der Medizinischen Hochschule Hannover (Ärztlicher Direktor: Univ.-Prof. Dr. med. habil. Alexander Kapp)
DNA-Zytometrie von Talgdrüsentumoren
der Haut
Inauguraldissertation zur
Erlangung des Doktorgrades in der Humanmedizin der
Medizinischen Hochschule Hannover
Vorgelegt von Natalja Denisjuk aus Kysyl-Syr
Hannover, 2007
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover Präsident/Präsidentin: Professor / Professorin Dr.
Betreuer der Arbeit:
Referent/Referentin:
Korreferent(en) / Korreferentin(nen):
Tag der mündlichen Prüfung:
Promotionsausschussmitglieder:
Widmung
Meiner Großmutter, Ada Skladman * 01.03.1927 † 25.07.1987
in großer Dankbarkeit gewidmet
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover Am 19.06.2009
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover
Präsident: Prof. Dr. med. Dieter Bitter-Suermann Betreuer der Arbeit: Prof. Dr. med. Alexander Kapp Referent: Prof. Dr. med. Michael Tronnier Korreferent: PD Dr. Reichard von Wassielewski Tag der mündlichen Prüfung: 19.06.2009
Promotionsausschussmitglieder:
Prof. Dr. Karl Welte
Frau Prof.‘in Dr. Sylvia Glüer Prof. Dr. Dietrich Peest
I. EINLEITUNG ...7
I.1 ALLGEMEINE EINFÜHRUNG...7
I.1.1. Talgdrüsen und Talgdrüsentumoren ...7
I.1.1.1. Histologie der Talgdrüsen... 7
I.1.1.2. Definition der Talgdrüsentumoren... 8
I.1.1.2.1. Talgdrüsenhyperplasie... 8
I.1.1.2.1.1. Klinisches Bild... 9
I.1.1.2.1.2. Histologie... 9
I.1.1.2.1.3. Therapie ... 10
I.1.1.2.1.4. Differenzialdiagnose ... 10
I.1.1.2.2. Naevus sebaceus von Jadassohn (=organoider Naevus) ... 10
I.1.1.2.2.1. Klinisches Bild... 10
I.1.1.2.2.2. Histologie... 11
I.1.1.2.2.3. Therapie ... 11
I.1.1.2.3. Talgdrüsenadenom ... 12
I.1.1.2.3.1. Klinisches Bild... 12
I.1.1.2.3.2. Histologie... 12
I.1.1.2.3.3. Therapie ... 13
I.1.1.2.4. Sebazeom ... 13
I.1.1.2.4.1. Klinisches Bild... 14
I.1.1.2.4.2. Histologie... 14
I.1.1.2.4.3. Therapie ... 15
I.1.1.2.5. Muir-Torre Syndrom ... 15
I.1.1.2.6. Talgdrüsenkarzinom... 15
I.1.1.2.6.1.Klinisches Bild... 16
I.1.1.2.6.2. Histologie... 16
I.1.1.2.6.3. Therapie ... 17
I.1.2. DNA-Zytometrie ...18
I.1.2.1. Bisherige Untersuchungsmethoden ... 18
I.1.2.2. DNA-Zytometrie ... 18
I.1.2.2.1. Indikation ... 18
I.1.2.2.2. Biologische Grundlagen ... 19
I.1.2.2.3. Material und Methoden ... 20
I.1.2.2.3.1.Untersuchungsgut... 20
I.1.2.2.3.2. DNA-Färbung ... 20
I.1.2.2.3.3. Messverfahren... 20
I.1.2.2.4. Diagnostische Interpretation... 21
I.2 ZIEL- UND FRAGESTELLUNG...22
II. MATERIAL UND METHODE...23
II.1 PRÄPARATGUT...23
II.1.1. Auswahl der Präparate...23
II.1.2. Anzahl der Präparate ...23
II.1.3. Kontrollpräparate...23
II.2. TECHNISCHE AUSSTATTUNG...24
II.2.1. Technische Ausstattung im histologischen Labor...24
II.2.2. Technische Ausstattung für die digitale DNA-Zytometrische Diagnostik...24
II.3. PRAKTISCHES VORGEHEN BEI DER VORBEREITUNG VON ZELLVEREINZELUNG...25
II.3.2. Automatische Rehydratation (1.Tag)...25
II.3.3. Enzymatische Zellvereinzelung (2.Tag) ...26
II.3.4. Mechanische Zellvereinzelung (2.Tag)...27
II.3.4.1. Zytozentrifugieren... 27
II.4. „FEULGEN-FÄRBUNG“ NACH RICHTLINIEN DER ESACP (EUROPEAN SOCIETY FOR ANALYTICAL CELLULAR PATHOLOGY) (3.TAG)...29
II.5. DNA-ZYTOMETRISCHE UNTERSUCHUNG...31
II.5.1. Untersuchungsmaterial...31
II.5.2. Untersuchungsmethode...31
II.5.2.1.DNA-Messung ... 31
II.5.2.2. Physikalische Grundlagen und diagnostische Kriterien der DNA-Zytometrie ... 34
II.5.2.3. Biologische Grundlagen der DNA-Zytometrie... 36
II.5.2.4. DNA-Histogramm... 38
II.5.3. Statistische Auswertung ...40
III. ERGEBNISSE ...41
III.1. TUMORTYPEN...41
III.1.1. Benigne Talgdrüsentumoren ...41
III.1.2. Borderline Talgdrüsentumoren ...42
III.1.3. Talgdrüsenkarzinome ...42
III.2. DNA-ZYTOMETRISCHE PARAMETER...42
III.2.1. 5[c]-Exceeding-Events ...42
III.2.2. 2[c]-Deviation-Index...44
III.2.3. Stammlinie: Modalwert (= modal value) und Ploidie...45
III.3. DNA-HISTOGRAMME DER BENIGNEN, BORDERLINE UND MALIGNEN TALGDRÜSENTUMOREN...47
III.3.1. Benigner Talgdrüsentumor (Talgdrüsenhyperplasie) ...47
III.3.2. Borderline Tumor (Atypisches Talgdrüsenadenom)...47
IV. DISKUSSION ...49
IV.1. BEDEUTUNG DER DNA-ZYTOMETRIE IN DER DIAGNOSTIK...49
IV.2. AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE...51
IV.2.1. 5[c]-Exceeding-Events ...51
IV.2.1.1. 5[c]-Exceeding-Events bei benignen Talgdrüsentumoren ... 51
IV.2.1.2. 5[c]-Exceeding-Events bei borderline Talgdrüsentumoren... 51
IV.2.1.3. 5[c]-Exceeding-Events bei malignen Talgdrüsentumoren ... 52
IV.2.1.4. 5[c]-Exceeding-Events : Schlussfolgerung ... 52
IV.2.2. 2[c]-Deviation-Index ...52
IV.2.2.1. 2[c]-Deviation-Index bei benignen Talgdrüsentumoren ... 52
IV.2.2.2. 2[c]-Deviation-Index bei borderline Talgdrüsentumoren ... 52
IV.2.2.3. 2[c]-Deviation-Index bei malignen Talgdrüsentumoren ... 53
IV.2.2.4. 2[c]-Deviation-Index : Schlussfolgerung... 53
IV.2.3. Stammlinie: Modalwert (= modal value) und Ploidie ...53
IV.2.3.1. Modalwert bei benignen Talgdrüsentumoren ... 53
IV.2.3.2. Modalwert bei borderline Talgdrüsentumoren... 54
IV.2.3.3. Modalwert bei malignen Talgdrüsentumoren ... 54
IV.3. ZUSAMMENFASSUNG DER ERGEBNISSE...54
IV.4. BEDEUTUNG DER DNA-ZYTOMETRIE BEI DER DIAGNOSTIK VON TALGDRÜSENTUMOREN...55
IV.4.1. Korrelation zwischen histopathologischer und DNA-Zytometrischer Befunderhebung...55
IV.4.2. Arbeits- und Kostenaufwand ...56
V. ZUSAMMENFASSUNG ...57
VI. LITERATURVERZEICHNIS: ...59
VII. ANHANG...71
VIII. LEBENSLAUF ...73
IX. DANKSAGUNG ...75
Abkürzungsverzeichnis:
2cDI 2[c] deviation index, 2[c]-Abweichungsindex 5cEE 5[c]-exceeding events, 5[c]-Ausreißerzelle CMV Cytomegalievirus
CV Variationskoeffizient DI DNA-Index
HE Hämatoxylin-Eosin-Färbung HPV Humanes Papillomavirus HSV Herpes-simplex-Virus IOD Integrierte optische Dichte
MI Malignancy Index, Malignitätsindex MV Modalwert ( = modal value)
STL Stammlinie
I.Einleitung
I.1 Allgemeine Einführung
I.1.1. Talgdrüsen und Talgdrüsentumoren
I.1.1.1. Histologie der Talgdrüsen
Die Talgdrüsen (Glandulae sebaceae) gehören zu den Anhangsgebilden der Haut.
Sie sind meistens mit den Haarfollikeln assoziiert und bilden mit ihnen zusammen eine follikulär-sebazeöse Einheit (110). Noch präziser wird diese Einheit als follikulär-sebazeös- apokrin bezeichnet, denn sowohl apokrine Schweißdrüsen als auch Talgdrüsen haben ihren Ursprung im Haarfollikelkeimepithel und sind mit dem Haarfollikel auch anatomisch verbunden.
Während der Sprossung des embryonalen Haarfollikels weiter in die Dermis entwickeln sich aus ihm drei Epithelknospen, die als Anlage für die Schweißdrüsen (die obere Knospe), Talgdrüsen (die mittlere Knospe) und den Ansatz des Musculus arrectorius (die untere Knospe) dienen (97). Die Entwicklung der Talgdrüsen aus der mittleren Knospe erfolgt zuerst am Kopf im 4. Schwangerschaftsmonat. Die Entwicklung vollzieht sich wie bei Haarfollikeln nach kaudal (95). Mit der Größenzunahme der mittleren Knospe in dieser Zeit differenziert sich eine basale Keimzellschicht von den anderen Zellschichten mit reifenden, vakuolisierenden Sebozyten (97). Bei der Geburt sind die Talgdrüsen wesentlich größer als im Kindesalter und tragen wesentlich zur Produktion von Vernix caseosa bei (95).
Die Talgdrüsen sind in der weiteren Entwicklung überall auf der Haut anzutreffen. Sie sind besonders zahlreich im Kopf- und Halsbereich, fehlen jedoch auf den Palmar- und Plantarflächen. Die Ausführungsgänge der Talgdrüsen münden auf der Haut in die äußere epitheliale Wurzelscheide des Haars.
Ektopische, nicht mit den Haarwurzeln assoziierte Talgdrüsen befinden sich sowohl an den Brustwarzen und am Brustwarzenhof als auch auf den Labiae minorae, am Präputium und gelegentlich auf der bukkalen Schleimhaut. Bei dieser Talgdrüsenart treten keine Neoplasien auf.
Zusätzlich werden folgende Talgdrüsen der periokulären Region von den anderen unterschieden:
a) Meibom-Drüse des Augenlids b) Zeis-Drüse der Zilien
c) Talgdrüsen der Augenbrauen, der Augenlideroberfläche und der Karunkel.
Die Augenliderdrüsen v.a. die Meibom-Drüsen sind von den Talgdrüsenkarzinomen am häufigsten betroffen (97).
Da die Talgdrüsen morphologisch eng mit der Haarwurzel und den apokrinen Drüsengängen verbunden sind, zeigen zahlreiche Talgdrüsenneoplasien eine follikuläre und apokrine Komponente (86).
Eine Talgdrüse besteht aus einigen Läppchen, die einen Haarfollikel im oberen Anteil umgeben und über Talgdrüsenausführungsgänge mit dessen Infundibulum in Verbindung stehen.
Jedes Talgdrüsenläppchen besteht aus einer einzelnen peripheren undifferenzierten germinativen Zellschicht mit kubischen, basophilen Vorläuferzellen und den zentral gelegenen reifen vakuolisierten Sebozyten.
Die Zellen in der Nähe des Ausführungsganges werden apoptotisch und setzen somit ihr Lipid frei. Die gesamte kernlose Talgdrüsenzelle wird als Talg in den Haarfollikel holokrin sezerniert (63,97).
I.1.1.2. Definition der Talgdrüsentumoren
Histopathologisch sind reife Sebozyten als Zeichen für eine talgdrüsige Differenzierung eines Tumors zu werten. Die Zellen der basalen Germinativzellschicht unterscheiden sich kaum von den basaloiden Tumorzellen der Epidermis oder des Haarfollikels.
Die Diagnostik der Talgdrüsentumoren wird ausschließlich nach morphologischen Kriterien am HE-Präparat durchgeführt.
Als Hilfsmittel dient die immunhistochemische Markierung der ausdifferenzierten Sebozyten im sonst überwiegend basaloiden Tumorgewebe mit EMA (63).
Zu den am häufigsten vorkommenden Talgdrüsentumoren wird die Talgdrüsenhyperplasie gezählt.
I.1.1.2.1. Talgdrüsenhyperplasie
Eine Talgdrüsenhyperplasie tritt meistens bei Erwachsenen mittleren Alters im Gesicht auf.
Selten wird sie in früherem Alter diagnostiziert (30). Multiple Talgdrüsenhyperplasien
kommen auch bei immunsupprimierten Patienten vor, z.B. bei Zyklosporinbehandlung oder im Rahmen einer Dialyse (66).
Die Talgdrüsenhyperplasie stellt eher eine hamartomatöse Vergrößerung der Drüsen mit verlangsamter Bewegung der Sebozyten von der Basalmembran zu den Drüsenlobuli bzw.
Drüsengängen dar (71).
I.1.1.2.1.1. Klinisches Bild
Die Talgdrüsenhyperplasie findet sich hauptsächlich auf der Stirn- oder Wangenhautoberfläche in Form einer kleinen, nur wenige Millimeter großen, zentral genabelten, gelblichen, weichen Papel.
I.1.1.2.1.2. Histologie
In der Übersicht erscheint der Tumor symmetrisch, bestehend aus großen reifen Talgdrüsenläppchen um ein zentrales Infundibulum, gefüllt mit Debris und Bakterien.
Die Sebozyten sind kleiner als gewöhnlich und die Basalzellen sind leicht vermehrt (63,68).
Abbildung 1: Talgdrüsenhyperplasie
I.1.1.2.1.3. Therapie
Eine Therapie ist nicht zwingend erforderlich. Aus kosmetischen Gründen kann die Läsion entweder mechanisch durch z.B. Exzision, Laser oder medikamentös mit Isotretinoin behandelt werden.
I.1.1.2.1.4
.
DifferenzialdiagnoseZu den Differenzialdiagnosen der Talgdrüsenhyperplasie gehören Naevus sebaceus und Talgdrüsenadenom, an der Nase auch das Rhinophym (70).
I.1.1.2.2. Naevus sebaceus von Jadassohn (=organoider Naevus)
Der Naevus sebaceus tritt als eine angeborene komplexe Fehlbildung im Kopf-Hals-Bereich auf (63,70).
Multiple Naevi sebacei finden sich assoziiert mit Anfallsleiden und geistiger Retardierung (37,72), neurologischen Ausfallserscheinungen (109) bzw. Knochendeformitäten (55) im Rahmen des sog. „neurokutanen Syndroms“.
In der Pubertät entwickelt der Naevus sebaceus sein typisches histologisches Erscheinungsbild.
In einem organoiden Nävus können sich im Erwachsenenalter solche Tumoren wie Syringocystadenoma papilliferum, Trichoblastome, Trichilemmome, Hidradenome (29) und seltenere Hautgeschwülste wie Leiomyome (26), Syringome, Basalzellkarzinome, Plattenepithelkarzinome, naevoide Melanozytenverbände (76), Keratoakanthome, Porokarzinome (102) und weitere Talgdrüsen- und Schweißdrüsentumoren (116) entwickeln.
I.1.1.2.2.1. Klinisches Bild
Aus einem haarlosen gelblichen Fleck am Kapillitium beim Neugeborenen entwickelt sich der Naevus sebaceus unter dem Einfluss der hormonellen Entwicklung in der Pubertät zu einem verrukösen Gebilde mit grau-bräunlich pigmentierter Epidermishyperplasie (63).
I.1.1.2.2.2. Histologie
In der Kindheit sind unreife kleine Follikel-Talgdrüsenkomplexe das Leitmerkmal des Naevus sebaceus. Die Epidermis ist leicht akanthotisch, Haarwurzeln und Terminalhaare fehlen fast vollständig.
In der Pubertät nehmen die Talgdrüsen im Tumor deutlich an Größe zu, die Epidermis wird mehr papillomatös und akanthotisch und es entwickeln sich häufig zystisch dilatierte Schweißdrüsenverbände (1,63,73,110,116).
Bei älteren Patienten können sich, wie schon oben beschrieben, verschiedene Hauttumoren innerhalb eines Naevus sebaceus entwickeln.
Abbildung 2: Naevus sebaceus
I.1.1.2.2.3. Therapie
Da sich ab dem 2. bis 3. Dezennium auch bösartige Adnextumoren entwickeln können, empfiehlt es sich den organoiden Naevus engmaschig zu kontrollieren bzw. zu exzidieren (63).
I.1.1.2.3. Talgdrüsenadenom
Das Talgdrüsenadenom ist ein seltener gutartiger zumeist solitärer Tumor. Es kann solitär oder multipel in Zusammenhang mit Viszeraltumoren im Rahmen eines Muir-Torre- Syndroms vorkommen (63,110).
I.1.1.2.3.1. Klinisches Bild
Das Talgdrüsenadenom ist meist ein weißlich-gelblicher, runder, ca. 0,5 cm im Durchschnitt großer Tumor im Kopf-Hals-Bereich eines älteren Patienten (83). Selten wird es auch an der Wangenschleimhaut vorgefunden (36). Gelegentlich kommt es zu zentralen Ulzerationen und Blutungen (110).
I.1.1.2.3.2. Histologie
Dieser Talgdrüsentumor ist gut umschrieben und besteht aus scharf begrenzten Drüsenläppchen, die durch ein Bindegewebsseptum voneinander getrennt sind. Der Tumor wird kragenförmig von verlängerten Reteleisten eingefasst. Die Talgdrüsenläppchen weisen einen Randsaum aus kleinen basophilen undifferenzierten Sebozyten, zentral gelegenen reifen Zellen und Übergangsformen zwischen ihnen auf. Somit dominieren die reifen Sebozyten.
Es kommen vereinzelt Mitosen in der Basalzellschicht vor. Strukturen der Talgdrüsenausführungsgänge fehlen fast vollständig. Zentral kommt es häufig zur Bildung einer zystischen Erweiterung, gefüllt mit holokrin abgestoßenen Zellresten. Eine zystische Form des feingeweblichen Tumoraufbaus gilt als wichtiger Hinweis auf ein Muir-Torre- Syndrom (63,110).
Abbildung 3: Talgdrüsenadenom
I.1.1.2.3.3. Therapie
Das Talgdrüsenadenom erfordert eine komplette Exzision im Gesunden, denn bei einer unvollständigen Tumorentfernung kommt es zu einer Rezidivbildung. Bei der Diagnose eines Talgdrüsenadenoms sollte ein Muir-Torre-Syndrom ausgeschlossen werden.
I.1.1.2.4. Sebazeom
Den Begriff Sebazeom führten 1984 J.L. Troy und A.B. Ackerman für einen gutartigen überwiegend basaloid erscheinenden sebozytären Adnextumor ein (63,105), der in der früheren Fachliteratur als Basalzellkarzinom mit sebozytärer Differenzierung (69,83) bzw. als Talgdrüsenepitheliom bezeichnet wurde (25,31).
I.1.1.2.4.1. Klinisches Bild
Das Sebazeom tritt meistens als ein kleinknotiger, solitärer, gelblicher Tumor im Kopfbereich häufiger bei älteren Frauen als bei Männern auf. Das multiple Auftreten lässt an Muir-Torre- Syndrom denken (83). Das Sebazeom weist ein langsames Wachstum auf.
I.1.1.2.4.2. Histologie
Das Sebazeom besteht aus multiplen, gut abgrenzbaren Nestern aus Talgdrüsenzellen der Basalschicht und ist in der oberen und mittleren Dermis konzentriert. Innerhalb dieser Zellverbände befinden sich einzelne oder kleingruppierte reife Sebozyten. Somit überwiegen die basaloiden Talgdrüsenzellen. Die ungeordneten Talgdrüsenausführungsgänge können zu Zysten verschmelzen, welche Talg enthalten können. Mitosen kommen vereinzelt vor, aber Atypien, die charakteristisch für das Talgdrüsenkarzinom sind, fehlen.
Ein Basalzellkarzinom mit talgdrüsiger Differenzierung ist die wichtigste Differenzialdiagnose für das Sebazeom. Es sind auch Überlappungen im feingeweblichen Bau der beiden Tumoren beschrieben worden (63,105,110).
Abbildung 4: Sebazeom
I.1.1.2.4.3. Therapie
Ein Sebazeom erfordert eine vollständige Exzision des Tumors und zeigt meistens eine sehr niedrige Rezidivrate.
I.1.1.2.5. Muir-Torre Syndrom
Über das Muir-Torre-Syndrom wurde zum ersten Mal 1967 berichtet (103). Es bezeichnet das multiple Auftreten von Talgdrüsentumoren assoziiert mit viszeralen Tumoren, v.a. mit gastrointestinalen Karzinomen (6,45,81,82,94,111).
Talgdrüsentumoren sind meistens schwer zu identifizieren, jedoch tragen sie Züge entweder von Talgdrüsenadenom, Sebazeom oder Talgdrüsenkarzinom (44).
Der feingewebliche Bau der Talgdrüsentumoren beim Muir-Torre-Syndrom weist Besonderheiten wie keratoakanthomartigen oder zystischen Aufbau auf (27).
Bei den stärker proliferierenden Tumoren mit Atypien und Ulzeration ist der sichere Ausschluss eines sich entwickelnden Talgdrüsenkarzinoms nicht möglich. Bisher wurden keine Metastasierungen oder Rezidive von Muir-Torre-Talgdrüsenkarzinomen beobachtet, was es von den anderen Talgdrüsenkarzinomen unterscheidet (84).
I.1.1.2.6. Talgdrüsenkarzinom
Das Talgdrüsenkarzinom ist nach der Lokalisation klassifiziert:
1. Talgdrüsenkarzinome im Lidbereich, ausgehend von Meibom-Drüsen, den Zeis- Drüsen oder okulären follikelgebundenen Talgdrüsen.
2. Extraokuläre Talgdrüsenkarzinome (43,78).
Letztere kommen selten vor. Die okulären Talgdrüsenkarzinome dagegen machen 1% aller Tumoren des Augenlides aus und werden am Oberlid häufiger diagnostiziert als am Unterlid.
Ein Drittel der Fälle metastasiert in die lokalen Lymphknoten, v.a. präaurikulär und zervikal.
Die 5-Jahre-Überlebensrate beträgt ca. 20% (80,117).
Über die Metastasierung der extrokulären Karzinome wurde weit seltener berichtet. Diese Art von Karzinomen ist weniger aggressiv als die von okulären Talgdrüsenkarzinomen (62,65,113).
Vereinzelt kommen Talgdrüsenkarzinome bei Muir-Torre-Syndrom vor (43).
Die Ätiologie dieser Talgdrüsenkarzinome bleibt bisher noch ungeklärt.
I.1.1.2.6.1.Klinisches Bild
Die extraokulären Tumoren kommen in Form einer gelblichen derben Papel, ca. 1-4 cm im Durchmesser und häufig ulzeriert im Kopf- und Halsbereich, vereinzelt an den Füßen, Labien und Penis vor (60,79,113).
I.1.1.2.6.2. Histologie
Der Tumor besteht aus Zellformationen, die voneinander durch ein fibrovaskuläres Stroma getrennt sind. Er ist meistens asymmetrisch und invadiert tief bis an das subkutane Fettgewebe.
Der histologische Befund variiert mit dem Differenzierungsgrad des Karzinoms. Meistens sind die Zellen fein oder schaumig vakuolisiert und färben sich am Gefrierschnitt durch Oil- Red-O bzw. Sudanschwarz. Die Zellkerne sind groß und es finden sich zahlreiche Mitosefiguren. Häufig weist der Tumor Nekroseherde auf.
Ergänzend können die Tumorzellen immunhistochemisch mit Hilfe von EMA (epitheliales Membranantigen), “human milk fat globules subclass 1 and 2“ oder Leu-M1 (CD15) markiert werden (80,83,106).
Im Elektronmikroskop werden im Zytoplasma Lipidtröpfchen sichtbar (113,117).
Abbildung 5: Talgdrüsenkarzinom
I.1.1.2.6.3. Therapie
Als primäre kurative Maßnahme gilt eine möglichst großzügige Exzision des Tumors.
Bei einem periorbitalen Befall wird eine Exenteratio orbitae (sprich Ausschälung der Orbita) durchgeführt.
Bei einem extraokulären Befund wird eine Exzision mit einem Sicherheitsabstand von 5-6 mm empfohlen. Dieses Verfahren ist noch nicht ganz optimal, denn bei 1/3 der Fälle kommt es zu einem lokalen Rezidiv.
Bei auffälligen regionalen Lymphknoten ist eine Lymphadenektomie in kurativem Sinne notwendig.
Bei nicht operablen Befunden wird eine Radio- und Chemotherapie als eine palliative Maßnahme durchgeführt.
I.1.2. DNA-Zytometrie
I.1.2.1. Bisherige Untersuchungsmethoden
Die bisherige Diagnostik der Talgdrüsentumoren orientiert sich an die makroskopischen und histopathologischen Untersuchungen. Außer den histologischen Standardmethoden z.B. die HE-Färbung existieren noch andere histochemische Spezialtechniken zur Darstellung von Talgdrüsentumorzellen.
Dazu gehören Oil-Red-O- und Sudanschwarz-Färbungen, die gezielt die Tumorzellen talgdrüsiger Differenzierung zum Vorschein bringen.
Dabei ist eine klare Abgrenzung der Borderline-Tumoren, die im weiteren Verlauf entarten können, von den malignen Neoplasien nicht immer sicher festzustellen und bereitet für den beurteilenden Arzt immer wieder Schwierigkeiten. Zu den sogenannten Borderline-Tumoren zählen v.a. die atypischen Adenome.
Außerdem sind Malignitätskriterien wie z.B. große pleomorphe Zellen, prominente Nukleoli, schaumiges bzw. vakuolenreiches Zytoplasma, Asymmetrie des Tumors, Ulzeration für die Diagnose von Talgdrüsenkarzinomen immer wieder unter den Fachhistopathologen umstritten.
I.1.2.2. DNA-Zytometrie
I.1.2.2.1. Indikation
Zellen mit gestörtem Zellzyklus weisen charakteristischerweise Veränderungen in ihrem Genom, z.B. chromosomale numerische oder strukturelle Abweichungen, auf (12,41,48,56).
Diese Art von chromosomalen Veränderungen wird als Aneuploidie bezeichnet. Sie tritt in Organismen mit normalen, vollständigen, euploiden Chromosomensätzen v.a. bei (meist malignen) Tumoren auf (15). Die Methode der DNA-Zytometrie basiert auf Bestimmung der Aneuploidie in verschiedenen Tumoren. Dabei gilt die DNA-Aneuploidie als Marker für neoplastische Zellen (87,99). Außerdem kann im Rahmen der DNA-Zytometrie anhand der Veränderungen am DNA-Gehalt eine zytogenetische Tumorprogression bestimmt werden (3,19,20,40,100).
2001 ist auf dem "International Consensus on the Fight against Cervical Cancer" beschlossen worden, die DNA-Zytometrie als eine zuverlässige Methode für die Identifizierung von malignen Zellen in Plattenepithelneoplasien anzuerkennen (48).
I.1.2.2.2. Biologische Grundlagen
Die Grundlage der DNA-Zytometriediagnostik beruht auf numerischen bzw. strukturellen Chromosomenaberrationen, welche einer zytometrischen Aberration bzw. einer Aneuploidie gleichzusetzen sind.
Es werden folgende Aberrationsgrade unterschieden:
1) primäre chromosomale Aberration. Bei dieser Form handelt sich um die balancierte Translokationen oder um minimale Verluste bzw. Gewinne des Chromosomenmaterials, welche durch die DNA-Zytometrie nicht erkennbar sind.
2) sekundäre chromosomale Aberration. Sie betrifft nur für den zu untersuchenden Tumor spezifische Chromosomen und ist durch DNA-Zytometrie gut zu ermitteln.
3) tertiäre chromosomale Aberration. Sie erscheint als Veränderung des tumorunspezifischen Chromosomenmaterials beim Fortschreiten der Neoplasie und stellt eine schlechte Prognose für den Patienten dar (20).
Der DNA-Gehalt wird nicht direkt mit der DNA-Zytometrie gemessen. Hierfür werden die Zellkerne mit der Feulgen-Färbung angefärbt. Dadurch wird der Faktor IOD, Integrated Optical Density, zum zytometrsichen Äquivalent für den DNA-Gehalt. Der DNA-Gehalt wird mit Hilfe einer c-Skala gemessen. Dabei ist "1c" gleich der Hälfte des DNA-Gehaltes eines normalen diploiden Chromosomensatzes in einer G0/1- Zellzyklusphase (48).
Bei der Interpretation von DNA-Histogrammen müssen verschiedene Faktoren berücksichtigt werden, die den DNA-Gehalt evtl. verändern können. Das sind z.B. eine euploide Polyploidisierung, d.h. Verdoppelung des normalen Chromosomensatzes, z.B. kurz vor der Mitose in der G2-Phase und nicht-neoplastische Polyploidisierung wie virale Infektion des Gewebes durch z.B. HPV, CMV, HSV, Therapie mit Zytostatika, Radiatio, Vit B12-Mangel.
Die Malignität eines Tumors wird in der DNA-Zytometrie letztendlich anhand folgender Kriterien festgelegt:
1) Anzahl der aneuploiden DNA-Stammlinien, wobei eine DNA-Stammlinie die Fraktion der proliferierenden Zellpopulation in der G0/1- Zellzyklusphase beschreibt;
2) Polyploidisierung der euploiden oder aneuploiden Stammlinien;
3) Vorkommen von Ausreißerzellen mit enorm hohem DNA-Gehalt bedingt v.a. durch Genomveränderungen(47).
I.1.2.2.3. Material und Methoden I.1.2.2.3.1.Untersuchungsgut
Als Untersuchungsmaterial können alle zytologischen Präparate sowie formalinfixiertes und in Paraffin eingebettetes Gewebe verwendet werden.
Als allgemeine Ausgangsregel für das Anfärben nach Feulgen gilt eine Andauung von Gewebe mit 1% Pepsin für 30 min bei 37°C und seine Fixierung mit 10%-igem Formalin (47).
I.1.2.2.3.2. DNA-Färbung
Die Feulgen-Reaktion ist seit ihrer Einführung von Feulgen und Rossenbeck 1924 eine der meistbenutzten quantitativen Nachweismethoden von DNA in der Zyto- und Histochemie (38). Sie beruht auf einer zweistufigen Reaktion, bei der im ersten Schritt im DNA-Molekül Aldehydgruppen durch Spaltung der Purinbasen Adenin und Guanin mit Hilfe einer Säure dargestellt werden. Im zweiten Schritt werden die Aldehydgruppen mit Schiff'schem-Reagenz (Pararosanilin = violett und Thionin = blau) durch eine Färbereaktion nachgewiesen. Die Bindung des Farbstoffes ist sehr stabil und kann nicht mehr von der DNA gelöst werden (92).
I.1.2.2.3.3. Messverfahren
Die Messung der optischen Dichte der nach Feulgen gefärbten Zellkerne erfolgt am Monitor eines PC-Fernsehbildanalysesystems, welches mit einem konventionellen Mikroskop verbunden ist. Das Mikroskop ist mit einer TV-Farbkamera samt Interferenzfilter für Blau (Thionin, z.B. 590+ -10nm) und Violett ( Pararosanilin, z.B. 560 +-10nm) ausgestattet.
Nach interner Kalibrierung mit Referenzzellen, in unserem Fall mit Fibroblasten, werden am PC 300 Analyse-/Tumor- und 30 Referenzzellkerne innerhalb einer Zellpopulation markiert und deren optische Dichte gemessen.
Anschließend wird gezielt nach einzelnen Tumorzellen mit auffallend hyperchromatischen Kernen gesucht und durch Anklicken dieser Zellen mit einer Maus auf dem Monitor automatisch gemessen (22).
Die Messungen erfolgen nach Richtlinien der European Society for Analytical Cellular Pathology (48).
Der Variationskoeffizient der DNA-Gehalte der Referenzzellen soll weniger als drei Prozent betragen.
I.1.2.2.4. Diagnostische Interpretation
Die Befundung der DNA-Histogramme zum Zweck der Identifizierung obligater Präkanzerosen bzw. der Frühdiagnose von Malignomen erfolgt qualitativ in die Kategorien DNA-diploid, DNA-aneuploid und DNA-polyploid anhand der unten aufgeführten Begriffe.
DNA-Histogramm Häufigkeitsverteilung der integrierten optischen Dichte spezifisch mit Feulgen-Reaktion gefärbter Zellkerne in der Einheit "c" ("c" = einfacher Chromosomensatz)
Modalwert, MV Häufigster Wert (Gipfel) eines DNA-Histogramms
DNA-Stammlinie G0/1- Phase-Fraktion des DNA-Histogramms einer proliferierenden Zellpopulation
DNA-Euploidie DNA-Verteilung wie bei einer normalen Zellpopulation
DNA-Diploidie Stammlinie, STL > 1,80c < 2,20c; euploide DNA-Verteilung mit zweifachem Chromosomensatz
DNA-Polyploidie Vorkommen von DNA-Stammlinien in den Verdoppelungsregionen a) euploider Stammlinien
b) aneuploider Stammlinien
DNA-Aneuploidie STL < 1,80c > 2,20c oder < 3,60c > 4,40c und/oder Werte > 9c;
DNA-Verteilung statistisch signifikant different von euploiden Exceeding events Einzelne ausgefallene DNA-Werte > 5c oder >9c (96)
Die Aneuplodie wird durch zwei Kriterien bestimmt:
a) Abweichung von der Stammlinie ( <1,8c>2,2c; <3,6c>4,4c), die ein G0/1-Phase- Häufigkeitsmaximum der Analyse- und Referenzzellen bedeutet (1c entspricht der DNA- Menge eines einfachen Chromosomensatzes).
b) Nachweis von abnorm hohen Einzelzell-DNA-Werten (5c and 9c exceeding events).
Beim Deuten der Aneuploidie in einem DNA-Histogramm ist es wichtig, einige physiologische, z.B. euploide Polyploidie und pathophysiologische Faktoren, z.B. virale Infektionen wie durch Humane-Papilloma-Viren (HPV), Cytomegalie-Virus (CMV), Humane-Herpes-Viren (HHV), Vit B12-Mangel usw., zu berücksichtigen.
Zusätzlich kann die Bestimmung des 2[c]-Deviation-Index (2cDI) für die DNA- Zytometrieinterpretation hilfreich sein. Denn dieser Wert zeigt eine Schwankung der DNA-
Gehalte um den normalen 2[c]-Wert und trägt zur Identifizierung von Chromosomenanomalien in der Zytogenetik bei (13).
I.2 Ziel- und Fragestellung
1) Wie ergänzt die DNA-Zytometrie der Talgdrüsentumoren die konventionelle Diagnostik?
2) Wie zuverlässig können die Talgdrüsenkarzinome von den gutartigen Talgdrüsentumoren mittels DNA-Zytometrie auseinandergehalten werden?
3) Prognostische Validität der DNA-Bild-Zytometrie bei Borderline-Talgdrüsentumoren (wie z.B. Talgdrüsenadenome bzw. Sebazeome)
4) Stimmen die DNA-Zytometrischen Ergebnisse mit den histologischen Befunden überein?
5) Wie hoch ist der 2c-Deviation-Index-Schwellenwert für benigne bzw. maligne Talgdrüsentumore?
II. Material und Methode
II.1 Präparatgut
II.1.1. Auswahl der Präparate
Die Präparate der benignen Talgdrüsentumoren für unsere Untersuchungen stammen zum größten Teil aus dem histopathologischen Archiv der Hautklinik Hannover.
Alle Karzinom- und teilweise auch Borderlinepräparate wurden uns freundlicherweise von dem Archiv des Einsenderlabors der dermatopathologischen Gemeinschaftspraxis Friedrichshafen von Dr. med. Hügel, Dr. med. Kutzner, Dr. med. Rütten, Dr. med. Hantschke und PD Dr. med. Mentzel und der dermatopathologischen Praxis Heidelberg von Dr. med.
Krahl zur Verfügung gestellt.
II.1.2. Anzahl der Präparate
Die Gesamtzahl der untersuchten Präparate beträgt insgesamt 105 Fälle. Davon sind 80 benigne Talgdrüsentumoren, 11 Borderlinetumoren und 14 Karzinome, die von zwei erfahrenen Dermatohistopathologen der Hautklinik Linden in Hannover unabhängig voneinander diagnostiziert wurden. Die Diagnostik erfolgte mit Hilfe der Einstufung nach Wick und Swanson (113) sowie Elder et al (34).
Die 80 benignen Tumoren bestehen aus 32 Talgdrüsenhyperplasien, 21 Naevi sebacei, 15 Adenomen und 12 Sebazeomen.
II.1.3. Kontrollpräparate
Als Kontrollpräparate bezüglich der Färbungsintensität, sprich IOD=image optical density, der jeweiligen Färbungssitzung von ca. 12 Tumorpräparaten verwendeten wir die Gewebsschnitte der normalen Rattenleber.
Die Rattenleberpräparate wurden zusammen mit den Tumorpräparaten gefärbt und anschließend DNA-Zytometrisch gemessen.
II.2. Technische Ausstattung
II.2.1. Technische Ausstattung im histologischen Labor
Die Vorbereitung von Zellvereinzelungspräparaten für die DNA-Zytometrische Diagnostik wurde mit Hilfe folgender Geräte durchgeführt:
1) Die Entparaffinierung von histologischen HE-Schnitten (Hämatoxylin-Eosin-Schnitt) mit Färbeautomat Citadel 2000 von Shandon
2) Brutschränke von Memmert
3) Zentrifuge Hettich von Rotanda/RP 4) Zytozentrifuge Cytospin 3 von Shandon
5) Eindecken von Präparaten mit Eindeckapparat Consul von Shandon.
II.2.2. Technische Ausstattung für die digitale DNA-Zytometrische Diagnostik
Die DNA-Zytometrische Diagnostik wurde mit Hilfe folgender Gerätschaften durchgeführt:
1) Mikroskop BH-2 von Olympus
2) An das Mikroskop und den Computer angeschlossene Farbkamera ½“ 3-CCD-Chips, Typ MC-3249 von AVT-Horn
3) Ein automatisch beweglicher Objekttisch Clean Damper Model D4Cl-5.0 Vextra von Oriental Motor Co. LTD
4) PC Pentium 586/166
5) Betriebssystem Windows NT 4.0
6) Bildanalysesystem Image DNA AutoCyte Quic-Immuno, Quic-DNA von AutoCyte Inc. Copyright © 1995-1999
II.3. Praktisches Vorgehen bei der Vorbereitung von Zellvereinzelung
II.3.1. Festlegung eines für die Untersuchung geeigneten Gewebsareals, (nach Richtlinien der ESACP (European Society for Analytical Cellular Pathology) (3)(5), (1.Tag)
Für die Festlegung eines für die Untersuchung geeigneten Gewebsareals werden ein Paraffinblock eines Tumorpräparates und ein dazugehörender HE-Schnitt (Hämatoxylin- Eosin-Schnitt) verwendet.
Auf dem HE-Schnitt wird unter dem Mikroskop eine für die Zellkernextraktion geeignete Tumorzellregion mit einem wasserfesten Filzstift markiert.
Für die DNA-Zytometrische Diagnostik werden maximal 12 Präparate in einer Sitzung vorbereitet.
II.3.2. Automatische Rehydratation (1.Tag)
Die markierte Stelle wird genau auf den Paraffinblock übertragen und vorsichtig mit einem Skalpell etwa 0.5 mm tief eingeritzt.
Danach gewinnt man etwa 2-3 Gewebsschnitte mit Hilfe eines Mikrotoms mit eingestellter Schneidedicke von 100 µm. Das eingeritzte Areal wird von dem Rest abgetrennt und in ein ca.
2 x 1,5 cm großes feinmaschiges Netzbeutelchen aus Nylongaze mit Maschenbreite von 70 µm hineingebracht. Die Nylongaze wird ganz verschlossen und in einer Biopsiekassette hineingelegt, mit der Präparatnummer versehen und in eine Entwässerungsmaschine zum Entparaffinieren für ca. 24 h hineingebracht.
In einem Vorgang werden maximal 12 Biopsiekassetten bearbeitet.
Die Gewebsschnitte laufen im Rahmen einer Rehydrierung folgende Lösungen in unten stehender Reihenfolge durch:
Tabelle 1: Rehydrierung
KÜVETTE LÖSUNG ZEIT
1 Xylol 30 min
2 Xylol 30 min
3 100%-iger Alkohol 30 min 4 96%-iger Alkohol 30 min 5 70%-iger Alkohol 30 min
6 Aqua bidest. 30 min
7 Aqua bidest. 30 min
Die Kassetten können dann anschließend über die Nacht in bidestilliertem Wasser stehen- bleiben.
II.3.3. Enzymatische Zellvereinzelung (2.Tag)
Zum Durchführen einer enzymatischen Zellseparation hat sich anhand der Vorstudien des Institutes für Pathologie der Technischen Hochschule Aachen (15) das Enzym Pepsin bewährt.
Die Zellkernvereinzelung erfolgt durch die Denaturierung zytoplasmatischer Proteine mittels Pepsin.
Zuerst Ansetzen einer Porcin-Pepsin-Lösung:
Es werden 7 ml 1 N HCl mit aqua dest. auf 100 ml aufgefüllt. Pro Zentrifugenröhrchen werden 25 mg Porcin-Pepsin (Pepsin porcine 17,2 mA/mg von Fa. Serva) abgewogen und mit jeweils 5 ml verdünnter HCl-Lösung (s.o.) aufgelöst. Die gesamte Menge des aufgelösten Porcin-Pepsins für max. 12 Zentrifugeröhrchen: (Anzahl der Röhrchen x 25 mg Pepsin porcine) + (Anzahl der Röhrchen x 5 ml verdünnter HCl) kommt in ein großes Reagenzglas und wird auf einem Rüttler bei 150 U/min (U/min=Umdrehung pro Minute) in einen Brutschrank bei 37°C für etwa 30-45 min gestellt.
Anschließend werden jeweils 5 ml fertiger Porcin-Pepsin-Lösung auf max. 12 Zentrifugenröhrchen verteilt.
Danach werden die Biopsiekassetten aus dem Entwässerungsautomat herausgenommen und geöffnet. Die darin enthaltenen Nylongazebeutelchen werden in die Zentrifugenröhrchen mit abgefüllter HCl-Porcin-Pepsin-Lösung überführt und wieder mit der entsprechenden Präparatnummer versehen.
Diese Zentrifugenröhrchen werden wieder auf den Rüttler bei 100 U/min in den Brutschrank bei 37°C für 1 Stunde gestellt.
Tabelle 2: Enzymatische Zellvereinzelung
Schritt Menge Substanz Vorgang Temp. Zeit
1 1) 7 ml 1)1 N HCl 2) aqua dest.
7 ml 1N HCl mit aqua dest. auf 100 ml auffüllen
2 1)25 mg/
Röhrchen 2)jeweils 5 ml
1)Porcin-
Pepsin 2) verdünnte HCl (s. Schritt 1)
25 mg pro Zentrifugenröhrchen mit jeweils 5 ml verdünnter HCl in einem großen Reagenzglas (für max. 12 Röhrchen) auflösen und auf Rüttler bei 150 U/min in einen Brutschrank stellen
37 °C
30-45 min 3 jeweils
5 ml
Fertige Porcin- Pepsin- Lösung (s. Schritt 2)
Jeweils 5 ml fertige Porcin- Pepsin-Lösung auf max. 12 Zentrifugenröhrchen verteilen
4 Nylongazebeutelchen aus den
Biopsiekassetten in je eine Zentrifugenröhrchen mit abgefüllter fertiger HCl-Porcin- Pepsin-Lösung verteilen (s.
Schritt 3), mit jeweiliger Präparatnummer versehen und auf Rütller bei 100 U /min in den Brutschrank stellen
37 °C 60 min
II.3.4. Mechanische Zellvereinzelung (2.Tag)
Durch die mechanische Zellvereinzelung werden die Verbindungen zwischen den Zytoplasma- und Zellkernbestandteilen endgültig gelöst und es treten durch das Netz von Nylongazesäckchen mit Maschenbreite von 70 µm nur die Zellkerne aus.
II.3.4.1. Zytozentrifugieren
In jedes unserer Zentrifugenröhrchen mit Nylongazesäckchen werden jeweils 5 ml PBS- Pufferlösung zu den vorhandenen 5 ml HCl-Porcin-Pepsin-Lösung abpipettiert. Die Röhrchen werden anschließend bei 1520 U/min 10 Minuten lang zentrifugiert. Im zweiten Schritt werden die Nylongazesäckchen mit der Pinzette aus den Röhrchen entnommen und verworfen. Die Röhrchen werden noch mal 10 Minuten mit 1520 U/min Drehgeschwindigkeit zentrifugiert. Im Röhrchen setzen sich die Zellkerne auf dem Boden ab, so dass sich eine flüssige und eine sehr schmale feste Phase bildet.
Die flüssige Phase wird vorsichtig bis auf ca. 1 ml mit einer Einwegglaspipette entfernt und verworfen.
Im letzten Schritt werden die restliche flüssige Phase mit dem Sediment durch mehrmaliges Auf- und Abziehen mit einer 1000 µl-Meßpipette mit Einwegplastikspitzen miteinander vermischt. Die entstandene Zellkernsuspension kommt anschließend in einen so genannten Zytoklip (cytoclip®) mit von einer Seite eingerastetem Objektträger und von anderer Seite angebrachtem Zytotrichter (cytofunnel®) mit einer runden etwa 5 mm im Durchmesser großen Öffnung von innen. Zwischen dem Objektträger und dem Zytotrichter befindet sich ein angepasstes Kammerfilterkärtchen. Der Zytoklip mit dem Inhalt wird in die Zytozentrifuge eingebracht und bei 1500 U/min 10 Minuten lang zentrifugiert. Während des Zentrifugiervorgangs werden die Zytotrichter senkrecht gekippt, so dass die Zellkerne aufgrund der Zentrifugalkraft gleichmäßig auf die klardefinierte Kreisfläche eines Objektträgers mit Durchmesser von ca. 5 mm verteilt werden und die Flüssigkeit von dem Filterkärtchen absorbiert wird.
Die beschichteten Objektträger mit den Präparatnummern werden aus den Zytoklips herausgenommen und zum Trocknen über Nacht in die Präparatmappe hineingelegt.
Tabelle 3: Mechanische Zellvereinzelung
Schritt Substanz Vorgang Umdrehung Zeit
1 5 ml PBS- Puffer
Jeweils 5 ml PBS-Pufferlösung zu den 5 ml HCL-Porcin-Pepsin-Lösung in jedes Zentrifugenröhrchen abpipettieren,
anschließend zentrifugieren 1520 U/min 10 min
2 Nylongazesäckchen aus dem Röhrchen
entfernen und wiederholt zentrifugieren
1520 U/min 10 min 3 Es bildet sich eine weiße feste Phase auf
dem Boden eines Zentrifugenröhrchens.
Die flüssige Phase darüber wird bis auf ca.
1 ml reduziert
4 Die feste Phase wird mit der
übriggebliebenen flüssigen Phase durchmischt, jeweils in einen Zytoklip mit einem Objektträger abgefüllt und in einer
Zytozentrifuge zentrifugiert 1500 U/min 10 min 5 Objektträger aus jeweiligem Zytoklip
herausnehmen und über Nacht trocknen lassen
II.4. „Feulgen-Färbung“ nach Richtlinien der ESACP (European Society for Analytical Cellular Pathology) (3)(5),(3.Tag)
Nach der Durchführung der Zellvereinzelung wird am nächsten Tag die „Feulgen-Färbung“
unserer Präparate durchgeführt. Die „Feulgen-Färbung“ der Zellkerne erlaubt eine digitale DNA-Zytometrische Farbintensitätsmessung.
Die „Feulgen-Färbung“ beruht auf einer zweistufigen Reaktion, bei der im ersten Schritt die Aldehydgruppen des DNS-Moleküls dargestellt werden, die im zweiten Schritt durch das Schiff’sche Reagenz sichtbar gemacht werden.
Die Darstellung der Aldehydgruppen erfolgt durch das Verbringen des zytologischen oder fixierten histologischen Präparates in einer Säure und Spaltung der Purinbasen Adenin und Guanin vom DNS-Molekül. An deren ehemaligen Bindungsstellen werden die Aldehydgruppen dargestellt, an welche sich der Farbstoff aus dem Schiff’schen Reagenz bindet. Diese Bindung ist sehr stabil und lässt sich von der DNS nicht mehr lösen.
Unsere Objektträger mit den Zellkernen von Talgdrüsentumoren werden zusammen mit einem HE-Präparat einer Rattenleber gefärbt. Die Rattenleber dient zur Farbintensitätskontrolle.
In folgendem Schema werden die einzelnen Färbeschritte genau aufgelistet:
Tabelle 4: Feulgen-Färbung
„
Feulgen-Färbung“
Küvette Lösung Zeit Vermerk 1 10% gepuffertes Formalin 50 min Mehrmals verwendbar
2 Aqua dest. 10 min
3 Aqua dest. 5 min
4 5N HCl 60 min In Brutschrank bei 25°C
5 Aqua dest. 2 min
6 Aqua dest. 2 min
7 Aqua dest. 2 min
8 Schiff’sches Reagenz 60 min In Brutschrank bei 25°C;
mehrmals verwendbar 9 SO2 –Wasser 5 min Einmalig verwendbar 10 SO2 – Wasser 5 min Einmalig verwendbar 11 SO2 – Wasser 5 min Einmalig verwendbar
12 Aqua dest. 1 min
13 Aqua dest. 1 min
14 70% Alkohol 3 min
15 96% Alkohol 3 min
16 100% Alkohol 3 min
17 Xylol 10 min Kann auch länger darin bis zum Eindecken bleiben
Je nach Ausgangsmaterial kann die Färbung mit dem Schritt 1 bzw. Schritt 4 gestartet werden.
Nach Papanicolaou, Giemsa bzw. Hämatoxylin-Eosin vorgefärbte Präparate sollten mit Schritt 1 in den gesamten Färbevorgang eingeleitet werden, um die eventuell noch vorhandenen Paraffin- bzw. Deckmediumsreste zu entfernen.
Alle unfixierten, formalinfixierten und paraffineingebetteten Präparate werden ab dem Schritt 4 verarbeitet.
Es sollte darauf geachtet werden, dass keine Spülreste in den Küvetten verbleiben, um eine Beeinträchtigung des Färbevorganges zu verhindern.
Formalin-Lösung und Schiff’sches Reagenz können mehrmals (bis max. 5-mal) verwendet werden, dagegen sollen HCl und SO2 –Wasser nach jedem Vorgang verworfen werden.
Fertige Präparate können nach jeweiligem Färbeprozess für mehrere Tage in Xylol verbleiben und anschließend mit Cargille-Oil eingedeckt werden.
II.5. DNA-Zytometrische Untersuchung II.5.1. Untersuchungsmaterial
Für die DNA-Zytometrische Untersuchung wurden 102 nach Feulgen gefärbte Zellvereinzelungspräparate angefertigt. Zusätzlich waren von jedem zu untersuchendem Talgdrüsentumor histologische HE-Schnittpräparate vorhanden, anhand welcher die Eingangsdiagnose festgelegt wurde.
II.5.2. Untersuchungsmethode
II.5.2.1.DNA-Messung
Die DNA-Zytometrischen Untersuchungen der Feulgen-gefärbten Zellvereinzelungspräparate erfolgten an einem interaktiven TV-Bildanalysesystem für DNA-Messungen, bestehend aus einem Olympus BH-2 Mikroskop mit 40-facher Vergrößerung (numerische Blende von 0,7) unter Verwendung einer Kondensorblende von 0,3, einer AVT-Horn 3-CCD-Chip Farbvideokamera, einem automatisch beweglichen Objekttisch Clean Damper Model D4Cl- 5.0 Vextra von Oriental Motor Co. LTD und AutoCyte QUIC-DNA Software (AutoCyte, Elon College, NC, U.S.A.) (19,107).
Abbildung 6: TV-Bildanalysesystem AutoCyte QUIC-DNA (7).
Folgende technische Voraussetzungen sollen vor jedem Starten des Bildanalysesystems erfüllt werden:
1) Verwendung von verschiedenen Interferenzfiltern für Blau (Thionin, z. B. 590 ± 10 nm) oder Rot (Pararosanilin aus Schiff'schem Reagenz, z.B. 560 ± 10 nm)
2) Anwendung von Köhler-Illumination 3) Analoge und digitale Abstimmung
4) Gewährleistung von Stabilität während des Messganges
5) Überprüfung von densitometrischer Linearität, z. B. durch Verwendung von neutralen Gläsern definierter Durchlassquoten
6) Kontrolle der Shadingphänomene
7) Kontrolle der Streulichtphänomene (Glarephänomene) 8) Kontrolle der Fraktionsmöglichkeiten
Zusätzlich sollten folgende Kriterien der densitometrischen Messung beachtet werden:
1) Messung von Kernen nur im Fokus
2) Kontrolle der Zellkernbildgalerie nach jedem Messvorgang
3) Keine Veränderung des Systems während der Messung (insbesondere Köhler- Illumination, analoge und digitale Justierung)
4) Shadingkorrektur in Softwareeinstellungen
5) Korrektur von lokalem Hintergrund pro Zellkern in Softwareeinstellungen 6) Korrektur des Streulichtes (glare) in Softwareeinstellungen
7) Korrektur von Fraktionsfehlern in Softwareeinstellungen
8) Visuelle Kontrolle der Zellkernbildgalerie während/nach der Messung
9) Kontrolle der Linearität der IOD-Werte, z. B. mit Hilfe von Hepatozytenpräparaten aus Rattenleber
10) Vermeidung von Kernausbleichung unter der Mikroskopbeleuchtung
11) Bildabspeicherung von gemessenen Zellkernen in einer Bildgalerie zur Qualitätskontrolle
12) Entfernung von überlagerten, autolytischen, nekrotischen oder fragmentierten Zellkernen (8,21,28,32,33,42,64,67,75,85)
Messungen erfolgten zweimal an jedem Präparat.
Zuerst wurden mindestens 300 Tumorzellkerne nach Zufallskriterien gemessen. Anschließend wurde der ganze Objektträger nach hyperchromatischen Tumorkernen durchsucht. Auffällige Kerne wurden markiert, ausgemessen und bei pathologisch erhöhtem DNA-Gehalt über der 5
[c]-Marke dazugezählt (1c entspricht der DNA-Menge eines einfachen Chromosomensatzes).
Die Messung erfolgte automatisch nach Markierung relevanter Zellkerne mit einer Maus auf dem Monitor.
Als Referenzzellen wurden ca. 30 interne, morphologisch unauffällige diploide Fibroblastenkerne gemessen (22). Ihr DNA-Gehalt diente zum Festlegen der 2[c]-Marke (Normwert für den diploiden Chromosomensatz). Der Variationskoeffizient (CV, coefficient of variation=Standardabweichung der IOD-Werte der G0/1-Referenzzellen / Mittelwert der IOD-Werte der G0/1-Referenzzellen * 100) der DNA-Gehalte der jeweiligen Referenzzellpopulation sollte weniger als 5% betragen (19,21,46,77,104).
Zum Schluss wird ein DNA-Histogramm nach folgenden Kriterien interpretiert:
1) Diagnose der Neoplasie 2) Prognose der Neoplasie 3) Therapieplanung (19).
Abbildung 7: Interaktiver Monitor des TV-Bildanalysesystems AutoCyte QUIC-DNA.
Umrandete Zellkerne stellen Analysezellen (Tumorzellen) dar. Rechts unten DNA-Histogramm der Referenz- und Analysezellen (8).
Abbildung 8: Analysezellgalerie nach abgeschlossener DNA-Zytometrischer Messung. Rechts oben DNA- Histogramm der Referenz-(blau) und Analysezellen (rot). Rechts unten die ausgemessene Parameter (8).
II.5.2.2. Physikalische Grundlagen und diagnostische Kriterien der DNA-Zytometrie
a) Physikalische Grundlagen
Als physikalische Grundlage der DNA-Bild-Zytometrie dient die Bestimmung des DNA- Gehaltes analog dem Absorptionsgrad von Lichtwellen, z.B. im Falle der Absorptionsphotometrie, mit Hilfe des Lambert-Beerschen Gesetzes (74). Dabei beruht die Absorptionsphotometrie auf einem Prinzip, dass die Lichtintensität beim Durchdringen einer Substanz durch diese reduziert wird.
Gleichung 1: Lambert-Beersches Gesetz
Eλ = ελ c d
Die Absorption Eλ ist eine dimensionslose physikalische Messgröße, die bei konstanter Wellenlänge λ und Schnittdicke d direkt proportional zur Färbekonzentration c ist.
Werden nur relative Werte gemessen, so kann der molare Absorptionskoeffizient ελ als Proportionalitätsfaktor durch eine konstante Größe, z. B. “1“ ersetzt werden. Sofern der molare Absorptionskoeffizient ελ (substanzspezifische Konstante bei einer bestimmten Wellenlänge) für eine Substanz bekannt ist, kann die absolute Konzentration derselbigen unter Verwendung der bekannten Absorptionsgröße ελ berechnet werden.
Jeder mit der Videokamera gemessene Zellkern wird in Form eines digitalisierten Bildes an den Computer übermittelt. Hierbei ist ein Bildschirmbild aus einzelnen kleinen Bildpunkten, Pixel, zusammengesetzt. Die optische Auflösung eines solchen Bildes wird in Anzahl der
sogenannten Pixel pro µm² Bildfläche gemessen. Jedem Pixel wird eine entsprechende optische Dichte bzw. Graustufe zugeteilt und anschließend für den ganzen Zellkern summiert.
Zur Berechnung der optischen Dichte wird das Lambert-Beersche Gesetz, welches die stöchiometrische Farbintensität zur Transmission des Lichtes ins Verhältnis setzt, angewendet (52).
b) Diagnostische Kriterien
Der ermittelte Wert der integrierten optischen Dichte (IOD) ist proportional zum jeweiligen DNA-Gehalt. IOD dient außerdem als Ausgangswert für weitere Parameter, wie z.B. DNA- Index (39).
Der DNA-Index (DI), auch bekannt als “stemline quotient“ (54), bezeichnet das Verhältnis des Modal- bzw. Mittelwertes des relativen DNA-Gehaltes der G0/1-Analysezellen zum Modal- bzw. Mittelwert des DNA-Gehaltes der diploiden G0/1-Referenzzellen.
Zellen mit einem regelrechten diploiden Karyotyp (zweifacher Chromosomensatz) weisen einen DNA-Index von 1,0, Zellen mit DNA-Gehalt gleich 5c (fünffacher Chromosomensatz) einen DNA-Index von 2,5 auf. Beim Auftreten von mindestens zwei separaten G0/1-Spitzen wird von einer DNA-Aneuplodie gesprochen (39,53).
Allgemein werden die DNA-Histogramme entweder als DNA-diploid, DNA-polyploid oder DNA-aneuploid befundet.
Tabelle 5: Diagnostische Beurteilung von DNA-Histogrammen
Typ Zytometrische Definition Diploid STL > 1,80c < 2,20c
Polyploid STL > 1,80c < 2,20c und > 3,60c < 4,40c
Aneuploid STL < 1,80c > 2,20c oder < 3,60c > 4,40c und/oder Werte > 9c
STL = DNA-Stammlinie
1c = DNA-Gehalt eines einfachen Chromosomensatzes (22)
Eine Feststellung von DNA-Polyploidie weist am ehesten auf das Vorliegen eines HPV- (Humanes-Papilloma-Virus-)Infektes (22,35).
DNA-Aneuploidie wurde nach in der Tabelle 5 aufgeführten Kriterien diagnostiziert (17).
Außerdem wurde die DNA-Aneuploidie im Rahmen der Einzelzellinterpretation bei mindestens drei Zellen > 5[c] (=5[c]-exceeding events, 5cEE) gezeigt (17).
Zusätzlich wurde der 2[c]-Abweichungsindex (=2[c] deviation index, 2cDI) von uns ausgemessen. 2cDI bezeichnet eine Varianz von Werten des DNA-Gehaltes um den 2[c]-Wert (= diploider Chromosomensatz) innerhalb eines Falles (13,108).
Gleichung 2: 2c deviation index
n
2cDI = 1/n ∑ (ci – 2c)² i=1
c = Menge des Chromosomensatzes
Die statistische Bewertung der 2cDI-Wertdifferenzen zwischen benignen, borderline und malignen Tumoren erfolgte mit Hilfe des Mann-Whitney U-Test. Das Signifikanzniveau lag bei P < 0,05.
Alle Werte wurden automatisch von der AutoCyte QUIC-DNA Software ausgerechnet (108).
II.5.2.3. Biologische Grundlagen der DNA-Zytometrie
Alle somatischen menschlichen Zellkerne enthalten einen diploiden Chromosomensatz, 2c, d.h. 2 x 22 + xx bzw. xy Chromosomen.
Kurz vor Zellteilung liegt in der G2-Phase des Zellzyklus ein vierfacher Chromosomensatz, 4c vor.
Abbildung 9: Zellzyklus einer somatischen Zelle (aus Roche Lexikon Medizin (4.Aufl.))
1. G1-Phase:
Im allgemeinen die längste Phase des Zellzyklus. Dies ist die Zeit in der die Zelle wächst, Stoffwechsel betreibt und in einem vielzelligen Organismus ihre spezielle Funktion ausübt. In der G1-Phase hat die Zelle ihren "normalen" Chromosomensatz, 2c.
2. S-Phase:
In der S-Phase werden die chromosomalen DNA-Moleküle repliziert.
3. G2-Phase:
Ist eine zweite gap(Ruhe-)-Phase, in der die Zelle allerdings bereits auf die Zellteilung ausgerichtet ist.
Während der G2-Phase ist die Zelle eigentlich tetraploid, 4c, denn jedes Chromosom (von dem zwei Kopien vorliegen) hat sich repliziert und enthält somit zwei DNA-Moleküle. Am Ende von G2 kondensieren die Chromosomen zu den Metaphasechromosomen.
4. M-Phase:
Umfasst den Zeitraum in dem Kern- (Karyokinese) und Zellteilung (Cytokinese) stattfinden. Man unterscheidet zwei Typen von Kernteilung, Mitose und Meiose.
In manchen Geweben kommt es im Rahmen einer euploiden Polyploidisierung zu einer physiologischen Vervielfachung des Chromosomensatzes, z. B. 4c, 8c, 16c, 32c.
Tabelle 6: Gewebe/Zellen mit euploider Polyploidisierung
Endometrium (Hypersekretionsphase) ß-Zellen der Langerhansschen Inseln Bronchiale Zylinderepithelien Zervikale Zylinderepithelien Magenschleimhautepithelien Herzmuskelgewebe
Hepatozyten Mesothelien
Schilddrüsenepithelien Mammaonkozyten Samenblasenepithelien Urothelzellen
aus (19)
Folgende Faktoren und einige gutartige Tumoren weisen ebenfalls eine euploide Polyploidisierung auf.
Tabelle 7: Auslöserfaktoren für euploide Polyploidisierung
Physiologisch Pathologisch
Replikation Virusinfekte (z. B. HPV, CMV,etc.) Apoptose Strahlentherapie
Nekrose Chemotherapie Entzündung Vitamin-B12-Mangel
aus (19)
Numerische oder strukturelle Abweichung von diesen Chromosomensätzen wird Aneuploidie genannt (15) und gilt besonders in der DNA-Zytometrie als Marker für neoplastische Zelltransformation (2,7,9,49,50,59,91,96,114).
Dass die Mehrheit der malignen Tumoren einen aneuploiden DNA-Gehalt aufweist, ist schon lange bekannt (23,88,89,90).
In der DNA-Zytometrie werden in nicht polyploidisierenden Geweben Zellkern-DNA- Gehalte größer als 4c im Prinzip als „aneuploid“ und unter Berücksichtigung des Gesamtmessfehlers größer als 5c bezeichnet (15).
Die absolute Zahl so definierter, aneuploider Zellen über 5c heißt “5c exceeding events“ (14).
Als Marker für Malignität gilt der Nachweis von mindestens drei Zellkernen mit einem DNA- Gehalt ≥ 5c. Im Prinzip reicht eine aneuploide Zelle aus, um eine maligne Neoplasie zu diagnostizieren (51,96). Es werden aber drei aneuploide Zellen mit DNA-Gehalt ≥ 5c als Grenzwert angenommen, um mögliche Methodenfehler zu vermeiden (14).
Bei der klassischen DNA-Zytophotometrie bezieht sich der Begriff Aneuploidie auf den Modalwert, d.h. auf den am häufigsten vorkommenden Wert (= peak) einer Zellpopulation.
Ein aneuploider Tumor weist einen Modalwert im aneuploiden Bereich, d.h. außerhalb von 2c ± 2 x CV (=Variationskoeffizient der Referenzzellen), auf.
II.5.2.4. DNA-Histogramm
Die Ergebnisse einer DNA-Zytometrischen Untersuchung werden in einem DNA- Histogramm erfasst.
Ein DNA-Histogramm zeigt den Ablauf des Zellzyklus, insbesondere die Ausprägung einzelner Zyklusphasen.
Ein euploides DNA-Histogramm geht mit einem Häufigkeitsgipfel im G0/1-Bereich einher.
Aneuploide DNA-Histogramme sind durch multiple Häufigkeitsgipfel, Verschiebungen des Häufigkeitsgipfels in aneuploide Bereiche und erhöhte S-Phase-Fraktionen gekennzeichnet und durch Parameter wie DNA-Index, 2c-Deviation-Index und 5cEE ausgedrückt.
DNA-Zytometrieprotokoll
Die DNA-Zytometrischen Untersuchungen wurden mit Hilfe der Software Quic-DNA von AutoCyte ausgewertet. Die Ergebnisse wurden dann in folgender Form festgehalten:
Patient/Case Information
Patient ID: Case ID:
Last Name: Organ:
First Name: Staining:
Birth Date: Sex: Date of Sampling:
DNA Histogramm
DNA Statistics
Reference Cells Analysis Cells Number Number
Correction Factor Min. [c]
CV [%] Max. [c]
REM[%]
Basic indices Stemline indices 2c Ref. IOD Modal Value 2c Dev.Index DNA Index (mean) DNA Malig.Grade DNA Index (peak) Diploid Dev. Std. Dev. Steml Z value CV Stemline Ploidy Balance Steml. Shoulder
Absolute indices Relative indices
2.5c Ex. Ev. 2.5c Ex. Ev.
3c Ex. Ev. 3c Ex. Ev.
4c Ex. Ev. 4c Ex. Ev.
5c Ex. Ev. 5c Ex. Ev.
7c Ex. Ev. 7c Ex. Ev.
9c Ex. Ev. 9c Ex. Ev.
Aneuploid Ev.(D) Aneuploid Ev.(D) Aneuploid Ev.(T) Aneuploid Ev.(T) SINE indices
SINE 1 SINE 2 SINE 3
SINE 4 II.5.3. Statistische Auswertung
Die im Rahmen der randomisierten Studie ermittelten Werte wurden computertechnisch bearbeitet und analysiert.
Die statistische Auswertung bezog sich auf folgende Tumorgruppen:
1) Benigne Talgdrüsentumoren 2) Borderline Talgdrüsentumoren 3) Maligne Talgdrüsentumoren.
Aufgrund ihrer optimalen Aussagekraft bezüglich der Atypie bzw. Dignität wurden folgende DNA-Zytometrische Parameter statistisch ausgewertet
1) 5[c]-Ausreißerzellen (5[c]-Exceeding-Events) 2) 2[c]-Abweichungsindex (2[c]-Deviation-Index) 3) Modalwert (Modal Value).
III. Ergebnisse
III.1. Tumortypen
Innerhalb der Studie wurden insgesamt 105 Talgdrüsentumoren untersucht. Das Alter der Patienten lag zwischen 7 und 87 Jahren mit einem Durchschnitt von 54 Jahren.
Davon waren histologisch 80 Fälle (77%) als benigne, 11 Fälle (10%) als borderline und 14 Fälle (13%) als maligne diagnostiziert worden.
Diagramm 1: Talgdrüsentumortypen
III.1.1. Benigne Talgdrüsentumoren
Von den benignen Talgdrüsentumoren wurden 15 (19%) als Talgdrüsenadenome, 32 (40%) als Talgdrüsenhyperplasie, 21 (26%) als Naevus sebaceus und 12 (15%) als Sebazeom diagnostiziert.
Diagramm 2: Benigne Talgdrüsentumoren
Benigne Talgdrüsentumoren
Naevus sebaceus
26%
Talgdrüsen- Adenome
19%
Sebaceome
15% Talgdrüsen-
hyperplasie 40%
Borderline 10%
Maligne 13%
Benigne 77%
III.1.2. Borderline Talgdrüsentumoren
Als borderline Talgdrüsentumoren bzw. atypische Talgdrüsenadenome wurden histologisch v. a. Tumoren mit Atypien, vermehrten Mitosefiguren und unklarer Dignität diagnostiziert.
III.1.3. Talgdrüsenkarzinome
Talgdrüsenkarzinome wiesen eine schlecht abgrenzbare Läppchenstruktur, Invasivität und Fehlen von Sebozytendifferenzierung auf.
III.2. DNA-Zytometrische Parameter III.2.1. 5[c]-Exceeding-Events
Aus diagnostischen Gründen wurde eine Interpretation der Einzelzellen durchgeführt.
Eine normale Zelle weist in der Go/G1-Phase einen zweifachen Chromosomensatz bzw. einen DNA-Gehalt von 2[c] auf. Während der S-Phase schwankt der DNA-Gehalt je nach Replikationsrate zwischen 2[c] und 4[c]. In der G2/M-Phase liegt der normale DNA-Gehalt bei vierfachem Chromosomensatz, d.h. bei 4[c].
Unter Berücksichtigung von Messfehlern wurden Zellkerne von ≥ 5[c] (5[c] Exceeding Events), d.h. weit über G2/M-Schwelle als pathologisch betrachtet.
Tumoren mit mindestens 3 pathologischen DNA-Gehalten von ≥ 5[c] werden als aneuploid (5[c] ≥ 3), solche mit 1 bis 2 pathologischen DNA-Gehalten als suspekt (0<5[c]<3) und Neoplasien bei fehlenden 5[c] Exceeding Events als non-aneuploid diagnostiziert.
In unserer Studie konnte bei benignen Tumoren kein 5[c]EE gemessen werden.
6 von 11 borderline Tumoren und 13 von 14 Talgdrüsenkarzinomen wiesen ≥1 5[c]EE auf.
Somit liegt die Sensitivität für Aneuploidie der borderline Tumoren bei 55% (6 von 11) und
Diagramm 3: 5[c]EE der borderline Tumoren
aneuploid 55%
non- aneuploid
45%
non-aneuploid aneuploid
der Talgdrüsenkarzinome bei 93 % (13 von 14), zusammen bei 76 % (19 von 25).
Die Spezifität liegt bei 100 % (80 von 80 benignen Tumoren).
Diagramm 4: 5[c]EE der Talgdrüsenkarzinomen
Der kleinste Wert des 5[c]EE betrug sowohl für borderline Tumoren als auch für Karzinome 1, der höchste Wert betrug für borderline Tumoren 4 und für Karzinome 62.
Diagramm 5: 5[c]EE der borderline und malignen Tumoren aneuploid
93%
non- aneuploid
7%
non-aneuploid aneuploid
0 10 20 30 40 50 60 70
0 1 2 3
5[c]EE
borderline Tumoren
maligne Tumoren
