Ultra-hyrdrophile metallische Biomaterialien

O R I G I N A L ! A R B E I T E N

Ultra-hyrdrophile metallische Biomaterialien

Eine neue Methode zur Oberflächenveredelung von Metallen mit Chromschwefelsäure wird vorgestellt. Die neuen Oberflächen zeigen paradoxes Verhalten. Trotz metallischen Ursprungs und von einer Rauigkeit im ym-Bereich (Ra-1 pm) verhalten sie sich wie höchst reine und extrem glatte (Ra-2-3 nm) Quarzgläser. Aus Analyse der vorliegen- den Daten wird mit einer gewissen Vorsicht geschlossen, dass durch die Chromschwefelsäurebehandlung neuartige ultra-hydrophile Ober- flächen auf Titan und rostfreiem 316L-Stahl erzeugt werden, deren Be- netzungseigenschaften (Randwinkel <9°, keine Hysterese) nicht auf einer durch Politur erzeugten Glätte und Homogenität der Oberfläche wie bei hochpoliertem Quarzglas, sondern auf einer neuartigen physi- kalisch-chemisch zu definierenden Mikro- oder Nanostruktur beru- hen. Für dieses Phänomen schlagen wir den Begriff „inverser Lotus- effekt" vor. Die neuen Oberflächenstrukturen erhöhen ebenfalls die Kopplungskapazität für Proteine. Weiter ist in anderen Untersuchun- gen gezeigt worden, dass nach der Chromschwefelsäuremethode be- handelte Titanoberflächen biokompatibel sind und in Verbindung mit rhBMP-2 zur einer deutlichen Steigerung des Knochenwachstums ßhren. Es wird vorgeschlagen, dass die ultra-hydrophilen Metallober- flächen einer neuen übergeordneten Gruppe der ultraphilen Materia-

lien und Oberflächen zugerechnet werden können.

Herbert P. Jennissen

Schlagworte: Titan - Edelstahl - Oberflächen- veredelung mit Chrom- schwefelsäure - Biolo- gisierung von Metall- implantaten - Immobi- lisierung von Bone mor- phogenetic protein 2 (BMP-2)

Einleitung

Das V o r k o m m e n nicht b e n e t z b a r e r Oberflächen im P f l a n - zenreich (beispielsweise Blätter des Kohls und der Mimose) ist seit A n f a n g des 20. J a h r h u n d e r t s nicht n u r in der Bota- nik, s o n d e r n auch in der physikalischen Chemie b e k a n n t [1], In den letzten J a h r e n erregte diese B e o b a c h t u n g e r n e u t A u f - sehen, als festgestellt w u r d e , dass j e n e extrem h y d r o p h o b e n Oberflächen nicht glatt, s o n d e r n rau d. h. mikrostrukturiert sind (für Übersicht, siehe [2]). Auf den Blättern der Lotusblu- me k ö n n e n beispielsweise Randwinkel (Kontaktwinkel) v o n

160° gemessen werden, welche den Blättern selbstreinigende Eigenschaften verleihen. Auf Grund der h o h e n Randwinkel k ö n n e n Wassertropfen O b e r f l ä c h e n s c h m u t z p a r t i k e l a u f n e h - men, u m d a n n die nicht h a f t e n d e Oberfläche durch Abperlen zu verlassen: „Lotuseffekt" [2]. Der Lotuseffekt b e g i n n t bei einem Randwinkel v o n zirka 130° und ist bei 160° voll a u s - geprägt. Oberflächen, die solch h o h e Randwinkel besitzen, w e r d e n auch s u p e r - h y d r o p h o b oder u l t r a - h y d r o p h o b g e - n a n n t . Auf der a n d e r e n Seite der Randwinkelskala h a b e n W a n g et. al. 1997 [3] und H y a k a w a et al. 1998 [4] u l t r a - h y - drophile Oberflächen beschrieben, die ebenfalls selbstreini- gend sein sollen. Wird ein d ü n n e r polykristalliner T i 02- A n a - tas-Film auf einer Glasoberfläche mit ultraviolettem Licht bestrahlt, d a n n v e r m i n d e r t sich der Randwinkel v o n 72° v o r der Bestrahlung auf zirka 0° n a c h der Bestrahlung. Auch in diesem Fall ist die Oberfläche nicht v o l l s t ä n d i g glatt [3]. Im

v e r g a n g e n e n J a h r ist es uns g e l u n g e n , ä h n l i c h e e x t r e m h y - drophile O b e r f l ä c h e n auf Metallen herzustellen [5-11]. Der u r s p r ü n g l i c h e R a n d w i n k e l der T i t a n - oder E d e l s t a h l o b e r - fläche v o n 60-70° wird d u r c h eine n e u a r t i g e C h r o m s c h w e - f e l s ä u r e b e h a n d l u n g auf 0 - 8 ° v e r m i n d e r t . Hydrophile ober- flächenveredelte M e t a l l i m p l a n t a t e dieser Art sind im Tier- versuch b i o k o m p a t i b e l [11] u n d stellen eine a u ß e r o r d e n t l i c h effektive G r u n d i e r u n g s s c h i c h t f ü r die S y n t h e s e b i o a k t i v e r B M P - 2 - h a l t i g e r Oberflächen d a r [10]. In dieser Arbeit sollen erste Hinweise f ü r die mögliche E i n o r d n u n g der v o n u n s hergestellten h y d r o p h i l e n Metalloberflächen in die n e u e G r u p p e der Ultra-Schichten dargelegt werden.

Material und Methoden

Polierte Q u a r z g l a s p l ä t t c h e n (Suprasil I, Fa. Heraeus, Hanau) 10 χ 25 χ 1 m m w u r d e n v o r G e b r a u c h in der optischen Werkstatt der Universität Essen hoch poliert zu einer P l a n a - rität v o n λ / 1 0 u n d einem a r i t h m e t i s c h e n mittleren Rauig- keitswert (Ra) v o n 2 - 3 n m (atomic force microscopy, AFM, Prof. Dr. V. Hlady, Dept. of Bioenginering, Salt Lake City, Utah).

Die Q u a r z p l ä t t c h e n w u r d e n in C h r o m s c h w e f e l s ä u r e (Merck, D a r m s t a d t ; 92 % H2S04, 1.3 °/o Cr03, Dichte 1.84 g/cm3) u n t e r Erhitzen auf 90 °C f ü r 60 min gereinigt. Die P l ä t t c h e n w u r d e n d a n n aus dem S ä u r e b a d e n t n o m m e n u n d a u s g i e b i g mit Reinstwasser (doppelt destilliert, über Milli-Q System [Millipore] e n d g e r e i n i g t u n d ultrafiltiert) g e w a s c h e n u n d

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d a n n darin f ü r 30 min gekocht. Nach erneutem ausgiebigem W a s c h e n in Reinstwasser wurden die Plättchen in einem Stickstoffstrom (Qualität 5) getrocknet und sofort zur Rand- winkelmessung eingesetzt.

Titanplättchen (cp titanium, grade 2; 15 χ 10 χ 0.8-1.0 mm) u n d rostfreie Stahlplättchen (316L) der gleichen Größe w u r - den aus elektropolierten (Titan und Stahl) oder elektropolier- ten und anodisch oxidierten (Titan) Blechen wie beschrieben gestanzt und oberflächenveredelt [8]. Nach Vorreinigung u n d Entfettung mit Aceton wurden die Plättchen f ü r zwei Stunden in 5°/o HN03 im Rückflusskühler gekocht [8]. Im Anschluss daran wurden sie in Chromschwefelsäure (92°/o H2S04, I.30/0 Cr03, Dichte 1.84 g/cm3) unter Rühren bei 230-240° C f ü r 60 Minuten oberflächenverdelt [8], g e w a - schen und wie beschrieben gelagert [8],

Die Randwinkelmessungen wurden in einer Wilhelmy-Plate- A p p a r a t u r bei 22° C mit einer Tauchgeschwindigkeit von 1 m m / m i n wie beschrieben d u r c h g e f ü h r t [8]. Elektropolierte oder anodisch oxidierte Metallplättchen wurden vor der Messung mit Aceton gereinigt (entfettet) u n d luftgetrocknet.

Nach HNO3- oder Chromschwefeläurebehandlung wurden die Plättchen mit H20 gewaschen, j e 30 Minuten in 2°/o EDTA ph 7.0 und H²0 gekocht und in trockenem Methanol gelagert wie bereits beschrieben [8]. Vor der Messung w u r d e der Alkohol durch Evaporation entfernt. Die Genau- igkeit der Messung liegt bei 1-2° (siehe auch [15]).

Die Proteine Ubiquitin u n d recombinantes h u m a n e s Bone M o r p h o g e n e s e Protein 2 (rhBMP-2) w u r d e n wie beschrieben hergestellt und mit l25I radioaktiv markiert [8], Für alle wei- teren Methoden wie der chemischen Modifikation der Metall- oberflächen, der Proteinkopplung, der Elektrophorese und der Tierexperimente siehe Ref. [8,10].

Theoretische Vorbemerkungen

Randwinkel und Benetzbarkeit

Eine der wenigen einfachen Methoden, um Informationen über die Benetzbarkeit, d. h. über die Hydrophilizität oder Hydrophobizität einer Oberfläche u n d deren Homogenität, zu gewinnen, ist die Randwinkel- oder Kontaktwinkelmes- sung. In dieser Arbeit wird aus praktischen und aus histori- schen Gründen [1] der Begriff Randwinkel dem des s y n o n y - m e n Kontaktwinkels vorgezogen.

Die Benetzbarkeit einer festen Oberfläche wird durch den Kontakt- oder Randwinkel (Θ) beschrieben [12-19]. Thermo- d y n a m i s c h lässt sich der Randwinkel als Gleichgewicht der G r e n z f l ä c h e n s p a n n u n g e n (σ) nach der Young-Gleichung mathematisch darstellen:

Gsg = Oß + Gfg COS θ„ (1) wobei os g, Gfg und σ)5 die G r e n z f l ä c h e n s p a n n u n g e n der j e - weiligen aneinandergrenzenden Phasengrenzen der Flüssig- keit (f), des festen Stoffes (s) und der Gasphase (g) darstellen, wobei θο der Gleichgewichtsrandwinkel ist. Von Benetzung spricht m a n bei θο < 90°, Nichtbenetzung bei θο > 90° u n d von vollständiger Benetzung bei θο = 0 u n d vollständiger Nichtbenetzung bei θο = 180°. Die Young-Gleichung gilt nur für ideale Oberflächen, die vollkommen glatt sind und weder chemische noch strukturelle Inhomogenitäten (siehe unten) aufweisen. Solche idealen Oberflächen findet man in der Regel nur auf Einkristallen oder auf frisch gespaltenen Glimmerplättchen.

Eine der aussagekräftigsten Methoden der Randwinkelmes- s u n g ist die dynamische Messung [13,14], Bewegt man einen Wassertropfen auf einer idealen h o m o g e n e n Oberfläche, so lässt er sich ohne V e r f o r m u n g oder Ä n d e r u n g des Randwin-

kels bewegen (Abb. la). Bei realen inhomogenen Ober- flächen hingegen verformt sich der Wassertropfen (Abb. lb), wobei an der Vorder- und Rückseite des Tropfens zwei ver- schiedene Randwinkel auftreten. Diese Winkel lassen sich mit der dynamischen Kontaktwinkelmessung nach Wilhelmy bestimmen (siehe [14]), wobei man von einem Vorrück- (θν) und einem Rückzugswinkel (0R) spricht. Beim Auftreten der beiden Randwinkel während einer dynamischen Randwin- kelmessung spricht man von einer Randwinkelhysterese (Abb. 2 und Gleichung 2).

Β — -

' Ν

^ \ 0 R θ ν / \

. ^ 1 ) \ m i n m i i miihi'iiiium hihihi ιτιιιιι n n M i i i i i n m i t m i m i i i

Abb. I: Bewegung eines Tropfens auf einer Oberfläche und Entstehung der Randwinkel

a) Bewegung unter idealen Gleichgewichtsbedingungen auf einer glatten idealen Oberfläche mit einem Randwinkel 9G und

b) Bewegung unter realen Bedingungen eines Nichtgleichgewichtes auf einer realen Oberfläche mit zwei verschiedenen Randwinkeln dem Vorrückwinkel θγ und dem Rückzugswinkel 0R als Ausdruck einer Rand- winkelhysterese (Gleichung 2. (Nach [13]).

Hydrophilizität und Hydrophobizität

Hydrophilizität und Hydrophobizität sind Begriffe, deren Anwendbarkeit auf wässrige Systeme beschränkt ist. In nicht wässrigen Systemen werden Begriffe wie Lipophilizität oder Oleophilizität [3] angewendet. Die Hydrophilizität einer Glasoberfläche wird als das Bestreben des Wassers definiert, eine solche Oberfläche zu benetzen, wobei es durch nicht- kovalente Anziehungskräfte (ζ. B. van-der-Waals, Wasser- stoffbrücken) zwischen den beiden Phasen zur Adhäsion des Wassers an der Oberfläche kommt. Hydrophilizität bedeutet in der Regel eine hohe Oberflächenenergie. Obwohl die Spreitung eines sessilen Wassertropfens auf einer Oberfläche beginnt, w e n n der Durchmesser der Kontaktfläche größer als der Durchmesser des Tropfens (θν < 90°) ist, gilt ein Rand- winkel von 60° im allgemeinen als Beginn einer realen Be- netzung [19].

Die Hydrophobizität einer Oberfläche wird als vermindertes Bestreben des Wassers, eine solche Oberfläche zu benetzen, definiert. Auf einer solchen Oberfläche kugelt sich der Was- sertropfen wegen eines Verlustes der nicht-kovalenten An- ziehungskräfte (Adhäsion) ab. Hydrophobizität bedeutet in der Regel eine niedrige Oberflächenenergie. Der Verlust der wasseradhärierenden Eigenschaften einer hydrophoben Oberfläche bedeutet aber nicht, dass die Oberfläche nun che-

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Abb. 2: Dynamische Randwinkelmessung nach Wilhelmy auf einem po- lierten Titanplättchen mit „natürlicher" Oberfläche in Wasser

Als natürliche Oberfläche wird die Oberfläche bezeichnet, die durch Re- passivierung nach der Politur entsteht. Vor der Randwinkelmessung fend nur eine entfettende Reinigung mit Aceton statt. Das Bild gibt die Ori- ginalcomputerzeichnung der Wilhelmy-Apparatur wieder. Mechanisch polierte, elektropolierte und anodisch oxidierte Titanplättchen und Stahl- plättchen zeigen ähnliche hohe Kontaktwinkel und -hysteresen (nicht ge- zeigt). Für weitere Einzelheiten siehe Methoden, den Text, und Abb. 4 und Ref. [8-10], Daten aus. Ref. [8],

misch inert ist. Im Gegenteil, obwohl sich eine sog. nieder- energetische Oberfläche gebildet hat, zeigen hydrophobe Oberflächen im wässrigen Milieu neue Bindungseigenschaf- ten gegenüber den verschiedensten Molekülen (ζ. B. Fettsäu- ren, Proteinen) in Form h y d r o p h o b e r Wechselwirkungen [20-22]. Nicht-kovalente Wechselwirkungen des h y d r o p h o - ben Typs werden als die „außergewöhnlich starke gegensei- tige Anziehung nicht-polarer Moleküle in Wasser" beschrei- ben [20], Die hydrophobe Anziehungsenergie zwischen zwei im Kontaktabstand zueinander stehenden Methanmolekülen ist mit zirka -8.5 kJ mol-1 [20,21] in Wasser sechsfach größer als die v a n - d e r - W a a l s - A n z i e h u n g s e n e r g i e im V a k u - um. Hydrophobe Wechselwirkungen beruhen mechanistisch auf der bindungsbedingten V e r d r ä n g u n g hochgeordneter Wassermoleküle aus einer monomolekularen Wasserschicht auf zwei benachbarten hydrophoben Oberflächen in u n g e - ordnetere Wassermoleküle des Bulkwassers. Durch den Wechsel des Ordnungszustandes der Wassermoleküle kommt es zu einer Erhöhung der Entropie. Unter der Bedingung ΔΗ

« Τ AS wird die Gibbs-freie Energie bei einer hydrophoben Wechselwirkung negativ (-AG « Τ AS), u n d m a n spricht von einer sog. entropiegetriebenen Reaktion (siehe Übersicht in [22]).

Es gibt jedoch auch Grenzfälle, bei denen eine klare Ver- w e n d u n g der o.g. Begriffe problematisch ist [23]. Hochreines Glas und ein Hydrogel wie poly(2-hydroxyethyl m e t h - acrylat) besitzen beide kleine Randwinkel und gelten daher als hydrophil. Die freie Grenzflächenenergie der Glas/Wasser Grenzfläche ist j e d o c h groß, hingegen die poly(2-hydroxy- ethyl methacrylatej/Wasser Grenzfläche fast null [23]. Eine Erklärung für dieses P h ä n o m e n ist in der Zusammensetzung der Oberflächenspannung aus einer polaren und nichtpola- ren (dispersiven) K o m p o n e n t e zu suchen [24]. Diese beiden Komponenten k ö n n e n j e nach System unterschiedlich wirk- sam werden. Hydrogele bedürfen somit einer S o n d e r b e h a n d - l u n g im Vergleich mit festen Oberflächen, und die allgemei- ne Gleichsetzung von Hydrophilizität mit guten Schmier-

eigenschaften („lubricity"), wie dies f ü r Hydrogele beschrie- ben wird [19], lässt sich nicht verallgemeinern.

In den letzten Jahren haben Begriffe wie ultra-hydrophil [4]

und s u p e r - h y d r o p h o b bzw. u l t r a - h y d r o p h o b (ultraphobic) [2] im Z u s a m m e n h a n g mit extremen Randwinkeln von 0°

und > 130° V e r w e n d u n g g e f u n d e n . Diese Begriffe verspre- chen nützlich zu sein, da Oberflächen mit solchen R a n d w i n - keln neue Eigenschaften aufzuweisen scheinen. Es fehlt j e - doch an dynamischen Randwinkelmessungen solcher Ober- flächen und klaren Definitionen. Es wird daher Folgendes vorgeschlagen: Ultra-hydrophile und u l t r a - h y d r o p h o b e Oberflächen bilden die Gruppe der ultraphilen Oberflächen („das Extreme liebend"). Die primäre E i n o r d n u n g als ultra- phile Oberfläche würde nach dem Kriterium des d y n a m i - schen Randwinkels erfolgen. Bei der d y n a m i s c h e n Randwin- kelmessung sollten Vorrück- und Rückzugswinkel identisch sein (keine Hysterese) und zwischen 0-10° (ultra-hydrophiler Bereich) oder 130-180° (ultra-hydrophober Bereich) liegen.

Ein zweites Kriterium könnte h i n z u k o m m e n : eine besondere Mikro- u n d / o d e r Nanostruktur der Oberfläche. Die Eigen- schaften (Randwinkel, Hysteresefreiheit) dieser letzteren Oberflächen sollten durch eine im Herstellungsverfahren er- zeugte Mikro-/Nanostruktur der Oberfläche - u n d nicht durch die Zerstörung solcher Strukturen in Folge v o n Hoch- politur zur größtmöglichen Glätte - hervorgerufen sein. Eine Rauigkeitsmessung (Ra-Wert) würde beispielsweise wird zu Werten im μηι-Bereich führen, f ü r die normalerweise keine Hysteresefreiheit zu erwarten ist. Das zweite Kriterium w ü r d e somit eine Z u o r d n u n g der Oberfläche in die Familie der Lotus-ähnlichen (mikrostrukturierten) Oberflächen mit besonderen Eigenschaften erlauben.

Das Modell der kritischen Oberflächenspannung nach Baier [26]

Auch biologisch spielen Randwinkel im Bereich der Bioma- terialen eine wichtige Rolle. Baier [26] schlug 1972 ein Mo- dell vor, in dem er eine Korrelation zwischen Biokompatibi- lität, Bioadhäsion und der kritischen O b e r f l ä c h e n s p a n n u n g des Festkörpers (yc) aufstellte. Eine Z u s a m m e n f a s s u n g befin- det sich in Tabelle 1, in der zusätzlich die zugehörigen Kon- taktwinkel berechnet wurden [10]. Im Modell von Baier, das ursprünglich f ü r den Blut-Biomaterialkontakt entwickelt wurde, liegt die „Zone der guten Biokompatibilität" im h y - drophoben Bereich bei 20-32 d y n / c m (Θ = 114°-145°) u n d die „Zone der Bioadhäsion" im hydrophilen Bereich bei 4 2 - 72 d y n / c m (θ = 0 - 90°). Die „Zone der starken Bioadhäsion"

liegt bei 6 8 - 7 2 dyn/cm (θ = 0 - 3 1 ° ) . Bisher ist es j e d o c h nicht gelungen, bei Biomaterialien einen biokompatiblen Bereich von 20-32 dyn/cm zu belegen. Das gelang u. a.

auch deswegen nicht, weil 1972 die große Rolle h y d r o p h o - ber Wechselwirkungen bei der Proteinadsorption nicht all- gemein b e k a n n t war und m a n d a v o n ausging, dass Proteine an niederenergetischen Oberflächen nicht adsorbiert würden.

Inzwischen hat es zahlreiche Versuche gegeben, Zonen der guten Biokompatibilität f ü r Biomaterialien zu definieren, doch blieben all diese Versuche o h n e Erfolg, so dass es bis heute keine allgemeingültigen Biokompatibilitätskriterien gibt. Wenig umstritten ist dagegen die Hypothese einer guten Gewebe-Bioadhäsion im hydrophilen Bereich, d. h. bei großen kritischen O b e r f l ä c h e n s p a n n u n g e n und kleinen Randwinkeln. Hier lässt sich sehr schön zeigen [27], dass die Zelladhäsion u n d Zellspreitung (cell spreading) eine stark sigmoide Funktion der Oberflächenenergie (7s) ist. Im h y d r o - phoben Bereich bei ys < ~ 60 dyn/cm ist praktisch keine Zelladhäsion von Fibroblasten zu beobachten, hingegen bei ys > ~ 60 d y n / c m eine ausgeprägte bis starke Adhäsion u n d

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erhöhte Adhäsion oder Spreitung der Zellen.

Insgesamt hat das Modell von Baier im Bereich der Biomate- rialforschung eine große heuristische Bedeutung erlangt, u n d es lässt sich auch heute noch in vielen Fällen als Richt- s c h n u r verwenden. Wie k ö n n t e man das Modell von Bayer auf molekularer Ebene verstehen? Mechanistisch muss m a n v o n der ersten Reaktion zwischen einem Biomaterial und dem Organismus der Proteinadsorption ausgehen. Bei hohen Kontaktwinkeln im hydrophoben Bereich werden andere Proteine adsorbiert als im hydrophilen Bereich bei niedrigen Kontaktwinkeln. Die unterschiedlichen adsorbierten Protein- schichten an der Oberfläche könnten somit verschiedene Ge- webereaktionen hervorrufen [9], die beispielsweise im h y - drophilen Bereich zu einer verstärkten Bioadhäsion führen.

Darüber hinaus muss berücksichtigt werden, dass die adsor- bierte Proteinschicht ihrerseits zu einer V e r ä n d e r u n g des Randwinkels und der Grenzflächenenergie f ü h r e n kann [9],

somit zu zwei verschiedenen Randwinkeln (Abb. lb) einem Vorrückwinkel θν und einem Rückzugswinkel 9R. Je größer die Differenz dieser Winkel ist, desto mehr klaffen die Kraft- differenzkurven (Abb. 2) auseinander (Hysterese) und desto unidealer ist in der Regel die Oberfläche.

Die Randwinkelhysterese (H) ist definiert als die Differenz von Vorrück- und Rückzugswinkel:

Η = Δθ = θν - θκ (2)

Die Flüssigkeit/Gas-Grenzfläche, die sich als Kontaktlinie bei der Messung über die Oberfläche schiebt (Vorrückstrecke) kehrt nicht entlang der Vorrückstrecke, sondern entlang eines neuen Weges, der Rückzugsstrecke zum A u s g a n g s - punkt zurück. Auf Grund der unterschiedlichen Vorrück- und Rückzugsstrecken werden die zwei verschiedenen Rand- winkel gemessen. Die Messung u n d in Analogie dazu die Spreitung eines Wassertropfens auf der vorliegenden Grenz-

Kritische Oberflächen- spannung (y

)

dyn/cm

Berechneter Randwinkel (Θ)

Benetzbarkeit mit Wasser

Relative Biologische

Interaktion

Biologische Zone

14.7 180°

Ultra-hydrophob

25 130°

Ultra-hydrophob

schwach Hypothetische Zone der Biokompatibilität

32 114°

Hydrophob

schwach Hypothetische Zone der Biokompatibilität

42 90°

Hydrophob

mittel

Zone der guten Bioadhäsion

50 77°

Hydrophil

mittel

Zone der guten Bioadhäsion

60 55° Hydrophil

stark

Zone der guten Bioadhäsion

70 22°

Hydrophil

stark

Zone der guten Bioadhäsion

71.55 10°

Ultra-hydrophil

stark

Zone der guten Bioadhäsion

72 0°

Ultra-hydrophil

stark

Zone der guten Bioadhäsion

*Die Randwinkel (vergleichbar θν einer dynamischen Messung) wurden, wie in [ 10] beschrieben, berechnet Für weitere Einzelheiten siehe [ 101.

Tab. I: Kritische Oberflächenspannung, Benetzbarkeit und relative biolo- gische Reaktivität von Biomaterialien (modifiziert nach dem Modell von ßaier, 1972 [26])

Die Randwinkelhysterese

Wie wir oben gesehen haben, erhält man bei Bewegung des Tropfens auf einer idealen glatten Oberfläche unter Gleich- gewichtsbedingungen einen einzigen Randwinkel (Abb. la).

Auf realen Oberflächen kommt es vor allem wegen der Oberflächenrauigkeit zu einer V e r f o r m u n g des Tropfens und

fläche wird thermodynamisch irreversibel. Die t h e r m o d y n a - mische Irreversibilität beruht auf mikro- und nanoskopi- schen Domänen, die lokale Energiebarrieren hervorrufen und zu metastabilen Zuständen führen (zum P h ä n o m e n der Hysterese siehe auch [25]). Da der Vorrückwinkel weniger empfindlich auf Inhomogenitäten der Oberfläche reagiert als der Rückzugswinkel, gilt ersterer als der maßgebliche Win- kel [18].

Die Randwinkelhysterese wird durch Oberflächeninhomoge- nitäten verursacht, die chemischer oder struktureller Natur

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sein können. Chemische Inhomogenitäten können beispiels- weise durch Oxidation, Korrosion, Beschichtungen, Korn- grenzen oder kristallographische Anisotropien entstehen.

Strukturelle Inhomogenitäten treten vor allem als Rauigkeit in Erscheinung. Früher galten Inhomogenitäten (Rauigkei- ten) der Oberfläche von > 100 nm [14] als Auslöser der Randwinkelhysterese. Heute [18] werden bereits Inhomoge- nitäten von > 10 nm als Ursache einer Randwinkelhysterese angesehen.

Der Einfluss der Oberflächenrauhigkeit auf den Randwinkel wird im Gleichgewicht durch die Wenzel-Gleichung [12, 17]

beschrieben:

cos 9rau = r cos eglatt (3)

wobei 9r a u der gemessene Randwinkel (reale rauhe Ober- fläche), 9g|att der wahre Randwinkel (ideale glatte Oberfläche) und r der Rauhigkeitsfaktor sind. Der Rauhigkeitsfaktor ent- spricht dem Quotienten cos 9^{r a u}/cos 9^gi^a„ u n d ist definiert als das Verhältnis der wahren Fläche zur scheinbaren (rauhen) Fläche des Festkörpers [12,17], Für 9^g,^att < 90° gilt 9^{r a u} <

9glatt und f ü r 9g|att > 90° 9r a u > 9g l a t t. Auf einer hydrophilen Oberfläche wird daher ein A u f r a u e n der Oberfläche zu einer Verkleinerung des Randwinkels und auf einer hydrophoben zu einer Vergrößerung des Randwinkels führen. Entschei- dend f ü r unsere hiesige Betrachtung ist jedoch, dass die Wenzel-Gleichung nicht für dynamische Randwinkelmes- sungen gilt, bei denen ein Vorrück- und ein Rückzugswinkel bestimmt werden [18]. In diesem Fall findet eine Berücksich- tigung der Randwinkelabweichung in der Bestimmung der Randwinkelhysterese (Gl. 2) statt.

Oberflächenrauigkeit

Oberflächenrauigkeiten gelten als die Hauptursache einer Randwinkelhysterese [16,18]. Daher soll simplifiziert und kurz auf diesen Parameter eingegangen werden. Bei einem Oberflächenprofil unterscheidet m a n einen niederfrequenten (Welligkeit) von einem h o c h f r e q u e n t e n Anteil (Rauigkeit).

Das hochfrequente Oberflächenprofil in einem definierten Längenfenster (0.8-5.6 mm) entspricht der Rauigkeit. Eine Referenzlinie wird so gelegt, dass die Fläche der Berge und Täler gleich groß ist. Dabei wird Ra als das arithmetische Mittel der absoluten A b w e i c h u n g e n der Profilhöhen nach oben und unten definiert (siehe [28,29]):

FL Jz-dx (4)

ζ ist der Absolutwert der Profilhöhe (positive oder negative Höhe auf der y-Achse) bezogen auf die Profilreferenzlinie. L ist eine definierte Meßlänge (Fenster) entlang der x-Achse.

Für n-Messungen von ζ in identischen Messabständen kann eine vereinfachte Gleichung zur Berechnung des arithmeti- schen Mittelwertes der Rauigkeit A n w e n d u n g finden [29]:

Ra = (z, + z2 + z3 + ... z j / n (5) Neben dem arithmetischen Mittelwert der Rauigkeit (Ra- Wert) wird auch der geometrische Mittelwert (Rq) verwendet [28], auf den hier j e d o c h nicht weiter eingegangen wird.

In Abbildung 3a wird ein h o c h f r e q u e n t e s (kurzwelliges) Oberflächenprofil in Form eines regelmäßigen Sinus-Profils mit M a x i m u m bei +1 p m und Minimum bei -1 p m Abwei- c h u n g v o n der Referenzlinie (Nullinie) dargestellt (Abb. 1).

Der Ra-Wert lässt sich nach den obigen Gleichungen sehr einfach auf Ra = 1 p m berechnen. In Abbildung 3b liegen

zwei alternierende sinusoide Profile mit unterschiedlichen Profilhöhen (0.5 und 1.0 pm) vor. Hier lässt sich ein Ra- Wert von 0.75 pm berechnen. Wie man aus Abbildung 3 er- kennt, gibt der Ra-Wert in diesen Fällen nur die halbe Höhe der gesamten Profilabweichung wieder. Letztere Größe wird daher als m a x i m a l e Profilhöhe Ry (= S u m m e aus höchster Profilkuppe z+P und und dem tiefsten Profiltal z.P) bezeich- net. Es ist leicht ersichtlich, dass in Abbildung 3 in beiden Fällen Ry = 2 p m ist. Schließlich ist zu berücksichtigen, dass Oberflächen mit identischen Ra-Werten nicht identische Oberflächenprofile besitzen müssen.

Ε a . 1 . 2 3 c 0 . 8

13 JZ Ο 0 . 4

<1) η

$

CO Ο - 0 . 4 η

- 0 . 8 - 0 . 8 - 0 . 8 - 1 . 2 +

0 0.1 0.2 χ (Bezugsstrecke), m m

0 . 3

Ε 3 . CT C .C U

Ο 'α) η ω

^ Ο λ—

α .

0.1 0.2 χ (Bezugsstrecke), m m

Abb. 3: Sinusoide Modellprofile zur Illustration von Rauigkeitsmessungen auf Oberflächen.

a) Hochfrequentes Oberflächenprofil in Form einer regelmäßigen Sinus- schwingung mit den Extremwerten ± I μηη Abweichung von der Referenz- linie (Nullinie). L: def. Messlänge, ζ Profilhöhe. Ra - 1.0 pm, Ry - 2.0 pm.

b) Hochfrequentes Oberflächenprofil in der Form zweier alternierender sinosoider Profile unterschiedlicher Höhe; Extremwerte der Einzelprofile

± 0.5 pm und ± I pm. Ra - 0.75 pm, Ry = 2 pm. Für weitere Einzelheiten siehe Text und Gl. 4 & 5 und Ref. [28]

Ergebnisse und Diskussion

In Abbildung 4 wird das dynamische Randwinkelprofil f ü r eine extrem reine und extrem glatte (Ra ~ 2 - 3 nm) Quarz-

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glasoberfläche gezeigt. Sowohl der Vorrückwinkel als auch der Rückzugswinkel betragen 0° (Fehlen einer Randwinkel- hysterese). Die Oberfläche des Quarzglases besitzt somit ultra-hydrophile Eigenschaften. Da Kontaktwinkelmessun- gen in der Nähe von 0° mit einem größeren Fehler behaftet sind, k ö n n e n in der Praxis Randwinkel zwischen 0-10° noch als Kriterium f ü r ultra-hydrophile Oberflächen angesehen werden.

G e k o p p e l t e s

l-Ubiquitin

Polierte Titankontrolle pg/cm

CSB-Titan pg/cm

0.074 0.323

0.066 0.300

0.490 0.486

Tab. 2: Kopplung von l25l-Ubiquitin an Chromschwefelsäure behandelte (CSB) Titanplättchen*

*Die angegebene Nettomenge von l35l-Ubiquitin, die auf der Titanober- fläche über Aminopropysilan und Carbonyldiimidazol gekoppelt wurde, wurden nach den Ergebnissen in Ref. [8] berechnet. Die Konzentration von Ubiquitin im Kopplungsansatz betrug I mg/ml. Für weitere Angaben siehe Ref. [81.

Abb. 4: Dynamische Randwinkelmessung nach Wllhelmy eines hochrei- nen und hochpolierten (Ra = 2-3 nm) Quarzgiasplättchens in Wasser.

Das Glasplättchen war auf eine Planarität von λ/10 und eine Oberflächen- rauigkeit (Ra) von 2-3 nm poliert worden. Das Plättchen wurde dann in heißer Chromschwefelsäure gereinigt (siehe Methoden). Die Eintauchtie- fe wurde auf den Kontakt des Plättchens mit der Wasseroberfläche (Ein- tauchtiefe = 0) normiert. Die Anteile der Computerzeichnung, die dem Vorrückmodus mit Vorrückwinkel (fy) und dem Rückzugsmodus mit Rückzugswinkel (θκ) entsprechen, sind angegeben.

Der Kontaktwinkel wurde nach der folgenden Gleichung berechnet:

P - Y f

(AF = Kraftdifferenz, p_= Dichte der Flüssigkeit (Wasser), yf - Ober- flächenspannung der Flüssigkeit (Wasser)). Für weitere Einzelheiten siehe Text, Gleichung I & 2 und Ref. [8-10]

Vor kurzem haben wir berichtet [5-11], dass die Oberflächen v o n Titan u n d rostfreiem Stahl (316L) durch eine n e u e nass- chemische Methode u n t e r V e r w e n d u n g v o n Chromschwefel- säure bei h o h e n Temperaturen (200 - 240°) veredelt werden k ö n n e n . Die makroskopische Erscheinung dieser Metalle nach der Chromschwefelsäurebehandlung ist in Abbildung 3 gezeigt. Die vorher glänzende elektropolierte Oberfläche ver- liert ihren Glanz und wird braun oder grau. Fischer et al.

[30] h a b e n zeigen können, dass die S ä u r e b e h a n d l u n g eine mikrostrukturierte Oberfläche mit einem Ra-Wert von 0.88-

1.33 p m erzeugt. Ferner zeigen die Oberflächen eine n a n o - strukturierte passive Oxidschicht mit einer Dicke von 50-150 nm für Titan und 10-50 nm f ü r 316L Stahl im Sinne des oben g e n a n n t e n Quarzglases [30], Die Oberflächen sind also keinesfalls als glatt anzusehen.

Eine der interessantesten Beobachtungen an den neuen Oberflächen betrifft jedoch die dynamischen Randwinkel.

Wie in Abbildung 4 gezeigt ist, Findet m a n nach Chrom- s c h w e f e l s ä u r b e h a n d l u n g Randwinkel von 4 - 9 ° bei m i n i m a - ler bzw. fehlender Randwinkelhysterese (θν Ξ 0R <10°) d. h.

die Oberflächen verhalten sich wie ultra-hydrophile, che- misch h o m o g e n e Oberflächen. In Einzelfällen findet m a n auch Randwinkel von 0° (nicht gezeigt). Die vergleichweise rauen mikrostrukturierten Metalloberflächen verhalten sich somit wie die vollkommen h o m o g e n e n Oberflächen der hochpolierten Quarzglasplatte in Abbildung 3, d. h. die Mikro-/Nanostrukturen in ihrer besonderen physikalisch- chemischen Zusammensetzung kompensieren die durch die Rauhigkeit zu erwartende V e r ä n d e r u n g des Rückzugswinkels auf bisher u n b e k a n n t e Weise.

Eine weitere Eigenschaft der neuen Oberfläche ist die erhöh- te Bindungskapazität f ü r Proteine. Wie in Tabelle 2 gezeigt ist, steigt die Kapazität f ü r die chemische Kopplung des Pro- teins Ubiquitin um den Faktor 4 - 6 auf der mit Chromschwe- felsäure behandelten Oberfläche im Vergleich zur Kontrolle an. Das könnte auf eine Vergrößerung der Oberfläche durch die g e n a n n t e Mikrostrukturierung oder auf die Erzeugung einer größeren Anzahl von Hydroxylgruppen für die Silani- sierungsreaktion zurückzufuhren sein. Im Falle des BMP-2 wurden 5-380 ng/cm2 auf Chromschwefelsäure behandelten Titanplättchen fixiert [8]. Kürzlich k o n n t e zum ersten Mal gezeigt werden [10], dass rhBMP-2 - im submikrogramm/cm2- Bereich auf Titan-Knochenimplantaten immobilisiert - zu einer dramatischen Beschleunigung der Knochenbildung in Spaltüberbrückungsexperimenten am Schaf führt. Bereits nach 28 Tagen kommt es zur zirkumferenten Integration des Implantates im Knochen [10]. Welche Rolle hierbei die neue durch Chromschwefelsäure hervorgerufene Oberfläche spielt, bleibt weiteren Versuchen vorbehalten.

Aus den bisher vorliegenden Daten möchten wir daher mit einer gewissen Vorsicht schließen, dass durch die Chrom- schwefelsäurebehandlung neuartige ultra-hydrophile Ober- flächen auf Titan und rostfreiem 316L-Stahl erzeugt werden, deren Benetzungseigenschaften (beide Randwinkel θν Et 0R <

10°, keine Hysterese) nicht auf einer durch Politur erzeugten Glätte und Homogenität der Oberfläche (ζ. B. hochpoliertes Quarzglas), sondern auf einer ungewöhnlichen physikalisch- chemisch zu definierenden Mikro- oder Nanostruktur beru-

Η.P. Jenissen: Ultra-hydrophile metallische Biomaterialien

O R I G I N A L ' A R B E I T E N

A.

· * ^A-fBf ~ p H ^ a ·

s p i l l

1 II III IV

Abb. 5: Chemische Oberflächenveredelung von Titan- (a) und Stahlplätt- chen (b) mit Chromschwefelsäure

a) Die elektropolierten Titanplättchen wurden für 60 min auf 240° C in Chromschwefelsäure erhitzt (III, IV), elektropolierte Kontrollen (I. II).

b) Die elektropolierten Stahlplättchen (316 L) wurden fur 60 min auf 230° C in Chromschwefelsäure erhitzt (III, IV), elektropolierte Kontrolle (I.

II). Für weitere Einzelheiten siehe Ref. 18,101. Daten aus Ref. [ 10]

hen. Dieses P h ä n o m e n möchten wir „inversen L o t u s e f f e k t "

(anti-Lotuseffekt) n e n n e n . Es gibt starke Hinweise, die d a f ü r sprechen, dass die neuen Eigenschaften durch eine neuartige Strukturierung der Oberflächen im Mikro- und Nanobereich hervorgerufen werden, wie das auch bei ultra-hydrophoben Oberflächen (Lotus-Effekt) der Fall ist. Nach dem Modell von Baier und Untersuchungen in der Literatur ist zu erwarten, dass ultra-hydrophile Oberflächen besonders gute bioadhäsi- ve Eigenschaften aufweisen werden. Das würde bedeuten, dass ultra-hydrophile Metallimplantate auch o h n e weitere Beschichtung oder Biologisierung heutigen Implantaten mit

„natürlicher" Oberfläche überlegen sein könnten. Ferner würde eine solche Oberfläche eine Beschichtung mit sog.

bioadhäsiven Peptiden, ζ. B. RGD-Peptiden, überflüssig ma- chen. Hingegen k ö n n t e man bei der Herstellung bioaktiver Oberflächen beispielsweise den Schwerpunkt auf die Immo- bilisierung morphogentetischer Proteine wie der knochenbil- denden BMPs oder der gefäßbildenden Angiotropine legen.

Abstract

The measurement of dynamic contact angles (θ) by the Wil- helmy-Plate procedure is a powerful method for gaining in- formation on subtile surface structures down to the molecu- lar level. This method differentiates an advancing (0Adv) from a receding contact angle (0Rcc) with the difference (ΔΘ) being contact angle hysteresis (H). Hydrophilicity and hydrophobi- city are generally equated with contact angles ranging from 0-180° whereby a low or absent hysteresis [H = 0] indicative is of an ideally smooth surface. On quartz glass (fused silica) surfaces can be obtained with an ultra-hydrophilic character displaying advancing and receding contact angles of 0°

after polishing to a surface roughness of Ra ~ 2-3 nm. Much to our surprise we have found similarly extremely hydrophi- lic surfaces on titanium and stainless steel after treatment by a novel chromosulfuric acid method. In spite of a ca.

300-500-fold higher surface roughness (Ra ~ 880-1100 nm) in comparison to the quartz glass controls, surfaces with

2 A Z 1 . 5 +

!

1

« 0 . 5 + 0 - 0 . 5

2 4 6

Einlauchtiefe, mm

Ζ Ε

2 "

1 . 5 - 1 • Ii.

< 0 . 5 - 0 - 0 . 5

Β

2 4 6

Eintauchtiefe, mm

θν = 9 ° θ „ = 9 ° ΔΘ

=0

θν =

4°

θ „ = ~0°

ΔΘ =

-4°

Abb. 6: Dynamische Randwinkelmessungen nach Wilhelmy von chron- schwefelsäureveredelten Titan- und Edelstahlplättchen in Wasser Gezeigt sind die Computerverlaufekurven mit den berechneten Vorrück- (qv) und Rückzugswinkeln (qR).

a) Chromschwefelsäureveredeltes Titanplättchen (vorher elktropoliert und anodisch oxidiert) mit einem Rauigkeitswert (Ra) von zirka I μιτι [30], Ähnliche Randwinkel werden mit elektropolierten Plättchen erhal- ten (nicht gezeigt).

b) Chromschwefelsäureveredeltes Edelstahlplättchen 316L (vorher elek- tropoliert). Die Eintauchtiefe wurde nicht auf Null normalisiert wie in Abb. 4.

Für weitere Einzelheiten siehe Methoden, und Ref. [8,10], Daten aus Ref.

110]

contact angles below 10° and even close to 0° (ultra-hydro- philic surfaces) in the absence of hysteresis were obtained.

We would linke to call this p h e n o m e n o n „Inverse Lotus Ef- fect". The extreme hydrophilicity and absence of hysteresis on a microstructurally rough metal surface form a p a r a d o x which remains to be elucidated. It is suggested that ultra- hydrophilic (0Adv ξ 0Rec < 10°) and ultra h y d r o p h o b i c (0Adv ξ 0Rec > 130°) surfaces compris a new group of ultraphilic sur- faces („extremes loving"). According to the critical surface tension model of Baier ultra-hydrophilic surfaces should show a strong bioadhesion. Ultra-hydrophilic surfaces on metals m a y therefore form the basis of a new generation of

^ "I BlOmaterialien 2 (1), 2001

ORIGINAL

"ARBEITEN

Prof. Dr.

H.P. Jennissen

Korrespondenzanschrift:

Prof. Dr. Η. P. Jennissen Institut für Physiologische Chemie

Universität Essen Universitätsklinikum Hufelandstr. 55 D-45122 Essen

Akademischer Lebenslauf

1970 Promotion zum Dr. med. am Institut für Bioche- mie in Freiburg; Enzyminduktion in Rattenleber 1971 Approbation, ECFMG

1977 Habilitation am Institut für Physiologische Che- mie in Bochum; Proteinadsorption an alkyl- substituierten Agarosen

1981 apl. Professor am Institut f ü r Physiologische Chemie in Bochum; Phosphorylase Kinase, Calmodulin, Adsorptionshysterese

1982 Ruf auf eine Universitätsprofessur für Physiolo- gische Chemie an der LMU München; ATP-ab- hängige Proteolyse, Ubiquitin

1989 Ruf auf eine Universitätsprofessur für Physiolo- gische Chemie an der Universität Essen; Leiter der Arbeitsgruppe Biochemische Endokrinolo- gie; Ubiquitinkonjugation von Calmodulin, gen- technische Herstellung von Mediatoren wie BMP-2, Biologisierung von Metallimplantaten mit BMP-2

advanced metallic and non-metallic biomaterials for human applications.

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