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NOTIZEN 1003
Über unlösliche, in Polyacrylam idgel fixierte Enzyme
Th e o d o r Wi e l a n d, He l m u t De t e r m a n n u n d Ka r l Bü n n ig 1
Institut für Organische Chemie der Universität Frankfurt (Main)
(Z. Naturforschg. 21 b, 1003 [1966] ; eingegangen am 11. Juni 1966)
Viele Enzyme sind in der Zelle nicht frei beweglich, sondern an Strukturen gebunden oder in gesonderten Räumen enthalten. Als Modellsystem für solche fixier
ten Enzyme 2 haben wir den Einschluß von Katalase 3, Lactatdehydrogenase (LDH), Alkoholdehydrogenase aus Hefe und Trypsin in Gele versucht, die durch drei
dimensionale Polymerisation von Acrylsäureamid und .'V,7V -Bismethylenacrylamid in Gegenwart der gelösten Proteine entstanden. Wir beobachteten, daß im Gel wie bei 1. c. 2e nach Zerkleinerung jeweils eine mehr oder weniger große Enzymmenge nicht auswaschbar zu
rückgehalten wird. Ein Gel mit brauchbarer LDH-Akti- vität erhielten wir im folgenden Ansatz:
285 mg Acrylsäureamid und 15 mg Bismethylenacryl- amid wurden in 2,3 ml 0,05-m. Phosphatpuffer (pn 7,6, 10-3-m. an Titriplex III) gelöst. Unter Reinstickstoff mit Magnetrührer wurden bei Raumtemperatur 1,0 mg Schweineherz-LDH (ca. 20 000 Bücher-E/mg) dann 0,1 ml 5-proz. wäßrige ^Dimethylaminopropionitril- Lösung und schließlich 0,1 ml 5-proz. wäßrige Ammo- niumpersulfatlösung zugegeben. Nachdem nach 3 bis 4 Min. der Rührkern im erstarrenden Gel steckenblieb, wurde noch 30 Min. im Eisbad aufbewahrt. Der Gel
block wurde durch Durchpressen durch ein Sieb zer
kleinert, und in Form von ca. 0,3 mm großen Körnern mit wenigstens 150 ml der oben angegebenen Puffer
lösung in einer kleinen Säule ausgewaschen. Die in der Waschlösung bestimmte Eiweißmenge4 diente zur in
1 Teil der Dissertation K. B ü n n i g , Universität Frankfurt (M ain), 1966. D 30.
2 U n lö s lic h e , b io lo g isc h a k tiv e E n zym e sin d nach v e rsc h ie d e n e n M e th o d e n e rh a lte n w o r d e n : a) durch K u p p lu n g m it d ia z o tier te m P o ly a m in o s ty r o l von N . G ru b h o fer u . L . S c h le it h , N a tu r w isse n sc h a fte n 40, 508 [1953], m it Car- b o x y m e t h y lc e llu lo s e a z id von M . A . M itz , L . J. Summaria, N a tu r e [L o n d o n ] 189, 576 [1961], m it r e a k tio n sfä h ig e m , z. B . Iso th io c y a n a tg r u p p e n -h a ltig e m S e p h a d e x von R . A x e n u . J. P o r a t h , N a tu r e [L o n d o n ] 210, 367 [1966]; b ) durch B in d u n g an A u sta u sc h e r, z. B . D o w ex 50 durch L . B . B a r- n e t t u . H . B . B u l l , B io ch im . b io p h y s ic a A c ta [A m ste r d a m ] 3 6 , 2 4 4 [1959]; c) durch A n k o n d e n sier e n von P o l y
direkten Ermittlung der im Gel verbliebenen Menge Enzym.
Die enzymatische Aktivität wurde in der Weise be
stimmt, daß man durch ein definiertes Volumen der Gelpartikel in einer kleinen Säule Pyruvat und hydrier
tes Coenzym (NADH) in definierter Geschwindigkeit strömen ließ und die Abnahme von NADH spektro- photometrisch verfolgte. Das oben beschriebene LDH- Gel enthielt dieser Messung zufolge 57 E pro ml, d. h.
1% der ursprünglich im ml des Ansatzes enthaltenen Aktivität. Später fanden wir, daß sich bedeutend akti
vere Gele erhalten lassen, wenn man das Acrylamid ohne Vernetzer in der Hälfte des Endvolumens ca.
2 Min. lang polymerisiert, dann den Vernetzer und das Enzym in der zweiten Hälfte des Ansatzes zusetzt und noch ca. 2 Min. gelieren läßt. Das so erhaltene Präpa
rat besaß 194 E/ml Gelpartikel.
Ein im Exsikkator getrocknetes Gel zeigte nach einem Monat keinen meßbaren Aktivitätsverlust, ein anderes, das im gequollenen Zustand im Kühlschrank aufbe
wahrt wurde, hatte nach 6 Monaten immerhin fast noch 10% der ursprünglichen Wirksamkeit. Eine Enzym
lösung gleicher Konzentration ist bereits nach wenigen Tagen inaktiv.
Von der Alkoholdehydrogenase waren 5% und vom Trypsin 11% der eingesetzten Aktivität im simultan
polymerisierten Gel wieder zu finden. Über die Natur der Bindung, ob es sich um in Hohlräume oder zwi
schen Molekülbündel der Matrix mechanisch einge
schlossene Enzymmoleküle handelt, oder ob das Protein bei der Polymerisation radikalisch covalent an einigen Seitenketten gebunden wird, läßt sich bisher keine sichere Aussage machen. Hierauf gerichtete Versuche sind im Gang.
Die Untersuchung wurde mit Unterstützung der D e u t s c h e n F o r s c h u n g s g e m e i n s c h a f t ausgeführt.
aminosäureketten von E. K a t c h a l s k i et al., z. B . J. biol.
Chemistry 236, 1720 [1961]; d) durch Adsorption (von Papain) an eine Kollodiummembrane und anschließendes Vernetzen mit bisdiazotierter Benzidin-3.3-disulfonsäure und e) — was unseren Versuchen am nächsten kommt — durch vernetzende Polymerisation von Acrylamiden in Ge
genwart von Enzymen von P. B e r n f e l d u . J. W a n , Science [Washington] 142, 678 [1963] und G. P. S t i c k s u . S . J.
U p d i k e , Analytic Chem. 38, 726 [1966].
3 Versuche von R . L o t z , 1965.
4 a) O. H. L o w r y , N. J. R o s e b r o u g h , A. L . F a r r u . R . J.
R a n d a l l , J. biol. Chemistry 193, 265 [1951] ; b) M. E g g s t e i n u. F . H. K r e n t z , Klin. Wochensdir. 33, 879 [1955].
