Aus dem Walther-Straub-Institut für Pharmakologie und Toxikologie der Ludwig-Maximilians-Universität München
Vorstand Prof. Dr. med. Thomas Gudermann
Isolierte Organmodelle zur Entwicklung neuer
therapeutischer Ansätze bei
Organophosphatvergiftungen
Dissertation
zum Erwerb des Doktorgrades der Humanbiologie der Medizinischen Fakultät der
Ludwig-Maximilians-Universität zu München
vorgelegt von
Katharina Aurelia Marquart, geb. Neumaier aus
Aichach 2018
Mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät der Universität München
Berichterstatter: Prof. Dr. med. Franz Worek Mitberichterstatter: Prof. Dr. rer. nat. Frank Mußhoff Mitberichterstatter: Prof. Dr. rer. nat. Gerhard Scherer Mitbetreuung durch den
promovierten Mitarbeiter: PD Dr. med. Timo Wille
Dekan: Prof. Dr. med. dent. Reinhard Hickel
I
Zusammenfassung
Jährlich sterben mehrere hunderttausend Menschen durch Organophosphat (OP)-Vergiftungen, sei es in suizidaler Absicht mit Pestiziden oder im Rahmen militärischer Einsätze, wie 2013 und 2017 durch den Einsatz von Sarin in Syrien. Bei diesen Vergiftungen kommt es zu einer irreversiblen Hemmung der Acetylcholinesterase. Die Patienten leiden aufgrund der daraus resultierenden Übererregung der cholinergen Rezeptoren an Miosis, Salivation, Bronchorrhoe, Faszikulationen, Konvulsionen und einer peripheren, bzw. zentralen Atemlähmung, an der sie auch versterben können. Da die bisherige Standardtherapie bei einigen OP-Vergiftungen unzureichend ist, bedarf es neuer Therapeutika. Aus ethischen Gründen können Untersuchungen von potentiellen Antidoten nicht am Menschen erfolgen. Deswegen stellen isolierte Organmodelle, die schon seit Jahrzehnten zur Pharmaka-Testung verwendet werden, sinnvolle und notwendige in vitro Methoden zur Eignungsprüfung dar.
Ein möglicher Therapieansatz im Rahmen einer OP-Vergiftung ist die direkte Modulation von nikotinergen, bzw. muskarinergen Rezeptoren durch Bispyridinium-(Non)-Oxime, z.B. HI-6 und SAD-128. Die weiterentwickelte Leitsubstanz MB 327 zeigte in in vitro und in vivo Versuchen mit Soman vielversprechende Therapieerfolge, war jedoch in hohen Konzentrationen in vivo toxisch. Dies hat uns dazu veranlasst, erstmalig nikotinerge und muskarinerge rezeptoraktive Substanzen am Langendorff-Rattenherz und im Rattenjejunum, als Modell der glatten Muskulatur, zu untersuchen.
Keine der getesteten Substanzen war im isolierten Langendorff-Herz kardiotoxisch. Demgegenüber zeigten die getesteten Substanzen im isolierten
II Dünndarm-Modell nach vorheriger Stimulation mit Carbamoylcholin eine konzentrationsabhängige Relaxation der glatten Muskulatur. Die Leitsubstanz MB 327 war hierbei am potentesten (EC50 = 0,7 x 10-5 M).
Aufgrund der Relevanz von Speziesunterschieden im Rahmen von OP-Vergiftungen und der entsprechenden Therapeutika-Entwicklung, wurden anschließend humane Dünndarmpräparate mit den Ergebnissen der Ratte verglichen. MB 327 zeigte einen zur Ratte vergleichbaren Effekt (EC50 = 0,7 x 10-5 M) bzw. entsprechende AChE-Aktivitäten.
Isolierte Organmodelle stellen eine praktikable Untersuchungsmethode potentieller Therapeutika im Rahmen einer OP- Vergiftung als Zwischenschritt von in vitro und in vivo Versuchen dar. Kardiologische Effekte lassen sich am isolierten Langendorff-Herz und glattmuskuläre Relaxation an Darmgewebe untersuchen, wobei für die relaxierende Wirkung eine Übertragbarkeit auf den Menschen gewährleistet ist.
III
Summary
Intoxications with organophosphorous compounds (OP) still pose a major threat. This is demonstrated by annual several hundred thousand deaths annually due to pesticide (self-) poisoning and the recent attacks with sarin in Syria 2013 and 2017. Here a partly irreversible inhibition of the enzyme acetylcholinesterase results in a subsequent overstimulation of cholinergic receptors. Patients suffer from miosis, salivation, bronchorrhoe, fasciculation, convulsions and a peripheral, as well as central respiratory paralysis possibly resulting in death. As the current standard therapy is insufficient for some OP compounds, new therapeutics have to be developed. Since these potential antidotes cannot be examined in humans due to ethical reasons and isolated organ models are used in pharmacological research since decades, these in vitro methods pose a sensible and necessary suitability test.
One possible therapeutic approach in case of OP poisoning is the direct modulation of nicotinergic and muscarinergic receptors with bispyridinium-(non)-oximes, e.g. HI-6 or SAD-128. The refined lead substance MB 327 showed promising results with soman in vitro and in vivo. However, it was toxic in high dosages in vivo. Therefore, nicotinic and muscarinic receptoractive substances were examined for the first time in the isolated Langendorff-heart, as well as the isolated rat jejunum, being a model for smooth musculature. None of the tested compounds showed a cardiotoxicity in the isolated Langendorff-heart. All substances displayed a concentration dependent smooth muscle relaxing effect in the isolated small bowel model; MB 327 being the most potent (EC50 = 0.7 x 10-5 M).
IV As species differences play a major role for OP poisoning as well as for their drug development, we compared human small bowel samples with the results gained with rat tissue in a follow-up study. MB 327 showed a comparable relaxing effect (EC50 = 0.7 x 10-5 M), and respective AChE-activity.
Summarizing, isolated organ models are useful tools to assess potential therapeutics for OP poisoning, as intermediate stage between in vitro and in vivo experiments. Cardiotoxic effects can be examined with isolated Langendorff-hearts. On the other hand the spasmolytic effect of different compounds can be investigated with small bowel samples, whereby transferability from rat to humans is warranted.
V
Eidesstattliche Versicherung
Ich erkläre hiermit an Eides statt, dass ich die vorliegende Dissertation mit dem Thema "Isolierte Organmodelle zur Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze bei Organophosphatvergiftungen" selbständig verfasst, mich außer der angegebenen keiner weiteren Hilfsmittel bedient und alle Erkenntnisse, die aus dem Schrifttum ganz oder annähernd übernommen sind, als solche kenntlich gemacht und nach ihrer Herkunft unter Bezeichnung der Fundstelle einzeln nachgewiesen habe.
Ich erkläre des Weiteren, dass die hier vorgelegte Dissertation nicht in gleicher oder in ähnlicher Form bei einer anderen Stelle zur Erlangung eines akademischen Grades eingereicht wurde.
Dr. Olga Prokopchuk (Chirurgische Klinik des Klinikum rechts der Isar, TU München) hat an der Durchführung dieser Arbeit mitgewirkt. Sie nahm die Patientenaufklärung, Probenentnahme und Probenübergabe des humanen Darmgewebes vor.
München, den 19.12.2018,
_____________________________ (Katharina Marquart)
VI
Inhalt
Zusammenfassung ... I Summary ... III Eidesstattliche Versicherung ... V Abkürzungsverzeichnis ... VIII Publikationsliste ... IX 1. Einleitung ... 1 1.1 Phosphororganische Verbindungen ... 1 1.2 Wirkmechanismus ... 2 1.3 Diagnostik ... 3 1.3.1 Symptomatik ... 3 1.3.2 Labordiagnostik ... 4 1.4 Standardtherapie ... 51.5 Alternativer Therapieansatz: Bispyridinium-Non-Oxime ... 7
1.6 Speziesunterschiede ... 9
1.7 Ziel der Dissertation ... 9
2. Veröffentlichungen ... 12
2.1 Veröffentlichung I ... 12
2.2 Veröffentlichung II ... 18
3. Literaturverzeichnis ... 24
VII
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1. 1 Strukturformeln verschiedener OP-Verbindungen. ... 2 Abb. 1. 2 Reaktion eines Organophosphats (OP) mit dem Enzym Acetylcholinesterase (AChE) und die daraus resultierende Hemmung der AChE. ... 3 Abb. 1. 3 Strukturformel von MB 327. ... 8
VIII
Abkürzungsverzeichnis
ACh Acetylcholin AChE Acetylcholinesterase BChE Butyrylcholinesterase GA Tabun GB Sarin GD Soman GF CyclosarinmAChR muskarinerge ACh Rezeptoren nAChR nikotinerge ACh Rezeptoren
OP phosphororganische Verbindungen PAM positiver allosterischer Modulator NKS Nervenkampfstoff(e)
IX
Publikationsliste
Publikationen
1. Neumaier, K., Worek, F., Thiermann, H., Wille, T., 2016. Bispyridinium
non-oximes: An evaluation of cardiac effects in isolated hearts and smooth muscle relaxing effects in jejunum. Toxicol. In Vitro 35, 11–16. 10.1016/j.tiv.2016.05.005.
2. Marquart, K., Prokopchuk, O., Worek, F., Thiermann, H., Martignoni, M.E., Wille, T., 2017. Human small bowel as a useful tool to investigate smooth muscle effects of potential therapeutics in organophosphate poisoning.
Toxicol. Lett. 293, 235–240. 10.1016/j.toxlet.2017.11.012.
Zusätzliche Publikationen
1. Wille, T., Neumaier, K., Koller, M., Ehinger, C., Aggarwal, N., Ashani, Y., Goldsmith, M., Sussman, J.L., Tawfik, D.S., Thiermann, H., Worek, F., 2016. Single treatment of VX poisoned guinea pigs with the phosphotriesterase mutant C23AL: Intraosseous versus intravenous injection. Toxicol. Lett. 258, 198–206. 10.1016/j.toxlet.2016.07.004.
2. Worek, F., Schilha, M., Neumaier, K., Aurbek, N., Wille, T., Thiermann, H., Kehe, K., 2016. On-site analysis of acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase activity with the ChE check mobile test kit-Determination of reference values and their relevance for diagnosis of exposure to organophosphorus compounds. Toxicol. Lett. 249, 22–28. 10.1016/j.toxlet.2016.03.007.
X 3. Worek, F., Seeger, T., Neumaier, K., Wille, T., Thiermann, H., 2016.
Blaptica dubia as sentinels for exposure to chemical warfare agents - a pilot study. Toxicol. Lett. 262, 12–16. 10.1016/j.toxlet.2016.09.006.
4. Marquart, K., Herbert, J., Amend, N., Thiermann, H., Worek, F., Wille, T., 2018. Effect of cholinergic crisis on the potency of different emergency anaesthesia protocols in soman-poisoned rats. Clin. Toxicol. 11, 1–7. 10.1080/15563650.2018.1520241.
1
1.
Einleitung
Der Einsatz von Sarin in Syrien 2013 und 2017 sowie mehrere hunderttausend Tote jedes Jahr durch Vergiftungen mit Organophosphatpestiziden zeigen die hohe toxikologische Relevanz von phosphororganischen Verbindungen (OP) [1–4]. Im Nachfolgenden werden zunächst die Unterschiede von verschiedenen OP und deren Wirkmechanismus aufgezeigt sowie Diagnostik- und Therapiemöglichkeiten erklärt. Anschließend wird auf nikotinerge bzw. muskarinerge rezeptormodulierende Substanzen eingegangen und deren Untersuchung in verschiedenen Organmodellen und entsprechende Ergebnisse in beiden Veröffentlichungen diskutiert.
1.1 Phosphororganische Verbindungen
Zu den OP zählen neben einer Vielzahl von Pestiziden auch Nervenkampfstoffe (NKS). Hierbei wird zwischen der G-Reihe, bestehend aus Tabun (GA), Sarin (GB), Soman (GD), Cyclosarin (GF), und der V-Reihe (VX, VR, CVX) unterschieden (siehe Abb. 1-1). Diese Phosphon- bzw. Phosphorsäurederivate mit zwei Alkylgruppen und einer Abgangsgruppe weisen Unterschiede hinsichtlich ihrer Toxizität und ihrer physikochemischen Eigenschaften auf [5,6]. Kampfstoffe der G-Reihe sind hydrolyselabilere und volatilere Flüssigkeiten als die Substanzen der V-Reihe und ihre Aufnahme erfolgt meist inhalativ. Bei den hydrolysestabileren NKS der V-Reihe hingegen kommt es meist zu einer perkutanen Vergiftung. Dies kann in einer kontinuierlichen Resorption des NKS resultieren und zu einer verzögerten, jedoch länger andauernden Vergiftung führen [5,7,8].
1. Einleitung 2
Paraoxon-Ethyl VX
Tabun (GA) Sarin (GB)
Cyclosarin (GF) Soman (GD)
Abb. 1. 1 Strukturformeln verschiedener OP-Verbindungen. Dargestellt ist die Grund-Strukturformel aller OP, verschiedene NKS der G-Reihe bzw. VX und Paraoxon-Ethyl als Vertreter der Pestizide.
1.2 Wirkmechanismus
Bei einer Vergiftung mit OP kommt es zur irreversiblen Hemmung von Esterasen, vor allem der Acetylcholinesterase (AChE). Hierbei wird die Serin-Hydroxyl-Gruppe im aktiven Zentrum des Enzyms phosphoryliert bzw. phosphonyliert [5]. Durch diese Hemmung der lebensnotwendigen AChE kommt es zu einer Akkumulation von Acetylcholin (ACh) im synaptischen Spalt, was zu einer Übererregung der cholinergen Rezeptoren mit cholinerger Krise (siehe 1.3.1) führt [3,9–11]. Die phosphorylierte bzw. phosphonylierte AChE kann in einigen Fällen durch spontane Hydrolyse reaktiviert werden (Spontanreaktiverung; Abb. 1-2). Bei einigen NKS, wie z.B. Soman, kommt es innerhalb weniger Minuten durch Dealkylierung zu einer schnellen „Alterung“
1. Einleitung 3 der AChE. Der so entstandene stabile Komplex kann anschließend nicht mehr durch Nukleophile reaktiviert werden (siehe Abb. 1-2) [5,6,8,12,13]. Bei einigen OP, wie z.B. Tabun, ist eine Reaktivierung aufgrund stabilisierender Konformationsänderungen des Enzym-NKS-Komplexes schwer möglich [5,14]. Im besten Fall kann durch Nukleophile, wie z.B. Oxime, eine Ablösung des OP-Restes von der AChE erreicht werden und so die Enzymfunktion reaktiviert werden (siehe Abb. 1.4).
X -AChE - OH AChE - OH Hemmung ki Oxim ks ka AChE - OH kr2= kr/KD H2O H2O
Reaktivierung durch Oxim
Spontanreaktivierung Alterung durch Dealkylierung
Abb. 1. 2 Reaktion eines Organophosphats (OP) mit dem Enzym Acetylcholinesterase (AChE) und die daraus resultierende Hemmung der AChE. Die Hemmkonstante ki ist
abhängig von den chemischen Eigenschaften des OPs. In den folgenden Schritten sind die Spontanreaktivierung (Spontanreaktivierungskonstante ks), Alterung durch Dealkylierung
(Alterungskonstante ka) und die Reaktivierung durch ein Oxim (Reaktivierungskonstante kr2)
dargestellt. Modifiziert nach [15].
1.3 Diagnostik
1.3.1 Symptomatik
Durch die Hemmung der AChE im Rahmen einer OP Vergiftung kommt es zu einer Akkumulation von ACh im synpatischen Spalt. Infolge dessen werden
1. Einleitung 4 muskarinerge bzw. nikotinerge ACh Rezeptoren (mAChR, bzw. nAChR) überstimuliert (vgl. Kapitel 1.2). MAChR kommen im Gehirn und in parasympathischen Erfolgsorganen vor, wobei bisher fünf Subtypen (M1 bis M5) mit Signaltransduktion durch heptahelikale Rezeptoren mit Aktivierung eines G-Proteins beschrieben sind [5,16,17]. NAChR hingegen sind Ionenkanäle, die aus fünf Untereinheiten bestehen und im Gehirn, in vegetativen Ganglien und an neuromuskulären Endplatten vorkommen [5]. Je nach Ort der Übererregung wird deswegen zwischen drei unterschiedlichen Symptomengruppen unterschieden: muskarinerge (Miosis, Bradycardie Bronchorrhoe, Bronchospasmus, Hyperhidrose, Salivation, Defäkation, Urinabgang), nikotinerge (Tachykardie, Hypertension, Faszikulationen, Plegien) und zentrale Symptome (Atemdepression, Angstzustände, Unruhe, Schwindel, Kopfschmerzen, Tremor, Konvulsionen). Die Patienten versterben i.d.R. an einer Kombination aus peripherer bzw. zentraler Atemlähmung [5,6,13]. Bei inhalativen Intoxikationen, wie z.B. durch Sarin, zeigen die Patienten erst lokale Veränderungen an den Schleimhäuten und Augen (z.B. Miosis, Rötungen, Lakrimation), anschließend kommt es rasch zu einer Generalisierung. Bei perkutaner Intoxikation hingegen, z.B. durch VX, tritt die Symptomatik verzögert auf [6].
1.3.2 Labordiagnostik
Da die Symptomatik bei inhalativen Intoxikationen schnell nach der Exposition auftritt und umgehend therapeutische Maßnahmen ergriffen werden müssen, kommt der Labordiagnostik nur ein konfirmatorischer Nachweis zu. Bei V-Stoffen hingegen, bei denen es zu einer langsamen Resorption kommt, stellt sie
1. Einleitung 5 die einzige Möglichkeit dar, um ggf. schon vor dem Auftreten der Symptome mit therapeutischen Maßnahmen zu beginnen. Die Ermittlung der Cholinesteraseaktivitäten des Patienten ist hier die einzige einsatzrelevante Diagnostikmethode (ChE check mobile bzw. ChE status monitor, Securetec Detektions-Systeme AG, Neubiberg, Deutschland). Hierbei wird die AChE-Aktivität im Vollblut und die Butyrylcholinesterase (BChE)-AChE-Aktivität im Vollblut bzw. Plasma mittels kolorimetrischen Ellman Assays gemessen [6,18–20]. Des Weiteren können NKS, deren Metabolite und Proteinaddukte im Vollblut, Plasma und Urin durch aufwendige Verfahren im Labor nachgewiesen werden. Diese Methoden besitzen jedoch keine Relevanz für die Einleitung und die Steuerung der Therapie [6,21–25].
1.4 Standardtherapie
Die bisherige Standardtherapie im Rahmen einer OP-Vergiftung besteht aus Atropin und einem Oxim.
Atropin wirkt hierbei als kompetitiver muskarinerger Rezeptorantagonist, verhindert somit eine Übererregung und die Ausbildung lebensbedrohlicher Symptomatik, wie z.B. Bronchokonstriktion und zentrale Atemdepression [12,13,17,26–29]. In hohen Konzentrationen wirkt es sogar krampflösend [17]. Initial sollten dem Patienten 2 mg Atropin intravenös oder intramuskulär verabreicht werden. Diese Dosis wird bis zum Sistieren der Symptomatik verdoppelt (4 – 8 – 16 – 32 mg, etc.) [17,26]. Dies kann dazu führen, dass Atropinkonzentrationen erreicht werden, die in unvergifteten Patienten zu schwerwiegenden Nebenwirkungen führen können [30].
1. Einleitung 6 Oxime hingegen reaktivieren die AChE indem sie die kovalente Bindung zwischen dem OP und dem Enzym in zwei Schritten brechen (siehe Abb. 1-2) [27,29,31]: Zuerst bindet das Oxim an die kovalent gebundene Phosphylgruppe, wodurch ein Oxim-Phosphyl-AChE-Konjugat entsteht [13,29,32]. Anschließend wird die reaktivierte AChE freigesetzt (Abb. 1-2) [12,27,29,32]. Die Reaktivierung wird durch mehrere Faktoren, wie z.B. Speziesunterschiede, spontane Reaktivierung und die "Alterung" der AChE beeinflusst (siehe Abb. 1-2) [33–40].
In Deutschland und weiteren Ländern wird das 1964 entwickelte Obidoxim verwendet [41,42]. Die vorgeschlagene Dosierung liegt hier initial bei einem Bolus von 250 mg und anschließender kontinuierlicher intravenöser Gabe von 750 mg über 24 Stunden [27,43,44]. Der ATOX II Combopen® (Meridian Medical Technologies Ltd, Belfast, Großbritannien) Autoinjektor enthält neben 2 mg Atropinsulfat 220 mg Obidoximchlorid. Das in den 1950er Jahren synthetisierte Pralidoxim (2-PAM) hingegen wird in Großbritannien und USA, aber auch in asiatischen Ländern eingesetzt [42,45–47]. Autoinjektoren enthalten 600 mg Pralidoximchlorid [48,49]. Zusätzlich gibt es noch TMB-4, das in Israel und HI-6, welches in Kanada und in Schweden in Autoinjektoren zum Einsatz kommt [13]. Jedoch sind alle bisher entwickelten Oxime nur gegen ein begrenztes OP-Spektrum wirksam. Obidoxim z.B. ist gegen Paraoxon, Sarin und VX effektiv wirksam. Es ist jedoch nur ein schwacher Reaktivator gehemmter AChE bei Cyclosarin- und Tabun-Vergiftungen [13,29].
Die im Rahmen der Vergiftung auftretenden Krampfanfälle sollten mit Benzodiazepinen behandelt werden. Hierbei wird je nach Schweregrad initial eine Dosis von 5 – 20 mg intravenös verabreicht [50,51].
1. Einleitung 7
1.5 Alternativer Therapieansatz: Bispyridinium-Non-Oxime
Da die bisherige Standardtherapie bestehend aus Atropin und einem Oxim (z.B. Obidoxim) bei einigen Nervenkampfstoffen, wie z.B. bei Soman, Tabun oder Cyclosarin, und Pestiziden, wie z.B. Fenamiphos und Profenofos, unzureichend ist, bedarf es neuer Therapeutika (vgl. Kapitel 1.1 und 1.4). Eine vielversprechende Möglichkeit stellt dabei die Modulation nikotinerger Rezeptoren dar.
Schon in den 1970er bzw. 1980er Jahren zeigten Oxime (z.B. HI-6) sowohl in vitro als auch in vivo neben der Reaktivierung der AChE einen therapeutischen Effekt [30,52–55]. Für SAD-128, eine weiterentwickelte Substanz ohne Oximgruppe, konnte eine Interaktion mit nikotinergen und muskarinergen Rezeptoren nachgewiesen werden [55,57–62]. Aufgrund dieser Rezeptormodulation war SAD-128 in in vivo Versuchen mit Soman-vergifteten Mäusen wirksam, ohne die gehemmte AChE zu reaktiveren [63–65]. Neben SAD-128 konnte eine Vielzahl von weiteren Bispyridinum-(Non)-Oximen die muskuläre Übertragung nach Somanvergiftung am isolierten Rattendiaphragma wiederherstellen [66]. MB 327 (1,1'-(propan-1,3-diyl)bis(4-tert-butylpyridinium)), eine weiterentwickelte Variante von SAD-128, wurde zunächst im Defence Science & Technology Laboratory, Porton Down, UK, untersucht und zählt zu den Bispyridinium-Non-Oximen. Sie zeichnet sich durch zwei Tert-Butyl-Gruppen und einen Propyl-Linker, der die beiden Pyrdiniumringe verbindet, aus (siehe Abb. 1-3) [30]. MB 327 zeigte ebenfalls eine rezeptormodulierende Wirkung an nikotinergen und muskarinergen Rezeptoren [67–69] sowie einen anti-nikotinergen Effekt in Rhabdomyosarkom-Zellen [69]. Neueste Studien belegen, dass Bispyridinium-Non-Oxime an muskarinergen Rezeptoren als
1. Einleitung 8 kompetitiver Antagonist über eine orthosterische Bindungsstelle und an nikotinergen Rezeptoren als positiv allosterische Modulatoren (PAM) wirken [67,70,71]. Zusätzlich war MB 327 in der Lage, die neuromuskuläre Übertragung in der quergestreiften Muskulatur nach Somanvergiftung wiederherzustellen [69,72]. Darüber hinaus hatte es in vivo einen protektiven Effekt bei Soman-vergifteten Meerschweinchen. Kontrolltiere, die kein Soman injiziert bekommen hatten, zeigten jedoch ab 30 mg/kg MB 327 Vergiftungserscheinungen in Form von schlaffer Lähmung und respiratorischer Insuffizienz. Ab 100 mg/kg wirkte MB 327 sogar tödlich, wobei der genaue Mechanismus der Toxizität nicht geklärt wurde [73].
Abb. 1. 3 Strukturformel von MB 327. MB 327 (1,1'-(propan-1,3-diyl)bis(4-tert-butylpyridinium)) besitzt zwei Tert-Butylgruppen und einen Propyl-Linker.
Bispyrdinium-Non-Oxime wirken somit sowohl an mAChR als auch an nAChR. Voraussetzungen für eine mögliche Zulassung von cholinergen Antagonisten sind jedoch eine gute Verträglichkeit in unvergifteten Patienten, die Wirksamkeit selbst bei hohen ACh-Konzentrationen und eine erhaltene, kontrollierte Erregungsweiterleitung [30].
1. Einleitung 9
1.6 Speziesunterschiede
Ratten wurden bis in die späten 1970er Jahre als das Standardversuchstier für Versuche mit Nervenkampfstoffen verwendet [8]. Jedoch hatten einige (potentielle) Therapeutika, die in anderen Spezies wirksam waren, in diesem Tiermodell eine viel schwächere Wirkung [8].
Zusätzlich weist diese Tierart im Gegensatz z.B. zum Meerschweinchen, hohe Aktivitäten der Plasma-Carboxylesterasen auf. Diese funktionieren als natürliche Bioscavenger und können somit die Toxizität von OP um bis zu 90 % reduzieren [74–77]. Obwohl die AChE nur von einem Gen kodiert wird und somit in jedem Gewebe einer Spezies hoch konserviert vorliegt [9,78], gibt es deutliche Unterschiede zwischen verschiedenen Tierarten hinsichtlich der Struktur und somit der Kinetik dieses Enzyms [13].
Diese Diskrepanzen können die Übertragbarkeit für die in der Ratte gewonnenen Daten beeinflussen. So war in Soman-vergifteter, quergestreifter Muskulatur die Wiederherstellung der neuromuskulären Aktivität im humanen Gewebe nur mit MB 327, nicht jedoch mit HI-6 möglich. In der Ratte hingegen zeigten beide Substanzen einen therapeutischen Effekt [53,72,79,80].
1.7 Ziel der Dissertation
Die Therapielücken bei Vergiftungen mit OP-Pestiziden und NKS, die trotz jahrzehntelanger, intensiver Forschung nach einem Breitspektrum-Therapeutikum weiterhin bestehen, unterstreichen den Forschungsbedarf für die Entwicklung neuartiger Therapieansätze bei OP-Vergiftungen. Da humane Studien aus ethischen Gründen nicht möglich sind, stellen in vitro Versuche mit
1. Einleitung 10 tierischem bzw. humanem Gewebe eine unerlässliche Untersuchungsmethode dar. In der pharmakologischen und toxikologischen Forschung werden isolierte Organmodelle eingesetzt, um potentielle Therapeutika im komplexen Zellverband zu untersuchen [81]. So wurden diese bisher u.a. in der quergestreiften Muskulatur, in Precision Cut Lung Slices, aber auch in der glatten Muskulatur getestet [71,72,79,82–84]. Speziesspezifische Unterschiede in der Toxizität von OP aufgrund verschiedener Cholinesterasen erschweren die Übertragbarkeit von tierischen Daten auf die humane Situation [39,85].
Ein vielversprechender Therapieansatz im Rahmen einer OP-Vergiftung ist die Modulation von nikotinergen bzw. muskarinergen Rezeptoren. Bispyridinium-Non-Oxime sind in der Lage, an nikotinergen Rezeptoren als PAM und an muskarinergen Rezeptoren als kompetitive Antagonisten zu binden [67,70,71]. Diese Wirkstoffgruppe, vor allem die Leitsubstanz MB 327, zeigte vielversprechende Therapieerfolge im Rahmen einer OP-Vergiftung in vitro und in vivo. Jedoch führte MB 327 im Tierversuch mit Meerschweinchen in Dosen knapp oberhalb des therapeutischen Bereichs zum Tod der Tiere [73]. Daher wurde in der ersten Studie dieser Arbeit der Effekt von Bispyridinium-Non-Oximen an zwei unterschiedlichen Modellen getestet: 1) dem isolierten Langendorff-Herz, um eine mögliche Kardiotoxizität der Substanzen zu untersuchen und 2) dem Modell der glattmuskulären Relaxation, um die anticholinerge Wirksamkeit am Rattendarm nachzuweisen. (siehe Kapitel 2.1). Keine der getesteten Substanzen war hierbei kardiotoxisch. In der glatten Muskulatur hingegen, zeigten alle Bispyridinium-Non-Oxime nach vorheriger Stimulation mit Carbamoylcholin einen deutlichen spasmolytischen Effekt.
Da speziesspezifische Unterschiede bei der Toxizität von OP und der Wirksamkeit von Antidoten vorliegen, die ggf. die Übertragbarkeit der in der
1. Einleitung 11 Ratte gewonnenen Daten auf den Menschen verhindern, wurde ein humanes Darmmodell vergleichbar zu dem Modell der glatten Muskulatur mit Rattengewebe aus der ersten Veröffentlichung etabliert. Hierbei wurden verschiedene Bispyridinium-Verbindungen untersucht, um die Ergebnisse mit den zuvor gewonnenen Rattendaten zu validieren. Zusätzlich wurden die Cholinesteraseaktivität im humanen und im Ratten-Dünndarmgewebe (Jejunum, Ileum) gemessen. Die Untersuchungen weisen auf eine Übertragbarkeit der für aus Rattengewebe mit Bispyridinium-(Non)-Oxim-Verbindungen gewonnenen Daten auf den Menschen hin (siehe Kapitel 2.2).
2. Veröffentlichungen 12
2.
Veröffentlichungen
2. Veröffentlichungen 18
24
3.
Literaturverzeichnis
1. Alkondon M, Albuquerque EX. The nonoxime bispyridinium compound SAD-128 alters the kinetic properties of the nicotinic acetylcholine receptor ion channel: A possible mechanism for antidotal effects. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 1989; 250(3):842–52.
2. Alkondon M, Rao KS, Albuquerque EX. Acetylcholinesterase reactivators modify the functional properties of the nicotinic acetylcholine receptor ion channel. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 1988; 245(2):543–56.
3. Aurbek N, Herkert NM, Koller M, Thiermann H, Worek F. Kinetic analysis of interactions of different sarin and tabun analogues with human acetylcholinesterase and oximes: Is there a structure-activity relationship? Chem. Biol. Interact. 2010; 187(1-3):215–9.
4. Balali-Mood M, Saber H. Recent advances in the treatment of organophosphorous poisonings. Iran J. Med. Sci. 2012; (37 (2)):74–91.
5. Barr JR, Driskell WJ, Aston LS, Martinez RA. Quantitation of metabolites of the nerve agents sarin, soman, cyclohexylsarin, VX, and Russian VX in human urine using isotope-dilution gas chromatography-tandem mass spectrometry. Journal of analytical toxicology 2004; 28(5):372–8.
6. BfArM. Voten des Sachverständigen-Ausschusses für Verschreibungspflicht nach § 53 AMG 56. Sitzung, 17.01.2006 zu Positionen, deren Änderung
zugestimmt wurde; 2006. Abrufbar unter der
URL:http://www.bfarm.de/SharedDocs/Downloads/DE/Arzneimittel/Pharmakovi gilanz/Gremien/Verschreibungspflicht/56Sitzung/anlage4.pdf?__blob=publicatio nFile&v=3.
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11. Clement JG. Toxicology and pharmacology of bispyridium oximes‐insight into the mechanism of action vs Soman poisoning in vivo. Fundam Appl Toxicol 1981; 1(2):193–202.
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4.
Danksagung
Den Personen, die zum Gelingen dieser Arbeit direkt oder indirekt beigetragen haben, möchte ich hier meinen Dank aussprechen.
Besonders möchte ich meinem Doktorvater Oberstarzt Prof. Dr. Worek und meinem Betreuer Oberfeldarzt PD Dr. Wille danken, die mich während meiner wissenschaftlichen Tätigkeit und dem Schreiben der Publikationen, als auch der Promotion stets begleitet, unterstützt und motiviert haben, als auch für die persönliche Unterstützung und ihre geduldigen Hilfestellungen, Ratschläge und Korrekturen. Joanna Brosig, die mich eingearbeitet und mit ihrer Erfahrung unterstützt hat, gilt ebenfalls mein Dank. Bei allen Mitarbeitern, Doktoranden, Post-Docs und Arbeitsgruppenleitern des Institutes bedanke ich mich für ihre Hilfsbereitschaft und die angenehme Atmosphäre, besonderer Dank gilt hier Fr. Oberstabsveterinär Dr. Herbert. Herrn Oberstarzt Prof. Dr. Thiermann, Leiter des Instituts für Pharmakologie und Toxikologie der Bundeswehr, danke ich für die Möglichkeit an diesem Institut wissenschaftlich tätig zu sein und meine Dissertation anfertigen zu können.
Meinen Dank möchte ich auch Prof. Dr. Martignoni und Dr. Prokopchuk für die gute und produktive Kooperation aussprechen.
Meinen Geschwistern Christopher und Teresa bin ich dankbar, für ihr Vorbild, die Motivation und ihre Hilfestellung. Besonderer Dank gilt meiner Mutter Ulrike, die mich in all meinen Interessen unterstützt und gefördert hat. Die es aber auch geschafft hat, mir in einer sehr schweren Zeit Anker und Stütze zu sein und maßgeblich zum Gelingen meines Studiums, als auch der Promotion beigetragen hat.
4. Danksagung 31 Meinem Ehemann Stefan, der mir nicht nur während des Studiums und meiner Promotion immer mit aufbauenden Worten, Wissen und Ermutigungen zur Seite gestanden und somit besonders zum Gelingen dieser Arbeit beigesteuert hat.
