der Medizinischen Hochschule Hannover
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Dissertation
Zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin
in der
Medizinischen Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Maximilian Wilhelm Horst Knöner aus Hameln
Hannover 2012
Gedruckt mit der Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover
Präsident: Prof. Dr. med. Dieter Bitter Suermann
Betreuer: Prof. Dr. rer. nat. Ulrich Lehmann Mühlenhoff Referent: Prof. Dr. med. Arnd Vogel
Korreferent: PD Dr. rer. nat. Nils Freiherr von Neuhoff
Tag der mündlichen Prüfung: 4.12.2012
Promotionsausschussmitglieder: Prof. Dr. med. Hans Heinrich Kreipe Prof. Dr. med. Sebastian Suerbaum Prof. Dr. med. Matthias Eder
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1.1. Epidemiologie des Magenkarzinoms 6
1.2. Ätiologie 7
1.3. Pathogenese 10
1.4. Klassifikation 12
1.5. Prognose und Prognosefaktoren 16
1.6. Familie der Tetraspanine und ihr Mitglied KAI1/CD82 18
1.7. Die Bedeutung von KAI1/CD82 in der Karzinogenese 19
1.8. Klinisch pathologische Bedeutung von KAI1/CD82 im Magenkarzinom 20
2.0. Fragestellung und Ziele 23
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2.1. Patienten 24
2.2. Tumormultiblöcke 26
2.3. KAI1 Immunhistochemie 27
2.5. Statistische Datenauswertung und Überlebenszeitanalyse 30
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3.1. Charakterisierung des Untersuchungskollektives 31
3.2. Assoziation von KAI1 mit klinisch pathologischen Parametern 35 3.3. Zusammenhang von KAI1 Immunoreaktivität und Gesamtüberleben 37
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8.1. Abkürzungsverzeichnis 59
8.2. Curriculum Vitae 60
8.3. Publikation 61
8.4. Danksagung 62
8.5. Erklärung nach § 2 Abs. 2 Nrn. 6 und 7 der Promotionsordnung der 63
Medizinischen Hochschule Hannover 63
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Das Magenkarzinom ist nach Lungen , Brust und Kolontumoren die vierthäufigste maligne Neoplasie weltweit (1). Seit 1985 ist die altersstandardisierte Inzidenz für Magenkarzinom weltweit um zirka 17% gesunken (2). Obwohl die Inzidenz und die Mortalität in den letzten Dekaden weltweit kontinuierlich rückläufig ist (3 6) liegt das Magenkarzinom hinter dem Lungenkarzinom an zweiter Stelle der malginombedingten Todesursachen (1, 7 ,8).
Die Häufigkeit des Magenkarzinoms unterliegt regionalen Unterschieden. Als Hochrisikoländer gelten Japan, China, Korea und Teile von Mittel und Südamerika (1). Mit der weltweit höchsten Inzidenzrate erkranken in Japan jährlich 60/100000 Einwohner. Im Vergleich dazu erkranken nur 8 weiße Amerikaner in den USA auf 100000 Einwohner (9, 10, 11). Für Japaner, die aus ihrem Hochrisikoheimatland in die USA emigrieren, nimmt das Gesamtrisiko, abhängig vom Alter bei der Einwanderung, an einem Magenkarzinom zu erkranken, geringfügig ab (9). Für deren Nachfolgegeneration in den USA verringert sich das Erkrankungsrisiko jedoch deutlich. Dennoch besteht für Sie immer noch ein im Vergleich zu den weißen Amerikanern erhöhtes Risiko, an einem Magenkarzinom zu erkranken (10). Nach Kolonel et al. ist die Ernährung als potentieller exogener Faktor hierfür eine mögliche Erklärung (11).
Man findet auch innerhalb Europas deutliche Unterschiede in der Inzidenz des Magenkarzinoms.
Die altersstandardisierte Inzidenzrate ist in Ost und Südeuropa höher als in Nord und Westeuropa (1). In Deutschland liegt die geschätzte altersstandardisierte Inzidenz bei 11 22/100000 (12). Zwischen 2002 und 2003 erkankten in Deutschland jährlich zirka 18800 Menschen an einem Magenkarzinom, die Mehrzahl von Ihnen waren Männer (12). Das mediane Erkrankungsalter liegt in Deutschland für Männer bei 70 Jahren und für Frauen bei 75 Jahren (12).
Im Vergleich zu den westlichen Ländern erkranken Japaner mit 59 Jahren im Durchschnitt 10 Jahre früher (13). Weltweit haben Männer gegenüber Frauen ein 1,5 2,5 erhöhtes Risiko an Magenkarzinom zu erkranken (9, 14). Trotz der insgesamt weltweit abnehmenden Inzidenz des
Magenkarzinoms nimmt die Inzidenz für Karzinome im Bereich der Magenkardia und des distalen Ösophagus besonders in den entwickelten Ländern zu (15 22). In 30% der Fälle befindet sich das Magenkarzinom im oberen Drittel des Magens (23). Gleichzeitig nimmt die Inzidenz der distalen Magenkarzinome ab. Ursächlich hierfür ist die Abnahme der Helicobacter pylori Infektion (24, 25) und einer ausgewogenen Ernährung mit einem hohen Anteil an Gemüse und Obst (16, 26). Damit kann nicht der Anstieg der proximalen Adenokarzinome erklärt werden. Hierfür werden unterschiedliche Hypothesen diskutiert (16). Chow et al. stellten fest, dass Fettleibigkeit und chronische gastroösophageale Refluxkrankheit starke unabhängige Risikofaktoren für das proximale Magenkarzinom sind und zu deren steigenden Inzidenz beitragen (27, 28).
In epidemiologischen Studien wurde gezeigt, dass das proximale Magenkarzinom mit einer schlechteren Prognose, einer weißen Hautfarbe, einer höheren sozioökonomischen Schicht, dem männlichen Geschlecht, jüngeren Menschen und dem intestinalen Typ nach Laurén assoziiert ist (16, 23, 29). Das distale Magenkarzinom ist mit einer niedrigen sozioökonomischen Schicht, einer schwarzen Hautfarbe assoziiert und tritt häufiger in entwickelten Ländern auf (23). Betrachtet man alleine die Inzidenzrate für Magenkarzinome, so ist sie erhöht bei Dunkelhäutigen, in Entwicklungsländer und in den unteren sozioökonomischen Schichten (9). Als eine mögliche Ursache dafür werden Ernährungsumstellungen diskutiert. Da in Japan das Magenkarzinom eine der häufigsten Todesursachen insgesamt darstellt, werden jedes Jahr in Massenscreenings 6 Millionen Japaner auf ein Magenkarzinom untersucht und es werden dadurch im Verhältnis mehr Frühkarzinome diagnostiziert (30, 31).
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Die Ätiologie des Magenkarzinoms ist multifaktoriell. Mehrere Studien belegen, dass der Tabakkonsum das Erkrankungsrisiko für beide Geschlechter signifikant erhöht (32 38). Es wurde gezeigt, dass die Stärke und die Dauer des Konsums entscheidend für die Entwickling eines Magenkarzinoms sind (34 36, 39). In der Studie von Nomura et al. wurde kein Zusammenhang
zwischen der Dauer und dem Risiko festgestellt werden (40). Ähnliche Ergebnisse wurden von Engeland et al. publiziert (39). Es wird angenommen, dass bis zu 18 % der Magenkarzinome auf den Tabakkonsum zurückzuführen sind (41).
1983 wurde von Warren et al. das Bakterium Helicobacter pylori beschrieben (42). Zahlreiche Studien stellten eine Assoziation zwischen dem Auftreten einer Helicobacter pylori Infektion und eines Magenkarzinoms fest (43 50). Dabei wird bei einer Infektion alleine die Wahrscheinlichkeit für die Entwicklung eines distalen Magenkarzinoms erhöht, jedoch nicht die für die Entwicklung eines proximalen Karzinoms (51, 52). Andererseits erkranken viele Patienten mit einer Helicobacter pylori Infektion nie an einem Magenkarzinom (44). Mit fortschreitender Infektionsdauer erhöht sich das Erkrankungsrisiko. So haben Personen mit einer 15 Jahre andauernden Helicobacter pylori Infektion ein 9 fach erhöhtes Risiko (53). Andere Studien stellten keinen Zusammenhang zwischen der Infektion und einem erhöhten Erkrankungsrisiko fest (54, 55). Einige dieser Studien berücksichtigten nicht die Möglichkeit von weiteren Kofaktoren, die ebenfalls als Ursache, Progressoren oder Störfaktoren in Betracht kommen. Aufgrund der weltweit hohen Prävalenz und der damit verbundenen vielseitigen Interaktionen mit anderen potentiellen Risikofaktoren (Nahrung, Tabakkonsum, Alkohol, Infektionen), ist es nicht möglich Helicobacter pylori anhand von epidemiologischen Studien als alleinige Ursache zu definieren (51). Allgemein anerkannt ist, dass Helicobacter pylori als Kofaktor in der Magenkarzinomentwicklung eine wichtige Rolle spielt (51).
Dabei wird von Correa et al. Helicobacter pylori als weltweiter Hauptgrund für das Magenkarzinom angesehen (56). Untersuchungen am Mausstamm C57BL/6 ergaben, dass bei einer zeitigen Helicobacter pylori Eradikationstherapie die mukosalen Veränderungen reversibel sind und die Progression zum Magenkarzinom komplett verhindert werden kann (57). Die „International Agency for Research on Cancer“ (IARC) klassifizierte 1994 das Bakterium Helicobacter pylori als ein Klasse 1 Kanzerogen (58). Watanabe et. al. konnten 1998 erstmals in einem Tiermodell die Induktion von Magenkarzinom durch Helicobacter pylori nachweisen (59).
Neben dem Tabakkonsum und der Helicobacter pylori Infektion ist die Ernährung ein weiterer möglicher Risikofaktor. Nach Joosson et. al. führt eine anhaltend hohe Zufuhr von Nitrat, natürlich vorkommend in Salat, zu einer frühen Magenschleimhautatrophie und steigert dadurch das Risiko an einem Magenkarzinom zu erkranken (60). Der Verzehr von frischem Gemüse gilt als protektiv.
Die darin enthaltenen Vitamine C und E sollen besonders stark das Risiko an einem Magenkarzinom zu erkranken mindern (61, 62). Vitamin C unterbindet die bakterielle Bildung von Nitrosaminen aus Nitrat (61). Als weitere Riskofaktoren gelten stark gesalzene, geräucherte Nahrungsmittel, Blutgruppe A und adenomatöse Magenpolypen (61). Perniziöse Anämie (63), familiäre Vorbelastung, Strahlentherapie (etwa bei Hodenkarzinom) (64, 65) und Magenoperationen aufgrund von Ulcera (66, 67) setzen die Reihe möglicher Risikofaktoren fort.
Alkoholkonsum ist als Risikofaktor umstritten (33, 34, 39, 68, 69). Abschließend sind noch die genetischen Aberrationen zu nennen. Somatische Mutationen des E cadherin Gens (CDH1) konnten im primären Magenkarzinom vom diffusen Typ und in verschiedenen Magenkarzinomzelllinien PCR nachgewiesen werden (70 72). Dabei führen Mutationen im E cadherin Gen über den Verlust des Wild Typ Allels zur kommpletten Inaktivierung des Gens.
Die Folge sind verminderte Zell Zellkontakte, deren Merkmale in der Histologie sichtbar sind (73).
So zum Beispiel prädispositionieren Keimbahnmutationen im CDH1 Gen (kodiert für E Cadherin) beim familiären oder hereditären diffusen Magenkarzinom (DGCS) für die Entstehung eines erblichen Magenkarzinoms (74). Die Funktion von p53 als Tumor Suppressor ist im Magenkarzinom häufig aufgrund von Punktmutationen, genauer Missensmutationen, beeintächtigt (75). Kommt es zur Schädigung der DNA bleibt der Arrest des Zellzykluses aus und es kommt zur fehlerhaften DNA–Reperatur mit der Gefahr der Karzinomprogression (75 77).
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Bei der Tumorentstehung im Allgemeinen handelt es sich um ein über Jahre andauernden prolongierten mehrstufigen Prozess. Ausgehend von präkanzerösen Veränderungen kommt es zur Entstehung eines invasiven Karzinoms. Chronische exogene und endogene Noxen sowie das Immunsystem des Betroffenen spielen in diesem Prozess eine Rolle. Die Pathogenese des Magenkarzinoms vom intestinalen Typ nach Laurén ist vergleichsweise gut charakterisiert. Die Entwicklung des Magenkarzinoms vom diffusen Typ ist noch weitgehend unverstanden (78).
Beispielsweise kann das Magenkarzinom vom intestinalen Typ offenbar von einer atrophischen Gastritis und einer Metaplasie der Magenschleimhaut ausgehen (79).
Das Modell von Correa et al. sieht ebenfalls am Anfang der Karzinoneogenese des Magenkarzinoms eine chronische Gastritis, die sich im weiteren Verlauf zu einer fokalen, später auch multifokalen Magenschleimhautatrophie weiterentwickelt. Hauptverantwortlich für eine chronische aktive Gastritis vom Typ B ist die Infektion mit dem Bakterium Helicobacter pylori (45, 56, 80, 81) Dabei kommt es aufgrund von anhaltenden endogenen und exogenen Noxen, wie beispielsweise die Infektion mit dem Bakterium Helicobacter pylori, zur Transformation der Schleimhaut mit einer intestinalen Metaplasie, die zu einer Dysplasie führt und letztendlich in einem Karzinom münden kann (82, 83). Allerdings führt nicht jede Helicobacter pylori Infektion beim betroffenen Menschen zu einem Magenkarzinom, dies ist abhängig vom Vorhandensein bestimmter Virulenzfaktoren wie zum Beispiel Cag A (cytotoxin associated genes) und weiteren Faktoren (45, 84, 85). Cag A ist ein Chromosomenabschnitt, den nur Cag A positive Helicobacter pylori Stämme aufweisen. Dieser Chromosomenabschnitt kodiert für ein Zytotoxin, welches vom Bakterium mittels eines nadelartigen Fortsatzes in die gesunde Magenepithelzelle injeziert wird und dort eine starke, über Interleukin 8 vermittelte, Gastritis auslöst (86). Cag A positive Stämme erhöhen aufgrund der induzierten schweren Gastritis auch das Risiko für ein Adenokarzinom im Antrum und im Korpusbereich (44, 87, 88). Die Infektion mit Cag A negativen Stämmen führt seltener zu einer Gastritis (85). Bestimmte Stämme produzieren außerdem VacA, ein Exotoxin, dass
neben der Entwicklung von Magenulzera auch die chronische Gastritis im Mausmodell (84) und die Entwicklung vom Magenkarzinom beim Menschen beschleunigt (89). Die Helicobacter pylori induzierte Entzündung in der Magenschleimhaut führt zu einer massiven Zellproliferation (90).
Dadurch steigt das Risiko einer Mutationsmanifestation (91, 92). Allerdings kann nicht bei jedem Patienten mit Magenkarzinom eine Helicobacter pylori Infektion nachgewiesen werden (45). Im weiteren Krankheitsverlauf beeinflusst die chronische Typ B Gastritis die Magensäuresekretion.
Infolge des alkalischen pH Wertes verändert sich das Magenmilieu und es kommt zur Kolonisation der Magenschleimhaut mit anaeroben Bakterien (93). Yang et al. haben gezeigt, dass diese Bakterien den Nitritgehalt im Magen steigern, indem Sie vermehrt das in Lebensmitteln enthaltene Nitrat, in das Zwischenprodukt Nitrit umwandeln (94). Durch Verbindungen mit Eiweißen entstehen dabei kanzerogene Nitrosamine (94). Der Gehalt an Nitrosaminen im Magenraum wird durch Tabakkonsum weiter erhöht. Ein exzessiver Salatkonsum erhöht ebenfalls durch das enthaltene Nitrat den Nitratgehalt im Magen und beschleunigt, über Stickstofftrioxid vermittelt, die Magenschleimhautatrophie mit der erhöhten Gefahr einer tumorösen Entartung (93). Ein weiterer wichtiger Mechanismus, über den die Magenschleimhaut geschädigt werden kann, ist oxidativer Stress. Dabei wird auf zwei unterschiedlichen Wegen vermehrt NO produziert. Nguyen et al.
stellten fest, dass Entzündungszellen, wie aktivierte Makrophagen und polymorphkernige Leukozyten an der NO Synthese beteiligt sind (95). Nach Mannick et al. führt die Gastritis bei betroffenen Patienten zu einer erhöhten Expression der induzierbaren Stickoxid Synthase. Diese bildet somit vermehrt das freie Radikal NO, dass in Form seiner Folgeprodukten Peroxynitrit und Stickstofftrioxid auf die DNA schädigend einwirkt (96). Beim Verzehr von frischem Obst und Gemüse kommt es zur Aufnahme von Antioxidantien wie Vitamin C (Ascorbinsäure) und Provitamin A (ß Carotin), die oxidative DNA Schäden verringern (61, 62).
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Das Magenkarzinom lässt sich in verschiedene Kategorien einteilen und anhand unterschiedlicher Merkmale klassifizieren. Zu nennen sind die Lokalisation, das makroskopische und das mikroskopische Erscheinungsbild.
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Die Borrmann Klassifikation ist für die makroskopische Beurteilung des Magenkarzinoms gebräuchlich (97). Diese Klassifikation bezieht sich auf das fortgeschrittene Magenkarzinom (T2 T4) und unterscheidet nach seiner äußeren Form insgesamt vier Typen:
• Typ 1, polypös: zeichnet sich durch ein zirkumskriptes, polypöses, exophytisches Wachstum ohne erhebliche Ulzerationen aus.
• Typ 2, exulzeriend: ist ein polypöser, ulzerierender Tumor mit wallwartigen Rändern und scharfer Grenze.
• Typ 3, ulzerierend: ist ein flacher, ulzerierender Tumor mit teils wallartiger Begrenzung, teils diffuser Ausbreitung.
• Typ 4, diffus: wächst als ein flacher infiltrierender, diffuser Tumor.
Davon wird die makroskopische Einteilung vom Magenfrühkarzinom abgegrenzt, die in der Borrmann Klassifikation nicht erfasst ist. Nach der japanischen Gastroenterologischen Vereinigung für Endoskopie wird ein Magenfrühkarzinom definiert als eine auf die Magenmukosa (M Typ) oder Submukosa (SM Typ) begrenzte Läsion des Magens mit oder ohne Lymphknotenmetastasen (98).
Läsionen, die bis auf die Submukosa reichen, haben eine erhöhte Inzidenz von Metastasen und ihre Prognose ist schlechter als für ein auf die Magenmukosa begrenztes Karzinom (99 101).
Nach der „Japan Society for Gastroenterological Endoscopy“ wird das Frühkarzinom in 3 Haupttypen unterteilt (102).
• Typ 1, polypös: Tumor erhebt sich mehr als 0,5 cm von der Magenschleimhaut.
• Typ 2, oberflächlich:
o 2 a, erhaben: Tumor erhebt sich weniger als 0,5 cm von der Magenschleimhaut.
o 2 b, flach: keine oder nur geringe Höhenveränderung zur Magenschleimhaut.
o 2 c, eingesenkt: oberflächlich und geringgradig eingesenkt und ggf. erosiv.
• Typ 3, exkaviert: deutliche Einsenkung, charakterisiert durch Ulzera ähnliche Erosion.
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Für die mikroskopische Einteilung sind drei verschiedene Klassifikationen, die Laurén, die Ming und die WHO Klassifikation, verbreitet. Bei der Klassifikation nach Laurén aus dem Jahr 1965 werden die Magenkarzinome nach zwei histologischen Typen unterteilt (103). Die voneinander unterschiedlichen Typen weisen eine unterschiedliche Epidemiologie, Ätiologie, Pathologie und Verhaltensweise auf:
• Typ 1, intestinaler: dieser Typ weist im histologischen Bild überwiegend große Drüsenlumina auf. Die Zellkerne sind größer, hyperchromatischer und zeigen recht häufig mitotische Figuren. Es zeigt sich ein geschlossenes Wachstumsmuster des Magenkarzinoms.
Typ 1 macht circa 50% der Magenkarzinome aus.
• Typ 2, diffuser: ein Karzinom, das diffus infiltrativ wächst. Die Zellen sind im Gewebe verstreut oder in kleinen Zellnestern organisiert, die keine oder nur geringgradige Drüsenformationen ausbilden. Sonderform: Linitis Plastica mit Neigung zu frühzeitiger Lymphknotenmetastasierung bei intramuralem Wachstum. Typ 2 macht circa 40% der Magenkarzinome aus.
Magenkarzinome vom intestinalen Typ zeigen in ihrer Entwicklung ein festes Schema. Sie beginnen als Schleimhautmetaplasie und werden über eine Zwischenstation der Dysplasie zum
invasivem Karzinom (103). Für diffuse Magenkarzinome sind keine Vorläuferläsionen bekannt.
Diffuse Karzinome zeigen aber eine höhere Inzindenz bei jüngeren Patienten (103). Karzinome die ein intestinales wie auch ein diffuses Wachstumsmuster aufweisen werden als „gemischter Typ“
klassifiziert. Sie machen circa 5 10% der Magenkarzinome aus.
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Die Ming Klassifikation unterscheidet die Magenkarzinome anhand ihres histologischen Wachstumsmusters in einen expansiven und infiltrativen Typ (104).
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Anders als die Klassifikation nach Laurén, unterscheidet die WHO Klassifikation Magenkarzinome nach spezifischen histologischen Merkmalen, die die Grundlage zur Definition spezieller Subentitäten des Magenkarzinoms bilden (105). Tubuläre, papilläre und muzinösen Adenokarzinome sowie die Siegelringkarzinome stellen mit 90% die häufigsten Magenkarzinomsubtypen dar. Zu den selteneren Entitäten gehören die szirrhösen, adenosquamösen, kleinzelligen, undifferentierten Karzinome. Zirka 10% der Tumore im Magenbereich werden durch Sarkome und MALT Lymphome verursacht, die nicht zu den Magenkarzinomen zählen.
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Das WHO Grading des Magenkarzinoms klassifiziert den Grad der histologischen Differenzierung vornehmlich der tubulären Karzinome als Primärtumor. Die übrigen histologischen Typen des Magenkarzinoms werden laut WHO Definition nicht graduiert. Hierbei werden neben der Differenzierung, die mitotische Aktivität, die Anzahl der Nekrosen, die Zellbeschaffenheit und die Zellkernpleomorphie berücksichtigt (105):
G1: hoch (gut) differenziertes Karzinom, weisen wohlgeformte Drüsen auf mit Tumorzellen, die an metaplastisches, intestinales Epithel erinnern.
G2: mäßig gut differenziertes Karzinom, weisen ein morphologisches Bild zwischen G1 und G3 auf.
G3: schlecht differenziertes Karzinom, weisen stark irreguläre sowie solide Strukturen auf, oder enthalten dissoziiert und in sogenannten Clustern angeordnete Tumorzellen.
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Im Jahr 2002 veröffentlichte das American Joint Comittee on Cancer (AJCC) die 6. überarbeitete Fassung vom Stagingsystem des Magenkarzinoms (106). Diese pTNM Klassifikation beruht im Wesentlichen auf einer Übereinkunft von UICC (Union International Contra Cancer), JCC (Japanese Cancer Comittee), und des AJCC (American Joint Comittee on Cancer) aus dem Jahre 1987 (107).
Das T Stadium beschreibt die Ausdehnung des Primärtumors, unterteilt von 1 4. Tis entspricht einem Carcinoma in situ. Das Magenfrühkarzinom entspricht der T1 Kategorie im pTNM System der UICC Klassifikation. Ein T1 Magenkarzinom ist auf die Lamina propria begrenzt. Das T1 Stadium wird weiter unterteilt in T1a Karzinome, die auf die Muscularis mucosae beschränkt sind und in T1b Karzinome, die sich auf die Submucosa begrenzen. T2 Magenkarzinome durchbrechen die Lamina propria überschreiten aber die Muscularis propria nicht. T3 Magenkarzinome infiltrieren bis in die Subserosa und T4 Karzinome perforieren die Subserosa beziehungsweise infiltrieren die Nachbarstrukturen (108). Das N Stadium steht für das Vorhandensein bzw. das Fehlen von regionären Lymphknotenmetastasen. N1 bedeutet, dass 1 6 Lymphknoten befallen sind.
N2, dass zwischen 7 und 15 Lymphknoten betroffen sind und N3 bedeutet, dass mehr als 15 Lymphknoten befallen sind. Das M Stadium dokumentiert eventuell vorhandene Fernmetastasen (108, 109). Anders als in der TNM Klassifikation von 1985 ist in der aktuellen TNM Klassifikation von 2010 (108) nicht der Abstand der befallenen Lymphknoten zum Primärtumor entscheidend, sondern die Anzahl der befallenen Lymphknoten.
Für die individuelle Therapieentscheidung und die Prognose ist eine korrekte Stadieneinteilung Vorraussetzung (21, 110).
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Die in der Rekrutierungsphase dieser Studie gültige klinische Stadieneinteilung gemäß UICC/AJCC (107) lautet:
• Stadium 0: Tis pN0 pM0 (Carcinoma in situ).
• Stadium Ι: pT1 pN0 pM0 (ΙA) oder pT1 pN1 pM0 (ΙB) oder pT2 pN0 pM0 (ΙB).
• Stadium ΙΙ: pT1 pN2 pM0 oder pT2 pN1 pM0 oder pT3 pN0 pM0.
• Stadium ΙΙΙ: pT2 pN2 pM0 (ΙΙΙA) oder pT3 pN1 pM0 (ΙΙΙA) oder pT4 pN0 pM0 (ΙΙΙA) oder pT3 pN2 pM0 (ΙΙΙB).
• Stadium ΙV: pT4 pN1 3 pM0, pT1 4 pN3 pM0 oder jedes pT jedes pN pM1.
Die von der UICC 2010 (108) novelierte klinische Stadieneinteilung für Magenkarzinome wurde im Rahmen dieser Arbeit nicht angewendet, da die zum Zeitpunkt der pTNM Beurteilung der Patienten gültige TNM Klassifizierung keine für die neue Stadieneinteilung relevante Unterscheidung zwischen mukösen und submukösen T Stadium vorsah.
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Etablierte prognostische Marker für das Magenkarzinom sind das TNM Staging System (111), der Erfolg der chirurgischen Intervention, angegeben als R0 Resektion (106, 112) und das Magenfrühkarzinom (113 115). Diskutierte prognostische Marker sind weiterhin die Lokalisation (116), der histologische Typ (117), das Grading (112, 117, 118), die Tumormarker CEA und CA19 9 (119), die p53 Expression (120) und der Plasminogen Inhibitor Typ 1 (116, 121, 122). Für das fortgeschrittene Magenkarzinom betrugen 2004 in Deutschland die kumulativen relativen 5 Jahres Überlebensraten (5 JÜR) 35% bei Männern und 31% bei Frauen (12). Das kurativ operierte oberflächliche Magenfrühkarzinom weist mit einer 5 JÜR von 80 95% eine wesentlich bessere Prognose auf (113), die in Abhängigkeit vom Grad des Lymphkontenbefalls, der
Infiltrationstiefe und der Metastasierung deutlich abnimmt (113, 123, 124). Dabei weist ein auf die Mukosa beschränktes Magenfrühkarzinom eine bessere Überlebenswahrscheinlichkeit auf als ein submukosal infiltriertes Magenfrühkarzinom (124, 125). Infiltriert ein T2 Karzinom die muscularis propria oder die Subserosa, beträgt die 5 JÜR 60 80% (126, 127). Das 5 JÜ beträgt bei einem T3 Karzinom 50% (126). Je tiefer das Magenkarzinom zum Zeitpunkt der Diagnose infiltriert ist, desto größer ist die Wahrscheinlichkeit, dass Lymphknoten befallen sind (128 131). Zum Zeitpunkt der Diagnosestellung liegt die Inzidenz für Lymphknotenmetastasen beim Magenfrühkarzinom bei ungefähr 15% (Mukosal 2% und bis zu 25% bei Submukosabefall). Beim fortgeschrittenen Magenkarzinom sind bei Diagnose bereits in 50 70% der Fälle Lymphknotenmetastasen vorhanden (125, 132). Analog zum T Stadium, verschlechtert sich die 5 JÜR mit steigender Anzahl der befallenen Lymphknoten (133). Dabei variiert die Überlebenswahrscheinlichkeit zwischen den N Stadien, allerdings nicht innerhalb eines N Stadiums. Roder et al. haben gezeigt, dass Patienten im N1 Stadium eine 45,5% 5 JÜR haben. Patienten mit N2 haben eine 29,7% 5 JÜR. Patienten mit N3 haben mit 10,4% die schlechteste 5 JÜR (133). Das Vorhandensein von Fernmetastasen ist ebenfalls von hoher prognostischer Relevanz (134 136). Neben dem TNM Staging System ist der R0 Status von prognostischer Relevanz (112). Aus der deutschen Magenkarzinom Studie von 1992 ging hervor, dass die UICC R0 Resektion mit einer höheren Überlebenswahrscheinlichkeit einhergeht und als unabhängiger Prognosefaktor neben dem T Stadium und N Stadium einen wichtigen Stellenwert besitzt (112). Dies wird durch weitere Studien unterstützt (131, 134). Die ausgedehnte chirurgische Lymphkontenentfernung (D2) führt zu einer signifikant höheren Überlebenswahrscheinlichkeit (137 139). Neben diesen Prognosefaktoren gibt es noch weitere prognostische Faktoren. Beispielsweise geht eine distale Lokalisation mit einer besseren Prognose einher (116). Es ist umstritten, welche prognostische Aussagekraft der histologische Typ nach Laurén hat. Matsui et al. wiesen eine schlechtere Prognose für den diffusen Typ nach Laurén als für den intestinalen Typ nach (117). Andere Autoren haben diesbezüglich keinen Zusammenhang gefunden (140). Die prognostische Aussagekraft des Gradings ist ebenfalls umstritten
(112, 117, 118, 131). Ausserdem wurde gezeigt, dass die Tumormarker CEA (karzinoembryonales Antigen) und das CA 19 9 unabhängige Marker für eine schlechtere Prognose sind (119). Eine immunopositive Färbung gegen das nukleär akkumulierte p53 Protein, als Zeichen einer vorliegenden p53 Mutation, ist mit einer schlechteren Prognose assoziiert (120, 141). Die 5 JÜR beträgt bei p53 Positivität 24% im Vergleich zu 56% bei humanen Magenkarzinomproben ohne nukleäre p53 Akkumulation (120). Weitere prognostisch relevante Marker sind der Plasminogen Aktivator (uPA) und Plasminogen Inhibitor Typ 1 (PAI 1) vom Urokinasesystem, die mittels Enzymimmunoassays (ELISA) evaluiert werden können (121, 122). Die prognostische Relevanz des zellulären Oberflächenrezeptors KAI1/CD82 ist aktuell Gegenstand der Forschung.
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Das Zelloberflächenprotein KAI1/CD82 (synonym Kangai 1, R2, C33, IA4 oder 4F9) gehört zu der Protein Superfamilie der Tetraspanine beziehungsweise der „Transmembranösen 4 Superfamilie“
(TM4SF) (142, 143). Die Gruppe der Tetraspanine besteht bei den Säugetieren aus 33 identifizierten Mitgliedern (142, 144). Mit Ausnahme von Erythrozyten, exprimieren alle humanen Zellen einzelne Tetraspanine. So wird zum Beispiel das Tetraspanin CD37 von lymphatischen B Zellen exprimiert (145). KAI1/CD82 wird in humanen Geweben nahezu ubiquitär exprimiert (146). Zellen der Milz, Plazenta, Lunge, Leber, Niere und der Prostata weisen einen besonders hohen Gehalt von KAI1/CD82 mRNA auf. Zellen der Bauchspeicheldrüse, Skelettmuskulatur, Gehirn, Herz, Ovarien, Uterus und des Magens weisen, mittels Northern Blot, eine geringere KAI1/CD82 mRNA Expression auf (147). Charakteristisch für alle Tetraspanine ist deren molekularer Aufbau aus 4 hochkonservierten, hydrophoben schleifenförmigen transmembranösen Domänen (TM 1 4) (148). KAI1/CD82 enthält sechs hoch konservierte Cysteine, die für das korrekte Falten einer großen extrazellulären Schleife verantwortlich sind. Mittels dieser Region tritt KAI1/CD82 in Interaktionen mit anderen Proteinen. An der Zelloberfläche sind Tetraspanine in sogenannten „Tetraspanin Netzen“ beziehungswiese „Tetraspanin angereicherten Mikrodomänen“
organisiert (149, 150). Sie treten mit anderen hydrophoben Oberflächenproteinen, wie zum Beispiel a) Integrinen, insbesondere ß1 und ß2 (151 154) b) andere Tetraspaninen wie CD9 und CD81 (155, 156), c) Immunorezeptoren wie MHC I und II Klasse Molekülen (157, 158), d) Wachstumsfaktoren einschließlich deren Rezeptoren (159), dem EGF Rezeptor (160), e) Proteinkinase C (161) und andere Proteinen wie KITENIN (162) in Wechselwirkung. Auf diesem Weg sind Tetraspanine wie KAI1/CD82 in fundamentale zelluläre Prozesse wie Zell Zell Interaktionen, Zellmotilität und Zellproliferation involviert (142, 143, 149). Tetraspanine beinflussen beziehungsweise regulieren Gewebedifferenzierung (163), Oozyten Befruchtung (im Mausmodell) (164), Inhibition von Metastasierung von Tumorzellen sowie Virus induzierte Syncytiumbildung (165, 166).
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Das Oberflächenglykoprotein KAI1/CD82 wurde erstmals 1991 auf der Oberfläche von T Zellen beschrieben (143). Das für KAI1 kodierende Gen befindet sich auf dem humanen Chromosomen 11p11.2 13 (147, 167). Es kodiert für ein 267 Aminosäure großes Protein (143). Dong et al.
konnten anhand der Tumorzelllinie AT6.1 im Tiermodell zeigen, dass KAI1/CD82 die Metastasierung inhibiert, ohne dabei Einfluss auf das Wachstum des Primärtumors zu nehmen (168). Ähnliche Forschungsergebnisse konnten Dong et al. und Yang et al.
beschreiben (168, 169). Sie zeigten im Tiermodell und anhand der Tumorzelllinien LCC6 und MDA MB 231, dass die ektope Überexpression von KAI1/CD82 die Zellmigration und Tumorinvasion in vitro sowie Metastasierung in vivo unterdrückt (168, 169). Die Mechanismen, über die KAI1/CD82 Zellmigration, Tumorinvasion und Metastasierung verhindert, sind wahrscheinlich vielfältig und werden noch nicht genau verstanden. Beispielsweise kann KAI1/CD82 die Endozytose von EGF Rezeptoren stimulieren, welche ihrerseits Tumorwachstum positiv beeinflussen (160). KAI1/CD82 reguliert aber auch die Signaltransduktion von Integrinen indem es mit der aktivierten intrazellulären Proteinkinase C in Wechselwirkung tritt (161, 170 172).
Außerdem verhindert KAI1/CD82 die Aktivierung von uPAR, was eine verminderte perizelluläre Proteolyse und eine verminderte Zellmigration zur Folge hat (173). Weiterhin induziert KAI1/CD82 Zellapoptose durch reaktive Sauerstoffverbindungen (174) und führt bei ektoper Expression in Magenkarzinom Zellen und Mammakarzinom Zellen im Tiermodell zur Verkleinerung des Primärtumors (153, 169). Dies konnte nicht für andere Tumorentitäten im Tiermodell gezeigt werden (168, 175). KAI1/CD82 positive Tumorzellen, heften sich intravsal über DARC, einem auf Endothelzellen exprimierten Protein, an das Endothel von Blut und Lymphgefäßen. Diese direkte Interaktion zwischen KAI1 und DARC verhindert die Proliferation von Tumorzellen (176, 177). Die Mechanismen, die zur Inaktivierung von KAI1/CD82 in humanen Karzinomen führen sind noch schlecht verstanden. Wahrscheinlich sind in erster Linie eher transkriptionelle oder posttranskriptionelle Prozesse für die verminderte Expression von KAI1/CD82 verantwortlich als Mutationen und/oder Deletionen oder epigenetische Inaktivierung (178 182). Unterschiedliche Transkriptionsfaktoren wie NFKB, N CoR, ß catenin, p53, AP 1 und AP 2 regulieren, zum Teil gegensätzlich, die Transkription von KAI1/CD82 (183). Christgen et al.
konnten zeigen, dass die KAI1/CD82 Expression in Mammakarzinomen vom Östorgenrezeptorstatus abhängig ist. Östrogenrezeptor positive Mammakarzinome zeigen immunhistochemisch überwiegend ein Fehlen von KAI1/CD82 (184). Weitergehend konnte anhand von immunhistochemischen Untersuchungen an primären Mammakarzinomen und deren zugehörigen Metastasen gezeigt werden, dass die Expression von KAI1/CD82 in Metastasengewebe von Mammakarzinomen ebenfalls abhängig vom Vorhandensein von Östrogenrezeptoren ist (185).
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Bisher veröffentlichte Untersuchungen zur Expression von KAI1/CD82 im Magenkarzinom ergaben zum Teil unterschiedliche Ergebnisse (& ="" ). Im Vergleich zur normalen Magenschleimhaut nimmt die KAI1 Expression im Magenkarzinom ab (141, 186 189).
Tsutsumi et al. untersuchten mittels Immunhistochemie an 174 humanen Magenkarzinomen den Zusammenhang zwischen der KAI1 Expression und klinisch pathologischen Parametern.
Die Untersuchungen ergaben, dass ein Verlust von KAI1 Expression signifikant mit einem fortgeschrittenen Tumorstadium, Lymphknotenbeteiligung und Fernmetastasen assoziiert ist (186).
Zu ähnlichen Ergebnissen führten die Untersuchungen von Lee et al. an 248 human Karzinomproben (141). Weitere immhistochemische Untersuchungen ergaben ebenfalls einen solchen Zusammenhang zwischen KAI1/CD82 klinisch pathologischen Parametern (141, 187, 189 191). Kim et al. evaluierten mittels Immunhistochemie die KAI1/CD82 Expression in primären Magenkarzinomen und in deren Leber und Lymphknotenmetastasen. Im Vergleich zum Primärtumor exprimierten Lymphknoten und Lebermetastasen signifikant weniger KAI1 (189).
Weiterhin wurde gezeigt, dass die verminderte KAI1/CD82 Expression mit einem höheren T Stadium assoziiert ist (189). Ein Magenkarzinom mit einem höheren T Stadium ist häufig KAI1/CD82 negativ > & ="" ? (189). Ausserdem besteht eine Assoziation zwischen dem Differenzierungsgrad des Tumors und der KAI1/CD82 Expression (186, 187, 192). Im Gegensatz zu diesen Ergebnissen, stellten Zheng et al. keine signifikante Assoziation zwischen dem nodalen Status und dem pM Status einerseits und der KAI1 Expression andererseits fest. Wohl aber für das T Stadium > & =""? (187). Anders als Lee et al. und Tsutsumi et al. konnten Hinoda et al.
keine signifikante Assoziation zwischen dem Verlust der KAI1 Expression im Magenkarzinom und dem Tumorstadium feststellen (188). Kein signifikanter Zusammenhang konnte bisher zwischen der KAI1/CD82 Expression und den klinischen Parametern Alter, Geschlecht und der Lokalisation des Magenskarzinoms (141, 186, 188, 189, 193) und der Borrmann Klassifikation festgestellt werden (186, 188, 192). In den Studien von Ilhan et al., Kim et al. und Lee et al. waren KAI1 positive Magenkarzinome nicht mit der Laurén Klassifikation assoziert, allerdings in der Studie von Zheng et al. (141, 187, 189). Anhand von Studien mit verschiedenen, malignen Tumorentitäten wurde gezeigt, dass Patienten mit KAI1/CD82 positiven malignen Tumoren im Vergleich zu Patienten mit KAI1/CD82 negativen Tumoren eine deutlich höhere Überlebenswahrscheinlichkeit aufweisen
(178, 194, 195). Für die Tumorentität Magenkarzinom konnte in fünf Studien für KAI1/CD82 positive Magenkarzinome eine signifikant bessere Prognose festgestellt werden >
& ="" ? (141, 186, 196). Wu et al. zeigten für ein Kollektiv unterschiedlicher KAI1/CD82 positiver Karzinome des Verdauungstrakts ein signifikant besseres Überleben (193). Dabei war KAI1/CD82 jedoch kein unabhängiger Prognose Parameter (186, 193).
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KAI1/CD82 supprimiert im Tiermodell Tumorwachstum und Metastasierung und bietet sich möglicherweise als ein neuer, prognostisch relevanter Marker für den klinischen Gebrauch an. Ziel dieser Arbeit ist es, die prognostische Relevanz von KAI1/CD82 im humanen Magenkarzinom immunhistochemisch zu evaluieren. Dazu wird ein, auf sogenannten Tumormultiblöcken zusammengefasstes, 271 Fälle umfassendes Kollektiv primärer Magenkarzinome mit einem detaillierten klinschen Follow Up herangezogen. Es handelt sich bei dieser Studie somit um die umfassendste bisher durchgeführte Untersuchung zur prognostischen Relevanz von KAI1 im humanen Magenkarzinom.
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Von April 1986 bis Dezember 1997 wurden 432 Patienten in eine Studie zum Magenkarzinom eingeschlossen. Von 271 Patienten lag evaluierbares Karzinomgewebe in Form von Tumormultiblöcken aus dem Institut für Pathologie der Medizinischen Hochschule Hannover vor (197). Diese Gewebeproben wurden in dieser Arbeit untersucht. Das Gewebe wurde im Rahmen der chirurgischen Tumorresektion an der Medizinischen Hochschule Hannover gewonnen und die Karzinom Diagnostik erfolgte im Institut für Pathologie der Medizinischen Hochschule Hannover. Alle Patienten erhielten keine adjuvante/ oder neoadjuvante Chemo oder Strahlentherapie. Es wurden 175 Gewebeproben von Männern (65%) und 96 Gewebeproben von Frauen (35%) evaluiert > & ="" .?. Das Durchschnittsalter lag bei 62,8 Jahren, die Altersverteilung reichte von 25 bis 88 Jahre. Die Überlebenszeit der Patienten wurde vom Tag der Diagnosestellung bis zum Todeseintritt beziehungsweise bis zum 1. Januar 2000 dokumentiert, daraus resultierte eine mittlere klinische Follow Up Dauer von 48 Monaten (1 Monat bis 15 Jahren und 3 Monate). Zum Zeitpunkt des Studienschlusses wurden lebende Patienten (n=101) zensiert.
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Für den Einschluss in die Studie mussten folgende Kriterien erfüllt sein:
1. histologisch gesichertes Magenkarzinom
2. keine neo /adjuvante Chemotherapie und/oder Strahlentherapie 3. keine Zweittumore
4. kein Rezidiv eines Magenkarzinoms 5. keine vorherigen Tumorerkrankungen 6. chirurgische R0 Resektion
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Die in der Studie erfassten Magenkarzinome wurden auf Grundlage des pTNM Systems von 1987 klassifiziert (107). Die histologische Subtypisierung der in der Studie erfassten Magenkarzinome erfolgte anhand der WHO Klassifikation von 1987 (198). Insgesamt 255 Tumore wurden den Entitäten a) Adenokarzinome, b) Adenokarzinom intestinaler Typ, c) Adenokarzinom diffuser Typ, d) papilläres Adenokarzinom, e) tubuläres Adenokarzinom, f) muzinöses Adenokarzinom, g) Siegelringkarzinom, h) adenosquamöses Karzinom, i) undifferenziertes Karzinom, j) andere/Mischtyp zugeordnet. Für 16 Karzinomproben lag keine WHO Klassifikation vor. Die UICC Version des TNM von 2010, die submuköse Magenkarzinome gesondert berücksichtigt, wurde nicht retrospektiv auf die untersuchten Tumore angewendet (108). Tumorgrading erfolgte in Übereinstimmung mit der Definition des WHO Gradings für Magenkarzinome in G1 (gut differenziert), G2 (mäßig differenziert) bis G3 (schlecht differenziert) (105). Des Weiteren wurden die Karzinome nach der Laurén Klassifikation in intestinal, diffus, Mischtyp oder unklassifiziert eingeteilt. Es folgte eine weitere Einteilung nach der Ming Klassifikation in expansiv, infiltrativ und unklassifiziert. Die Zuordnung des makroskopischen Erscheinungsbildes der Magenkarzinome erfolgte nach der Borrmann Klassifikation. Weitergehend fand eine Einteilung der Magenkarzinome nach ihrer Lokalisation statt. Dabei waren Mehrfachzuordnungen eines Magenkarzinoms möglich. Für 45% der Patienten wurde der Karnofsky Index dokumentiert (199).
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Das 271 Fälle umfassende Kollektiv an humanen Magenkarzinomen wurde retrospektiv gemäß der Klassifikation für klinische Stadieneinteilung von Magenkarzinomen der UICC von 1987 wie folgt eingeteilt > & =""?.
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Die klinisch pathologischen Daten der 271 Patienten und der zugehörigen Tumorgewebe wurden aus den Archivdaten des Instituts für Pathologie der Medizinischen Hochschule Hannover erhoben.
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Von n=271 Patienten lag evaluierbares Tumorgewebe in Form von Tumormultiblöcken vor (197, 200). Jeder Tumor war durch eine 1,4 mm Stanze eines representatives Tumorareals auf den Multiblöcken erfasst. Ein Multiblock bestand aus 60 verschiedenen humanen malignen Magengewebeproben. Mit dem Mikrotom 2040 Reichert Jung (Leica Microsystems AG, Wetzlar, Deutschland) wurden 4 m dicke Parafinschnitte angefertigt und auf Glasobjektträger aufgebracht.
Zur besseren Anhaftung der Parafinschnitte am Glasobjektträger wurden sie bei 56°C für 3 Stunden inkubiert.
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Pipette Research variabel (Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland)
In Paraffin eingebettetes humanes Magenkarzinomgewebe (Institut für Pathologie, Medizinische Hochschule Hannover, Deutschland)
In Paraffin eingebettete Zelllinien MCF 7 und UACC 893 (Institut für Pathologie, Medizinische Hochschule Hannover, Deutschland), als negative beziehungsweise positive Kontrolle (201 203) Monoklonaler KAI1 Antikörper G2 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, Kalifornien, USA)
Pascal Dako Cytomation, Dampfdrucktopf (DAKO Deutschland GmbH, Hamburg, Deutschland) Xylol reinst (Mallickrodt Baker BV, Deventer, Niederlande)
Menzel Gläser Superfrost Pb ( Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Deutschland) Ethanol absolut (Mallinckrodt Baker, Deventer, Niederlande)
Shandon Coverplates (Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Deutschland)
Electrothermal, Wasserbad (Drägerwerk AG & Co. KgaA, Lübeck, Deutschland) Mikrotom 2040 Reichert Jung (Leica Microsystems AG, Wetzlar, Deutschland) DAB High Kontrast Kit (Zytomed Systems, Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland)
Biotin freies ZytoChem Plus HRP Polymer anti Mouse/Rabbit Kit (Zytomed Systems, Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland)
Eindeckmedium Glycerol Gelatin (Sigma Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland) 10 mM Zitrat Puffer, pH 6 (DAKO Deutschland GmbH, Hamburg, Deutschland)
Hämatoxylin
Antibody Diluent 500 ml ( Zytomed Systems, Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland)
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Für die Immunhistochemie wurden die insgesamt 5 Multiblöcke mit 271 humanen Magenkarzinomproben verwendet. Die immunhistochemische Färbung erfolgte mit dem Antikörper KAI1 G2 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, Kalifornien, USA). Christgen et al. haben mit ihrer Arbeit anhand der Brustkrebszelllinien UACC 893 und MCF 7 die Spezifität der immunhistochemischen Färbung mit diesem monoklonalen Mausantikörper gezeigt. UACC 893 und MCF 7 Zellen wurden als Positiv beziehungsweise Negativkontrolle für die KAI1 Färbung etabliert (204). Der Antikörper wurde für die Färbung mit Antibody Diulent (Zytomed Systems, Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) 1:100 verdünnt. Vor der immunhistochemischen Färbung der Multiblöcke und der internen Kontroll Zelllinien UACC 893 und MCF 7 wurden die aufgebrachten Schnitte in Xylol entparaffiniert und durch eine absteigende Alkoholreihe rehydratisiert. Im gleichen Arbeitsschritt wurden die endogenen Peroxidasen mit Hilfe von 3% H2O2 in 70% Ethanol inaktiviert. Diese Schritte wurden nach der Arbeitsanweisung des Institutes für Pathologie zur
„Entparaffinierung und Rehydrierung von Gewebeschnitten“ wie folgt durchgeführt:
Xylol I 10 Minuten
Xylol II 10 Minuten
Xylol III 10 Minuten
100 % Ethanol kurz spülen
100 % Ethanol kurz spülen
100 % Ethanol kurz spülen
100 % Ethanol kurz spülen
100 % Ethanol 2 Minuten
90 % Ethanol 2 Minuten
70 % Ethanol/ H2O2 10 Minuten
50 % Ethanol 2 Minuten
Aqua Deltaselect Spüllösung
Die Tumormultiblöcke beziehungsweise die internen Kontrollen wurden für die immunhistochemische Färbung in einem Dampfdrucktopf bei 125°C in 10mmol/l Citrat Puffer (PH 6) für 3 Minuten vorbehandelt. Die Antigenanfärbung erfolgte mittels der ABC Methode (Avidin Biotin Komplex) unter Einschluss von Tris Puffer in Coverplates, eingespannt in Tanks.
Dabei wurden die Multiblöcke und die internen Kontrollen mit dem Antikörper KAI1 G2 angefärbt, sowie mit dem biotin freiem ZytomedChem Plus HRP Polymer anti Mouse/Rabbit Kit (Zytomed Systems, Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) in Verbindung mit dem DAB High Kontrast Kit (Zytomed Systems, Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) behandelt. Entsprechend der Arbeitsanweisung „Immunfärbungen in Coverplates“ des Institutes Pathologie der Medizinischen Hochschule Hannover wurden die einzelnen Arbeitsschritte wie folgt durchgeführt:
Tris Puffer 5 Minuten
Proteinblock 5 Minuten
Tris Puffer 5 Minuten
Inkubation mit primären AK 60 Minuten
Tris Puffer 5 Minuten
Postblock 20 Minuten
Tris Puffer 5 Minuten
HRP Polymer 30 Minuten
Tris Puffer 5 Minuten
DAB 15 Minuten
Aqua Deltaselect Spüllösung 5 Minuten Gegenfärbung mit Hämatoxylin 3 Minuten Bläuen mit Leitungswasser 10 Minuten
Für die mikroskopische Beurteilung und die fotografische Dokumentation wurden die angefärbten Schnitte mit Eindeckmedium versehen und mit einem Deckgläschen fixiert.
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Die mikroskopische Beurteilung der anti KAI1 gefärbten histologischen Schnitte der Tumormultiblöcke wurde von drei ärztlichen Mitarbeitern des Institutes für Pathologie der Medizinischen Hochschule Hannover und dem Doktoranden zusammen am Disskusionsmikroskop durchgeführt. Die Evaluierung der membranösen KAI1 Immunoreaktivität wurde in Analogie zum
„Remmele Score“ für Östrogenrezeptor (ER) in Mammakarzinomen vorgenommen (205). Tumore mit einem IRS ≤ 2 wurden als KAI1 negativ bewertet, Tumore mit einem IRS ≥ 3 wurden als KAI1 positiv eingestuft. Als interne Positiv / Negativkontrollen dienten die Zelllinien UACC 893 und MCF 7.
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Die Literaturrecherche zu dieser Arbei wurde mit den Meta Datenbanken Pubmed und Scopus unter Verwendung der Suchbegriffe gastric cancer, KAI1, clinicopathological parameters and gastric cancer, gastric cancer and correlation with KAI1, KAI1 and immunhistochemistry sowie weiteren Suchwörtern ohne Einschränkung des Suchzeitraumes durchgeführt. Die möglichen Zusammenhänge von KAI1 mit klinisch pathologischen Parametern in Magenkarzinom wurden bisher in 10 publizierten Studien mittels Immunhistochemie untersucht >& =""?. Die Angaben wurden den Publikationen entnommen, tabellarisch zusammengefasst und miteinander verglichen
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Die statistische Auswertung des 271 Fälle umfassenden Kollektives primärer Magenkarzinome wurde mit der Software GraphPad Prism Version 3.0 (GraphPad Software Inc., Carlifornia, USA) durchgeführt. Bei der Analyse der KAI1 Expression bezüglich der Assoziation mit einzelnen klinisch pathologischen Parametern wurden der Vierfelder Test, der Vierfelder Test für Trends und
der Vierfleder Test für Mehrfelder Kontingenztafeln angewendet. Die Testung auf Signifikanz bezüglich der Assoziation von einem Merkmal, hier KAI1 Expression als Prognoseparameter, und der Überlebenswahrscheinlichkeit wurde mit dem Log Rank Test durchgeführt. Als statistisch signifikant wurde bei Vergleich zweier Gruppen ein ! Wert von <0,05 angesehen. Für die graphische Darstellung wurden Kaplan Meier Kurven verwendet (206).
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Insgesamt wurden 271 Gewebeproben von Magenkarzinomen mit zugehörigen klinisch pathologischen Daten der zugehörigen Patienten für diese Studie ausgewertet. Das Kollektiv bestand aus 96 Frauen (35%) und 175 Männern (65%) >& ="".?. Unabhängig von der KAI1 Expression betrug das mediane Erkrankungsalter bei den weiblichen Patienten 67 Jahre und bei den männlichen Patienten 64 Jahre >& ="" .?. Bei allen Patienten der Studie lag eine R0 Resektion vor. Kein Patient wurde mit einer neoadjuvanten oder adjuvanten und/oder Radio /Chemotherapie behandelt. & ="" . zeigt die klinisch pathologischen Charakteristika des untersuchten Tumorkollektives im Überblick. Bei Diagnosestellung lag bei 46% der Patienten der Karnofsky Index bei ≥80. Die Geschlechts unabhängige mediane Gesamtüberlebenszeit nach Diagnosestellung bis zum Tod betrug 27 Monate >& ="" .?. Am Ende des Beobachtungszeitraumes lebten noch 101 (37%) Patienten während 170 (63%) Patienten verstorben waren. Die Patienten in der gößten Subgruppe (47%) befanden sich bei Diagnosestellung im fortgeschrittenen Tumorstadium T2 >& ="" .?. 10% aller Patienten wiesen Fernmetastasen auf
>& ="" .?. Wie man der & ="" entnehmen kann, bildete das Tumorstadium IIIA nach UICC (1987) in dem Tumorkollektiv mit 22% die stärkste Untergruppe, gefolgt von dem Tumorstadium II mit 20%. Der größte Anteil der untersuchten Magenkarzinome entsprach nach der Laurén Klassifikation dem Magenkarzinom vom intestinalen Typ (57%), nach der Ming Klassifikation dem Magenskarzinom vom expansiven Typ (52%). Nach der
Borrmann Klassifikation waren die meisten Fälle (40%) Typ II Magenkarzinome. Adenokarzinome nicht näher bezeichnet (Adenokarzinome, NOS) waren mit 47% am häufigsten vertreten, gefolgt von Siegelringzellkarzinomen (19%). ==" zeigt eine Übersicht repräsentativer anti KAI1 immunhistologischer Färbungen aus den untersuchten Tumormultiblöcken. Oben sind die als Positiv / und Negativkontrollen eingesetzten Zelllinien abgebildet >==" ?. Unten sind repräsentativ jeweils zwei als KAI1 positiv, beziehungsweise KAI1 negativ evaluierte Magenkarzinome abgebildet >==" ?. Insgesamt zeigten 168 (62%) der Magenkarzinome KAI1 immunoreaktivität. Der geringere Anteil der Magenkarzinome (38%) war KAI1 negativ
>& ="".?.
