Untersuchungen zum Aufbau und zur Dynamik der Blut-Hoden-Schranke in Mäusen mit einem Sertoli Zell-spezifischen Knockout von Connexin43
(SCCx43KO)
INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin
– Doctor medicinae veterinariae – ( Dr. med. vet. )
vorgelegt von Julia Heinrich
Flensburg
Hannover 2017
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Ralph Brehm Anatomisches Institut
Tierärztliche Hochschule Hannover
2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Andreas Beineke Institut für Pathologie
Tierärztliche Hochschule Hannover
Tag der mündlichen Prüfung: 19.04.2017
Meinen Eltern
in Liebe und Dankbarkeit
gewidmet
Loss of Connexin 43 in Sertoli cells and its effect on the expression of Claudin-3, -5 and -11 and blood-testis barrier integrity in mice.
DOI 10.337/anatges.2015.00224; Posterpräsentation auf der „31. Arbeitstagung der Anatomischen Gesellschaft / 110th Annual Meeting“, 23.–25. September 2015, Würzburg, Germany
HEINRICH, J., J. GERBER, F. HANSMANN, H. GASSE, R. BREHM (2016):
Loss of Connexin 43 in Sertoli cells and its effect on the expression of Claudin-3, -5 and -11 and blood-testis barrier integrity in mice.
In: A. Einspanier (Hrsg.):
49. Jahrestagung Physiologie & Pathologie der Fortpflanzung und gleichzeitig 41.
Veterinär-Humanmedizinische Gemeinschaftstagung.
DVG Service GmbH, Giessen, S. 87, ISBN 978-86345-304-6; Posterpräsentation auf der „49. Jahrestagung Physiologie & Pathologie der Fortpflanzung und
gleichzeitig 41. Veterinär-Humanmedizinische Gemeinschaftstagung“, 10.–12.
Februar 2016, Leipzig, Germany
HEINRICH, J., J. GERBER, H. GASSE u. R. BREHM (2016):
Loss of Connexin 43 in Sertoli cells and its effect on the expression of Claudin-3, -5 and -11 and blood-testis barrier integrity in mice.
Ana. Histol. Embryol. 45, Suppl. 1, 35; Vortrag auf der “31st Conference of the European Association of Veterinary Anatomists”, 27.–30. Juli 2016, Wien, Austria
Weitere Veröffentlichungen der Autorin:
GERBER, J., J. HEINRICH u. R. BREHM (2016):
Blood-testis barrier and Sertoli cell function: lessons from SCCx43KO mice.
Reproduction 151, R15 - 27
2 LITERATURÜBERSICHT ... 3
2.1 Histologie des Hodens ... 3
2.1.1 Keimzellen ... 4
2.1.1.1 Spermatogenese ... 5
2.1.1.2 Entwicklung der Spermatogenese bei der Maus ... 8
2.1.1.3 Der Keimepithelzyklus der Maus ... 8
2.1.1.4 Hormonelle Regulation der Spermatogenese ... 11
2.1.2 Sertoli Zellen ... 13
2.1.2.1 Ursprung der Sertoli Zellen ... 14
2.1.2.2 Proliferation und Differenzierung der Sertoli Zellen ... 15
2.2 Aufbau und Funktion der Blut-Hoden-Schranke ... 16
2.2.1 Tight Junctions ... 17
2.2.1.1 Occludin ... 19
2.2.1.2 Claudine ... 20
2.2.2 Adherens Junctions ... 24
2.2.3 Gap Junctions ... 25
2.2.3.1 Connexin43 ... 26
2.3 Knockout und transgene Mausmodelle für Connexin43 ... 28
2.3.1 Konstitutive Cx43-Knockout- und Cx43-Knockin-Mausmodelle ... 28
2.3.2 Konditionaler Cx43-Knockout in Sertoli Zellen ... 29
2.3.3 Konditionaler Cx43-Knockout in Keimzellen ... 34
3 MATERIAL UND METHODEN ... 35
3.1 Angewandte Methoden und verwendete Versuchstiere ... 35
3.2.2 Generierung der SCCx43KO -Mäuse ... 38
3.3 Genotypisierung ... 38
3.4 Probengewinnung (Hodenentnahme) ... 42
3.5 Herstellung von Paraffinschnitten ... 43
3.5.1 Fixierung in Bouin’scher Lösung ... 43
3.5.2 Einbettung der Proben in Paraffin ... 43
3.5.3 Mikrotomie ... 44
3.6 Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung ... 44
3.7 Immunhistochemie ... 45
3.7.1 EnVision-Methode ... 46
3.7.1.1 Claudin-11 ... 46
3.7.1.2 β-Galaktosidase ... 48
3.7.2 ABC-Methode ... 49
3.7.2.1 Claudin-3 ... 50
3.7.2.2 Claudin-5 ... 52
3.8 PCR am Gesamthodenhomogenat adulter Mäuse ... 53
3.8.1 RNA-Isolation ... 53
3.8.2 Messung der RNA-Konzentration und der RNA-Reinheit ... 54
3.8.3 DNase Verdau ... 54
3.8.4 cDNA-Synthese mittels Reverser Transkription ... 55
3.8.5 Überprüfung der cDNA-Synthese ... 56
3.8.6 Konventionelle PCR für Claudin-3, -5 und -11 ... 57
3.8.7 Quantitative Real-Time PCR für Claudin-3, -5 und -11 ... 58
3.8.7.3 Sequenzierung der PCR-Produkte für die Referenzgene ... 62
3.8.7.4 Bestimmung der Primereffizienzen ... 63
3.8.7.5 Vergleich der Genexpression für Claudin-3, -5 und -11 ... 65
3.9 Quantitative Real-Time PCR für Claudin-11 am Gesamthodenhomogenat prä- und peripubertärer Mäuse ... 67
3.9.1 RNA-Isolation ... 67
3.9.2 Messung der RNA-Konzentration und der RNA-Reinheit ... 68
3.9.3 cDNA-Synthese mittels Reverser Transkription ... 69
3.9.4 Überprüfung der cDNA-Synthese ... 69
3.9.5 Quantitative Real-Time PCR für Claudin-11 ... 69
3.10 Funktionelle Untersuchung zur Integrität der Blut-Hoden-Schranke ... 69
3.10.1 Probengewinnung und Fixierung ... 70
3.10.2 Eponeinbettung und Semidünnschnitte ... 70
4 ERGEBNISSE ... 72
4.1 Genotypisierung ... 72
4.2 Bestätigung des Genotyps ... 74
4.2.1 Morphologische Beurteilung der Hoden anhand der HE-Färbung ... 74
4.2.2 β-Galaktosidase Immunhistochemie ... 76
4.3 Vergleichende Untersuchungen zur Expression der TJ-Proteine Claudin-3, -5 und -11 in adulten WT- und SCCx43KO-/--Mäusen ... 78
4.3.1 Claudin-3 Immunhistochemie... 78
4.3.2 Claudin-5 Immunhistochemie... 81
4.3.3 Claudin-11 Immunhistochemie... 84
4.3.4 PCR-Versuche ... 86
4.3.4.2 Konventionelle PCR für Claudin-3, -5 und -11 ... 87
4.3.4.3 Quantitative Real-Time PCR für Claudin-3 und -5 und -11... 88
4.4 Vergleichende Untersuchungen zur Entwicklung der Blut-Hoden-Schranke in prä- und peripubertären WT- und SCCx43KO-/--Mäusen ... 90
4.4.1 Claudin-11 Immunhistochemie... 90
4.4.2 Funktionelle Untersuchung zur Integrität der Blut-Hoden-Schranke ... 97
4.4.3 Quantitative Real-Time PCR für Claudin-11 ... 103
5 DISKUSSION ... 106
5.1 Expression der TJ-Proteine Claudin-3, -5 und -11 in adulten SCCx43KO-/-- Mäusen ... 107
5.2 Entwicklung der Blut-Hoden-Schranke in peripubertären SCCx43KO-/-- Mäusen ... 118
6 ZUSAMMENFASSUNG ... 127
7 SUMMARY ... 130
8 VERZEICHNISSE ... 133
8.1 Literaturverzeichnis ... 133
8.2 Abkürzungsverzeichnis ... 167
8.3 Abbildungsverzeichnis ... 171
8.4 Tabellenverzeichnis ... 172
9 ANHANG ... 173
9.1 Puffer und Lösungen ... 173
9.2 Stoffe und Reagenzien ... 180
9.3 Antikörper ... 183
9.4 Geräte ... 184
9.7 Tabellen-Anhang ... 188
9.7.1 Daten der quantitativen Real-Time PCR ... 188
9.7.2 Daten der Auszählung für die funktionelle Untersuchung ... 200
10 DANKSAGUNG ... 202
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1 EINLEITUNG UND ZIELE DER ARBEIT
Ein unerfüllter Kinderwunsch betrifft nahezu jedes sechste Paar weltweit und stellt für die Betroffenen eine große emotionale und psychische Belastung dar. Während man früher hauptsächlich die Frau für die Kinderlosigkeit verantwortlich gemacht hat, ist es heute üblich, beide Partner in die Evaluierung des Problems mit einzubeziehen.
Laut der Weltgesundheitsorganisation liegt der Grund in 40 % der Fälle bei der Frau und in 20 % der Fälle beim Mann, in 25 % der Fälle sind beide Partner beteiligt und in 15 % der Fälle bleibt der Grund unbekannt. Die Inzidenz männlicher Infertilität beträgt nahezu 7 %. Etwa ein Drittel dieser Männer bekommt die Diagnose
„idiopathische Infertilität“, was natürlich die Frage nach dem Grund dieser Infertilität aufwirft. In verschiedenen Veröffentlichungen konnte bereits gezeigt werden, dass eine veränderte Expression des Gap Junction (GJ)-Proteins Connexin43 (Cx43) mit männlicher Infertilität in Verbindung gebracht werden kann.
Cx43 ist das dominierende GJ-Protein im Hoden. Im Keimepithel verbindet es sowohl benachbarte somatische Sertoli Zellen (SZ) als auch SZ und Keimzellen (KZ) und ermöglicht so über einen direkten Stoffaustausch die Kommunikation zwischen diesen Zellen. Das Protein ist involviert in die Hodenentwicklung und die Zellreifung und spielt darüber hinaus eine wichtige Rolle bei der Initiierung und Aufrechterhaltung der Spermatogenese. Weiterhin gibt es Hinweise darauf, dass Cx43 regulatorisch am Aufbau der Blut-Hoden-Schranke (BHS) beteiligt ist. Neben den GJ sind auch Proteine der Tight Junctions (TJ) und Adherens Junctions (AJ) am Aufbau der BHS beteiligt, wodurch eine effektive interzelluläre Barriere entsteht.
Diese schafft durch kontrollierten Stoffaustausch ein spezifisches Mikromilieu für die Entwicklung der verschiedenen KZ und schützt die haploiden KZ vor dem körpereigenen Immunsystem. Dennoch ist die BHS ein sehr dynamisches Gebilde, sie unterliegt ständigen Auf- und Abbauprozessen, denn die KZ müssen im Rahmen ihrer Entwicklung die BHS passieren.
Um die Rolle von Cx43 in den SZ auf die Spermatogenese untersuchen zu können, wurde in einem transgenen Tiermodell erfolgreich eine konditionale SZ-spezifische Cx43-Knockout-Maus (= SCCx43KO) unter Zuhilfenahme des sogenannten
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Cre/loxP-Rekombinasesystems generiert und etabliert. Den homozygoten männlichen Nachkommen fehlt somit nur in somatischen SZ das Cx43-Gen, mit dem Ergebnis, dass in der Mehrzahl der Keimtubuli der adulten homozygoten männlichen Tiere ein SZ-only-Syndrom (SCO) oder Arreste auf unterschiedlichen Stufen der Spermatogenese zu finden sind. Zusätzlich zeigen sich intratubuläre SZ-Cluster und/oder vakuolenreiche Keimtubuli. Die homozygoten männlichen SCCx43KO- Mäuse sind infertil.
In dieser Arbeit soll nun mit Hilfe dieses etablierten transgenen Mausmodells sowie verschiedener zell- und molekularbiologischer Techniken die Frage geklärt werden, welchen Einfluss eine gestörte Zell-Zell-Kommunikation über Cx43 im Hoden auf den Aufbau und die Funktion der BHS hat.
Hierfür wurden im ersten Teil der Arbeit die Expressionen der TJ-Proteine Claudin-3, -5 und -11 in adulten Wildtyp (WT)- und SCCx43KO-Mäusen mit Hilfe der Immunhistochemie (IHC) und der Polymerasen-Kettenreaktion (PCR) untersucht und verglichen.
Der zweite Teil der Arbeit diente der vergleichenden Untersuchung der initialen Ausbildung der BHS in jugendlichen WT- und SCCx43KO-Mäusen. Hierbei wurden IHC-Färbungen und PCR-Versuche für das TJ-Protein Claudin-11 in verschiedenen Altersstufen durchgeführt. Zusätzlich wurden funktionelle Untersuchungen zur Integrität der BHS mittels einer hypertonen Fixierlösung durchgeführt.
Es wird die Hypothese aufgestellt, dass eine veränderte Expression von Cx43 den Aufbau und die Dynamik der BHS verändert und deshalb die Spermatogenese nicht mehr physiologisch ablaufen kann. Bestätigt sich diese Hypothese, würde Cx43 auch als möglicher Ansatzpunkt für die medikamentöse Behandlung männlicher Fruchtbarkeitsstörungen interessant werden.
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2 LITERATURÜBERSICHT
2.1 Histologie des Hodens
Der Hoden ist ein paariges Organ, das zwei Hauptaufgaben erfüllt: die Produktion der männlichen KZ (Spermatogenese) und die Synthese männlicher Geschlechtshormone. Außen ist der Hoden von einer derben bindegewebigen Kapsel (Tunica albuginea) umgeben, der eine Tunica serosa aufliegt. Von der Tunica albuginea aus ziehen bindegewebige Septen (Septula testis) in das Organinnere und unterteilen das Hodenparenchym in Läppchen (Lobuli testis). Im Zentrum des Hodens bilden diese Bindegewebssepten einen Bindegewebskörper, das Mediastinum testis. Im Mediastinum testis liegt das Rete testis (LIEBICH 2010).
Morphologisch und funktionell wird der Hoden in ein interstitielles und ein tubuläres Kompartiment unterteilt (siehe Abb. 1). Das interstitielle Kompartiment besteht aus lockerem Bindegewebe, welches Blut- und Lymphgefäße sowie Nervengeflechte einschließt. In das Bindegewebe eingelagert sind die Leydig Zellen (LZ), welche v. a.
der Testosteronsynthese dienen. Das tubuläre Kompartiment besteht aus den Samenkanälchen (Keimtubuli, Tubuli seminiferi contorti), in denen die Spermienproduktion abläuft. Die Samenkanälchen sind vom Keimepithel ausgekleidet, welches sich aus den somatischen SZ und den sich entwickelnden KZ zusammensetzt. Das Keimepithel sitzt einer Basalmembran auf, welche außen von peritubulären Zellen umgeben wird. Bei diesen Zellen handelt es sich um kontraktile Myofibroblasten, deren Aufgabe es ist, die Abgabe der Spermien in das Tubuluslumen sowie deren Transport zu unterstützen (WEINBAUER et al. 1996;
LIEBICH 2010).
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Abb. 1: Histologische Übersicht eines adulten Mäusehodens (Hämatoxylin-Eosin-Färbung)
Dargestellt ist ein Samenkanälchen eingebettet in das interstitielle Gewebe (Sternchen). Die Samenkanälchen werden vom Keimepithel ausgekleidet, an dessen Basis die SZ-Kerne (langer Pfeil) und die Spermatogonien (kurzer Pfeil) liegen. Lumenwärts schließen sich weiter fortgeschrittene Entwicklungsstufen der KZ an. Die elongierten Spermatiden (Pfeilspitze) werden schließlich ins Tubuluslumen abgegeben.
2.1.1 Keimzellen
Zu den KZ im Keimepithel des Hodens zählen die Spermatogonien vom Typ A und B, die primären und sekundären Spermatozyten sowie die runden und elongierten Spermatiden (WEINBAUER et al. 1996; LIEBICH 2010). Die KZ entwickeln sich aus embryonal eingewanderten Primordialkeimzellen. Diese Urkeimzellen liegen beim Säugetier zunächst extraembryonal im Epithel des Dottersacks in der Nähe der Allantoisanlage. Später wandern sie über das Bindegewebe des Enddarms in das Mesenterium ein und gelangen über die Nierenanlage in die Genitalleiste. Die Wanderung erfolgt sowohl aktiv über amöboide Eigenbewegung als auch passiv durch die Abfaltung des Embryonalkörpers. Während dieser Wanderung kommt es
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zu einer starken Proliferation der Primordialkeimzellen (BENDEL-STENZEL et al.
1998; MCLAREN 2000; LIEBICH 2010; SCHNORR u. KRESSIN 2011b).
2.1.1.1 Spermatogenese
Unter der Spermatogenese (siehe Abb. 2) versteht man sämtliche Vermehrungs- und Differenzierungsprozesse, die sich während der Entwicklung der männlichen KZ in den Samenkanälchen abspielen und die Entwicklung reifer männlicher KZ (Spermien) zum Ziel haben. Die Spermatogenese kann in 3 Phasen eingeteilt werden (WEINBAUER et al. 1996): (1) Die mitotische Proliferation und Differenzierung der diploiden KZ (Spermatogonien), (2) die meiotische Reifeteilung der tetraploiden KZ (Spermatozyten) und (3) die Transformation der haploiden KZ (Spermatiden) in Spermien (Spermiogenese).
In der ersten Phase der Spermatogenese kommt es zu einer mitotischen Teilung der diploiden Spermatogonien vom Typ A (2n2C), welche stets einen engen Kontakt zur Basalmembran haben und in allen Phasen des Keimepithelzyklus anzutreffen sind.
Eine der beiden entstandenen Zellen verbleibt als Spermatogonie vom Typ A und dient als Stammzelle. Die andere Zelle durchläuft weitere mitotische Teilungen, wodurch zunächst die intermediären Spermatogonien und schließlich die Spermatogonien vom Typ B entstehen. Diese Zellen haben keinen Kontakt mehr zur Basalmembran. Die Spermatogonien teilen sich nicht vollständig, es bleiben Zytoplasmabrücken zwischen den Zellen bestehen, welche der besseren Koordination späterer Teilungsschritte dienen. Erst gegen Ende der Spermiogenese verlieren die KZ diese Zytoplasmabrücken. Die Spermatogonien vom Typ B durchlaufen weitere mitotische Teilungen und entwickeln sich so zu den primären Spermatozyten (Spermatozyten 1. Ordnung). Die primären Spermatozyten treten in die erste Reifeteilung der Meiose ein. Zuvor kommt es im Präleptotän-Stadium zu einer Verdopplung der Chromatiden. Die präleptotänen primären Spermatozyten besitzen somit zwei Chromosomen mit jeweils zwei Chromatiden, ihr DNA-Gehalt ist also tetraploid (2n4C). Anschließend durchlaufen die primären Spermatozyten die verschiedenen Stufen der Prophase I: Im Leptotän-Stadium beginnen die
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Chromosomen zu kondensieren, im Zygotän-Stadium kommt es zur Paarung der homologen Chromosomen, im Pachytän-Stadium kommt es zur Chiasmabildung mit Crossing-over und im Diplotän-Stadium werden die homologen Chromosomen voneinander getrennt. In der darauffolgenden Diakenese löst sich die Zellkernhülle auf und die Zellen treten in die Metaphase I ein. Diese läuft ebenso wie die Anaphase I und die Telophase I sehr rasch ab. Damit sind am Ende der ersten Reifeteilung die sekundären Spermatozyten (Spermatozyten 2. Ordnung) entstanden, welche einen haploiden Chromosomensatz mit zwei Chromatiden besitzen (1n2C). Diese Zellen treten nach einer kurzen Interphase in die zweite meiotische Reifeteilung ein. Hier kommt es in den Teilungsphasen (Metaphase II, Anaphase II und Telophase II) zu einer Trennung der Chromatiden der Chromosomen, sodass die am Ende der zweiten Reifeteilung vorliegenden runden Spermatiden einen haploiden Chromosomensatz mit jeweils einem Chromatid besitzen (1n1C). Mit der Entstehung der runden Spermatiden ist die Vermehrungsphase der Spermatogenese abgeschlossen und es folgt die Spermiogenese, in der sich die runden Spermatiden zu den elongierten Spermatiden entwickeln. In der Spermiogenese werden vier Phasen unterschieden: (1) die Golgiphase, (2) die Kappenphase, (3) die Akrosomphase, (4) die Reifungsphase. In der Golgiphase entstehen am Golgi-Apparat zahlreiche kleine Vesikel, welche durch Verschmelzung das akrosomale Vesikel bilden. In der Kappenphase stülpt sich das akrosomale Bläschen kappenartig über den Kern und wird so zur Akrosomkappe.
Unter der Akrosomkappe beginnt sich das Chromatin zu verdichten und die Hauptmasse des Zytoplasmas verlagert sich nach distal des Spermatidenkerns. In der Akrosomphase kommt es zu einer dorsoventralen Abflachung des Kerns. Die Akrosomkappe wird zum Akrosom, welches hydrolytische Enzyme enthält, die während der Befruchtung das Eindringen in die weibliche Eizelle ermöglichen. Im Halsbereich der jetzt länglichen Spermatiden entwickelt sich der Geißelapparat. In der abschließenden Reifungsphase wird die tierartspezifische typische Kopfform der Spermien ausgebildet. Hals, Mittelstück und Schwanz erhalten ihre endgültige Struktur. Der Hauptteil des Zytoplasmas wird als Residualkörper abgeschnürt und von den SZ phagozytiert. Mit Abschluss der Spermiogenese sind die elongierten
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Spermatiden entstanden, welche in das Lumen der Samenkanälchen abgegeben werden (Spermiation) (CLERMONT 1972; WEINBAUER et al. 1996; BERGMANN 2006; HERMO et al. 2010; LIEBICH 2010; SCHNORR u. KRESSIN 2011b).
Abb. 2: Ablauf der Spermatogenese, schematisch
Durch mitotische Teilung entstehen aus den Spermatogonien die primären Spermatozyten. Diese durchlaufen die erste Reifeteilung der Meiose und werden so zu den sekundären Spermatozyten. Die sekundären Spermatozyten durchlaufen die zweite Reifeteilung der Meiose und es entstehen die runden Spermatiden. Durch morphologische Veränderungen während der Spermiogenese bilden sich die elongierten Spermatiden, welche in das Tubuluslumen abgegeben werden (modifiziert nach WEINBAUER et al. 1996).
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2.1.1.2 Entwicklung der Spermatogenese bei der Maus
Die ersten Primordialkeimzellen können bei der Maus an Tag 7–7,5 post coitum (p. c.) im Bereich des sich entwickelnden Enddarms gefunden werden. Ab Tag 9,5 p. c. verlassen die Zellen den Enddarm und wandern über das dorsale Mesenterium in die Genitalleiste ein. An Tag 11,5 p. c. haben die meisten Primordialkeimzellen die Genitalleiste erreicht. Die Proliferationsaktivität der Zellen hält nach Erreichen der Genitalleiste noch für 2–3 Tage an, danach verharren die Zellen in der G1 Phase des Zellzyklus und treten erst kurz nach der Geburt wieder in die Mitose ein (KLUIN u. DE ROOIJ 1981; BENDEL-STENZEL et al. 1998;
MCLAREN 2000). Ab dem Moment, wenn die Primordialkeimzellen mit SZ-Vorläufern in Strängen angeordnet und von peritubulären Zellen umgeben werden, werden sie als Gonozyten bezeichnet (DE ROOIJ u. RUSSELL 2000). Das Keimepithel besteht bei neugeborenen Mäusen zunächst nur aus SZ und Gonozyten (BELLVE et al. 1977). Die ersten Spermatogonien vom Typ A treten an Tag 3 post partum (p. p.) auf (VERGOUWEN et al. 1991). An Tag 8 p. p. können zusätzlich auch Spermatogonien vom Typ B gefunden werden. Primäre Spermatozyten sind ab Tag 10 p. p. Bestandteil des Keimepithels und vereinzelte sekundäre Spermatozyten sowie runde Spermatiden tauchen erstmals an Tag 18 p. p. auf (BELLVE et al.
1977). An Tag 25 p. p. befindet sich bereits eine größere Anzahl runder Spermatiden im Keimepithel und an Tag 28 und 31 p. p. können elongierte Spermatiden gefunden werden. Ab Tag 35 p. p. ist die Spermatogenese bei der Maus histologisch komplett (VERGOUWEN et al. 1993).
2.1.1.3 Der Keimepithelzyklus der Maus
Während der Spermatogenese sind im Keimepithel verschiedene Stadien sichtbar.
Jedes Stadium ist gekennzeichnet durch das Auftreten charakteristischer KZ-Populationen. Die zeitliche Abfolge aller Stadien wird als Keimepithelzyklus bezeichnet (WEINBAUER et al. 1996; HESS u. RENATO DE FRANCA 2008). Die Anzahl der Stadien ist tierartlich unterschiedlich. So können bei der Ratte 14 (LEBLOND u. CLERMONT 1952a) und beim Mann 6 Stadien (CLERMONT 1963) unterschieden werden. Bei der Maus lässt sich der Keimepithelzyklus in 12 Stadien
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einteilen und zusätzlich lassen sich die Spermatiden morphologisch in 16 Stufen der Spermiogenese einteilen (OAKBERG 1956a). Ein Keimepithelzyklus bei der Maus dauert 8,63 Tage und für die Entwicklung einer Spermatogonie vom Typ A bis zur elongierten Spermatide werden vier Zyklen benötigt. Daraus ergibt sich für die Maus eine Gesamtdauer der Spermatogenese von 34,5 Tagen (OAKBERG 1956b).
Während beim Mann mehrere Stadien in einem Tubulusquerschnitt auftreten, zeigen sich bei der Maus und der Ratte immer nur ein Stadium pro Tubulusquerschnitt (LEBLOND u. CLERMONT 1952a; OAKBERG 1956a; CLERMONT 1963;
WEINBAUER et al. 1996; BERGMANN 2006; HESS u. RENATO DE FRANCA 2008).
Die Bestimmung der einzelnen Stadien erfolgt hauptsächlich über die Präsenz der einzelnen Spermatidenpopulationen im Tubulusquerschnitt. Zur morphologischen Einteilung der Spermatidenpopulationen werden die Entwicklung der Akrosomkappe und die Form des Kerns herangezogen. Dabei ermöglicht eine Periodsäure- Schiffsches Reagenz (PAS)-Reaktion eine gute Darstellung des Akrosoms (LEBLOND u. CLERMONT 1952a, b; OAKBERG 1956a; HESS u. RENATO DE FRANCA 2008; MEISTRICH u. HESS 2013).
MEISTRICH u. HESS (2013) haben eine vereinfachte Methode zur Identifizierung der Keimepithelstadien in der Maus entwickelt. Hierbei kommt ein binärer Entscheidungsschlüssel zum Einsatz, welcher einer Reihe von Fragen enthält, die entweder mit Ja oder Nein beantwortet werden müssen. Die erste Frage dient der Unterscheidung nach Stadien in denen ein oder zwei Spermatidenpopulationen sichtbar sind. In den Stadien IX-XII befindet sich nur eine Spermatidenpopulation im Keimepithel, in den Stadien I-VIII sind es zwei Spermatidenpopulationen. Danach folgt die weitere Unterscheidung der einzelnen Stadien nach unterschiedlichen Gesichtspunkten (siehe Abb. 3). Das Stadium VIII ist gekennzeichnet durch die Abgabe der elongierten Spermatiden in das Tubuluslumen (Spermiation) (OAKBERG 1956a; MEISTRICH u. HESS 2013).
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Abb. 3: Analysenbaum zur Stadieneinteilung bei der Maus
Binärer Analysenbaum zur schnellen und einfachen Stadieneinteilung bei der Maus (modifiziert nach MEISTRICH u. HESS 2013).
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Abb. 4: Keimepithelzyklus der Maus
Der Keimepithelzyklus der Maus kann in 12 Stadien eingeteilt werden. Jedes Stadium ist gekennzeichnet durch das gemeinsame Auftreten charakteristischer Keimzellpopulationen. Die Entwicklung der Spermatiden (Spermiogenese) verläuft in 16 Stufen. Abkürzungen: B: Typ B Spermatogonien, PL: präleptotäne Spermatozyten, L: leptotäne Spermatozyten, Z: zygotäne Spermatozyten, P: pachytäne Spermatozyten, D: diplotäne Spermatozyten, SS: sekundäre Spermatozyten (modifiziert nach BREHM u. STEGER 2005).
2.1.1.4 Hormonelle Regulation der Spermatogenese
Die hormonelle Regulation der Spermatogenese (siehe Abb. 5) erfolgt über einen Regelkreis, der den Hypothalamus, die Hypophyse und den Hoden einschließt. Der Hypothalamus übernimmt dabei die Aufgabe des übergeordneten Regulationszentrums und entlässt das Peptidhormon GnRH (Gonadotropin Releasing Hormon). Das GnRH wirkt auf die Adenohypophyse und bewirkt dort die Freisetzung der Gonadotropine LH (Luteinisierendes Hormon) und FSH (Follikel stimulierendes Hormon). LH stimuliert in den LZ die Testosteronsynthese, während FSH über die SZ die Spermatogenese anregt. FSH induziert in den SZ die Bildung des Androgen-bindenden Proteins (ABP), mit dessen Hilfe das Testosteron die BHS
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überwinden kann. Im Keimepithel stimuliert Testosteron die Spermatogenese, indem es an den Androgenrezeptor (AR) der SZ bindet, denn die KZ selbst besitzen diesen Rezeptor nicht. Neben den SZ besitzen auch die LZ und die peritubulären Zellen den AR. In den peritubulären Zellen beeinflusst Testosteron die Kontraktilität, welche wichtig für die Spermiation ist und in den LZ kann über den Rezeptor die eigene Testosteronsynthese gesteuert werden. Reguliert wird die hormonelle Steuerung der Spermatogenese über einen negativen Rückkopplungsmechanismus. Eine hohe Testosteronsynthese hemmt die Ausschüttung von GnRH aus dem Hypothalamus und von LH/FSH aus der Hypophyse. Das von den SZ produzierte Peptidhormon Inhibin hemmt die Freisetzung von FSH aus der Hypophyse, während Aktivin die Freisetzung von FSH steigert (WEINBAUER et al. 1996; HOLDCRAFT u. BRAUN 2004; BREHM u. STEGER 2005).
Abb. 5: Hormonelle Regulation der Spermatogenese
Durchgehende Linie: positiver Effekt; gepunktete Linie: negativer Effekt. GnRH: Gonadotropin Releasing Hormon, LH: Luteinisierendes Hormon, FSH: Follikel stimulierendes Hormon, ABP:
Androgen-bindendes Protein (modifiziert nach BREHM u. STEGER 2005).
13 2.1.2 Sertoli Zellen
Die SZ bilden den „somatischen Anteil“ des Keimepithels. Benannt sind diese Zellen nach ihrem Entdecker Enrico Sertoli (1843–1910). Bei der SZ handelt es sich um eine hochprismatische Zelle, welche sich von der Basalmembran bis zum Tubuluslumen erstreckt und mit ihren Zytoplasmaausläufern sämtliche Populationen der KZ umfasst (siehe Abb. 6). Die SZ haben für die KZ eine Ernährungs- und Stützfunktion und ermöglichen ihren intraepithelialen Transport während der Spermatogenese, da die KZ selber nicht zur Bewegung befähigt sind. Am Ende der KZ-Entwicklung ermöglichen sie die Abgabe der reifen KZ in das Tubuluslumen (Spermiation) (WEINBAUER et al. 1996; BREHM u. STEGER 2005; LIEBICH 2010).
Neben der absoluten Hodengröße bestimmt die Anzahl der SZ so auch die Effektivität der Spermatogenese, da jede SZ speziesabhängig mit nur einer bestimmten Anzahl von KZ morphologisch und funktionell in Kontakt stehen kann (ORTH et al. 1988; SHARPE et al. 2003). Untereinander stehen die SZ über spezielle Zell-Zell-Verbindungen in Kontakt. Diese Zell-Zell-Verbindungen tragen u. a. zur Ausbildung der BHS bei. Auf den Aufbau und die Funktion der BHS wird in Kapitel 2.2 näher eingegangen. Weitere Funktionen der SZ sind die Phagozytose des Residualkörpers am Ende der Spermiogenese, die Synthese und Sekretion verschiedener Proteine (z. B. ABP und Inhibin) sowie die Sekretion der intratubulären Samenflüssigkeit (WEINBAUER et al. 1996; BREHM u. STEGER 2005; LIEBICH 2010).
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Abb. 6: Aufbau des Keimepithels
(A) Toluidinblau gefärbter Semidünnschnitt eines adulten Mäusehodens. Zu sehen sind ein Sertoli Zellkern (Pfeil) sowie verschiedene Entwicklungsstufen der KZ (Pfeilspitze). (B) Schematische Zeichnung einer SZ mit KZ. Die SZ sitzt der Basalmembran (BM) auf und erstreckt sich bis zum Lumen. Die SZ stehen untereinander über spezielle Zell-Zell-Verbindungen in Kontakt (Boxen). (C) Die Zell-Zell-Kontakte beinhalten Gap Junctions (1), Adherens Junctions (2) und Tight Junctions (3) (modifiziert nach GERBER et al. 2016).
2.1.2.1 Ursprung der Sertoli Zellen
Der Ursprung der SZ wird bis heute kontrovers diskutiert. Verschiedene Autoren vertreten die Ansicht, die SZ hätten einen epithelialen Ursprung im Zölomepithel, andere Autoren sprechen den SZ einen mesenchymalen Ursprung aus der Urniere (Mesonephros) zu, wiederum andere propagieren einen gemeinsamen epithelialen und mesenchymalen Ursprung (BYSKOV 1986). Für die Maus allerdings ist der epitheliale Ursprung aus dem Zölomepithel nachgewiesen (KARL u. CAPEL 1998).
Die embryonalen SZ tragen entscheidend zur Geschlechtsdifferenzierung bei. Ab Tag 10,5 p. c. beginnt in den Prä-SZ die Expression des Gens für die „Sex determinierende Region auf dem Y-Chromosom“ (kurz SRY), woraufhin sich die
15
Gonadenanlage zu den Hoden entwickelt (GOODFELLOW u. LOVELL-BADGE 1993; LOVELL-BADGE 1993; BENDEL-STENZEL et al. 1998). Zusätzlich bilden die SZ vom Zeitpunkt der fetalen Geschlechtsdifferenzierung bis zur Pubertät das Anti-Müller-Hormon (AMH). Das AMH bewirkt die Rückbildung der Müller’schen Gänge, welche die Anlage für den Uterus, die Eileiter und die Vagina darstellen (TRAN et al. 1987; MÜNSTERBERG u. LOVELL-BADGE 1991; JOSSO et al. 2001;
SCHNORR u. KRESSIN 2011a).
2.1.2.2 Proliferation und Differenzierung der Sertoli Zellen
Eine Proliferation der SZ findet nur bis zum Einsetzen der Pubertät statt, danach sind diese Zellen postmitotisch und nehmen unter normalen Bedingungen ihre Proliferationsaktivität auch nicht wieder auf (KLUIN et al. 1984; VERGOUWEN et al.
1991; SHARPE et al. 2003; BREHM u. STEGER 2005). Zu Beginn der Pubertät finden in den SZ radikale morphologische und funktionelle Umbauvorgänge statt. Die Zellen werden größer und bilden ihre zytoplasmatischen Fortsätze aus, der Kern
„wandert“ nach basal und es entwickelt sich der typische dreigeteilte Nukleolus.
Durch die Ausbildung von TJ zwischen den SZ kommt es zur Bildung der BHS sowie des Tubuluslumens. Gleichzeitig kommt es mit der Ausreifung der SZ zu einem Verlust oder einem Einsetzen/Beginn der Expression verschiedener Proteine (z. B.
AMH, AR, Aromatase). Da z. B. das AMH nur von präpubertären SZ gebildet wird, kann es als Marker für unreife SZ herangezogen werden. Im Gegensatz dazu wird der AR von ausgereiften SZ stadienspezifisch exprimiert und dient somit als Marker für ausdifferenzierte SZ (BREMNER et al. 1994; RAJPERT-DE MEYTS et al. 1999;
SUAREZ-QUIAN et al. 1999; SHARPE et al. 2003; BREHM u. STEGER 2005;
HAVERFIELD et al. 2015). Ein möglicher Impulsgeber für die Ausreifung der SZ sind die sich entwickelnden KZ, denn die Proliferationsaktivität der SZ endet mit dem Auftreten der ersten meiotischen KZ (WEINBAUER et al. 1996; SHARPE et al. 2003;
BREHM u. STEGER 2005). Allerdings führt das Fehlen von KZ nicht zwangsläufig zu einer Unterbrechung der SZ-Reifung (SHARPE et al. 2003; BREHM u. STEGER 2005). Das Fehlen meiotischer und postmeiotischer KZ kann aber zu Veränderungen in den reifen SZ führen, wodurch letztere dann wieder Merkmale unreifer SZ
16
aufweisen (JEGOU u. SHARPE 1993; SHARPE et al. 1993; BOUJRAD et al. 1995;
GUITTON et al. 2000).
2.2 Aufbau und Funktion der Blut-Hoden-Schranke
Die BHS wird während der Pubertät zwischen benachbarten SZ gebildet und setzt sich vereinfacht aus drei Typen von Zell-Zell-Verbindungen zusammen: (1) TJ, (2) AJ und (3) GJ (siehe Abb. 6). Die Gesamtheit dieser Zellkontakte wird auch als „Sertoli cell junctional complex“ bezeichnet. Die verschiedenen Junction-Proteine benachbarter SZ verbinden sich im basalen Drittel des Keimepithels und bilden dadurch eine effektive interzelluläre Barriere. Die Aufgaben dieser Barriere sind es, die haploiden KZ vor einer Erkennung durch das körpereigene Immunsystem zu schützen und durch kontrollierten Stoffaustausch ein spezifisches metabolisches Milieu für den erfolgreichen Ablauf der Meiose und Spermiogenese bereitzustellen.
Durch die Ausbildung der BHS wird das Keimepithel zudem in zwei Abschnitte unterteilt. Im basalen Kompartiment (unterhalb der BHS) befinden sich die diploiden Spermatogonien und präleptotäne Spermatozyten und im adluminalen Kompartiment (oberhalb der BHS) die weiter fortgeschrittenen haploiden KZ-Populationen. Die KZ müssen im Laufe ihrer Entwicklung die BHS überqueren, um von dem basalen in das adluminale Kompartiment zu gelangen, ohne dass die BHS ihre Funktion/Dichtigkeit verliert. Dies geschieht bei Nagern in den Stadien VIII–IX des Keimepithelzyklus. Die BHS ist also kein starres sondern ein sehr dynamisches Gebilde, da sie ständigen Auf- und Abbauprozessen unterliegt, z. B. während der Passage von präleptotänen/leptotänen Spermatozyten in das adluminale Kompartiment (DYM u.
FAWCETT 1970; für Reviews siehe: PELLETIER u. BYERS 1992; CHENG u. MRUK 2002; MRUK u. CHENG 2004; PELLETIER 2011; STANTON 2016). In den folgenden Kapiteln wird genauer auf die einzelnen Bestandteile der BHS eingegangen.
17 2.2.1 Tight Junctions
TJ werden während der Pubertät von benachbarten SZ gebildet, zeitgleich mit einem Anstieg von LH/Testosteron und FSH in der Blutzirkulation, und führen so zu einer impermeablen Barriere im basalen Drittel des Keimepithels (DYM u. FAWCETT 1970; VITALE et al. 1973; NAGANO u. SUZUKI 1976; RUSSELL u. PETERSON 1985; WEINBAUER et al. 1996; CYR et al. 1999; HELLANI et al. 2000; MENG et al.
2005; MORROW et al. 2009). In zahlreichen Studien wurde die Dichtigkeit dieser Barriere/Schranke mit Hilfe von funktionellen Untersuchungen belegt. Hierbei kamen z. B. der elektronendichte Tracer Lanthan, hypertone Fixierungsmittel oder ein Biotintracer zum Einsatz. Ist die BHS intakt, können diese Stoffe die TJ nicht passieren und sind ausschließlich im basalen Kompartiment des Keimepithels sichtbar. Ist die BHS durchlässig, sind die Stoffe auch im adluminalen Kompartiment nachweisbar (DYM u. FAWCETT 1970; NEAVES 1973; RUSSELL 1977; CONNELL 1978; BERGMANN 1987; MENG et al. 2005; CARETTE et al. 2010; WILLEMS et al.
2010a; MCCABE et al. 2012; SINGH et al. 2013; SULTANA et al. 2014). Der Mechanismus mit dem die BHS den Durchtritt der präleptotänen/leptotänen Spermatozyten ermöglicht, ohne dabei ihre Integrität aufzugeben, ist bis heute nicht vollständig geklärt. Eine Theorie für dieses Phänomen ist die Ausbildung eines intermediären Kompartiments. Hierbei bilden sich unterhalb der präleptotänen/leptotänen Spermatozyten neue TJ, bevor sich die alten TJ oberhalb der Zelle auflösen und die Zellen so in das adluminale Kompartiment entlassen (siehe Abb. 7) (RUSSELL 1977; KOMLJENOVIC et al. 2009; SMITH u. BRAUN 2012).
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Abb. 7: Dynamik der Blut-Hoden-Schranke
Die Schemazeichnung zeigt zwei benachbarte SZ mit ihren Kernen (1) und dem Bereich der BHS (2).
(A) Die Spermatogonien (4) sitzen der Basalmembran auf. Die präleptotänen Spermatozyten (3) haben den Kontakt zur Basalmembran verloren und „bewegen sich“ in Richtung adluminales Kompartiment. (B) Um die Integrität der BHS zu gewährleisten werden unterhalb der präleptotänen/leptotänen Spermatozyten (3) neue TJ (6) ausgebildet. (C) Die alten TJ lösen sich auf und entlassen die leptotänen Spermatozyten (3) in das adluminale Kompartiment (modifiziert nach GERBER et al. 2016).
Die TJ-Proteine werden unterteilt in integrale TJ-Proteine in der Zellmembran und zytoplasmatische Proteine. Zu den integralen TJ-Proteinen im Hoden gehören die Claudine (MORITA et al. 1999b; MENG et al. 2005; MORROW et al. 2009), Occludin (MOROI et al. 1998), die JAM (junctional adhesion molecule)-Familie (GLIKI et al.
2004; ZHANG u. LUI 2015) sowie der Coxsakievirus- und Adenovirus-Rezeptor (SU et al. 2012; SULTANA et al. 2014). Zu den zytoplasmatischen TJ-Proteinen im Hoden gehört z. B. das ZO-1 und das ZO-2 (zonula occludens-1 und -2). Diese Proteine vermitteln die Verbindung der integralen TJ-Proteine mit dem Zytoskelett (BYERS et al. 1991; FURUSE et al. 1994; ITOH et al. 1999; XU et al. 2009; RODE et al. 2015).
19 2.2.1.1 Occludin
Occludin ist als erstes Protein als Bestandteil von TJ entdeckt worden. Es handelt sich um ein Transmembranprotein mit vier transmembranen Domänen, zwei extrazellulären Schleifen und einer intrazellulären Schleife, das N (Amino)- und das C (Carboxyl)-terminale Ende liegen intrazellulär (siehe Abb. 8) (FURUSE et al.
1993). Occludin ist bei der Maus bereits embryonal in den Keimsträngen nachweisbar. Bis Tag 8 p. p. zeigt Occludin eine diffuse Verteilung im Keimepithel, ab Tag 10 p. p. ist die Verlagerung der immunopositiven Reaktion Richtung BHS zu erkennen. An Tag 14 p. p. zeigt sich eine deutliche bandartige Färbung im basalen Teil des Keimepithels. Im adulten Hoden wird Occludin von den SZ im Bereich der BHS stadienunabhängig exprimiert (MOROI et al. 1998; CYR et al. 1999; GERBER et al. 2014). Diese Beobachtungen lassen zunächst darauf schließen, dass Occludin maßgeblich am Aufbau der BHS während der Pubertät beteiligt ist. Allerdings führt ein Knockout (KO) von Occludin zu keinen phänotypischen Veränderungen im Hoden sechs Wochen alter Mäuse. Das Keimepithel hat sich hier normal entwickelt und die Spermatogenese ist ungestört. Erst später, zwischen der 40. und 60.
Lebenswoche, kommt es zu einer Atrophie der Keimtubuli. In der 60. Lebenswoche sind nur noch SZ im Keimepithel zu erkennen (SAITOU et al. 2000). Zwei weitere Studien verdeutlichen die Rolle von Occludin in den TJ der BHS: Durch die intratestikuläre Injektion eines synthetischen Occludin-Peptids kommt es zur Störung der Wechselwirkungen zwischen den Occludin-Molekülen benachbarter SZ. Dies führt zu einer reversiblen Störung der Spermatogenese und der Integrität der BHS in Ratten (CHUNG et al. 2001). In vitro führt ein Ausschalten des Gens für Occludin mit Hilfe von small interfering (si)RNA zu einer deutlichen Verminderung funktionsfähiger TJ zwischen SZ (MCCABE et al. 2016). Zusätzlich scheint das GJ-Protein Cx43 einen regulatorischen Einfluss auf die Occludin-Expression und -Lokalisation zu haben. Im Hoden adulter Mäuse ist Occludin im Bereich der BHS mit Cx43 kolokalisiert und ein SZ-spezifischer KO von Cx43 führt zu einer erhöhten Expression von Occludin im Keimepithel sowie zu einer verzögerten Ausrichtung von Occludin in Richtung der BHS (CYR et al. 1999; CARETTE et al. 2010; GERBER et al. 2014).
20 2.2.1.2 Claudine
Claudine sind ebenso wie Occludin transmembrane TJ-Proteine mit vier transmembranen Domänen, zwei extrazellulären Schleifen und einer intrazellulären Schleife, das N- und das C-terminale Ende liegen intrazellulär (siehe Abb. 8).
Claudine zeigen aber keine Sequenzähnlichkeiten zu Occludin (FURUSE et al. 1998;
MORITA et al. 1999a; CHIBA et al. 2008; MORROW et al. 2010). Die Claudin- Familie besteht bisher aus 24 Mitgliedern, wächst aber stetig weiter (MINETA et al.
2011). Die Claudine zeigen eine ausgeprägte gewebe- und zellspezifische Verteilung (CHIBA et al. 2008) und die Claudine-3, -5 und -11 scheinen eine wichtige Rolle für den Aufbau und die Funktion der BHS zu spielen (GOW et al. 1999; MORITA et al.
1999b; MENG et al. 2005; MORROW et al. 2009; MAZAUD-GUITTOT et al. 2010).
Abb. 8: Proteinstruktur von Occludin und Claudinen
Occludin und Claudine sind Transmembranproteine mit vier transmembranen Domänen, zwei extrazellulären und einer intrazellulären Schleife. Sowohl das N- als auch das C-terminale Ende liegen intrazellulär (modifiziert nach MORROW et al. 2010).
21 Claudin-3:
Claudin-3 wird im Keimepithel sowohl von SZ als auch von KZ (präleptotäne/leptotäne Spermatozyten) exprimiert (CHIHARA et al. 2013). Auf Proteinebene kann Claudin-3 erstmals an Tag 15 p. p. nachgewiesen werden. Zu diesem Zeitpunkt zeigt sich eine schwache und diffuse Verteilung innerhalb des Keimepithels. An Tag 20 p. p. hat sich Claudin-3 in den TJ-Strängen im basalen Teil des Keimepithels angeordnet. Ebenfalls ab Tag 15 p. p. ist Claudin-3 auf RNA-Ebene im Hoden nachweisbar (MENG et al. 2005). CHIHARA et al. (2010) konnten Claudin-3 auf RNA-Ebene in allen Altersstufen nachweisen, wobei ab Tag 15 p. p.
ein Anstieg der Expression zu beobachten war. An Tag 25 p. p. war das höchste Level der mRNA-Expression erreicht. Im adulten Hoden zeigt Claudin-3 eine stadienspezifische Expression im basalen Teil des Keimepithels in den Stadien VI–IX des Keimepithelzyklus, wenn die präleptotänen/leptotänen Spermatozyten die BHS überqueren (CHIHARA et al. 2010, 2013). Diese und weitere Studien geben Hinweise darauf, dass Claudin-3 an der Ausbildung neuer TJ während der Passage der KZ durch die BHS beteiligt ist und so zur Ausbildung des intermediären Kompartiments beiträgt (siehe Abb. 7) (MENG et al. 2005; KOMLJENOVIC et al.
2009; SMITH u. BRAUN 2012). Die Expression von Claudin-3 im Keimepithel steht unter dem direkten Einfluss von Androgenen. In hypogonadalen Mäusen (Fehlen von FSH und LH) ist Claudin-3 erst nach einer zehntägigen Gabe von Dihydrotestosteron (DHT) im Keimepithel nachweisbar (MCCABE et al. 2012). In Mäusen mit einem SZ- spezifischen KO des AR ist kein Claudin-3 Protein im Keimepithel nachweisbar und auch auf RNA-Ebene ist Claudin-3 bei diesen Tieren herunterreguliert (MENG et al.
2005; WILLEMS et al. 2010a; CHAKRABORTY et al. 2014). SCARKO (SZ- spezifischer KO des AR) Mäuse zeigen einen Arrest der Spermatogenese auf Höhe der meiotischen Zellen (pachytäne Spermatozyten) (DE GENDT et al. 2004). Die Ausbildung der BHS ist in diesen Tieren verzögert oder komplett gestört und während der Passage durch die BHS sind die präleptotänen Spermatozyten in unvollständigen intermediären Kompartimenten eingeschlossen, welche ausschließlich von Claudin-11 gebildet werden (MENG et al. 2005; WILLEMS et al.
2010a; CHAKRABORTY et al. 2014).
22
Interessanterweise zeigen Mäuse mit einem KO von Claudin-3 eine ungestörte Spermatogenese sowie eine voll funktionsfähige BHS (CHAKRABORTY et al. 2014).
CHIHARA et al. (2013) konnten allerdings zeigen, dass ein KO von Claudin-3 mittels siRNA zu einer verzögerten Migration der KZ durch die BHS führt (die Migration war erst in Stadium XI abgeschlossen) und, dass die präleptotäne Phase der Spermatogenese verlängert ist. Die Integrität der BHS war aber auch hier ungestört.
Claudin-5:
Claudin-5 ist im Hoden der Maus im Endothel der Blutgefäße, im Epithel des Rete testis sowie im Keimepithel nachweisbar. Im Keimepithel wird Claudin-5 sowohl von SZ als auch von KZ (Spermatogonien, Spermatozyten und Spermatiden) exprimiert (MORROW et al. 2009; SU et al. 2014; KORHONEN et al. 2015). Auf Proteinebene kann Claudin-5 bereits an Tag 8 p. p. im Keimepithel nachgewiesen werden und zeigt dort eine diffuse Verteilung um die KZ. Auf RNA-Ebene kommt es zu einem starken Anstieg der Expression in dem Zeitraum, in dem sich die BHS bildet (zwischen Tag 16 und 20 p. p.). In adulten Mäusen wird Claudin-5 stadienspezifisch exprimiert und zeigt die höchste Expression im Stadium VIII des Keimepithelzyklus.
Dort ist die positive Immunreaktion um die präleptotänen/leptotänen Spermatozyten herum sichtbar. Die Expression von Claudin-5 im Keimepithel ist dabei abhängig von dem Transkriptionsfaktor ETS Variante 5 (ETV5). ETV5 ist im Hoden verantwortlich für die Erneuerung und Aufrechterhaltung der Spermatogonien-Stammzellen. Mäuse mit einem homozygoten KO von ETV5 (ETV5-/-) durchlaufen während der pubertären Entwicklung nur die erste Spermatogenesewelle und zeigen als adulte Tiere den Phänotyp eines SCO. Auf Proteinebene ist Claudin-5 bei diesen Tieren im Keimepithel gar nicht nachweisbar und auf mRNA-Ebene zeigt sich eine deutlich reduzierte Expression, was zu einer gestörten Integrität der BHS führt. Die Expression von Claudin-5 im Endothel der Blutgefäße sowie im Epithel des Rete testis ist bei den ETV5-/--Tieren unverändert (MORROW et al. 2007, 2009).
Zusätzlich konnten MORROW et al. (2009) zeigen, dass die Expression von Claudin- 5 im Keimepithel auch abhängig von der Anwesenheit der KZ ist. Mäuse mit einer Mutation des c-Kit Gens (W/Wv-Mäuse), welche Stamm-Spermatogonien erhalten
23
haben, zeigen Keimtubuli mit und ohne Spermatogenese. Eine positive Immunfärbung für Claudin-5 ist bei diesen Tieren nur in den Keimtubuli mit Spermatogenese sichtbar (MORROW et al. 2009).
Claudin-11
Claudin-11 wird im Hoden ausschließlich im Keimepithel von den somatischen SZ exprimiert (MORITA et al. 1999b; HELLANI et al. 2000). Auf Proteinebene ist Claudin-11 nicht vor Tag 13 p. p. nachweisbar, zu diesem Zeitpunkt ist es diffus im gesamten Keimepithel verteilt. Ab Tag 20 p. p. ist Claudin-11 auf Höhe der BHS lokalisiert und wird dort stadienunabhängig exprimiert (MENG et al. 2005; MAZAUD- GUITTOT et al. 2010). Auf mRNA-Ebene ist Claudin-11 bereits im fetalen Hoden nachweisbar. Unter Betrachtung des Gesamthodenhomogenats beginnt die Expression ab Tag 3 p. p. zu steigen, erreicht zwischen Tag 6 und 16 p. p. ihr höchstes Level und fällt danach wieder ab (HELLANI et al. 2000). Während der Passage der KZ durch die BHS ist Claudin-11 sowohl in den alten als auch in den neugebildeten TJ nachweisbar (SMITH u. BRAUN 2012).
Obwohl die Expression von Claudin-11 auch unter dem Einfluss von Androgenen steht (FLORIN et al. 2005; KAITU'U-LINO et al. 2007; WILLEMS et al. 2010b), scheint dieser Einfluss nicht so essentiell zu sein wie bei Claudin-3 (siehe oben). In hypogonadalen Mäusen ist Claudin-11, im Gegensatz zu Claudin-3, im Keimepithel nachweisbar, zeigt aber statt der basalen Lokalisation auf Höhe der BHS eine eher adluminale Verteilung. Eine Anordnung von Claudin-11 im basalen Teil des Keimepithels ist erst nach einer zehntägigen Gabe von DHT zu beobachten (MCCABE et al. 2012). Auch in Mäusen mit einem SZ-spezifischen KO des AR ist Claudin-11, im Gegensatz zu Claudin-3, im Keimepithel nachweisbar. Es werden jedoch keine funktionsfähigen TJ ausgebildet oder die Ausbildung funktionsfähiger TJ ist verzögert (MENG et al. 2005; WILLEMS et al. 2010a; CHAKRABORTY et al.
2014). Auch KZ scheinen einen Einfluss auf die Claudin-11-Expression und -Lokalisation zu haben, denn in Fällen mit gestörter Spermatogenese kann eine veränderte Claudin-11-Expression und -Lokalisation nachgewiesen werden (FINK et al. 2009; CHIBA et al. 2012; HAVERFIELD et al. 2013; STAMMLER et al. 2016).
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Weiterhin konnten FLORIN et al. (2005) zeigen, dass postmeiotische KZ einen inhibitorischen Effekt auf die Claudin-11-Expression in den SZ haben. Genau wie Occludin scheint auch Claudin-11 unter dem regulatorischen Einfluss des GJ-Proteins Cx43 zu stehen, denn ein SZ-spezifischer KO von Cx43 führt zu einer gestörten Spermatogenese und einer erhöhten Expression von Claudin-11 im Hoden adulter Mäuse (GERBER et al. 2014).
Ein KO von Claudin-11 führt zu einem Verlust der TJ zwischen den SZ sowie einer gestörten Spermatogenese mit erhöhter Apoptoserate der KZ. Die SZ bilden adluminale Zell-Cluster und weisen sowohl Merkmale unreifer (z. B.
Proliferationsaktivität und Verlust der Polarität) als auch reifer (z. B. Expression des AR) SZ auf. Dabei kommt es bereits ab Tag 20 p. p. zu morphologischen Veränderungen im Hoden (GOW et al. 1999; MAZAUD-GUITTOT et al. 2010). Das nachträgliche erneute Einbringen des Claudin-11-Gens in die Claudin-11-KO- Mauslinie führt zu einer völligen Wiederherstellung der Hodenmorphologie und -funktion. Dabei hat auch die Überexpression von Claudin-11 auf mRNA-Ebene keine negativen Auswirkungen (WU et al. 2012).
In vitro führt ein Ausschalten des Claudin-11-Gens mit Hilfe von siRNA zu einer deutlichen Verminderung funktionsfähiger TJ zwischen SZ (MCCABE et al. 2016).
Claudin-11 spielt demnach eine wichtige Rolle für (1) die Differenzierung/Reifung der SZ, (2) die Ausbildung funktionsfähiger TJ zwischen den SZ und (3) für den Ablauf der Spermatogenese (GOW et al. 1999; MAZAUD-GUITTOT et al. 2010; WU et al.
2012; MCCABE et al. 2016).
2.2.2 Adherens Junctions
Im Keimepithel des Hodens befinden sich AJ sowohl zwischen benachbarten SZ als auch zwischen SZ und KZ. Sie verbinden das Zytoskelett einer Zelle mit einer benachbarten Zelle oder der extrazellulären Matrix und tragen so zur Integrität von Geweben bei. Zusätzlich sind die Proteine der AJ auch an Signalübertragungsprozessen beteiligt (CHENG u. MRUK 2002; MRUK u. CHENG 2004; PELLETIER 2011). Im Hoden wurden drei AJ-Funktionseinheiten identifiziert:
(1) Cadherin/Catenin, (2) Nektin/Afidin/Ponsin und (3) Integrin/Laminin. Von diesen
25
stellen die Cadherine die am besten untersuchten AJ-Proteine dar. Es handelt sich um Transmembranproteine, deren Kopplung an die Aktinfilamente des Zytoskeletts durch Catenine vermittelt wird (CHENG u. MRUK 2002; MRUK u. CHENG 2004;
PELLETIER 2011). Ein KO des Gens für β-Catenin in SZ führt zu keinen morphologischen Veränderungen (TANWAR et al. 2011). Allerdings führt die Aktivierung von β-Catenin in SZ zu einer Störung der SZ-Reifung und der Spermatogenese (BOYER et al. 2008; TANWAR et al. 2010). Ein SZ-spezifischer KO des GJ-Proteins Cx43 führt zu einer erhöhten Expression der AJ-Proteine N-Cadherin und β-Catenin (CARETTE et al. 2010).
2.2.3 Gap Junctions
GJ verbinden die Zytoplasmata benachbarter Zellen miteinander und ermöglichen so einen direkten Austausch von Stoffen bis zu einem Molekulargewicht von 1 kDa (z. B. second messenger und Ionen). Jede der beiden beteiligten Zellen stellt dabei einen Halbkanal (Connexon), der wiederum aus sechs Untereinheiten, den Connexinen (Cx), besteht. Cx sind Membranproteine mit vier Transmembrandomänen, zwei extrazellulären Schleifen und einer intrazellulären Schleife, das N- und das C-terminale Ende liegen intrazellulär. Innerhalb der Zellmembran formieren sich mehrere GJ zu sogenannten GJ-Plaques (siehe Abb. 9).
Die Nomenklatur der Cx leitet sich von dem Molekulargewicht ihrer Polypeptidketten ab. So hat z. B. das GJ-Protein Cx43 ein Molekulargewicht von 43 kDa. (KUMAR u.
GILULA 1996; GOODENOUGH u. PAUL 2009). Im Hoden von Nagern konnten bisher Cx26, 31, 32, 33, 37 und 43 auf Proteinebene nachgewiesen werden (RISLEY et al. 1992; TAN et al. 1996; BATIAS et al. 1999; FIORINI et al. 2004; BREHM u.
STEGER 2005; FISCHER et al. 2005; CARETTE et al. 2009; KIBSCHULL et al.
2015).
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Abb. 9: Aufbau eines Gap Junction-Kanals und -Plaque
Mehrere GJ-Kanäle formieren sich zu sogenannten Plaques. Ein GJ-Kanal setzt sich aus zwei Connexonen zusammen. Jedes Connexon besteht wiederum aus sechs Connexinen (modifiziert nach GOODENOUGH u. PAUL 2009).
2.2.3.1 Connexin43
Im Hoden ist Cx43 das vorherrschende GJ-Protein und es kann in den peritubulären Zellen, den LZ und im Keimepithel nachgewiesen werden. Im Keimepithel verbindet es sowohl die benachbarten somatischen SZ als auch die SZ und KZ (Spermatogonien und Spermatozyten) miteinander. Dabei scheint der Austausch von Molekülen zwischen SZ und KZ unidirektional zu sein, nämlich hauptsächlich von SZ zu KZ. Cx43 beeinflusst maßgeblich die Hodenentwicklung und ist essentiell für den Beginn und den physiologischen Ablauf der Spermatogenese (RISLEY et al. 1992, 2002; PEREZ-ARMENDARIZ et al. 1994; PELLETIER 1995; BATIAS et al. 2000;
BRAVO-MORENO et al. 2001; BREHM u. STEGER 2005; POINTIS u. SEGRETAIN 2005; BREHM et al. 2007; SRIDHARAN et al. 2007a, b; WEIDER et al. 2011a, b;
GIESE et al. 2012; GERBER et al. 2014; NOELKE et al. 2015). Cx43 ist bereits fetal in den Gonadenanlagen nachweisbar (PEREZ-ARMENDARIZ et al. 2001). Nach der Geburt ist Cx43 zunächst diffus im Keimepithel verteilt. Ab Tag 8 p. p. beginnt die
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Ausrichtung der immunopositiven Reaktion nach basal in Richtung BHS, wo Cx43 bereits ab Tag 12 überwiegend nachweisbar ist (BRAVO-MORENO et al. 2001;
GERBER et al. 2014).
In Keimtubuli mit normaler Spermatogenese ist die Verteilung bei Maus, Ratte, Hund und Mensch nahezu identisch (RISLEY et al. 1992; STEGER et al. 1999; BATIAS et al. 2000; RÜTTINGER et al. 2008) und auch bei verschiedenen Nutztieren (Eber, Bulle und Hengst) wurde Cx43 im Keimepithel detektiert (AHMED 2005; HEJMEJ et al. 2007; KOPERA et al. 2010; RODE et al. 2015). In Fällen mit gestörter Spermatogenese konnten bei verschiedenen Tierarten und beim Mann Veränderungen in der Cx43-Expression festgestellt werden (STEGER et al. 1999;
BREHM et al. 2002, 2006a, b; DEFAMIE et al. 2003; HEJMEJ u. BILINSKA 2008;
RÜTTINGER et al. 2008; RODE et al. 2015). Weiterhin scheint Cx43 auch den Aufbau der BHS zu beeinflussen. So führt ein SZ-spezifischer KO von Cx43 zu einer veränderten Expression verschiedener AJ- und GJ-Proteine (CARETTE et al. 2010;
GERBER et al. 2014). Über die Regulation der Ca2+-Konzentration innerhalb des Keimepithels scheint Cx43 zudem wichtig für den zyklischen Auf- und Abbau der TJ- Proteine in der BHS zu sein (LI et al. 2010). GERBER et al. (2016) postulierten, dass ein SZ-spezifischer KO von Cx43 zu einer Akkumulation von Ca2+ in den SZ führt, was den zyklischen Abbau der TJ benachbarter SZ verhindert und so zu einer gestörten Dynamik der BHS beiträgt. Und in Tubuli mit chemisch (Adjudin)- induzierter Spermatogenese- und BHS-Funktionsstörung führt eine künstlich herbeigeführte Überexpression von Cx43 zu einer Induktion der Spermatogenese bis zu den runden Spermatiden sowie einer Wiederherstellung der physiologischen BHS-Funktion (LI et al. 2016).
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2.3 Knockout und transgene Mausmodelle für Connexin43
2.3.1 Konstitutive Cx43-Knockout- und Cx43-Knockin-Mausmodelle
Unter einem konstitutiven KO versteht man die Deletion eines Gens in allen Körperzellen. Um die Funktion von Cx43 im Körper zu untersuchen, wurde zunächst ein solches konstitutives Cx43KO-Mausmodell entwickelt. Dieses Modell eignete sich allerdings nicht, um den Einfluss von Cx43 auf die Hodenentwicklung und die Spermatogenese zu untersuchen, da die homozygoten Nullmutanten bereits unter der Geburt verstarben. Eine schwere Herzmissbildung (Obstruktion der Pulmonalarterie) führte dazu, dass die Tiere nicht lebensfähig waren (REAUME et al.
1995). Untersuchungen an den perinatal verstorbenen Tiere konnten aber zeigen, dass die Gonaden in beiden Geschlechtern der homozygoten Nullmutanten auffallend klein waren, was auf eine verminderte KZ-Zahl zurückgeführt werden konnte. Die verminderte KZ-Zahl konnte bis zum Tag 11,5 p. c. zurückverfolgt werden (JUNEJA et al. 1999). Zwischen Tag 9,5 und 11,5 p. c. wandern die Primordialkeimzellen aus dem Enddarm in die Genitalleiste ein. Während dieser Wanderung kommt es zu einer starken Proliferation der Zellen. An Tag 11,5 p. c.
haben die meisten Zellen die Genitalleiste erreicht (BENDEL-STENZEL et al. 1998;
MCLAREN 2000). Die verminderte Anzahl der KZ in der Genitalleiste und den fetalen Gonaden lässt also darauf schließen, dass die Ausbildung von GJ via Cx43 wichtig für die Migration, Proliferation und das Überleben der Primordialkeimzellen zu sein scheint (JUNEJA et al. 1999).
FRANCIS u. LO (2006) konnten zudem zeigen, dass es zwischen Tag 8,5 und 10,5 p. c. keinen Unterschied in der Anzahl der Primordialkeimzellen zwischen WT- und homozygoten Cx43KO-Embryonen gibt. Auch schien die Migration der KZ in die Genitalleisten nicht beeinflusst zu sein. Stattdessen postulieren sie eine erhöhte Apoptoserate als Ursache für die verminderte KZ-Zahl an Tag 11,5 p. c. in den homozygoten Cx43KO-Embryonen.
In zwei Studien, bei denen die fetalen Hoden der homozygoten Cx43KO-Mäuse unter die Nierenkapsel normaler oder kastrierter adulter WT-Mäuse transplantiert wurden, konnte gezeigt werden, dass auch die postnatale Proliferation der KZ gestört
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ist, nicht aber die Steroidsynthese der interstitiellen LZ (ROSCOE et al. 2001;
KAHIRI et al. 2006).
Zusätzlich zu den konstitutiven Cx43KO-Mausmodellen wurden zwei Cx43-Knockin (Cx43KI)-Mausmodelle entwickelt. Hierbei wurde die Gensequenz, welche für Cx43 kodiert, entweder durch die Sequenz für Cx32 oder Cx40 oder durch die Sequenz für Cx26 ersetzt. Die Cx43KI-Mäuse waren lebensfähig, zeigten aber dennoch eine gestörte Spermatogenese (PLUM et al. 2000; WINTERHAGER et al. 2007).
Alle diese Studien unterstreichen die essentielle Rolle von Cx43 im Keimepithel.
2.3.2 Konditionaler Cx43-Knockout in Sertoli Zellen
Unter einem konditionalen KO versteht man die Deletion eines Gens in ganz bestimmten Körperzellen oder auch zu einem ganz bestimmten Zeitpunkt. Um die Rolle von Cx43 in SZ auf die Spermatogenese untersuchen zu können, wurde in einem transgenen Tiermodell erfolgreich eine konditionale SZ-spezifische Cx43-KO- Maus (= SCCx43KO) mit Hilfe des sogenannten Cre/loxP-Rekombinasesystems generiert und etabliert (BREHM et al. 2007; SRIDHARAN et al. 2007b). Das Prinzip des Cre/loxP-Rekombinasesystems beruht auf der Verpaarung zweier transgener Mauslinien (siehe Abb. 10). Die eine Mauslinie exprimiert das Cre-Enzym unter Kontrolle eines zellspezifischen Promoters, bei der anderen Mauslinie ist das Zielgen von zwei loxP-Einheiten flankiert. Bei den loxP-Einheiten handelt es sich um spezifische 34 bp lange Nukleotidsequenzen, welche aus einer 8 bp langen Kernregion bestehen, die von beiden Seiten von identischen gegenläufigen (Palindromen) 13 bp langen Sequenzen flankiert wird. Bei dem Cre-Enzym handelt es sich um eine Rekombinase aus dem Bakteriophagen P1, welche die Basenabfolge der loxP-Einheiten erkennt und die DNA-Sequenz zwischen diesen Einheiten ausschneidet. Da die Expression des Cre-Enzyms dabei an den zellspezifischen Promoter gebunden ist, ist es so möglich, den KO des Zielgens auf eine bestimmte Zelle, ein bestimmtes Gewebe oder auch einen bestimmten Zeitraum zu beschränken (HOESS et al. 1982; HAMILTON u. ABREMSKI 1984; NAGY 2000;
KOS 2004; BREHM u. STEGER 2005).
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Abb. 10: Cre/loxP-Rekombinasesystem
Das Prinzip des Cre/loxP-Rekombinasesystems beruht auf der Verpaarung zweier transgener Mauslinien. Die eine Mauslinie exprimiert das Cre-Enzym unter Kontrolle eines zellspezifischen Promoters, bei der anderen Mauslinie ist das Zielgen von loxP-Einheiten flankiert. Werden diese Mauslinien nun miteinander verpaart, erkennt das Cre-Enzym die loxP-Einheiten und schneidet das Zielgen zwischen diesen aus. Da das Cre-Enzym unter Kontrolle eines zellspezifischen Promoters exprimiert wird, kommt es auch nur in diesen Zellen zu einer Deletion des Zielgens (modifiziert nach BREHM u. STEGER 2005).
Für die Zucht der SCCx43KO-Mauslinie werden Cx43flox-LacZ-Mäuse und AMH- Cre-Mäuse miteinander verpaart (BREHM et al. 2007; SRIDHARAN et al. 2007b).
Bei der Cx43flox-LacZ-Mauslinie ist das Gen, welches für Cx43 codiert, auf beiden
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Allelen von loxP-Einheiten flankiert. Zusätzlich ist in das Gen ein stilles LacZ-Reportergen integriert, welches für das Protein β-Galaktosidase (β-Gal) kodiert.
Erst bei der erfolgreichen Deletion von Cx43 wird das Reportergen aktiviert und β-Gal ist in den SZ nachweisbar (THEIS et al. 2000, 2001). Bei der AMH-Cre- Mauslinie ist das Cre-Enzym an den AMH-Promoter gekoppelt (LECUREUIL et al.
2002). Das AMH wird bei männlichen Mäusen nur von unreifen SZ ab Tag 12,5 p. c.
exprimiert. Zwei bis drei Wochen nach der Geburt, wenn die ersten KZ in die Meiose eintreten, wird die AMH-Expression abgeschaltet. Nach der Pubertät ist das AMH in adulten SZ nicht mehr nachweisbar (MÜNSTERBERG u. LOVELL-BADGE 1991).
Werden diese beiden Linien nun miteinander verpaart, erkennt die Cre-Rekombinase das markierte Cx43-Gen und schneidet es in den SZ aus. Die homozygoten männlichen SCCx43KO-Mäuse (SCCx43KO-/-) sind infertil. Die weiblichen Tiere der SCCx43KO-Mauslinie hingegen sind fertil und können daher zur Nachzucht und Erhaltung der transgenen Mauslinie verwendet werden (BREHM et al. 2007;
SRIDHARAN et al. 2007b).
Makroskopisch zeigen die SCCx43KO-/--Männchen einen normalen Hodenabstieg, allerdings sind die Größe und das Gewicht der Hoden im Vergleich zu den WT-Männchen deutlich reduziert. Der Rest des Urogenitalsystems ist normal entwickelt (siehe Abb. 11). Histologisch zeigen die Keimtubuli der SCCx43KO-/--Männchen ein SCO oder einen Arrest der Spermatogenese auf Höhe der Spermatogonien, intratubuläre SZ-Cluster und Vakuolen im SZ-Zytoplasma (siehe Abb. 11). Die Anzahl der SZ pro Tubulus ist dabei deutlich erhöht, die Anzahl der Spermatogonien hingegen deutlich erniedrigt. Interessanterweise zeigen in den SCCx43KO-/--Männchen bis zu 5 % der Tubuli eine Restspermatogenese, welche bis zum Stadium der elongierten Spermatiden reichen kann. Bisher konnte weder eine fehlerhafte Deletion des Cx43-Gens noch eine Kompensation durch andere Cx nachgewiesen werden, um diese Restspermatogenese zu erklären. Die heterozygoten SCCx43KO-Männchen (SCCx43KO+/-) zeigen sowohl makroskopisch als auch mikroskopisch keinerlei Abweichungen zu den WT-Tieren (ZEILER et al.
2006a, b; BREHM et al. 2007; SRIDHARAN et al. 2007b; NOELKE 2014).
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Abb. 11: Makroskopische und mikroskopische Bilder adulter WT- und SCCx43KO-/--Mäuse
Bild (A) und (B) zeigen den makroskopischen Vergleich zwischen WT- und SCCx43KO-/--Männchen.
Das Urogenitalsystem der SCCx43KO-/--Männchen ist normal entwickelt, lediglich die Hoden sind kleiner als bei den WT-Tieren. Bild (C) zeigt das histologische Bild eines WT-Hodens. In (D) ist die typische Morphologie der SCCx43KO-/--Hoden zu erkennen. Es zeigen sich Spermatogenesearrest, SCO, SZ-Cluster (Pfeilspitze) und Vakuolen im Zytoplasma der SZ (Pfeil) (modifiziert nach GERBER et al. 2016).
Die erhöhte SZ-Zahl scheint auf eine verlängerte Proliferationsphase dieser Zellen in den SCCx43KO-/--Tieren zurückzuführen sein. Normalerweise stellen die SZ ihre Proliferationstätigkeit während der Pubertät ein. Es gibt aber Hinweise darauf, dass die SZ der SCCx43KO-/--Mäuse auch nach der Pubertät noch proliferieren können.
Gleichzeitig zeigen die SZ Kennzeichen sowohl unreifer als auch reifer SZ und bilden
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somit einen intermediären Phänotyp aus (SRIDHARAN et al. 2007b; WEIDER et al.
2011b). Neben der Anzahl der SZ im Keimtubulus ist bei den SCCx43KO-/--Mäusen auch die Anzahl der LZ im Interstitium erhöht. Obwohl in dem SCCx43KO-Mausmodell das Cx43 nur in den SZ ausgeschaltet ist, ist auch in den LZ keine Cx43-Proteinsynthese nachweisbar. Die Testosteronsynthese der LZ scheint allerdings ungestört zu sein (NOELKE et al. 2015). GIESE et al. (2012) zeigten in einer Microarray-Studie an 8 Tage alten WT- und SCCx43KO-/--Mäusen, dass es bei 658 Genen zu einer veränderten Expression in den SCCx43KO-/-- Mäusen kommt. Hierbei waren 135 Gene heraufreguliert, 523 Gene waren herunterreguliert. Die meisten der herabregulierten Gene sind wichtig für die Spermatogenese.
Weitere Studien belegen den Einfluss des SZ-spezifischen KO von Cx43 auf den Aufbau und die Funktion der BHS. Überraschenderweise ist die BHS bei adulten SCCx43KO-/--Tieren intakt. Für verschiedene TJ- und AJ-Proteine (β-Catenin, N-Cadherin, Occludin und Claudin-11) konnte eine erhöhte Proteinsynthese nachgewiesen werden (CARETTE et al. 2010; GERBER et al. 2014; GERBER 2015). Für die beiden TJ-Proteine Occludin und Claudin-11 konnte mittels quantitativer Real-Time (qRT)-PCR zusätzlich eine erhöhte mRNA-Expression im Gesamthodenhomogenat adulter SCCx43KO-/--Männchen nachgewiesen werden (GERBER et al. 2014). Da angenommen wird, dass Occludin zur initialen Ausbildung der BHS während der Pubertät beiträgt (CYR et al. 1999), wurde in einer Zeitstudie die räumliche und zeitliche Expression von Occludin in jugendlichen SCCx43KO-/-- und WT-Mäusen untersucht. Hierbei zeigte Occludin eine verzögerte Orientierung in Richtung BHS in den SCCx43KO-/--Tieren. Bei den WT-Tieren war bereits an Tag 10 p. p. in einigen Tubuli eine Orientierung nach basal zu erkennen, bei den SCCx43KO-/--Tieren erst an Tag 11 p. p. (GERBER et al. 2014). Zusätzlich zu den TJ- und AJ-Proteinen ist in den SCCx43KO-/--Tieren auch die Expression des AR auf Proteinebene verändert. Hierbei ist die Veränderung der Expression abhängig vom Grad der Störung der Spermatogenese. Zeigen die Tubuli der SCCx43KO-/--Tiere eine qualitativ normale Spermatogenese, ist die Färbeintensität des AR vergleichbar mit den WT-Tieren. Bei den Tubuli mit einem Arrest der Spermatogenese auf Höhe
