lysispuffers und einer einstündigen Lagerung der Zellsuspension auf Eis erfolgte, bei nicht homogener Suspension, eine Behandlung im Ultraschallbad für 3 mal 5 s. Alle Messungen erfolgten als Doppelbestimmungen. Die Erstellung der Eichreihe mit entsprechenden Reagenzien wurde lt. Pipettierschema (s. Tabelle 2.2.2-1) durchgeführt.
Nach der Inkubation für 30 min bei 37 °C erfolgte die Extinktionsmessung der definierten Proteinkonzentrationen sowie der Zellproben bei 560 nm.
Durch die anschließende Berechnung einer Regressionsgeraden aus den Extinktions-Mittelwerten für die definierten Proteinkonzentrationen wurde die jeweilige Proteinkonzentration der AML-Zellproben unter Berücksichtigung des Verdünnungsfaktors ermittelt (s. Abbildung 2.2.2-1)
Tabelle 2.2.2-1 Erstellung der Eichreihe - Pipettierschema
1 2 3 4 … 7 8 9 10 11 A BSA 0 µl LP 100 µl BCA 100 µl BSA 10 µl LP 90 µl BCA 100 µl BSA 20 µl LP 80 µl BCA 100 µl BSA 30 µl LP 70 µl BCA 100 µl BSA 60 µl LP 40 µl BCA 100 µl BSA 70 µl LP 30 µl BCA 100 µl BSA 80 µl LP 20 µl BCA 100 µl BSA 90 µl LP 10 µl BCA 100 µl BSA 100 µl LP 0 µl BCA 100 µl B BSA 0 µl LP 100 µl BCA 100 µl BSA 10 µl LP 90 µl BCA 100 µl BSA 20 µl LP 80 µl BCA 100 µl BSA 30 µl LP 70 µl BCA 100 µl BSA 60 µl LP 40 µl BCA 100 µl BSA 70 µl LP 30 µl BCA 100 µl BSA 80 µl LP 20 µl BCA 100 µl BSA 90 µl LP 10 µl BCA 100 µl BSA 100 µl LP 0 µl BCA 100 µl C Patient1 1:20 Patient2 1:20 D Patient1 1:20 Patient2 1:20 Legende:
BSA: Bovine Serum Albumin (ICN, USA) 2 mg/ml
LP: Lysispuffer 10 mmol TRIS-Base
2 mmol EDTA
1 % Triton 100 (Sigma)
0,1 % SDS (Merck)
Proteinaseinhibitor (Complete Böhringer) 1 Tablette pro 50 ml
BCA: BCA-Reagenz (Pierce,USA), Reagenz A:Reagenz B=50:1
Abbildung 2.2.2-1 Bestimmung Proteinkonzentration - Regressionsgerade 0,00 0,13 0,31 0,51 0,76 1,04 1,38 1,74 2,01 2,31 2,60 y = 0,0012x R2 = 0,9733 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 0,00 500,00 1000,00 1500,00 2000,00 2500,00 Proteinkonzentration (BSA in µg/ml) E X T IN K T IO N BSA-Standard Linear (BSA-Standard)
2.2.3 Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese
Die Auftrennung der Proteine erfolgte durch eine Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese. Für die Herstellung des Trenngels wurden 3-3,5 ml des Gelansatzes zwischen zwei Glasplatten gegossen und mit aqua bidest überschichtet. Nach beendeter Polymerisation wurde das überstehende aqua bidest entfernt und mit dem Sammelgelansatz bis zur oberen Kante der Glasplatten aufgefüllt. Das Einsetzen des Kamms für die späteren Geltaschen erfolgte unter Vermeidung von Luftblasenbildung. Nach beendeter Polymerisation des Sammelgels wurde der Kamm entfernt und die Gele in die Elektrophoresekammer (Biorad) überführt. Vor der Beladung des Gels wurde die Elektrophoresekammer mit Laufpuffer aufgefüllt.
Jede Geltasche des über dem Trenngel befindlichen Sammelgels wurde mit 20 µg Protein einer Patientenprobe bestückt, welche zuvor mit einem Ladepuffer auf 15 µl
aufgefüllt und anschließend bei 95°C für 5 min denaturiert wurde. Weiterhin wurde eine Bahn des Gels jeweils mit 20 µg Protein der Zellinie BJAB (human Burkitt-like lymphoma cell line) bestückt, welche alle der mittels Immunoblot untersuchten Proteine exprimiert und damit als Positiv-Kontrolle fungierte. Eine weitere Geltasche wurde jeweils mit 4 µl eines Markers für das Molekulargewicht bestückt. Nach der Beladung des Gels erfolgte zunächst die Passage des Sammelgels für ca. 15-20 min bei 100 mV. Zur daran anschließenden Passage des Trenngels wurde die Spannung auf 200 mV für eine Zeit von 35 min erhöht. Nachdem die Bromphenolblau-Front des Ladepuffers das Trenngelende erreicht hatte, wurde die Elektrophorese beendet und die Gele für den anschließenden Western Blot aus den Kammen entfernt.
2.2.3.1 Zusammensetzung der Substanzen für Gelherstellung für Polyacryalamid-Gel -Elektrophorese (wie in 2.2.3 beschrieben)
Herstellung des Trenngels (12%):
Ansatz für zwei kleine Gele (in 15 ml Röhrchen):
PAA 3,60 ml
Trenngel-Puffer 2,25ml
Aqua bidest 3,15ml
APS 45, 0 µl
TEMED 4, 5 µl
Herstellung des Sammelgels (5%):
Ansatz für zwei kleine Gele (in 15 ml Röhrchen):
PAA 0,85ml Sammelgel-Puffer 1,25ml Aqua bidest 2,90ml APS 20, 0 µl TEMED 5, 0 µl Legende für Gelansätze:
PAA: Polyacrylamid (Biorad)
APS: Ammoniumperoxidisulfat Temed: Tetramethyldiamin Trenngel-Puffer(4-fach): 91,0 g Tris-Base ca. 120,0 ml 1 N HCL (Merck) 2,0 g SDS ad 500 ml aqua bidest; pH 8,8 Sammelgel-Puffer: 6,0 g Tris-Base ca. 48,0 ml 1 N HCL (Merck)
0,4 g SDS
ad 100 ml aqua bidest; pH 6,8
Laufpuffer (10-fach): 30,3 g Tris-Base 144,0 g Glycin
10 g SDS
ad 1000 ml aqua bidest; pH 8,3
Ladepuffer (2-fach): 12,5 ml Sammelgelpuffer
2,0 g SDS
1,0 ml 2- Mercaptoethanol (Merck) 10 ml Glycerin (Merck)
2,0 mg Bromphenolblau (Merck)
2.2.4 Western Blot im Semidry-Verfahren
Im Anschluss an die Elektrophorese folgte der Western Blot. Die Proteine aus dem Gel wurden dabei auf eine Nitrozellulosemembran transferiert. Die Transferzeit betrug 1h bei 0,8 mA/cm².
Aufbau des Transfer -„Sandwiches“:
Zuschneiden von Filterpapieren und Nitrozellulosemembran auf Gelgröße
Kathode (-)
3 Filterpapiere getränkt in Puffer C
G E L
Nitrozellulosemembran getränkt in Puffer B 2 Filterpapiere getränkt in Puffer B
1 Filterpapier getränkt in Puffer A
Anode (+)
Legende:
Filterpapier: Whatman-Paper®
Nitrozellulosemembran: Porengröße 0,2 µm (Schleicher&Schuell) Puffer A: 300,0 mmol/l Tris-Base pH 10,4
Puffer B: 25,0 mmol/l Tris-Base pH 9,4
Puffer C: 25,0 mmol/l Tris-Base pH 10,4 40,0 mmol/l Glycin (Merck)
2.2.5 Immundetektion
Nach dem Transfer der Proteine auf die Nitrozellulosemembran folgte die Immundetektion. Zur Absättigung freier Bindungsstellen wurde die Membran zunächst für 1 h bei Raumtemperatur in Blockierungspuffer inkubiert. Daran anschließend erfolgte die Inkubation mit dem primären Antikörper in geeigneter Verdünnung mit Blockierungspuffer für 1 h bei Raumtemperatur.
Nach der Inkubation folgten mehrere Waschschritte um die Membran von überschüssiger Antikörperlösung zu trennen. Hierfür wurde Blockierungspuffer für 3 x 5 min und 1 x 15 min verwendet.
An die Waschritte schloss sich die Inkubation mit dem sekundären, einem Meerrettich-Peroxidase konjugierten, Antikörper an. Nach der einstündigen Inkubation folgten wiederum mehrere Waschschritte:
3 x 5 min in Blockierungspuffer
1 x 10 min in TBS mit 0,05 % Tween 20 1 x 15 min in entmineralisiertem Wasser
Lösungen:
Blockierungspuffer: 0,5 % fettarme Trockenmilch 0,05 % Tween 20 (Calbiochem) Tris gepufferte Saline (TBS): 50 mmol/l Tris-Base pH 7,4
150 mmol/l NaCl (Roth)
Bei den untersuchten Proteinen und den verwendeten Antikörpern handelte es sich im einzelnen um:
Actin (rabbit, Sigma, USA) Verdünnung 1:1000
cIAP-1 (rabbit, R&D Sytems, Deutschland) Verdünnung 1:1000 Bcl-xl (rabbit, Santa Cruz Biotechnology, USA) Verdünnung 1:200 Caspase 3 (rabbit, Pharmingen, USA) Verdünnung 1:1500
XIAP (mouse, Transduction Laboratories, USA) Verdünnung 1:250 Survivin (rabbit, R&D Sytems, Deutschland) Verdünnung 1:1000 sekundäre Antikörper:
anti-rabbit (goat, Promega Corporation, USA) Verdünnung 1:5000 anti-mouse (goat, Promega Corporation, USA) Verdünnung 1:5000
