Aus der Klinik für Geflügel der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Pathogenesestudie eines intermediärvirulenten Gumborovirus in spezifiziert-pathogen-freien (SPF) Hühnern und
kommerziellen Broilern
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines DOKTORS DER VETERINÄRMEDIZIN
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Arne Jung aus Bremen Hannover 2006
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Silke Rautenschlein, PhD
1. Gutachter: Prof. Dr. Silke Rautenschlein, PhD 2. Gutachter: Prof. Dr. Beatrice Grummer
Tag der mündlichen Prüfung: 22.05.2006
Meinen Eltern gewidmet
Abkürzungsverzeichnis
°C Grad Celsius
aa amino acid (Aminosäure)
A Adenin Abb. Abbildung
AC-ELISA antigen capture-ELISA
AGP Agarosegel-Präzipitationstest Ala Alanin
Aqua bidest. bidestilliertes Wasser
Arg Arginin Asn Asparagin Asp Aspartat bp Basenpaare bzw. beziehungsweise C Cytosin
CAM Chorioallantoismembran cm Zentimeter
DNA desoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure)
dNTP Desoxiribonukleosidtriphosphat d.p.c. days post challenge (Tage nach Belastung)
d.p.v. days post vaccination (Tage nach Impfung)
EID Ei-infektiöse Dosen
ELD Ei-letale Dosen
ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
E. coli Escherichia coli
et al. et alii (und andere)
g Gramm G Guanin Gln Glutamin Glu Glutamat Gly Glycin
HAH Hämagglutinationshemmungs-Test His Histidin
HIV Human immunodeficiency virus
IB Infektiöse Bronchitis
IBD Infectious Bursal Disease
IBDV Infectious Bursal Disease Virus IFN-γ Interferon-γ
IFT Immunfluoreszenztest
IgM Immunoglobulin M
IgG Immunoglobulin G
IL-2 Interleukin-2 IL-6 Interleukin-6 Ile Isoleucin kb Kilobasen log Logarithmus LT Lebenstag
MgSO4 Magnesiumsulfat
min Minuten ml Milliliter mM millimolar μl Mikroliter μm Mikrometer nm Nanometer
OD optische Dichte
ORF open reading frame (offener Leserahmen) PBS phosphate buffered saline (Phosphatpuffer)
PCR polymerase chain reaction (Polymerase-Kettenreaktion)
p.m. post mortem
pmol Pikomol Pro Prolin
RFLP Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus
RSV Respiratory syncitial virus
RT-PCR reverse transcription-PCR
RNA ribonucleic acid (Ribonukleinsäure)
RNAse Ribonuklease
SD standard deviation (Standardabweichung) sek. Sekunden
SPF spezifiziert-pathogen-frei
s.o. siehe oben
s.u. siehe unten
T Thymin
TCID tissue culture infectious doses (Zellkultur-infektiöse Dosen)
Thr Threonin
Tris Tris-(Hydroxymethyl)aminomethan u. und
U units (Einheiten)
u.a. unter anderem
UV Ultraviolett
VNT Virusneutralisationstest VP Virusprotein
vs. versus
vvIBDV very virulent IBDV
z.B. zum Beispiel
ZPE zytopathischer Effekt
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung... 13
2 Literaturübersicht... 15
2.1 Infektiöse Bursitis (IBD)... 15
2.1.1 Einleitung ... 15
2.1.2 Historische Entwicklung ... 15
2.1.3 Verbreitung... 16
2.1.4 Ökonomische Bedeutung ... 17
2.1.5 Das Virus der infektiösen Bursitis (IBDV) ... 17
2.1.5.1 Taxonomie... 17
2.1.5.2 Einteilung in Serotypen ... 18
2.1.5.3 Morphologie und Genomstruktur ... 18
2.1.5.4 Immunogene Eigenschaften der Virusproteine ... 19
2.1.6 Epidemiologie ... 20
2.1.7 Klinik... 21
2.1.8 Pathologie und Histologie ... 21
2.1.9 IBDV-Pathogenese... 22
2.1.10 Diagnose... 23
2.1.11 Differentialdiagnosen ... 25
2.2 Immunprophylaxe ... 25
2.2.1 Lebendimpfstoffe ... 25
2.2.2 Totimpfstoffe... 26
2.2.3 Neuere Entwicklungen ... 26
2.2.4 Impfzeitpunkt ... 28
2.3 Fragestellung der eigenen Untersuchungen ... 29
3 Material und Methoden... 31
3.1 Tiere ... 31
3.2 Virusstämme ... 31
3.2.1 Titration von Impfvirus ... 32
3.2.2 Vermehrung und Titration von vvIBDV ... 33
3.3 Untersuchungsmethoden ... 34
3.3.1 Serologische Untersuchungsmethoden... 34
3.3.1.1 Blutentnahme und Serumgewinnung ... 34
3.3.1.2 Enzyme-linked immunosorbent Assay (ELISA)... 34
3.3.1.3 Virusneutralisationstest ... 35
3.3.2 Pathologisch-anatomische Untersuchungen nach Impfung und nach Belastungsinfektion ... 36
3.3.3 Histologische Untersuchung... 37
3.3.4 Immunhistochemische Detektion von IBDV-Antigen in histologischen Präparaten von Bursa, Milz und Zäkaltonsillen ... 39
3.3.5 IBD Antigen-Capture-ELISA... 41
3.3.6 Virus-RNA-Isolierung... 41
3.3.7 Nachweis von IBDV-Genom mittels RT-PCR (Reverse Transcription- Polymerase Chain Reaction) ... 42
3.3.8 Agarosegel-Elektrophorese der PCR-Produkte... 44
3.3.9 Spektroskopische Bestimmung der DNA-Konzentration ... 44
3.3.10 Sequenzierung der PCR-Produkte... 45
3.3.11 Klonierung von PCR-Produkten ... 45
3.3.11.1 TOPO-Klonierung ... 45
3.3.11.2 Transformation ... 46
3.3.11.3 Plasmid-Isolierung... 46
3.3.11.4 Spaltung der Plasmide mittels Restriktionsenzym ... 47
3.3.11.5 Sequenzierung der klonierten Plasmide ... 47
3.4 Versuchsaufbau... 48
3.4.1 Versuch 1... 48
3.4.2 Versuch 2... 49
3.5 Statistische Auswertung... 50
4 Ergebnisse ... 51
4.1 Verlauf des maternalen Antikörperspiegelabfalls bei kommerziellen Broilern 51 4.2 Bestimmung des IBDV-Antikörperspiegels nach Impfung ... 53
4.3 Entwicklung des Bursa-Körpergewichtsverhältnisses nach IBDV-Impfung.... 57
4.4 Entwicklung des Milz-Körpergewichtsverhältnisses nach Impfung... 60
4.5 Läsionen an der Bursa cloacalis nach Impfung... 63
4.6 Detektion von Impfvirus-Antigen mittels Immunhistochemie und Antigen- Capture-ELISA ... 66
4.7 Nachweis von IBDV-Genom in der Bursa cloacalis nach Impfung mittels RT- PCR ... 70
4.8 Schutz der geimpften Tiere vor einer vvIBDV-Belastungsinfektion... 72
4.9 Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenz von direkt sequenzierten und klonierten PCR-Produkten des IBDV-Impfvirus ... 76
4.10 Sequenzierung von PCR-Produkten der aus Bursahomogenat isolierter Impfvirus-RNA an verschiedenen Tagen nach Impfung ... 78
5 Diskussion ... 81
5.1 Bestimmung des Impfzeitpunktes ... 82
5.2 Vergleichende Untersuchungen der humoralen Immunantwort in SPF-Hühnern vom Legetyp und Broilern mit maternalen Antikörpern... 83
5.3 Vergleichende Untersuchungen der Impfreaktion in SPF-Hühnern vom Legetyp und Broilern mit maternalen Antikörpern... 83
5.4 Nachweis von IBDV-Impfvirus in Milz und Bursa von SPF-Hühnern und Broilern ... 84
5.5 Schutz der geimpften Tiere vor einer vvIBDV-Belastungsinfektion... 86
5.6 Untersuchungen zur Stabilität des Impfvirusgenoms ... 87
5.7 Fazit... 91
6 Zusammenfassung... 92
7 Summary... 94
8 Literaturverzeichnis... 96
9 Anhang ... 125
9.1 SPF-Liste... 125
9.2 Lösungen, Puffer, Medien... 126
10 Danksagung ... 129
1 Einleitung
Die infektiöse Bursitis (IBD) gehört weltweit zu den bedeutendsten immunsuppressiven Krankheiten der Hühner. Neben der erhöhten Mortalitätsrate ist es vor allem die durch das Virus verursachte Immunsuppression, die zu großen wirtschaftlichen Verlusten führt. Es treten vermehrt Infektionen durch Sekundärerreger auf, außerdem kann es zum Impfversagen bei Vakzination gegen andere Krankheitserreger kommen.
IBD wurde erstmals 1957 in Gumboro in dem amerikanischen Bundesstaat Delaware beschrieben und ist deshalb auch als „Gumboro-Krankheit“ bekannt. Inzwischen ist IBD weltweit verbreitet und tritt auf jedem Kontinent auf. Das Virus der infektiösen Bursitis (IBDV) gehört zu der Familie der Birnaviridae und hat eine hohe Tenazität.
Dies ist auch der Grund, weswegen die Erkrankung schwer aus einem einmal infizierten Bestand zu eliminieren ist. Deshalb ist eine Impfung gegen IBDV in den meisten Regionen zur Erhaltung der Tiergesundheit und zur Verhinderung von ökonomischen Verlusten unumgänglich. Geimpft werden sowohl Legehennen als auch Masthähnchen (Broiler). Die Broiler weisen oft maternale Antikörper auf, die sie in den ersten Lebenswochen vor einer Feldinfektion mit IBDV schützen sollen. Bei einer IBDV- Impfung dieser Tiere kann es zu einer Interferenz des Impfvirus mit den möglicherweise vorhandenen maternalen Restantikörpern kommen.
Bei experimentellen Untersuchungen, welche zur Evaluierung der Wirksamkeit und Unbedenklichkeit von IBDV-Vakzinen durchgeführt werden, werden zumeist spezifiziert-pathogen-freie (SPF) Hühner vom Legetyp ohne maternale Restantikörpertiter verwendet. Es besteht jedoch die Notwendigkeit, Untersuchungen zu Impfreaktionen nicht nur mit SPF-Hühnern vom Legetyp sondern auch mit Broilern durchzuführen, da die Impfstoffe gerade in dieser Nutzungsrichtung in großem Maßstab angewendet werden.
In dieser Arbeit wurde der Verlauf der Impfreaktionen zwischen SPF-Hühnern vom Legetyp und Broilern nach Impfung mit einem intermediärvirulenten IBDV-Stamm verglichen. Es wurden zwei Versuche durchgeführt. In Versuch 1 wurden SPF-Hühner ohne maternale Antikörper und Broiler mit niedrigen maternalen Restantikörpertitern eingesetzt, 86% der Broiler wiesen einen Antikörpertiter unter dem vom Hersteller vorgegebenen Durchbruchtiter der Vakzine auf. In Versuch 2 wurden SPF-Hühner ohne
maternale Antikörper und Broiler mit höherem maternalen Antikörpertiter mit einer intermediärvirulenten IBDV-Vakzine geimpft. Nur 22% der Broiler hatten zu diesem Zeitpunkt Antikörperspiegel unter dem Durchbruchtiter der Vakzine. Dabei wurde die Induktion der humoralen Immunantwort, die Restpathogenität des Impfvirus und der Impfvirusnachweis in der Bursa cloacalis und der Milz verglichen. Außerdem wurde der Impfschutz vor einer vvIBDV-Belastungsinfektion untersucht.
Es wurde in dieser Studie weiterhin untersucht, ob die maternalen Restantikörper möglicherweise einen Einfluss auf die Stabilität des Impfvirusgenoms haben. IBDV gehört zu den RNA-Viren. Aufgrund der hohen Fehlerrate der RNA-Polymerase dieser Viren kann es relativ schnell zu Mutationen im Virusgenom kommen. Der Einfluss von Antikörpern auf die Entstehung neuer Virusvarianten wurde schon für andere RNA- Viren wie das Human immunodeficiency virus (HIV) und das Respiratory syncytial virus (RSV) gezeigt.
2 Literaturübersicht
2.1 Infektiöse Bursitis (IBD) 2.1.1 Einleitung
Die infektiöse Bursitis (IBD) ist eine Viruserkrankung junger Hühner. Die Hauptzielzellen des Virus der infektiösen Bursitis (IBDV) sind die B-Zellen der Bursa cloacalis. Eine Infektion kann einerseits zu einer akuten Erkrankung mit erhöhter Mortalitätsrate, andererseits zu anhaltender Immunsuppression mit nachfolgenden Sekundärinfektionen führen. IBD ist bei Hühnern weltweit verbreitet und hat für die Geflügelwirtschaft große ökonomische Bedeutung.
2.1.2 Historische Entwicklung
1962 wurde erstmals eine Erkrankung beschrieben, die seit 1957 in Gumboro im amerikanischen Bundesstaat Delaware bei Hühnern auftrat und wegen der auffälligen Nierenveränderungen zunächst als „aviäre Nephrose“ bezeichnet wurde (COSGROVE 1962). Die Identifizierung des infektiösen Agens wurde durch das zeitgleiche Auftreten eines nephropathogenen Stammes des Virus der infektiösen Bronchitis (sog. gray strain) erschwert (WINTERFIELD u. HITCHNER 1962). In weitergehenden Untersuchungen wurde dann gezeigt, dass Tiere, die gegen das Gray-Virus immun waren, nach wie vor erkrankten und weiterhin Nieren- und Bursaveränderungen zeigten.
Das infektiöse Agens wurde in embryonierten Hühnereiern isoliert und als infectious bursal agent bezeichnet (WINTERFIELD et al. 1962). 1970 wurde dann wegen der charakteristischen Bursaläsionen der bis heute gültige Name infectious bursal disease für die Erkrankung vorgeschlagen (HITCHNER 1970).
Mitte der 80er Jahre wurde in den USA von gehäuften Gumboroausbrüchen in geimpften Herden berichtet (ROSENBERGER et al. 1985). Die isolierten Stämme wurden als variant strains (Variantstämme) bezeichnet (ROSENBERGER u. CLOUD 1986). Diese verursachten nicht die bisher bekannten klinischen Symptome, sondern führten zu einer ausgeprägten Immunsuppression der Tiere. Mittels monoklonaler
Antikörper konnte gezeigt werden, dass ein Antigendrift für die Entstehung der variant strains verantwortlich war (SNYDER et al. 1988). Diese Stämme wurden zunächst nur in Nord- und Mittelamerika beobachtet (SNYDER 1990; JACKWOOD u. SOMMER 1999). Vor einigen Jahren traten die Variantstämme dann auch in Australien auf (SAPATS u. IGNJATOVIC 2000).
Ein weiteres wichtiges Ereignis in der Evolution des IBDV war das Auftreten von so genannten hochvirulenten (very virulent) Stämmen in Europa Ende der 80er Jahre (CHETTLE et al. 1989). Bei einem der ersten Ausbrüche in Europa wurden in Belgien trotz Vakzination Mortalitätsraten von 25% bei Masthähnchen und 60% bei Legehennen festgestellt (VAN DEN BERG et al. 1991). Die Infektion ging einher mit hochgradig gestörtem Allgemeinbefinden, wässrigem Durchfall und plötzlichen Todesfällen.
Weitere Charakteristika der neuen Stämme waren die hohen Mortalitätsraten in SPF- Küken (bis zu 100%) und die Wirkungslosigkeit der gängigen Impfstoffe. Auch von anderen Kontinenten wurde von dem Auftreten des hochvirulenten IBDV-Typs berichtet, wie z.B. in Asien (NUNOYA et al. 1992), in Afrika (HORNER et al. 1994) oder in Südamerika (IKUTA et al. 2001). Für vvIBDV konnten die gleichen Antigeneigenschaften wie für die erstbeschriebenen klassischen Stämme nachgewiesen werden (ÖPPLING et al. 1991). Die Zuordnung zu klassisch virulenten oder hochvirulenten Stämmen erfolgt bisher über die Mortalitätsraten in Hühnern oder embryonierten Hühnereiern, da die molekulare Grundlage für die starke Virulenz bis heute nicht vollständig bekannt ist.
2.1.3 Verbreitung
Nach der Erstbeschreibung 1962 wurde in den folgenden Jahren zunächst von dem Auftreten der Erkrankung auf dem gesamten amerikanischen Kontinent berichtet (LASHER u. DAVIS 1997), kurze Zeit später wurde auch auf anderen Kontinenten ein ähnliches Krankheitsbild beschrieben. In Deutschland traten 1965/66 erste Ausbrüche der „infektiösen Bursa-Erkrankung“ auf (LANDGRAF et al. 1967). Nachfolgend wurde das Auftreten in Europa, im mittleren Osten, im afrikanischen Raum, in Indien und in Australien dokumentiert (FARAGHER 1972; FIRTH 1974; ONUNKWO 1975; VAN
DEN SLUIS 1999). Heutzutage ist das Gumboro-Virus auf der gesamten Welt verbreitet, 62 von 65 Länder berichten über Krankheitsausbrüche (VAN DEN BERG et al. 2000).
2.1.4 Ökonomische Bedeutung
IBD wird als wirtschaftlich sehr bedeutende Erkrankung des Geflügels angesehen.
Wirtschaftliche Schäden dieser Erkrankung kommen einerseits durch Tierverluste bei dem akuten Verlauf bei meist älteren Tieren, andererseits durch Immunsuppression bei Infektion sehr junger Tiere zustande. Die Immunsuppression führt zu einer erhöhten Anfälligkeit für Sekundärinfektionen, die sich in Kümmerwachstum, mangelnden Zunahmen, erhöhtem Medikamentenverbrauch und größeren Verwurfsraten am Schlachthof niederschlägt. Außerdem besteht die Gefahr des Impfversagens bei Impfungen gegen andere Erkrankungen wie z.B. infektiöse Bronchitis (IB) oder Newcastle-Krankheit (MÜLLER et al. 2003). In einer irischen Studie wurde gezeigt, dass eine subklinische Infektion mit IBDV bei Broilerherden im Vergleich zu nicht infizierten Herden zu einem Einkommensverlust von 14% führte (MC ILROY et al.
1989). Der Einkommensverlust ergab sich hauptsächlich aus einem geringeren Körpergewicht und einer schlechteren Futterverwertung.
2.1.5 Das Virus der infektiösen Bursitis (IBDV) 2.1.5.1 Taxonomie
Die taxonomische Einteilung des IBD-Virus war lange Zeit umstritten. Es wurde den Picornaviren (CHO u. EDGAR 1969) und den Reoviren (KÖSTERS et al. 1972;
HARKNESS et al. 1975) zugeordnet. In einer Studie wurde dann gezeigt, dass das IBDV und das Virus der infektiösen Pankreasnekrose der Salmoniden (IPNV) sowie das Oyster virus (OV), das Tellina tenius virus (TV) und das Drosophila X virus (DXV) gleiche Strukturmerkmale besitzen (DOBOS et al. 1979). Schließlich wurden diese fünf
Viren in einer Familie zusammengefasst und als Birnaviridae (bisegmented RNA viruses) bezeichnet (BROWN 1986). Innerhalb der Birnaviridae wird das IBDV dem Genus Avibirnavirus zugeordnet (PRINGLE 1998).
2.1.5.2 Einteilung in Serotypen
Mit dem Serumneutralisationstest lassen sich zwei Serotypen des IBD-Virus unterscheiden, Serotyp 1 und Serotyp 2 (MCFERRAN et al. 1980; JACKWOOD et al.
1982). Nur der Serotyp 1 führt zu der klinischen Erkrankung bei Hühnern. Der Serotyp 2 wurde erstmals aus Puten isoliert (JACKWOOD et al. 1982) und verursacht weder unter experimentellen noch unter natürlichen Bedingungen Erkrankungen in Puten und Hühnern (JACKWOOD et al. 1985; ISMAIL et al. 1988).
Innerhalb des Serotyps 1 werden „klassisch“ virulente Stämme, Variantstämme, hochvirulente (vv) Stämme und attenuierte Impfstämme unterschieden. Das zum ersten Mal isolierte IBD-Virus war ein klassisch virulenter Stamm, ebenso wie die in den folgenden Jahren auftretenden Stämme (COSGROVE 1962).
2.1.5.3 Morphologie und Genomstruktur
Das IBD-Virus besitzt ein unbehülltes, ikosaedrisches Kapsid mit einem Durchmesser von 55-65 nm (HIRAI u. SHIMAKURA 1974; NICK et al. 1976; OZEL u.
GELDERBLOM 1985). Das Genom besteht aus zwei Segmenten (A und B) einer doppelsträngigen RNA (BECHT 1980; DOBOS et al. 1979). Je nach Virusstamm ist Segment A ca. 3,4 kb, Segment B ca. 2,8 kb groß (MÜLLER et al. 1979b). Segment A enthält zwei offene Leserahmen (open reading frame; ORF). Der größere kodiert für ein Vorläuferprotein VP0, aus dem nach Spaltung die Virusproteine VP2, VP4 und VP3 entstehen (AZAD et al. 1985; HUDSON et al. 1986; MÜLLER u. BECHT 1982), während der teilweise überlappende kleinere ORF für das Virusprotein VP5 kodiert (MUNDT et al. 1995). Segment B kodiert für VP1.
VP2 und VP3 stellen die Hauptstrukturproteine dar und haben einen Anteil von 51%
bzw. 40% am Gesamtvirusprotein (DOBOS et al. 1979). VP4 ist eine virale Protease, die das Vorläuferprotein VP0 spaltet (JAGADISH et al. 1988; KIBENGE et al. 1997).
VP5 ist ein Nichtstrukurprotein, das für die Virusreplikation nicht essentiell (MUNDT et al. 1995, 1997) aber möglicherweise an der Freisetzung von IBD-Viren aus der Zelle beteiligt ist (LOMBARDO et al. 2000; YAO u. VAKHARIA 2001). Für VP1 konnte RNA-Polymerase-, Guanylyltransferase- und Methyltransferase-Aktivität nachgewiesen werden (SPIES et al. 1987; SPIES u. MÜLLER 1990).
2.1.5.4 Immunogene Eigenschaften der Virusproteine
Auf VP2 befindet sich die für die Ausbildung von neutralisierenden Antikörpern wichtige sogenannte variable Region. Neutralisierende Antikörper binden nicht an denaturiertes VP2, sondern nur die native Form des Proteins, die B-Zell-Epitope auf VP2 sind also konformationsabhängig (BECHT et al. 1988). Die variable Region befindet sich im mittleren Drittel von VP2 von Aminosäure 206-350 (BAYLISS et al.
1990). Zwei hydrophile Peaks an den Aminosäurepositionen 210-225 (major peak A) und 313-324 (major peak B) flankieren diese Region (HEINE et al. 1991). Es werden zwei weitere hydrophile Abschnitte innerhalb der variablen Region unterschieden, und zwar minor peak 1 von Aminosäure 249-254 und minor peak 2 von Aminosäure 279- 290 (VAN DEN BERG et al. 1996).
Variantstämme und vvIBDV zeigen Abweichungen in der Aminosäuresequenz in major peak A und major peak B im Vergleich zu klassisch virulenten Stämmen. Bei vvIBDV findet man im Vergleich mit klassisch virulenten Stämmen einen typischen Austausch im Bereich des major peak A an Aminosäureposition 222 (Pro→Ala; BROWN et al.
1994; ETERRADOSSI et al. 1998). In Variantstämmen ist an dieser Position ebenfalls regelmäßig eine typische Abweichung von den klassisch virulenten Stämmen zu beobachten (Pro→Thr; CHEN et al. 1998; DORMITORIO et al. 1997; ETERRADOSSI et al. 1998). Weitere Abweichungen, die bei Variantstämmen auftreten, befinden sich im Bereich des major peak B, an Position 318 (Gly→Asp) und an Position 321 (Ala→Glu). Diese Mutationen gehen einher mit dem Verlust der Bindungsfähigkeit von bestimmten monoklonalen Antikörpern an VP2, führen also zu Änderungen der
Antigenität (ETERRADOSSI et al. 1998). Außerdem wird ein Aminosäureaustausch an Position 254 (Gly→Ser) als typisch für IBDV-Variantstämme angesehen (DORMITORIO et al. 1997).
Mutationen im Bereich der minor peaks führen zur Attenuierung des Virus. Mittels reverser Genetik wurden die Aminosäuren 253 (His→Gln) und 284 (Ala→Thr) ausgetauscht. Die rekombinanten Viren zeigten verringerte Pathogenität im Tier und verstärkte Replikation in der Zellkultur (MUNDT 1999; VAN LOON et al. 2002). Auch der Austausch von Aminosäure 279 (Asp→Asn) und 284 (Ala→Thr) führte zur Zellkulturadaptation (LIM et al. 1999).
Monoklonale Antikörper gegen VP3 erkennen Antigen von Serotyp 1 und Serotyp 2, sie detektieren somit gruppenspezifische Epitope (AZAD et al. 1987; BECHT et al. 1988).
2.1.6 Epidemiologie
Der natürliche Wirt für das IBD-Virus sind Hühner. In Puten wurde das Virus nachgewiesen, allerdings zeigen Puten keine klinischen Symptome. Antikörper gegen das Virus wurden u.a. auch in Krähen und wilden Fasanen gefunden (CAMPBELL 2001). Bei Hühnern sind alle Nutzungsrichtungen für eine Infektion empfindlich, wobei Tiere vom Legetyp stärkere Klinik zeigen und höhere Mortalitätsraten aufweisen (VAN DEN BERG et al. 1991). Die größte Empfänglichkeit für eine klinische Erkrankung ist bei Hühnern von der dritten bis zur sechsten Lebenswoche zu finden. Tritt eine Infektion früher auf, läuft die Erkrankung oft subklinisch ab und führt zu einer starken Immunsuppression (ALLAN et al. 1972; FARAGHER et al. 1974).
Die Infektion kann oral, nasal, aerogen oder konjunktival erfolgen. Eine vertikale Übertragung wurde experimentell zwar nachgewiesen (LANDGRAF et al. 1980), in der Praxis liegen aber keine Hinweise dafür vor. Insekten wie der Getreideschimmelkäfer oder Mücken können als Vektoren fungieren (SNEDEKER et al. 1967; HOWIE u. THORSEN 1981). Das Virus der infektiösen Bursitis hat eine hohe Tenazität und kann über lange Zeit in Stallanlagen persistieren (BENTON et al. 1967a).
Zerstört wird das Virus durch pH-Werte ab 12, 1%iges Formalin, 0.5%iges Chloramin und 1%iges Kresol (FARAGHER 1972; IDE u. STEVENSON 1978).
2.1.7 Klinik
Nach einer Inkubationszeit von zwei bis drei Tagen zeigen die betroffenen Tiere Mattigkeit, aufgeplustertes Gefieder, Anorexie, Durchfall, Dehydratation und schwere Depression bis hin zum Tod (COSGROVE 1962). Die meisten Todesfälle treten fünf bis sieben Tage nach IBDV-Infektion auf, danach erholt sich die Herde rasch wieder.
Die Mortalität kann bei Erstausbrüchen bis zu 30% betragen, bei der Infektion mit vvIBDV wurden Mortalitätsraten von bis zu 100% beobachtet (VAN DEN BERG et al.
1991).
Der Verlauf der Erkrankung ist altersabhängig. Die aufgeführten klinischen Symptome treten bei über drei Wochen alten Tieren auf. Bei jüngeren Tieren verläuft die Infektion oft subklinisch und führt zu einer Immunsuppression (ALLAN et al. 1972). Dadurch kommt es zu einer erhöhten Empfänglichkeit und schwereren Krankheitsverläufen von Erkrankungen wie Kokzidiose, infektiöser Laryngotracheitis, infektiöser Bronchitis, Marekscher Krankheit oder der Newcastle-Krankheit (KALETA 1978; SCHAT et al.
1981; DOHMS et al. 1981). Auch die Immunantwort nach Impfungen wird reduziert (FARAGHER et al. 1974).
2.1.8 Pathologie und Histologie
Die Bursa cloacalis stellt das Hauptzielorgan des IBD-Virus dar. Die Bursa zeigt am dritten Tag nach Infektion eine Gewichts- und Größenzunahme, um den fünften Tag herum hat sie das Ausgangsgewicht wieder erreicht. Danach ist eine Atrophierung des Organs zu beobachten, eine gegenüber nichtinfizierten Tieren verkleinerte Bursa ist die Folge (CHEVILLE 1967). In der Phase der Hypertrophie ist die Bursa von gelbem, gelatinösem Transsudat umgeben, eventuell sind Hämorrhagien auf der Bursaoberfläche oder auch im gesamten Organgewebe zu sehen. Im Bursalumen kann glasiger Schleim oder nekrotisches Material gefunden werden. Mit fortlaufender Atrophie wird das Organ derb und nimmt eine graue Farbe an.
Schon einen Tag nach Infektion sind histologische Veränderungen in der Bursa zu erkennen (HELMBOLDT u. GARNER 1964; CHO u. EDGAR 1972). In der Medulla der Bursafollikel findet man eine Nekrose der B-Lymphozyten und Ansammlungen von
heterophilen Granulozyten und retikuloendothelialen Zellen. Drei bis vier Tage nach Infektion sind alle Bursafollikel betroffen, das interfollikuläre Bindegewebe ist ödematisiert und hyperämisch. Nach dem Abklingen der akuten Entzündungsphase entwickeln sich in den Bursafollikeln Vakuolen, die Struktur der Follikel geht vollständig verloren. Bei Infektion mit klassisch virulenten Stämmen findet eine Repopulation der Follikel mit IgM-tragenden B-Zellen statt, die aber erst nach mehreren Wochen abgeschlossen ist (KIM et al. 1999). Nach Infektion mit vvIBDV ist keine Repopulation mit IgM- oder IgG-positiven Zellen zu beobachten (WILLIAMS u.
DAVISION 2005).
Auch in der Milz zeigen sich nach einer Infektion Veränderungen. Das Organ ist vergrößert und es sind gleichmäßig verteilte graue Foci auf der Organoberfläche zu sehen (RINALDI et al. 1965). Am dritten Tag nach Infektion ist eine lymphoide Nekrose in den Milzfollikeln und den periarteriolären Scheiden zu erkennen. Auch in anderen lymphoiden Organen wie Zäkaltonsillen, Thymus und Knochenmark können sich zelluläre Läsionen zeigen. Wie auch in der Milz sind diese Läsionen weniger ausgeprägt als in der Bursa cloacalis und die Regeneration erfolgt schneller. Weiterhin können bei virulenten IBDV-Stämmen petechiale Blutungen in der Brust- und Beinmuskulatur sowie im Drüsenmagen auftreten.
Beobachtete Nierenveränderungen sind unspezifisch und möglicherweise mit der Dehydratation der Tiere zu erklären (PETERS 1967).
Bei Infektionen mit vvIBDV sind häufig stärkere Läsionen in Milz, Zäkaltonsillen, Thymus und Knochenmark zu sehen, während Bursaveränderungen wie bei klassischen Stämmen auftreten.
Bei Variantstämmen sind ähnliche Bursaläsionen wie bei den klassischen Stämmen zu finden, allerdings ist keine inflammatorische Immunantwort in den Follikeln nachzuweisen (SHARMA et al. 1989).
2.1.9 IBDV-Pathogenese
Nach oraler Aufnahme wird das Virus im Gastrointestinaltrakt von Makrophagen aufgenommen und gelangt über das Pfortadergefäßsystem in die Leber und von dort in
die Bursa cloacalis. (MÜLLER et al. 1979a). In der Bursa kommt es zur Virusvermehrung gefolgt von einer massiven Virämie. Das Virus wird auch in andere lymphatische Organe wie Milz, Thymus und Zäkaltonsillen transportiert.
IgM+-B-Lymphozyten sind die Hauptzielzellen des Virus (NAKAI u. HIRAI 1981).
Diese Zellen werden durch die Virusreplikation zerstört (BURKHARDT u. MÜLLER 1987; VASCONCELOS u. LAM 1994; WEISS 1978). Dies führt zu einem Mangel an B-Lymphozyten und zu einer reduzierten Immunantwort gegenüber anderen Infektionen (KIM et al. 1999).
Die Replikation des IBD-Virus in B-Lymphozyten der Bursa cloacalis ist begleitet von einer Infiltration von T-Lymphozyten (KIM et al. 2000; TANIMURA u. SHARMA 1997). Die T-Lymphozyten kontrollieren die Virusreplikation, führen jedoch auch zu einer verstärkten inflammatorischen Reaktion in der Bursa, möglicherweise durch Freisetzung von Zytokinen wie Interleukin-2 (IL-2) und Interferon-γ (IFN-γ) und zytotoxischen Effekten (RAUTENSCHLEIN et al. 2002). Auch Makrophagen wird eine Bedeutung in der Pathogenese beigemessen, da sie in der akuten Phase der IBDV- Infektion Interleukin-6 (IL-6), Stickoxid (NO) und Cyclooxygenase 2 (COX2) ausschütten (KHATRI u. SHARMA 2005).
2.1.10 Diagnose
Bei einem akuten Ausbruch ermöglicht das klinische Bild in Zusammenhang mit der pathologisch-anatomischen Untersuchung eine Verdachtsdiagnose, die durch die histologische Untersuchung abgesichert werden kann. Bei Erkrankung sehr junger Hühner, Hühnern mit hohen maternalen Antikörperspiegeln und bei Infektion mit Variantstämmen stützt sich die vorläufige Diagnose nur auf die histopathologischen Befunde.
Eine sichere Diagnose ist am zuverlässigsten durch den direkten Virusnachweis aus der Bursa möglich. Andere lymphoide Organe eignen sich für den Nachweis nur bedingt, da das Virus dort nur in geringer Menge vorkommt. Zur IBDV-Anzucht wird das Organmaterial homogenisiert, abzentrifugiert und der Überstand auf die Chorioallantoismembran (CAM) von 9-11 Tage alten Hühnerembryonen verimpft
(HITCHNER 1970). Ist die Probe IBDV-positiv, stirbt der Hühnerembryo nach drei bis fünf Tagen ab. Das Virusantigen kann in den Organen des Embryos mit verschieden Methoden detektiert werden (s.u.). Die Virusanzucht in der Zellkultur ist sehr zeitaufwendig, da ein zytopathischer Effekt erst nach mehreren Blindpassagen zu beobachten ist (JACKWOOD et al. 1987). Außerdem lassen sich nicht alle Feldstämme in Zellkultur vermehren (VAN DEN BERG et al. 1991). Die geeignetsten Zellen zur Anzucht sind B-Zelllinien vom Huhn. Hühnerembryofibroblasten und Leber- oder Nierenzelllinien können auch verwendet werden. Allerdings lassen sich mit diesen Zellen nicht alle Stämme vermehren (MCFERRAN et al. 1980). Weiterhin kann die Elektronenmikroskopie zur Darstellung ganzer Viruspartikel verwendet werden.
Virusantigen kann durch Agarosegel-Präzipitationstest (AGP), in histologischen Präparaten der Bursa cloacalis immunhistochemisch oder mit Hilfe der Immunfluoreszenz detektiert werden. Mittels Antigen-Capture-ELISA lassen sich Feldstämme differenzieren (ETERRADOSSI et al. 1997). Als sensitivstes Diagnostikum ist die RT-PCR zu nennen, die Virus-RNA nachweist (z.B. KATARA et al. 2001; LEE et al. 1992; WU et al. 1992; THAM et al. 1995). Dabei werden meist Sequenzen amplifiziert, die für VP2 oder VP3 kodieren. Mit einer Restriktionsenzymanalyse (RFLP) der PCR-Produkte oder durch Sequenzierung lassen sich verschiedene IBDV-Isolate in molekulare Gruppen einteilen (JACKWOOD und SOMMER 1997, 1999; VAN DEN BERG et al. 2004). Mittlerweile gibt es auch Protokolle für den IBDV-Nachweis in Real-time quantitativer RT-PCR (JACKWOOD et al. 2003; PETERS et al. 2005).
In der serologischen Diagnostik werden der Virusneutralisationstest (VNT) und kommerziell erhältliche ELISA-Systeme verwendet. Die Ergebnisse beider Methoden korrelieren miteinander (SOLANO et al. 1985; THAYER et al. 1987). Mit dem VNT können Antikörper gegen verschiedene Serotypen des Virus unterschieden werden (JACKWOOD u. SAIF 1987), während das ELISA-System ein schneller Test ist, der routinemäßig zum Monitoring des Antikörperstatus einer Herde verwendet wird. Ein weiteres serologisches Diagnostikum stellt der Agarose-Gel-Präzipitationstest (AGP) dar, der allerdings arbeitsaufwendig und weniger sensitiv als der VNT ist (PHILLIPS 1981).
2.1.11 Differentialdiagnosen
Aufgrund der akuten Krankheitserscheinungen wie Depression und Durchfall ist Kokzidiose auszuschließen. Nephropathogene IB-Stämme können ähnliche Nierenveränderungen verursachen, wie sie gelegentlich bei IBD gefunden werden.
Weitere Erkrankungen wie die Newcastle-Krankheit oder septikämisch verlaufende bakterielle Infektionen müssen abgegrenzt werden. Die typischen Bursaveränderungen sind aber nur bei einer IBDV-Infektion zu finden. Blutungen in der Muskulatur und im Drüsenmagen werden auch bei dem Auftreten des hämorrhagischen Syndroms beobachtet, das durch einen Vitamin K-Mangel, wie er z. B. bei Verabreichung von Sulfonamiden auftreten kann, verursacht wird. Bei dem hämorrhagischen Syndrom sind die Blutungen als Hauptsymptom aber stärker ausgeprägt. Andere Organveränderungen fehlen.
2.2 Immunprophylaxe 2.2.1 Lebendimpfstoffe
Das Virus der infektiösen Bursitis ist sehr widerstandsfähig gegenüber vielen Desinfektionsmitteln und physikalischen Noxen (BENTON et al. 1967b). Eine vollständige Eradikation des Virus aus den betroffenen Gebieten gilt deshalb als unrealistisch (VAN DEN BERG et al. 2000). Es wurde schon früh erkannt, dass Impfstoffe entwickelt werden müssen, um Krankheitsausbrüche zu verhindern.
Attenuiertes IBD-Virus, durch welches eine Immunantwort induziert wurde und welches geringe Bursaläsionen hervorrief, entstand durch vielfaches Passagieren im Hühnerembryo (WINTERFIELD 1969) oder in der Fibroblasten-Zellkultur (GELENCZEI u. LASHER 1969).
Bei den kommerziell erhältlichen Lebendvakzinen werden je nach Herkunft Hühnerembryo-adaptierte und Zellkultur-adaptierte Impfstämme und nach Attenuierungsgrad mild, intermediate und intermediate plus (hot) Vakzinen unterschieden. Die mild Vakzinen werden bei älteren Tieren mit niedrigem oder fehlendem maternalen Antikörpertiter angewendet, z.B. in Elterntierherden und bei
Junghennen. Die intermediate Impfstoffe werden in Masthähnchenherden eingesetzt, die maternale Restantikörpertiter aufweisen, welche zur Neutralisation einer mild Vakzine führen würden. Wenn ein hoher Felddruck mit vvIBDV besteht, kommen intermediate plus Impfstoffe zum Einsatz. Weiterhin kann man zwischen klassischen Vakzinestämmen und Vakzinen, die Variantstämme enthalten, unterscheiden.
Die Lebendimpfstoffe werden zumeist über das Trinkwasser verabreicht, auch eine Vernebelung ist möglich. Es gibt kein universelles Impfprogramm, da der optimale Impfzeitpunkt vom maternalen Antikörperspiegel, vom Management und von der epidemiologischen Situation abhängt (s.u.). In Broilerherden wird meistens einmal zwischen dem 15. und dem 25. LT geimpft. Junghennen können während der Aufzucht ein- oder auch zweimal geimpft werden. Bei Elterntieren werden meistens zwei Impfungen in der Aufzucht durchgeführt, gefolgt von einer Vakzination mit einem Inaktivatimpfstoff ca. drei Wochen vor Legebeginn (s.u.).
2.2.2 Totimpfstoffe
Bei den Inaktivatvakzinen handelt es sich meist um Ölemulsionsimpfstoffe, welche parenteral verabreicht werden müssen. Diese Impfstoffe kommen hauptsächlich in Elterntierherden zum Einsatz. Die Tiere werden zunächst mit einer Lebendvakzine geimpft, um dann vor Legebeginn eine Boosterimpfung mit einem Inaktivatimpfstoff zu erhalten. Dies führt zu einem hohen und gleichmäßigen maternalen Antikörpertiter bei den Nachkommen (EIDSON et al. 1980; WYETH u. CULLEN 1978).
2.2.3 Neuere Entwicklungen
Bei der Entwicklung von neuen IBD-Impstoffen gibt es verschiedene Ansätze.
Es gibt die Möglichkeit, Hühnerembryonen am 18. Bebrütungstag in ovo zu impfen, sodass sich im geschlüpften Küken sehr schnell eine Immunität ausbilden kann (GAGIC et al. 1999). Dazu werden oft Immunkomplexvakzinen verwendet, bei denen das Virus einer Vakzine mit IBDV-Antikörpern eines Hyperimmunserums in vitro vermischt wird
und Komplexe bildet. Der genaue Wirkungsmechanismus der Immunkomplexvakzinen ist noch nicht vollständig geklärt, es wird aber vermutet, das die Komplexierung zur Lokalisation und zum Persistieren der Vakzine an immunologisch wichtigen Orten, z.B.
den follikulären dendritischen Zellen in Keimzentren in der Milz, führt (JEURISSEN et al. 1998).
Überwiegend noch im experimentellen Stadium befinden sich Subunit-Impfstoffe, bei denen nur die immunogenen Proteine verabreicht werden. Erfolgreich als Expressionssysteme eingesetzt wurden dabei E. coli (ROGEL et al. 2003), Insektenzellen (DYBING u. JACKWOOD 1998; PITCOVSKI et al. 1996) und Hefen (PITCOVSKI et al. 2003).
Eine weitere Methode besteht darin, rekombinante Viren, die Teile des IBDV-Genoms enthalten, als Impfstoffe zu verwenden, sodass das immunogene Virusprotein in vivo exprimiert wird. Experimentell als Vektoren eingesetzt wurden aviäre Herpesviren (TSUKAMOTO et al. 2002), Hühnerpocken-Viren (SHAW u. DAVISON 2000), aviäres Adenovirus (FRANCOIS et al. 2001), Marek-Herpesvirus (TSUKAMOTO et al.
1999) und Newcastle disease virus (HUANG et al. 2004).
Auch Plasmide, die VP2 oder VP2-4-3 exprimieren, wurden als DNA-Vakzine eingesetzt (KIM et al. 2004). In einigen Versuchsansätzen wurden gleichzeitig Plasmide verabreicht, die für Zytokine wie Interleukin-2 (IL-2) oder IL-6 kodieren. Diese Botenstoffe sollen eine zusätzliche Immunstimulation bewirken (LI et al. 2004; SUN et al. 2005). Alle hier aufgezählten Vakzinen sind noch nicht kommerziell erhältlich. Sie haben den Vorteil, dass sie nicht zu unerwünschten Nebenwirkungen wie transienter Immunsuppression führen, wie sie bei Impfung mit intermediate plus Vakzinen auftreten können. Auch eine Reversion zu virulenten Stämmen ist bei diesen Impfstoffen nicht möglich.
Ein anderer Ansatz ist die Herstellung von rekombinantem Impfvirus durch den Austausch von Genomabschnitten von Variantstämmen und klassischen Impfstämmen mittels site-directed mutagenesis und reverser Genetik. Es konnte ein chimäres Virus erzeugt werden, das Schutz gegen Belastung mit klassisch virulentem Virus als auch mit einem Variantstamm induzierte (MUNDT et al. 2003). Allerdings besteht bei diesen Vakzinen die Gefahr der Reversion zum Feldstamm (RAUE et al. 2004).
2.2.4 Impfzeitpunkt
Ein wesentlicher Faktor, der Einfluss auf den Impferfolg bei jungen Hühnern hat, ist der maternale Antikörpertiter der Tiere zum Zeitpunkt der Impfung (VAN DEN BERG u.
MEULEMANS 1991; TSUKAMOTO et al. 1995b). Die Höhe der maternalen Antikörper ist abhängig von dem Impfprogramm der Elterntiere. Bei Erstimpfung mit einem IBDV-Lebendimpfstoff und Boosterung kurz vor Legebeginn mit einer Inaktivatvakzine werden hohe und gleichmäßige Antikörpertiter in den Nachkommen erreicht. Auch eine Feldinfektion der Elterntiere führt zu hohen Titern. Werden keine Inaktivatimpfstoffe eingesetzt, sind die maternalen Antikörpertiter niedriger und unregelmäßiger.
Hat ein Großteil der Masthühner zum Zeitpunkt der Impfung einen Antikörpertiter, der deutlich über dem sogenannten Durchbruchtiter der Vakzine liegt, wird der Impfstoff bei diesen Tieren von den maternalen Antikörpern neutralisiert, es wird keine Immunität ausgebildet. Bei zu später Impfung nach vollständigem Abbau der maternalen Antikörper besteht das Risiko einer Feldvirusinfektion, da die Tiere über einen langen Zeitraum hinweg ungeschützt bleiben.
Es ergibt sich die Notwendigkeit, den maternalen Antikörpertiter der Tiere vor der Impfung zu bestimmen, um den geeigneten Impfzeitpunkt festlegen zu können. In den Niederlanden wurde die Deventer-Formel entwickelt, mit der man annäherungsweise den „optimalen“ Impftag bestimmen kann, an dem ein bestimmter Prozentsatz (meist 75%) der Tiere impffähig ist (DE WIT 2001). Es wird davon ausgegangen, dass die verbleibenden 25% der Tiere mit zu hohen Antikörpertitern durch ausgeschiedenes Impfvirus nachgeimpft werden, sobald ihr Titer unter den Durchbruchtiter der Vakzine fällt (GIAMBRONE u. CLAY 1985). Die Deventer-Formel lässt sich bei verschiedenen Vakzinen und Nutzungsrichtungen anwenden. Ist die Titerverteilung der Herde sehr ungleichmäßig, wird eine zweimalige Impfung zu verschiedenen Zeitpunkten empfohlen (DE WIT 2001).
Andere Faktoren, die für eine erfolgreiche IBDV-Impfung beachtet werden müssen, sind die epidemiologische Situation, der verwendete Impfstoff und der Zeitpunkt anderer Impfung.
2.3 Fragestellung der eigenen Untersuchungen
Bei experimentellen Untersuchungen, welche zur Evaluierung der Wirksamkeit und Unbedenklichkeit von IBD-Vakzinen im Zusammenhang mit dem Zulassungsverfahren durchgeführt werden, muss sich an den Anforderungen des Europäischen Arzneibuches (European Pharmacapoeia, derzeit gültig: 5. Edition) orientiert werden. Dort ist festgelegt, dass zur Untersuchung von Wirksamkeit und Restpathogenität spezifiziert- pathogen-freie (SPF) Hühner vom Legetyp verwendet werden müssen. Es ist unklar, ob sich die Ergebnisse dieser Untersuchungen auf Broiler übertragen lassen, da diese einen anderen genetischen Hintergrund haben und oft maternale Restantikörpertiter aufweisen.
In der Literatur gibt es kaum vergleichende Untersuchungen zur Impfreaktion von SPF- Legetyp-Hühnern und Broilern (ABDEL-ALIM u. SAIF 2001). Hingegen sind zahlreiche Studien nur mit SPF-Tieren oder nur mit Broilern zu finden. Die Ergebnisse dieser Studien lassen sich aufgrund unterschiedlicher Versuchsbedingungen nicht miteinander vergleichen. Da IBDV-Lebendvakzinen bei Masthähnchen sehr häufig angewendet werden, besteht die Notwendigkeit, die Übertragbarkeit der Ergebnisse von Untersuchungen der Impfreaktionen in SPF-Hühnern vom Legetyp auf kommerzielle Broiler nachzuweisen.
In dieser Arbeit wurde der Verlauf der Impfreaktion zwischen SPF-Hühnern vom Legetyp und Broilern nach Impfung mit einem intermediärvirulenten IBDV-Stamm verglichen. Dabei wurden zwei Versuche durchgeführt:
In Versuch 1 wurden Broiler mit niedrigen maternalen Restantikörpertitern unter dem vom Hersteller vorgegebenen Durchbruchtiter eingesetzt.
In Versuch 2 wurden Broiler mit höherem maternalen Antikörpertiter über dem Durchbruchtiter der Vakzine verwendet.
Es wurde die Induktion humoraler Immunität, das Auftreten von Bursaläsionen und die Persistenz des Virus in Bursa und Milz untersucht. Außerdem wurde eine vvIBDV- Belastungsinfektion durchgeführt, um den Schutz der geimpften Tiere zu untersuchen.
Dabei wurden die klinische Symptomatik und histopathologische Veränderungen in der Bursa cloacalis beurteilt.
Weiterhin wurde der Einfluss der maternalen Restantikörper auf die Stabilität des
Impfvirusgenoms untersucht. Dazu wurde Impfvirus-RNA an verschiedenen Tagen nach Impfung aus der Bursa geimpfter Tiere beider Nutzungsrichtungen isoliert und ein 743 bp großer Bereich des für die variable Region von VP2 kodierenden Genomabschnitts amplifiziert. Die Sequenzen dieser PCR-Produkte wurden mit den Sequenzen der ursprünglichen Vakzine verglichen.
3 Material und Methoden
3.1 Tiere
Es wurden Eier von spezifiziert-pathogen-freien (SPF) Hühnern vom Legetyp (Valo®LSL-LITE; Firma Lohmann Tierzucht GmbH, Cuxhaven) bezogen und im klinikeigenen Brutschrank (Firma Grumbach, Asslar) bei 37,8-38,0°C und 55-60%
relativer Luftfeuchte (SCHOLTYSSEK 1968) bebrütet. Drei Tage vor Schlupf wurden die Eier mit einer Schierlampe auf Vitalität untersucht und in den Schlupfbrüter bei 36,8-37,0°C und 80% relativer Luftfeuchte umgelegt (SCHOLTYSSEK 1968). Die Küken wurden am ersten Lebenstag in Isolierställe der Klinik verbracht.
Das Freisein der SPF-Eier von bestimmten Erregern bzw. Antikörpern wird garantiert (siehe Anhang).
Kommerzielle Broiler vom Ross-Typ wurden als Eintagsküken von der Brüterei Weser- Ems GmbH & Co KG (Visbek) bezogen und in Isolationseinheiten der Klinik eingestallt.
In dem Tierhaus der Klinik stehen mehrere isolierte Stalleinheiten zur Verfügung, welche mit Überdrucklüftung betrieben werden und separate Eingänge besitzen. Die Einheiten können von außen durch Fenster eingesehen werden, ohne dass sie betreten werden müssen. Die Stalltemperatur, die Beleuchtungsdauer und die Lichtintensität wurden zentral geregelt und waren in allen Isolationseinheiten gleich.
Die SPF-Tiere wurden mit dem Legehennenfutter all-mash L (Firma Deuka) gefüttert.
Die Broiler erhielten Kükenmastfutter, in den ersten Tagen Landkornstarter (Firma Deuka), dann Landkornmast (Firma Deuka). Das Futter und Wasser aus Stülptränken stand den Tieren über den gesamten Versuchszeitraum ad libitum zur Verfügung.
Die Tiere wurden täglich kontrolliert.
3.2 Virusstämme
Bei dem verwendeten Impfstamm handelte es sich um eine kommerziell erhältliche IBDV-Vakzine von intermediärer Virulenz. Eine Dosis enthielt 103,0 Ei-infektiöse Dosen (EID)50.Jedes zu impfende Tier erhielt eine Dosis in 100 µl Aqua bidest. oral.
Die Belastungsinfektion wurde mit vvIBDV, Stamm 89163/7.3 (bereitgestellt durch N.
Eterradossi, AFSSA, Ploufragan; ETERRADOSSI et al. 1992) durchgeführt. Dabei erhielt jedes Tier 104 EID50 durch Augentropfen.
Für den Virusneutralisationstest wurde der IBDV-Stamm Bursine 2 Poulvac (Fort Dodge) mit 200 tissue culture infectious doses (TCID)50/well verwendet.
3.2.1 Titration von Impfvirus
Die Titration von Impfvirus zur Bestätigung der Angaben des Herstellers fand in 10 Tage bebrüteten embryonierten SPF-Hühnereiern statt (ROSENBERGER et al. 1998).
Dabei wurde der lyophilisierte Impfstoff in 2 ml PBS aufgenommen und in einer zehnfachen Verdünnungsreihe verdünnt. Pro Verdünnungsstufe wurden sechs embryonierte Hühnereier inokuliert. Von dem verdünnten Impfstoff wurden jeweils 100 µl mit einer sterilen Spritze auf die Chorioallantoismembran (CAM) des embryonierten Eies gegeben. Sechs weitere Eier erhielten als Kontrolle 100 µl PBS in gleicher Art und Weise.
Die inokulierten Eier wurden sieben weitere Tage bebrütet, jeden Tag geschiert, die abgestorbenen Eier eröffnet und auf pathologische Veränderungen untersucht. Am siebten Tag nach Inokulation wurden auch die nicht abgestorbenen Eier eröffnet. Dabei wurde insbesondere auf folgende Veränderungen geachtet:
Embryo
• abdominale Ödeme
• petechiale Blutungen in der Haut
• Leber: blass/ockerfarben, petechiale Blutungen
• Milz: blass, Nekrosen
Chorioallantoismembran (CAM)
• petechiale Blutungen
Zur Bestimmung der EID50 wurde die Formel von REED und MUENCH (1938) verwendet. Die unspezifisch abgestorbenen Embryonen der ersten 24 Stunden nach Inokulation wurden nicht mit einbezogen. Es wurden zunächst die beiden Verdünnungsstufen bestimmt, zwischen denen der 50%-Wert an infizierten Eiern zu finden war. Dann wurde der Index wie folgt berechnet:
gsstufe Verdünnun hsthöheren
%-Wert näc r zum
Eier in de ierter
- % infiz
e nnungsstuf eren Verdü
hstniedrig
%-Wert näc n der zum
ter Eier i
% infizier
% e - nnungsstuf eren Verdü
hstniedrig
%-Wert näc n der zum
ter Eier i
% infizier
50 50
50 50
Der Index wurde als negativer Exponent zu der zum 50%-Wert nächstniedrigeren Verdünnungsstufe hinzugerechnet. Die EID50 ist dann der Kehrwert dieser Verdünnung.
3.2.2 Vermehrung und Titration von vvIBDV
Der vvIBDV Stamm wurde durch Inokulation (103 Ei-letale Dosen (ELD)50/ Tier als Augentropfen) in fünf Wochen alten SPF-Hühnern vermehrt. Die Tiere verstarben innerhalb von 72 Stunden nach Infektion oder wurden aus Tierschutzgründen getötet.
Die Bursae cloacales der Tiere wurden entnommen und homogenisiert. Drei Einfrier- und Auftauzyklen wurden durchgeführt und das Homogenat wurde abzentrifugiert. Der Überstand wurde gepoolt, zu je 1 ml aliquotiert und bis zur weiteren Verwendung bei -70°C gelagert.
Die Titration von vvIBDV wurde analog zu der Titration des Impfvirus (s.o.) durchgeführt.
3.3 Untersuchungsmethoden
3.3.1 Serologische Untersuchungsmethoden 3.3.1.1 Blutentnahme und Serumgewinnung
Die Blutentnahme erfolgte mit einer auf eine sterile Einmalspritze (1 ml) aufgesetzten sterilen Einmalkanüle aus der Flügelvene (Vena basilica).
Das Vollblut wurde eine Stunde bei 37°C inkubiert und dann für 10 Minuten mit 3500g zentrifugiert. Das Serum wurde abpipettiert, in sterile Reaktionsgefäße überführt und bei -20°C gelagert.
3.3.1.2 Enzyme-linked immunosorbent Assay (ELISA)
Die Detektion von IBDV-Antikörpern erfolgte mit dem kommerziell erhältlichen IBDV-Antikörper-Testkit ProFlok®Plus (Firma Synbiotics, San Diego, USA).
Der Test wurde nach Herstellerangaben durchgeführt. Das zu untersuchende Serum wurde 1:100 verdünnt und auf der Testplatte für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert, sodass die IBDV-Antikörper an die mit viralem Antigen beschichtete Platte binden konnten. Parallel zu den zu untersuchenden Proben wurden die mitgelieferten Positiv- und Negativkontrollen aufgetragen. Nach mehreren Waschschritten wurde der zweite, mit dem Enzym Peroxidase gekoppelte Antikörper (Konjugat) auf die Platte gegeben.
Nach der vorgeschriebenen Inkubationszeit von 30 min bei Raumtemperatur und wiederum mehreren Waschschritten wurde das Substrat ABTS zugegeben, das im Falle einer positiven Serumprobe von dem Enzym zu einem Farbstoff umgesetzt wurde.
Dieser Farbumschlag wurde nach 15 min mittels OD-Wertmessung bei einer Wellenlänge von 405 nm mit einem Spektrometer (ICN Flow Titertek Multiscan Plus) quantifiziert.
Die Auswertung wurde mit dem Programm ProFile (Synbiotics) durchgeführt.
Erst wurde die korrigierte Positivkontrolle berechnet:
Extinktion (Mittelwert Positivkontrolle - Mittelwert Negativkontrolle) = korrigierte Positivkontrolle
Die Titerberechnung erfolgte dann nach folgenden Formeln:
Extinktion (Serumprobe - Mittelwert Negativkontrolle) / korrigierte Positivkontrolle = SP Wert
Log10 Titer = 1,172 * (Log10 SP Wert) + 3,614 Titer = Antilog10 (1,172 * (Log10 SP Wert) + 3,614)
Unterschritt der SP Wert einer Serumprobe den vom Hersteller angegebenen cut off von 0,299, erhielt der Titer den Wert 0, das heißt, die Probe wurde als negativ angesehen.
3.3.1.3 Virusneutralisationstest
Durch den virusneutralisierenden Effekt der Antikörper lässt sich mit dem Virusneutralisationstest feststellen, ob ein Serum Antikörper enthält. Mit der Verwendung einer konstanten Virusmenge pro Volumeneinheit und einer Serumverdünnungsreihe wird der Antikörpergehalt quantifizierbar.
Bei Durchführung des Virusneutralisationstestes wurde sich an der in „A Laboratory Manual for the Isolation and Identification of Avian Pathogens“ beschriebenen Methode orientiert (ROSENBERGER et al. 1998). Zunächst wurde eine Verdünnungsplatte erstellt. Hierbei wurde für jedes Serum eine Serumverdünnungsreihe mit dem Verdünnungsfaktor 2 erzeugt und mit dem gleichen Volumenanteil einer auf 200 tissue culture infectious doses (TCID)50/well eingestellten Suspension des Virus Bursine 2 gemischt und eine Stunde bei 37°C inkubiert.
Dann wurde das Serum-Virusgemisch in jeweils zweifachem oder vierfachem Ansatz auf eine mit primären Hühnerembryofibroblasten bewachsene 96-well-
Mikrotitrationsplatte gegeben und in einem Brutschrank bei 37°C inkubiert. Ab dem dritten Tag nach Inokulation fand eine tägliche Kontrolle der Zellen auf einen zytopathischen Effekt (ZPE) statt und die Ergebnisse wurden notiert. Hierbei wurde die höchste Serumverdünnungsstufe ermittelt, bei der noch 50% der Zellen geschützt sind.
Der Antikörpertiter ergab sich aus dem reziproken Wert der Virusverdünnung.
3.3.2 Pathologisch-anatomische Untersuchungen nach Impfung und nach Belastungsinfektion
Nach Betäubung durch einen Schlag auf den Kopf wurden die Tiere durch Durchtrennen der Arteria carotis communis und nachfolgendes Ausbluten getötet. Das Blut wurde für serologische Untersuchungen aufgefangen. Die Tiere wurden gewogen, auf dem Sektionstisch in Rückenlage gebracht und eröffnet. Es wurden alle pathologischen Abweichungen an den Organen vermerkt.
Insbesondere wurde dabei auf Veränderungen an der Bursa cloacalis und der Milz geachtet, die typischerweise von IBDV hervorgerufen werden:
Tabelle 1: Mögliche pathologische Veränderungen nach IBDV-Infektion
Bursa cloacalis Ödem und Hypertrophie, gelatinöses Transsudat auf der Oberfläche, purulentes Exsudat im Organlumen, petechiale Blutungen, Hämorrhagien; später im Infektionsverlauf Atrophie
Milz kleine graue Foci auf der Organoberfläche und im Anschnitt (marmoriert)
Muskulatur petechiale Blutungen
Im Anschluss an die pathologisch-anatomische Untersuchung wurden Bursa cloacalis, Milz und Zäkaltonsillen entnommen. Es erfolgte die Bestimmung des Bursa- Körpergewichtsverhältnis nach folgender Formel (CHEVILLE 1967):
(Bursagewicht [g]/Gewicht des Tierkörpers [g]) x 1000
Das Milz-Körpergewichtsverhältnis wurde analog berechnet.
3.3.3 Histologische Untersuchung
Von jedem Tier wurde ein Stück der Bursa cloacalis und der Milz sowie die Zäkaltonsillen in jeweils eine Kunststoff-Histokassette sortiert und in ein braunes Becherglas mit zehnprozentiger neutral gepufferter Formalinlösung verbracht und mindestens 24 Stunden bei 4°C fixiert.
Die fixierten Organe wurden mindestens 10 Stunden gewässert, anschließend wurde das Formalin in dem Gewebe der Organe in einer aufsteigenden Isopropanol- und Acetonreihe (Shandon Citadel 1000, Isopropanol 50%, -70%, -80%, -90%, zweimal Isopropanol 100%, zweimal Isopropanol/Aceton 50% / 50%, zweimal Aceton 100%, zweimal Paraffin) durch Paraffin ersetzt. Die Organe wurden in der Eingießstation (Shandon Histocenter) in flüssiges Paraffin eingebettet und abgekühlt, sodass eine Blockform entstand und Organquerschnitte angefertigt werden konnten. Mit einem Schlittenmikrotom (Auto Cut, Firma Reichert & Jung) wurden Schnitte von 3 µm Dicke hergestellt, im Wasserbad geglättet, auf einen Objektträger gezogen und getrocknet.
Anschließend wurde, wie in Tabelle 3 dargestellt, eine Hämalaun-Eosin-Färbung (Shandon Varistain 24-2) durchgeführt.
Die gefärbten Schnitte wurden unter einem Lichtmikroskop (Leica DM LB) beurteilt, wobei jeweils 100 Bursafollikel ausgezählt wurden. Dabei wurde der prozentuale Anteil der Bursafollikel berechnet, die eine Depletion lymphoider Zellen aufwiesen und mit Hilfe eines Scoring-Systems bewertet (KIM et al. 1999; SHARMA et al. 1989).
Weiterhin wurde das Vorkommen von heterophilen Granulozyten sowie von Zysten und Vakuolen in den Follikeln vermerkt
Tabelle 2: Scoring-System zur Beurteilung der Bursaläsionen
Score Prozent der Bursafollikel mit Zelldepletion
0 0 1 1-25 2 26-50 3 51-75 4 76-100
Tabelle 3: Protokoll zur Färbung der histologischen Präparate
Chemikalie Dauer in Minuten
N-Butylacetat 10 N-Butylacetat 10
Isopropanol 100% 5
Isopropanol 96% 5
Isopropanol 70% 5
Isopropanol 50% 5
bidestilliertes Wasser 5
Meyers Hämalaun Gebrauchslösung 10
fließendes Leitungswasser 10
bidestilliertes Wasser 2
Eosin Gebrauchslösung 10
bidestilliertes Wasser 0.5
bidestilliertes Wasser 0,5
Isopropanol 70% 0,5
Isopropanol 96% 2
Isopropanol 100% 2
N-Butylacetat 10
3.3.4 Immunhistochemische Detektion von IBDV-Antigen in histologischen Präparaten von Bursa, Milz und Zäkaltonsillen
Die Histologischen Schnitte von Bursa, Milz und Zäkaltonsillen wurden wie unter 3.3.3 beschrieben hergestellt.
Vor dem Deparaffinisieren kamen die Objektträger (Superfrost®/Plus, Firma Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe) mit den Organpräparaten für zwei Stunden bei 60°C in einen Trockenschrank, um später einen besseren Halt der Organe auf dem Objektträger zu gewährleisten. In einer absteigenden Xylol- und Isopropanolreihe wurde aus den histologischen Schnitten das Paraffin entfernt.
Die Detektion des IBDV-Antigens erfolgte mit einem polyklonalem Anti-IBDV- Kaninchenserum, das zuvor mit dem Virus Bursine 2 an der Klinik hergestellt worden war (TSUKAMOTO et al. 1995a).
Die immunhistochemische Färbung wurde mit dem kommerziell erhältlichen Vectastain Universal Elite ABC Kit (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, USA) nach Herstellerangaben durchgeführt. Das Prinzip dieses Kits beruht auf der hohen Affinität des Glykoproteins Avidin zu dem Vitamin Biotin, die um mehrere Zehnerpotenzen höher ist, als die Affinität von den meisten Antikörpern zu den entsprechenden Antigenen. Nach Inkubation der Schnitte mit dem ersten Kaninchen-anti-IBDV- Antikörper erfolgte die Zugabe des zweiten biotingekoppelten Anti-Kaninchen- Antikörpers und nach weiterer Inkubationszeit die Zugabe von avidingekoppeltem Enzym, das dann das Substrat 3,3’-diaminobenzidine (DAB Substrate Kit, Vector Laboratories, Inc., Burlingame, USA) umsetzte und so zu einer Farbreaktion der virusenthaltenden Zellen führte. Diese Farbreaktion wurde dann lichtmikroskopisch quantifiziert. Dazu wurden pro Organprobe bei 400facher Vergrößerung in zehn Gesichtsfeldern die IBDV-positiven Zellen gezählt und anschließend der Mittelwert an IBDV-positiven Zellen/Gesichtsfeld und Organ gebildet.
Die einzelnen Schritte dieser Technik sind in Tabelle 4 aufgelistet.
Tabelle 4: Protokoll zur immunhistochemischen Detektion von IBDV-Antigen
Vorgang Material, Durchführung
Deparaffinisierung absteigende Xylol- und Isopropanolreihe Unterbindung endogener
Peroxidaseaktivität in den Organen
in 3%iger Wasserstoffperoxidlösung für 15 min
Waschen 2 x 5 min in PBS
Blockieren der unspezifischen Bindungsstellen
Blocking Serum (450 µl/Schnitt) für 20 min
Detektion von IBDV polyklonales Anti-IBDV-Kaninchenserum (450 µl/Schnitt, Verdünnung 1:8000) für 60 min bei 37°C
Waschen 2 x 5 min in PBS
Detektion des 1.Antikörpers biotingekoppelter 2.Antikörper (450 µl/Schnitt) für 30 min bei Raumtemperatur
Waschen 2 x 5 min PBS
Markierung des 2. Antikörpers Vectastain ABC-Reagenz (450 µl/Schnitt) für 30 min
Waschen 2 x 5 min PBS
Färbung DAB (Diaminobenzidin
Tetrahydrochlorid; Vector Laboratories, Inc., Burlingame, USA; 450 µl/Schnitt) für 3-4 min
Waschen 2 x 5 min PBS
Gegenfärbung in MAYERs Hämalaun Gebrauchslösung
für 30 sek.
Entfärben fließendes Leitungswasser für 10 min
Eindeckeln Aquatex (Merck) und Deckglas
3.3.5 IBD Antigen-Capture-ELISA
Der Nachweis des viralen Antigens erfolgte aus Organhomogenisat der Bursa und der Milz. Dazu wurde das kommerziell erhältliche Kit IBD AC-ELISA der Firma Synbiotics (IBD Screening Plates Pack und Reagent Pack) verwendet. Es wurde nach Herstellerangaben vorgegangen.
Das Organhomogenisat wurde in der gleichen Menge Antigen-Verdünnungspuffer aufgenommen, drei Einfrier- und Auftauzyklen unterzogen und zentrifugiert, der Überstand 1:25 verdünnt und zur Inkubation auf die antikörperbeschichtete Testplatte gegeben. Nach 12 bis 16 Stunden bei 4°C wurde die Platte dreimal gewaschen, in dieser Reihenfolge das IBD Positive Serum, Konjugat, Substrat und Stopplösung, jeweils unterbrochen von Waschschritten, dazugegeben und die Testplatte schließlich bei 405 nm ausgelesen (Spektrometer ICN Flow Titertek Multiscan Plus, Zoetermeer, Niederlande).
Der Test konnte ausgewertet werden, wenn die Positivkontrolle einen OD-Wert ≥ 0,600 und die Negativkontrolle einen OD-Wert ≤ 0,300 aufwies. Die erhaltenen OD-Werte der zu untersuchenden Proben wurden dann wie in Tabelle 5 dargestellt interpretiert.
Tabelle 5: Interpretation der OD-Werte des IBDV-Antigen-ELISA OD ≥ 0,600 IBD-positive Probe
0,300 < OD < 0,600 unklares Ergebnis OD ≤ 0,300 IBD-negative Probe
3.3.6 Virus-RNA-Isolierung
Die IBD-Virus-RNA-Isolierung wurde mit dem Purescript Zell & Gewebe Kit (Gentra Systems, Inc., Minneapolis, USA) nach Herstellerangaben durchgeführt. Dabei wurden ca. 10 mg Gewebe der Bursa cloacalis in ein Reaktionsgefäß (1,5 ml) mit 300 µl Cell Lysis Solution verbracht und das Gewebe mit einem Einwegpistill homogenisiert. Nach der Ausfällung der Proteine und der DNA mittels Protein-DNA-Precipitation-Solution
für 5 min auf Eis wurde das Präzipitat bei 16.000g für 3 min abzentrifugiert. Aus dem Überstand wurde die RNA durch Zugabe von 100%igem Isopropanol ausgefällt. Nach einem weiteren Zentrifugationsschritt wurde das RNA-Pellet mit 70%igem Ethanol gewaschen, 15 min getrocknet und schließlich in 50 µl RNAse freiem Wasser (Firma Sigma-Aldrich) aufgenommen. Die Virus-RNA wurde bei -70°C gelagert.
3.3.7 Nachweis von IBDV-Genom mittels RT-PCR (Reverse Transcription- Polymerase Chain Reaction)
Die Polymerasekettenreaktion ist eine Methode, um DNA-Sequenzen zu amplifizieren.
Sie besteht aus der fortwährenden Wiederholung von drei aufeinander folgenden Temperaturschritten. Zuerst wird der DNA-Doppelstrang durch den Denaturierungschritt bei ~94°C getrennt, dann lagern sich in dem Annealingschritt bei
~55°C Oligonucleotidprimer, die speziell für den zu untersuchenden Genabschnitt hergestellt wurden, an die entstandenen Einzelstränge an. Im Elongationsschritt bei
~72°C werden die beiden Primer nun durch die Taq-Polymerase verlängert, sodass wieder doppelsträngige DNA-Moleküle entstehen, die Kopien der Ausgangs-DNA darstellen. Weil die Komplementierung an beiden Strängen der Ausgangs-DNA stattfindet, wird in einem Zyklus dieser drei Temperaturschritte die Anzahl der Ziel- DNA-Moleküle verdoppelt, sodass daraus bereits nach wenigen Zyklen eine millionenfache Vervielfältigung des gewünschten DNA-Fragments resultiert.
Als reverse Transkription bezeichnet man das Umschreiben von RNA in DNA mittels des Enzyms Reverse Transkriptase.
Die reverse Transkription der isolierten Virus-RNA und die Polymerasekettenreaktion (PCR) erfolgte in einem Schritt mit dem kommerziell erhältlichen Kit SuperScriptTM III One-Step RT-PCR System with Platinum Taq DNA Polymerase (Invitrogen, Carlsbad, USA). Die RT-PCR wurde mit einem 50 µl-Ansatz durchgeführt. Dazu wurden je Probe zu 49 µl Mastermix 1 µl isolierte RNA pipettiert. Bei jedem Durchlauf wurden eine Negativ- und eine Positivkontrolle mitamplifiziert. Die RNA der Positivkontrolle stammte aus der Bursa eines Huhnes, das mit IBDV infiziert war, die Negativkontrolle bestand aus 49 µl Mastermix und 1 µl RNAse freiem Wasser.
Tabelle 6: Zusammensetzung des Mastermixes
Reagenz Konzentration Volumen
2X Reaction Mix, enthält: 25 µl
PCR-Puffer 2-fach
dNTP 0,4 mM je Nukleotid
MgSO4 3,2 mM
sense primer 10 µM 1 µl
antisense primer 10 µM 1 µl
Superscript III RT/Platinum Taq Mix
2 µl
RNAse freies Wasser 20 µl
Der sense primer (5'-GGC CCA GAG TCT ACA CCA TAA C-3') und der antisense primer (5'-CCG GAT TAT GTC TTT GAA GCC-3') flankierten ein PCR-Produkt von 743 Basenpaaren Länge (JACKWOOD u. SOMMER 1997).
Die Proben wurden in dem Thermocycler PTC-200 (MJ Research Inc., Watertown, USA) mit in Tabelle 7 aufgeführtem Programm amplifiziert.
Tabelle 7: RT-PCR Programm
Vorgang Temperatur Dauer
1. Reverse Transkription 55°C 30 min
2. initiale Denaturierung 94°C 2 min
3. Denaturierung 94°C 15 sek.
4. Annealing 57°C 30 sek.
5. Elongation 68°C 1,5 min
6. 37x zu Schritt 3
7. finale Elongation 68°C 5 min
8. Kühlung 8°C bis zur Entnahme
3.3.8 Agarosegel-Elektrophorese der PCR-Produkte
Das Prinzip der Gelelektrophorese beruht auf der unterschiedlichen Wandergeschwindigkeit von DNA-Fragmenten entsprechend ihrer Größe in einem elektrischen Feld. Durch den Farbstoff Ethidiumbromid werden die DNA-Banden im Gel unter UV-Licht sichtbar gemacht.
Es wurden je 10 µl PCR-Produkt mit 3 µl Ladepuffer (Bromphenolblau-Sucrose) gemischt und in die Taschen eines 1,8%igen Agarosegels (SeaKem® LE Agarose, Cambrex Bioscience Rockland Inc., Rockland, USA) pipettiert. Auf jedem Gel wurde die weiter oben beschriebene Negativ- und Positivkontrolle sowie ein DNA-Marker (1Kb Plus DNA Ladder, Invitrogen) mitlaufen gelassen. Benutzt wurde das Gelelektrophoresegerät 200/2.0 Power Supply (Bio-Rad, USA) bei 67 Volt für 8 Zeiteinheiten (entspricht 48 min), als Elektrophoresepuffer wurde Tris-Acetat-EDTA (TAE) verwendet.
Die Färbung der DNA-Banden erfolgte in Ethidiumbromidlösung (0,5 µg/ml) für 20 min, danach wurde das Gel zur Kontrasterhöhung für 5 min gewässert und dann auf einen UV-Transilluminator (Intas, Göttingen) gelegt und unter UV-Licht betrachtet.
Dabei wurden nur die Agarosegele ausgewertet bei denen keine Amplifikate in der Negativkontrolle und die Bande der Positivkontrolle bei ~700 bp zu sehen waren. Die angefärbten DNA-Banden der Proben mussten auf gleicher Höhe wie das Amplifikat der Positivkontrolle sein.
Die Ergebnisse wurden notiert und das Agarosegel wurde gegebenenfalls fotografiert.
3.3.9 Spektroskopische Bestimmung der DNA-Konzentration
Die PCR-Produkte wurden mit dem QIAquick® PCR Purification Kit (Qiagen, Hilden) nach Herstellerangaben gereinigt und die DNA-Konzentration ermittelt.
Dazu wurde die optische Dichte (OD) mit einem Spektralphotometer (GeneQuant pro RNA/DNA Calculator, Amersham Biosciences, Cambridge, UK) bei einer Wellenlänge von 260 und 280 nm gemessen. Die Messung wurde mit einem Probenvolumen von 70 µl in einer Quarzküvette mit einem Zentimeter Durchmesser durchgeführt. Zuvor
wurde die DNA-Präparation 1:10 mit Aqua bidest. verdünnt.
Für DNA liegt das Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von 260 nm.
Zuverlässige Ergebnisse bekommt man nur bei OD-Werten zwischen 0,1 und 1, ein OD-Wert von 1 entspricht dabei einer DNA-Konzentration von 50 µg/ml.
3.3.10 Sequenzierung der PCR-Produkte
Es wurden 30 ng DNA/100 Basen in 20 µl Tris-HCl (5 mM) in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß aufgenommen, die DNA-Konzentration der PCR-Produkte wurde wie weiter oben beschrieben bestimmt. Weiterhin wurden ca. 20 µl des sense primer (5'-GC CCA GAG TCT ACA CCA TAA C-3') mit einer Konzentration von 10 pmol/µl in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß verbracht.
Die Reaktionsgefäße wurden in einem gepolsterten Umschlag zu der Firma MWG- Biotech AG (Ebersberg) gesendet, wo die Sequenzierung durchgeführt wurde.
Die Ergebnisse wurden mit dem Freeware-Programm Genedoc (http://www.psc.edu/biomed/genedoc) bearbeitet.
3.3.11 Klonierung von PCR-Produkten 3.3.11.1 TOPO-Klonierung
Einige PCR-Produkte wurden vor der Sequenzierung erst in einen Plasmidvektor einkloniert. Dazu wurde das TOPO TA Cloning® Kit (Invitrogen, Carlsbad, USA) verwendet. Bei der TOPO-Klonierungsreaktion wird die Ligationsaktivität der Topoisomerase I aus Vaccinia virus genutzt, die durch den „aktivierten“ Vektor pCR®4- TOPO® bereitgestellt wird. In einer Ligationszeit von nur fünf Minuten verbindet sich der Plasmidvektor mit dem PCR-Produkt, das einen 3’-A-Überhang besitzen muss, was bei mittels Taq-Polymerase amplifizierten PCR-Produkten der Fall ist. Das Ligationsprodukt kann direkt in kompetente E. coli transformiert werden.
Die Klonierungsreaktion wurde nach dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Dazu wurden 2 µl PCR-Produkt mit 1 µl Puffer, 2 µl steriles Wasser und 1 µl TOPO-Vektor vermischt und für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert.
3.3.11.2 Transformation
Zur Transformation wurden One Shot® Top10 chemisch kompetente E. coli (Invitrogen, Carlsbad, USA) verwendet. Es wurde nach dem Rapid One Shot® Chemical Transformation Protocol vorgegangen. Dabei wurden 4 µl der Klonierungsreaktion in das 1,5 ml Reaktionsgefäß mit den chemisch kompetenten E. coli gegeben und vorsichtig vermischt. Es folgte ein Inkubationsschritt für 5 min auf Eis. Dann wurden je 50 µl auf eine vorgewärmte Lennox L Agar-Platte (LB-Platte; Invitrogen, Carlsbad, USA) mit 100 µg/ml Ampicillin gegeben und mit einem Drigalskispatel gleichmäßig verteilt. Die Platten wurden bei 37°C über Nacht inkubiert. Am nächsten Tag wurden zehn Kolonien entnommen und in je 5 ml LB-Bouillon (Invitrogen, Carlsbad, USA) mit 100 µg/ml Ampicillin in einem Schüttelinkubator (GFL, Burgwedel) über Nacht inkubiert.
3.3.11.3 Plasmid-Isolierung
Die Bakteriensuspension wurde bei 3500g für 5 min zentrifugiert und der Überstand verworfen. Die Plasmidisolierung aus dem Bakterienpellet wurde mit einem kommerziellen Purifikationskit (QIAprep Spin Miniprep Kit, Qiagen, Hilden) durchgeführt, dabei wurde nach Herstellerangaben vorgegangen. Das Bakterienpellet wurde in Puffer 1 resuspendiert. Nach Zugabe von Puffer 2 zur Zelllysis und Puffer 3 zur Denaturierung der Zellproteine fand ein Zentrifugationsschritt für 10 min bei 18.000g statt. Der Überstand wurde auf die Mini-Säule gegeben und für 60 sek. bei 18.000g zentrifugiert, was zu einer Bindung der Plasmide an die Silica-Matrix der Säule führte. Der Durchfluss wurde verworfen. Nach einem Waschschritt wurden die Plasmide schließlich mit 50 µl sterilem Wasser eluiert.
3.3.11.4 Spaltung der Plasmide mittels Restriktionsenzym
Die Plasmide wurden mit einem Restriktionsenzym verdaut, um den Erfolg der Klonierung nachzuweisen. Als Enzym wurde EcoRI verwendet. Das Plasmid besitzt zwei Schnittstellen für EcoRI in der Nähe der Klonierungsstelle (cloning site). Es wurden 4 µl Plasmid, 2 µl Puffer H (Roche, Basel, Schweiz), 0,25 µl Restriktionsenzym EcoRI (10 U/µl; Roche) und 13,75 µl steriles Wasser zusammen pipettiert und für zwei Stunden bei 37°C inkubiert. Der Verdau wurde dann auf ein Agarosegel geladen und die DNA-Stücke mittels Gelelektrophorese (s.o.) ihrer Größe nach aufgetrennt. Nach dem Sichtbarmachen der DNA-Banden mittels Ethidiumbromidfärbung und Betrachtung unter UV-Licht konnten bei den erfolgreich klonierten Plasmiden mit insert zwei Banden, eine bei ~4000 bp und eine bei ~700 bp, nachgewiesen werden.
3.3.11.5 Sequenzierung der klonierten Plasmide
Zur Sequenzierung wurden nur die Plasmide verwendet, bei denen mittels Restriktionsverdau ein insert nachgewiesen wurde. Die DNA-Konzentration der Plasmide wurde wie weiter oben beschrieben mittels Spektralphotometer bestimmt.
Danach wurde die Plasmidkonzentration auf 0,1 µg/µl eingestellt und die Reaktionsgefäße mit den Plasmiden in einem gepolsterten Umschlag zu der Firma MWG- Biotech AG (Ebersberg) gesendet, wo die Sequenzierung durchgeführt wurde.
Zur Sequenzierung wurde der bei MWG vorrätige Primer T3 verwendet.
Die Ergebnisse wurden mit dem Freeware-Programm Genedoc (http://www.psc.edu/biomed/genedoc) bearbeitet.
