Wirkung von GnRH und seines Antagonisten Antide auf die Expression der synaptischen Proteine Spinophilin und Synaptophysin im Hippocampus

(1)

Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf Zentrum für Experimentelle Medizin

Institut für Neuroanatomie

Direktorin: Frau Prof. Dr. Gabriele Rune

Wirkung von GnRH und seines Antagonisten Antide auf

die Expression der synaptischen Proteine Spinophilin und

Synaptophysin im Hippocampus

Dissertation

zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin an der Medizinischen Fakultät der Universität Hamburg.

vorgelegt von: Michael Schön geb. am 08.01.1981

in Freiberg / Sachs

(2)

Angenommen von der

Medizinischen Fakultät der Universität Hamburg am: 25.02.2014

Veröffentlicht mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät der Universität Hamburg. Prüfungsausschuss, die/der Vorsitzende: Prof. Dr. G. Rune

Prüfungsausschuss, zweite/r Gutachter/in: PD Dr. J. Prange-Kiel

(3)

Inhaltsverzeichnis 1

Wirkung von GnRH und seines Antagonisten Antide auf die Expression der synaptischen Proteine Spinophilin und Synaptophysin im Hippocampus

Inhaltsverzeichnis:

1. Abkürzungsverzeichnis

3

2. Einleitung

5

2.1 Der Hippocampus 6

2.2 E2-Synthese im Hippocampus und biochemischer Wirkmechanis-

mus von E2 8

2.3 GnRH 10

2.4 Hemmung der E2-Synthese 12

2.5 Spinophilin und Synaptophysin 13

2.6 Fragestellung 15

3. Arbeitsmaterialien

17 3.1 Material 17 3.2 Geräte 17 3.3 Software 18 3.4 Chemikalien 18 3.5 Antikörper 19 3.6 Lösungen 19

4. Methoden

21

4.1 Hippocampale Dispersions- und Slicekulturen 21

4.1.1 Verwendete Tiere 21

4.1.2 Präparation des Hippocampus aus der Ratte 21

4.1.3 Dispersionskulturen 21

4.1.4 Stimulation und Inhibition der Dispersionskulturen 22

4.1.5 Fixierung der Dispersionskulturen 23

4.1.6 Organotypische Schnittkulturen 23

4.1.7 Stimulation und Inhibition der organotypischen Schnittkulturen 24

4.1.8 Fixierung und Zuschnitt der Slicekulturen 24

4.2 Immunhistochemie 24

(4)

mit-Inhaltsverzeichnis 2

tels Improvision 26

4.4 Quantitative Bestimmung der E2-Konzentration aus Nährmedium 27

5. Ergebnisse

29

5.1 E2-Synthese unter Einfluss von GnRH bei Slicekulturen 29

5.2 E2-Synthese unter Einfluss von GnRH bei Dispersionskulturen 30

5.3 E2-Synthese unter Einfluss von GnRH, Antide und Letrozol bei

Disper-sionskulturen 31

5.4 Spinophilin-Expression unter Einfluss von GnRH und Letrozol bei

Dis-persionskulturen 32

5.5 Spinophilin-Expression der Slicekulturen 34

5.5.1 Spinophilin-Expression unter Einfluss von GnRH 34

5.5.2 Spinophilin-Expression unter Einfluss von GnRH und Antide 36

5.6 Synaptophysin-Expression der Slicekulturen 40

5.6.1 Synaptophysin-Expression unter Einfluss von GnRH 40 5.6.2 Synaptophysin-Expression unter Einfluss von GnRH und Antide 42 5.6.3 Synaptophysin-Expression unter Einfluss von GnRH, Letrozol

und E2 45

6. Diskussion

48

6.1 GnRH reguliert die Estradiolsynthese dosisabhängig 49

6.2 GnRH reguliert die Expression synaptischer Proteine über seinen

Ein-fluss auf die E2-Synthese 54

6.3 Überlegungen zum Transfer von GnRH in den Hippocampus 55

6.4 Regulation der GnRH-Rezeptoren durch E2 und GnRH 57

6.5 Die Bedeutung von GnRH für die synaptische Plastizität 60

7. Literaturverzeichnis

65

8. Danksagung

73

9. Lebenslauf und Publikation

74

(5)

Abkürzungsverzeichnis 3

1. Abkürzungsverzeichnis

17β-HOR 17β-Hydroxysteroidoxidoreduktase

3β-HSD 3β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase

Abb. Abbildung

ANOVA Analysis of Variance (Varianzanalyse)

AK Antikörper Aufl. Auflage bzw. beziehungsweise °C Grad Celsius ca. circa CA 1-3 Cornu ammonis 1-3

cAMP cyclisches Adenosinmonophosphat

CO2 Kohlendioxid

Cy3 Indocarbocyanin 3

DAPI 4',6-Diamidino-2-phenylindol

dest. destillata (destilliert)

d. h. das heißt

DHEA Dehydroepiandrosteron

E2 17β-Estradiol

EDTA Ethylendiamintetraacetat

ER-α Östrogenrezeptor Alpha

ER-β Östrogenrezeptor Beta

et al. et alii (und andere)

etc. et cetera (und so weiter)

FSH Follikel Stimulierendes Hormon

GnRH Gonadotropin Releasing Hormon

h Stunde(n)

HBSS Hank's Buffered Salt Solution

HCI Salzsäure

HMG-CoA-Reduktase Hydroxymethyl-Glutaryl-CoA-Reduktase

IP3 Inositoltriphosphat

(6)

Abkürzungsverzeichnis 4

kDa Kilodalton

KM Kulturmedium

l Liter

LH Luteinisierendes Hormon

LHRH (=GnRH) Luteinizing Hormone Releasing Hormone

Let Letrozol

M Molar

mol/l mol pro Liter

MEM Minimal Essential Medium

min Minute ml Milliliter µg Mikrogramm µl Microliter µm Micrometer mm Millimeter NaCl Natriumchlorid NaHCO3 Natriumhydrogencarbonat

NaOH Natriumhydroxid (Natronlauge)

Ncl. Nucleus

NGS Normal Goat Serum

nM Nanomolar

PBS Phosphate Buffered Saline

PFA Paraformaldehyd

RT Raumtemperatur

sog. sogenannte

SPSS Statistical Package for the Social Science

StAR Steroidogenetic Acute Regulatory Protein

Tab. Tabelle

u. a. unter anderem

U/min Umdrehungen pro Minute

v.a. vor allem

z.B. zum Beispiel

(7)

Einleitung 5

2. Einleitung

Das Sexualhormon Estradiol (E2), dessen Biosynthese hauptsächlich in den Gonaden

stattfin-det, besitzt ein vielfältiges, bis in das Gehirn reichendes Wirkungsspektrum. Die sowohl am Tiermodel als auch durch klinische Studien erworbenen wissenschaftlichen Erkenntnisse der letzten Jahre über die weitreichenden Effekte von E2 zeigen eindrücklich, dass dieses

Hor-mon, jenseits der Reproduktion, im Gehirn an vielen Funktionen, wie Lernen, Gedächtnis- und Emotionsbildung beteiligt ist. Dabei stellt der Hippocampus, als ein Teil des Cortex, ein wichtiges Ziel für das Hormon dar (Woolley und McEwen, 1992; McEwen et al., 2002). Des Weiteren konnten klinische Studien demonstrieren, dass E2 neuroprotektive Eigenschaften im

Kontext mit neurologischen bzw. neurodegenerativen Erkrankungen besitzt. Es wird vermu-tet, dass E2 das Risiko für Morbus Alzheimer und Erkrankungen aus dem Formenkreis der

Schizophrenie mindert (Azcoitia et al., 2002; Garcia-Segura et al., 2001) und förderlich auf die Genesung bei Schlaganfall wirkt (Garcia-Segura et al., 2001; Chu et al., 2008). Das Aus-maß der Bedeutung dieses Steroidhormons auf neuronaler Ebene zeigt sich möglicherweise in Zukunft in der Etablierung neuer Therapiekonzepte solcher Erkrankungen.

Jüngere Untersuchungsergebnisse haben gezeigt, dass es besonders unter Einfluss von E2 zu

einer anhaltenden Veränderung synaptischer Kommunikation zwischen den Neuronen und ihren Afferenzen kommt (Woolley und McEwen, 1992; Leranth et al., 2000; Prange-Kiel et al., 2004). Diese unter dem Begriff synaptische Plastizität beschriebenen Umgestaltungen synaptischer Bahnen, lassen sich durch morphologische Veränderungen der Dendriten von Neuronen nachweisen. So haben frühere Studien bewiesen, dass die Dichte von Spines, den postsynaptischen, dornenartigen Auswüchse an den Dendriten, (Segal und Murphy, 2001; McEwen et al., 2002) sowie die Synthese synaptischer Proteine, wie z.B. Spinophilin und Synaptophysin, im Hippocampus durch E2 induziert wird (Brake et al., 2001; Rune et al.,

2002; Hao et al., 2003; Yokomaku et al.; 2003).

Aufgrund der vielfältigen neuronalen Wirkung von E2 und seiner Bedeutung für die

synapti-sche Plastizität, gewann das Sexualhormon in den letzten Jahren zunehmend Einfluss auf den Inhalt neuroanatomischer Forschung.

Weitreichende Untersuchungen konnten belegen, dass die für die E2-Synthese benötigten

En-zyme neben den Gonaden auch in hippocampalen Neuronen nachweisbar sind (Furukawa et al., 1998; Wehrenberg et al., 2001; Shibuya et al., 2003) und diese Neurone die Fähigkeit

(8)

be-Einleitung 6

sitzen, E2 de novo zu synthetisieren (Prange-Kiel et al., 2003). Wird in hippocampalen

Zell-kulturen bzw. organotypischen SchnittZell-kulturen die lokale E2-Synthese gehemmt, verringert

sich die Zahl der Spinesynapsen und die Expression synaptischer Proteine ist verringert. Dar-aus lässt sich schließen, dass im Hippocampus generiertes E2 eine bedeutende Rolle für die

Aufrechterhaltung hippocampaler Synapsen spielt (Kretz et al., 2004).

2.1 Der Hippocampus

Der Hippocampus ist Bestandteil des zum Archicortex zählenden Abschnitts des limbischen Systems. In der Ratte ist der Hippocampus dorsal über dem Thalamus, dicht unter dem Cortex lokalisiert und erstreckt sich jeweils medial beider Temporallappen C-förmig von rostral be-ginnend in enger Lage zum Ventrikel.

Abb. 1: Lage des Hippocampus im limbischen System beim Menschen

(9)

Einleitung 7

Der vorherrschende Zelltyp im mikroskopischen Bild des Stratum pyramidale des Hippocam-pus ist die Pyramidenzelle, die sich strukturell in den zwei einzelnen Abschnitten des Cornu ammonis (CA1 und CA3) unterscheidet. In der CA1 Region bilden relativ kleine Zellen ein dicht gepacktes Zellband, welches sich in die CA3 Region als ein aufgelockerter Verband größerer Pyramidenzellen fortsetzt und sich im Hilus weiter auflockert. Der Hilus des Hippo-campus wird von den Neuronen des Gyrus dentatus, den Körnerzellen, umfasst.

An das Stratum pyramidale gliedern sich nach innen das breite Stratum radiatum und molecu- lare und nach außen das Stratum oriens an, welches aus hemmenden Körnerzellen besteht.

Abb. 2: Mikroskopischer Schnitt durch den Hippocampus (DG = Gyrus dentatus, CA = Cornu ammonis)

Quelle: modifiziert nach

http://www.deltagen.com/target/histologyatlas/atlas_files/nervous/cerebrum_hippo_10x.htm

Wichtige Afferenzen erhält der Hippocampus aus der Regio entorhinalis, einer ebenfalls zum Archicortex gehörenden Struktur, die sich im Bereich des Gyrus parahippocampalis befindet. Die überwiegende Mehrheit dieser afferenten Fasern verläuft im Tractus perforans, welcher Impulse aus dem Neocortex, Corpus amygdaloideum und Riechhirn über die Regio entorhina-lis dem Hippocampus zuführt. Weitere Faserverbindungen erreichen den Hippocampus aus dem Septum, Gyrus cinguli, Thalamus und dem Hirnstamm.

(10)

Einleitung 8

Die hauptsächlich im Fornix verlaufenden efferenten Fasern des Hippocampus projizieren zum Großteil in die Corpora mamillaria. Über den Fasciculus mamillothalamicus führen die hippocampalen Efferenzen in den Ncl. anterior des Thalamus und schließlich zum Gyrus cin-guli, dessen Fasern wiederum retrograd zum Hippocampus projizieren. Auf diesem Weg bil-det der Hippocampus eine wichtige Schaltstelle im sogenannten Papez-Neuronenkreis. Als Bestand des limbischen Systems werden dem Hippocampus zahlreiche Aufgaben zuge-rechnet, die für das Zustandekommen von Affektverhalten, Aggression, Bewusstsein und Mo-tivation verantwortlich sind. Bei der Überführung aller rational greifbaren Gedächtnisinhalte vom Kurz- ins Langzeitgedächtnis spielen der Hippocampus und die anderen Bestandteile des Papez-Neuronenkreises eine herausragende Rolle.

2.2 E

2

-Synthese im Hippocampus und biochemischer Wirkmechanismus von E

2

Die für die E2-Synthese essentiellen Enzyme konnten in verschiedenen Zellkompartimenten

des Hippocampus nachgewiesen werden (Furukawa et al., 1998; Wehrenberg et al., 2001; Shibuya et al., 2003). Die Mehrheit dieser Enzyme gehört zur Familie der Cytochrom-P450-Mischoxygenasen und katalysiert die verschiedenen Hydroxylierungen der jeweiligen Vorläu-fermoleküle.

Der erste Schritt der E2-Synthese ist die Synthese von Pregnenolon aus Cholesterin, welches

unter Mitwirkung des Trägerproteins Steroidogenic Acute Regulatory Protein (StAR) ins Mi-tochondrium transportiert wird (Segawara et al., 1996). Das von einer Desmolase aus Choles-terin synthetisierte Pregnenolon verlässt das Mitochondrium und wird im Endoplasmatischen Retikulum, wo alle folgenden Syntheseschritte ablaufen, durch das Enzym P450c-17 irrever-sibel in Dehydroepiandrosteron (DHEA) umgewandelt. Durch einen weiteren enzymatischen Prozess wird Androstendion synthetisiert, welches anschließend durch Reduktion der 17-Ketogruppe irreversibel in Testosteron überführt wird.

Der entscheidende Schritt ist schließlich die Aromatisierung von Testosteron und damit die Synthese von E2 durch den Cytochrom P450-Aromatase-Komplex. Bei diesem letztgenannten

Schritt wird die Methylgruppe (C19) von Testosteron abgespaltet und der Ring A aromati-siert.

Bereits seit längerem bekannt ist die Wirkung von E2 über intrazelluläre Rezeptoren, die der

(11)

Einleitung 9

einen allen Mitgliedern gemeinsamen modularen Aufbau mit einer am N-terminalen Ende befindlichen Domäne, welche die Interaktion mit anderen Transkriptionsfaktoren vermittelt und eine sich anschließende kurze DNA-Bindungsdomäne, die schließlich am C-terminalen Ende von einer Hormonbindungsdomäne gefolgt wird.

Abb. 3: Ablauf der Estradiol-Synthese

(12)

Einleitung 10

Die Bindung des E2 an den zytosolischen Rezeptor führt über Konformationsänderungen und

Dimerisierung zweier Rezeptoren zu deren Aktivierung. Daran anschließend erfolgt die Translokation des Hormon-Rezeptor-Komplexes in den Zellkern, wo er durch Bindung an die DNA als Transkriptionsfaktor E2-sensitiver Gene fungieren kann.

Zwei Isoformen dieses zytosolischen E2-Rezeptors können differenziert werden: ERα und

ERβ, die sowohl in den Interneuronen (Weiland et al., 1997), als auch in den Neuronen der Pyramidenzellschicht und des Gyrus dentatus des Hippocampus vorkommen (Shughrue und Merchenthaler, 2000; Wehrenberg et al., 2001; Rune et al., 2002).

Neben diesem o.g. Weg der Transkriptionsregulation konnte in späteren Forschungsreihen beobachtet werden, dass E2 auch schnell wirksame Mechanismen der Signaltransduktion

be-dient, wie dies z.B. bei der Stimulation der Second Messenger-Synthese cAMP und IP3 zu

verfolgen ist (Beyer et al., 1999), welche durch membranständige Rezeptoren vermitteln wer-den (Lee und McEwen, 2001; McEwen, 2002).

2.3 GnRH

Das im Hypothalamus synthetisierte Hormon Gonadoliberin (Gonadotropin-Releasing Hor-mone, GnRH, LHRH) nimmt über dessen stimulierende Wirkung auf die Synthese der Hypo-physenhormone LH und FSH regulierenden Einfluss auf die gonadale Hormonsynthese. Ne-ben diesem indirekten Mechanismus auf ENe-bene der Hypothalamus-Hypophysen-Gonaden-Achse, ist jedoch auch bekannt, dass dieses Hormon auf direktem Weg die gonadale E2

-Synthese beeinflusst, indem es beispielsweise in niedriger Dosis stimulierenden und in hoher Dosis inhibitorischen Effekt auf die Granulosazellen der Ovarien ausübt (Janssens et al., 2000).

In adulten Ratten erfolgt die Biosynthese von GnRH, einem Dekapeptid, neben Kernen des Hypothalamus, auch im medialen Septum und der präoptischen Area (Petersen et al. 1993). Das in den Neuronen synthetisierte Hormon besitzt einen modifizierter N-Terminus, der vor frühzeitigem Abbau durch Exopeptidasen schützt.

(13)

Einleitung 11

Abb. 4 Strukturformel von GnRH

Quelle: www.chm.tu-dresden.de/bc1/agnau/gnrh.gif

Die Sezernierung von GnRH in das Pfortadersystem der Hypophyse findet an der Eminentia mediana statt und erfolgt in regelmäßigen Pulsen von etwa 1 Minute Dauer. Die Bindung des GnRHs an einen G-Protein gekoppelten Rezeptor in der Membran gonadotroper Zellen der Adenohypophyse bewirkt deren Stimulation.

Die Aktivierung des Rezeptors führt über den Second Messenger IP3 zu einem Anstieg des

intrazellulären Ca2+-Spiegels und bewirkt mit Hilfe von Calmodulin auf diese Weise sowohl die Förderung der Synthese, als auch die episodische Sekretion der Gonadotropine FSH und LH.

Sowohl FSH als auch LH, die beide der Familie der Glykoproteinhormone zugerechnet wer-den, entfalten ihre Wirkung in den weiblichen und männlichen Gonaden. Dabei fördert FSH unter anderem das Wachstum und die Entwicklung der Keimzellen und LH wurde kontrollie-rende Wirkung bei der Produktion der Steroidhormone der Keimdrüsen nachgewiesen.

Die intermittierende Sezernierung von GnRH und somit die periodische Stimulierung der Sekretion von FSH und LH ist Voraussetzung für die Erhaltung der sekretorischen Funktion der Hypophyse. Gesteuert wird die Hypothalamus – Hypophysen – Gonaden – Zellachse durch ein komplexes Regulationssystem nach dem Prinzip der positiven und negativen Rück-kopplung. Als Beispiel sei hierbei eines der Endprodukte dieser Zellachse – E2 genannt.

Neben der indirekten Steuerungsfunktion von GnRH auf die E2-Ausschüttung über FSH und

LH, sind auch direkte Einflussmöglichkeiten von GnRH auf die E2-Synthese in den Gonaden

(14)

Einleitung 12

Ovar stimulierende Effekte in geringen Dosen und inhibitorische Wirkung in höherer Dosie-rung zeigt (Janssens et al., 2000; Parinaud et al., 1988).

Autoradiografische Analysen und in situ Hybridisierung haben gezeigt, dass GnRH-Bindungsstellen und exprimierte GnRH-Rezeptor-mRNA neben dem Ovar u. a. auch im Stra-tum pyramidale der CA1- und CA3 Region, als auch im Gyrus dentatus des Hippocampus der Ratte zu finden sind (Badr und Pelletier, 1987; Jennes et al., 1988; Leblanc et al., 1988; Jennes und Woolums, 1994; Chu et al., 2008). Obwohl GnRH nachgewiesener Maßen eine wesentliche Rolle bei der Reproduktion spielt, scheint dieses Hormon wesentlich weiter rei-chende neuronale Effekte zu besitzen (Albertson et al., 2008).

2.4 Hemmung der E

2

-Synthese

Neuere Untersuchungen zeigen, dass hippocampale Neurone in der Lage sind E2 de novo zu

synthetisieren (Prange-Kiel et al., 2003). Die dafür notwendigen Enzyme, wie StAR, Enzyme des Cytochrom P450-Komplexes und 3β-Hydrosteroid-Dehydrogenase, konnten in früheren Studien im Hippocampus nachgewiesen werden (Furukawa et al., 1998; Wehrenberg et al., 2001). Das Enzym Aromatase, welches Testosteron in E2 umwandelt, konnte in mehreren

Untersuchungen in hippocampalen Neuronen der Ratte sowohl auf mRNA-Ebene (Abdelgadir et al., 1994; Wehrenberg et al., 2001), als auch auf Protein-Ebene (Sanghera et al., 1991; Gar-cia-Segura et al., 1999) nachgewiesen werden.

Zahlreiche Varianten die E2-Synthese zu hemmen sind bekannt und finden im medizinischen

Alltag, z.B. bei der Bekämpfung ER-positiver Mammakarzinome rege Verwendung.

Wie bereits oben beschrieben, spielt das hypothalamische Hormon GnRH bei der E2-Synthese

eine wichtige regulatorische Rolle. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass dieses Hormon in beiden Systemen, den Ovarien und im Hippocampus regulatorische Funktion bei der E2

-Synthese besitzt. Diese Steuerungsfunktion macht man sich zu Nutzen, die E2-Synthese von

Hypothalamus-Hypophysenebene zu unterbinden, indem GnRH antagonisiert wird. Der GnRH Antagonist Antide ist ein Dekapeptid und wirkt kompetetiv inhibitorisch auf die G-Protein gekoppelten Rezeptoren von GnRH. Das dadurch fehlende Steuerungssignal für die E2-Synthese bringt nun diese zum Erliegen.

(15)

Einleitung 13

Eine weitere Möglichkeit die E2-Synthese zu unterbinden liegt im letzten Schritt der

Enzym-kette. Dabei hemmen Aromataseinhibitoren, z.B. Letrozol, kompetetiv die katalytische Akti-vität des Enzym Aromatase, welches Testosteron zu E2 umwandelt.

Der Einsatz von Aromataseinhibitoren ermöglicht es, die Bedeutung der hippocampalen E2

-Synthese zu untersuchen. Kretz et al. (2004) demonstrierten an Slicekulturen, nach Blockade der hippocampalen E2-Synthese mittels Letrozol, eine signifikanten Abnahme der

Spine-Synapsen-Dichte und Boutons. Umgekehrt brachte eine Behandlung der Kulturen mit exogen zugeführtem E2 keine Erhöhung der Spine- und Bouton-Dichte im Vergleich zur Kontrolle.

Diese Blockade der lokalen hippocampalen E2-Synthese geben Hinweise auf die enorme

Be-deutung hippocampalen E2 und beweisen, dass die Reduktion der E2-Synthese eine

sensitive-re Methode darstellt E2-Effekte zu untersuchen, als eine exogene Applikation des Hormons

(Kretz et. al., 2004).

2.5 Spinophilin und Synaptophysin

Bei der Signalübertragung von Neuron zu Neuron spielen die Synapsen als Kontaktstellen eine wichtige Rolle. Strukturell kann man, getrennt durch den synaptische Spalt, einen prä- und postsynaptischen Anteil in der Synapse unterscheiden.

Bei der Erregungsübertragung wird die Information durch meist niedermolekulare chemische Verbindungen, sog. Neurotransmitter, übermittelt. In präsynaptischen Nervenendigungen kommen neben Mitochondrien in großer Anzahl mit Neurotransmitter gefüllte Vesikel vor. Bei der Depolarisation einer präsynaptischen Nervenendigung kommt es zur Exozytose der Vesikel und somit zur raschen Freisetzung von Neurotransmittern in den synaptischen Spalt, wo sie innerhalb kürzester Zeit hohe Konzentrationen erreichen. Nachdem sie an die entspre-chenden Rezeptoren der postsynaptischen Membran gebunden haben, wird die Erregung wei-tergeleitet.

(16)

Einleitung 14

Abb. 5: Ausschnitt einer Synapse mit synaptischem Spalt, Lagebeziehung von Synaptophysin u. Spinophilin

Quelle: modifiziert aus http://www.nature.com/neuro/journal/v7/n6/fig_tab/nn0604-570_F1.html

Das als präsynaptischer Marker angesehene Synaptophysin ist ein Bestandteil der Vesikel-membran und ermöglicht die Anheftung der mit Neurotransmittern gefüllten Vesikel an die Plasmamembran (Tarsa und Goda, 2001; Brake et al., 2001).

Neuere Untersuchungen zeigen, dass Synaptophysin während der Synaptogenese in erstaun-lich hoher Quantität exprimiert wird und sich als eines der ersten Proteine in Zellkulturen an-reichert (Tarsa und Goda, 2001). Dieses für die synaptischen Vesikel essentielle Protein hat vielfältige, teilweise noch nicht vollständig verstandene Aufgaben. Es wird jedoch angenom-men, dass es sich entwickelnden Synapsen eine individuelle Anpassung an erhöhte oder ver-minderte Transmitterfreisetzung ermöglicht.

Mehrere Forschungsarbeiten haben gezeigt, dass Spinophilin in den Neuronen des Hippo-campus fast ausschließlich in den Dendriten lokalisiert ist. Dieses postsynaptische Protein ist für die Bildung und Funktion der dendritischen Dornfortsätze, sog. Spines, von entscheiden-der Bedeutung (Allen et al., 1997; Feng et al., 2000; Hao et al., 2003; Muly et al., 2004) und kann deshalb als indirekter Marker für Spines betrachtet werden (Brake et al., 2001; Alves et

(17)

Einleitung 15

al., 2002). Spinophilin interagiert mit unterschiedlichen Proteinen. Es bündelt Aktinfilamente und ist für die Bildung, Aufrechterhaltung und Gestalt des für die Spines unerlässlichen Zyto-skeletts verantwortlich (Fifkova, 1985; Matus, 2000; Kaech et al., 2001). Aufgrund seiner Funktion ist Spinophilin ebenfalls ein geeigneter Marker für dynamische Veränderungen der Spinedichte (Amateau und McCarthy, 2002).

Die im Zusammenhang mit unseren Untersuchungen stehenden Proteine Synaptophysin und Spinophilin sind mit Hilfe von spezifischen Antikörpern immunhistochemisch nachweisbar und die somit messbaren Veränderungen ihrer Quantität zeigen Veränderungen in der Menge der vorhandenen Spinesynapsen an.

2.6 Fragestellung

Es ist schon seit längerem bekannt, dass E2 die synaptische Plastizität im Hippocampus

beein-flusst. Im Hippocampus weiblicher Nager fluktuiert die Spinesynapsendichte mit dem ovariel-len Zyklus der Tiere, woraus zunächst geschlossen wurde, dass gonadales E2 der regulierende

Faktor ist (Woolley et al., 1990; Gould et al., 1990). Neuere Untersuchungen zeigen aber, dass in den Neuronen des Hippocampus E2 de novo synthetisiert wird (Prange-Kiel et al.,

2003). Dabei sind die enzymatischen Voraussetzungen im Hippocampus mit denen der Gona-den absolut iGona-dentisch (Abdelgadir et al., 1994; Furukawa et al., 1998; Garcia-Segura et al., 1999; Wehrenberg et al., 2001). Neuere Forschungsergebnisse weisen zudem darauf hin, dass daslokal, im Hippocampus, synthetisierte E2 die synaptische Plastizität reguliert (Kretz et. al.,

2004). Allerdings ist es bislang weitestgehend unbekannt, welche Faktoren für die Regulation der hippocampalen E2-Synthese verantwortlich sind.

Da nachgewiesenermaßen die gonadale E2-Synthese durch das hypothalamische Hormon

Go-nadotropin-Releasing-Hormon (GnRH) reguliert wird und GnRH-Bindungsstellen auch im Hippocampus vorkommen, soll in der vorliegenden Arbeit geklärt werden, ob GnRH und sein Antagonist Antide die hippocampale E2-Synthese regulieren. Um dieser Frage auf den Grund

zu gehen werden sowohl Slice- als auch Dispersionskulturen mit GnRH, GnRH und Antide (kompetetiver Antagonist von GnRH) und GnRH, Letrozol (Hemmer der Aromatase) und 17β Estradiol (E2) behandelt. Anschließend wird die Freisetzung von E2 in das Zellkulturmedium,

als Parameter für die E2-Synthese, bestimmt. Außerdem werden die Indikatorproteine für die

(18)

immunhistoche-Einleitung 16

misch nachgewiesen und mittels computer-gestützter Bildanalyse quantifiziert. Da bereits bekannt ist, dass beide synaptischen Marker von E2 beeinflusst werden, dienen

Veränderun-gen in ihre Expressionsmenge als indirekter Nachweis für GnRH-abhängige VeränderunVeränderun-gen in der E2-Synthese.

(19)

Arbeitsmaterialien 17

3. Arbeitsmaterialen

3.1 Material

Adhäsions-Objektträger, Histobond MARIENFELD

Aluminiumfolie LAGER UKE

Cutfix Surgical Disposable Skalpell BRAUN

Deckgläser, 21x26 mm MARINFELD

Deckgläser, 24x60 mm MARINFELD

Einmalspritzen, verschiedene Größen BRAUN

ep T.I.P.S. Standard 500-1000 µl EPPENDORF AG

Falcon Cell Strainer, 40 µm Nylon BECTON DICKINSON

Falcon Tissue Kulturplatte, 6 Well BECTON DICKINSON

Falcon Tubes, 15 ml, 50 ml BECTON DICKINSON

Handschuhe KIMBERLY-CLARK

Heidemannspatel M AESCULAP DE

Instrumentenkasten MERCK

Mikroskopische Deckgläser ASSISTENT

Neubauer Zählkammer, Tiefe 0,1 mm; 0,0025 mm2 BRAND GERMANY

Parafilm M PECHINEY PLASTIC

Pasteurpipetten, 25 cm MERCK

Pinzette nach Dumont MERCK

Pipetten, diverse GILSON

Pipettenspitzen, diverse BECTON DICKINSON

Reaktionsgefäße 3810X, 1,5 ml EPPENDORF AG

Schere AESCULAP DE

Spritzenvorsatzfilter, 0,22 µm MERCK

Tissue Culture Dish, 35x10 mm BECKTON DICKINSON

Zellstofftücher Samtess WEPA

3.2 Geräte

Brutschrank WTC BINDER

Gefrierschrank, -25°C, -80°C LIEBHERR

Hettrich Zentrifuge, EBA 1R HETTRICH

Kryostat MICROM HM 560

Kühlschrank, 4°C BOSCH

Laser-Scan Mikroskop LSM, ZEISS, JENA, GERMANY

Mikroskop Axiovert 2 ZEISS

Sicherheitswerkbank Klasse 2 HERAEUS

Vortex-Gene 2 SCINTIFIC INDUSTRIES

Waage SARTORIUS

Wasserbad mit Schüttler GFC

(20)

3.3 Software

Axio Vision 3.1 CARL ZEISS

Excel 2000 MICROSOFT

LSM Image Browser, Version 3,2,0,115 ZEISS

Openlab 3.1.5 IMPROVISION Photoshop 7.0 ADOBE See 5.0 ACD SPSS für Windows SPSS GmbH SOFTWARE Windows 2000 MICROSOFT Windows XP MICROSOFT Word 2000 MICROSOFT

3.4 Chemikalien

17β-Estradiol (E2) -Water soluble, 100 mg SIGMA

Aceton MERCK

Albumine, Bovine, BSA SIGMA

Antide 100 nM SIGMA

Aqua ad iniectabilia BAXTER DEUTSCHLAND

DAKO, S 3023 (Eindeckmedium) DAKO CYTOMATION

DAPI SIGMA

Desinfektionsmittel, BARRYCIDAL 36 HELMUT SCHRÖDER, Stuttgart

Ethanol, 70 %, 96 % Apotheke UKE

Formaldehydlösung, 37 % MERCK

GnRH (LHRH) SIGMA

Letrozol NOVARTIS

L-Glutamin, 200 nM GIBCO

Natronlauge MERCK

Neurobasal A Medium GIBCO

Neurobasal A Medium ohne Phenolrot GIBCO

Normal Goat Serum 2 % (NGS) SIGMA

Penicillin/Streptomycin GIBCO PBS-Tabletten GIBCO PFA MERCK Poly-d-Lysin SIGMA Saccharose MERCK Salzsäure MERCK Trypsin/EDTA BIOCHROM

(21)

3.5 Antikörper

Primärantikörper Poly-/Monoklonal Herkunft Verdünnung in PBS Firma

Spinophilin polyklonal Kanninchen 1:750 Upstate

Synaptophysin monoklonal Maus 1:1000 Chemicon

Sekündärantikörper Poly-/Monoklonal Herkunft Verdünnung in PBS Firma

Cy3 polyklonal

Ziege-anit-Kanninchen

1:500 Jackson

Cy3 monoklonal Ziege-anti-Maus 1:500 Jackson

Tab. 1: Liste verwendeter Primär- und Sekundärantikörper

3.6 Lösungen

Beschichtung der Dispersionskultur-Platten

! 600 µl Poly-d-Lysin (0,1 mg/ml Aqua dest.) pro Kavität ! 12 h inkubieren

! abpipettieren und mit Neurobasal A spülen (mit Phenolrotzusatz) ! mindestens 2 h trocknen lassen

Fixierung (3,7% Formaldehydlösung)

! 5 ml Formaldehyd (37%) ! 45 ml PBS

bFGF

! 5 mM Tris in Aqua dest. gelöst, pH = 7,6 ; sterilfiltern

! 50 µl bFGF in 1000 µl Tris-Lösung lösen; vortexen und aliquotieren ! bei -25°C lagern Kulturmedium für Dispersionskultur ! 500 µl B27 ! 125 µl L-Glutamin ! 500 µl Penicillin/Streptomycin ! 50 µl bFGF ! ad 50 ml Neurobasal A

(22)

Kulturmedium für Slicekultur

! 50% MEM ! 25% HBSS

! 25% hitzeinaktiviertes, steriles Pferdeserum ! 2 mM Glutamin ! 0,044% NaHCO3 ! pH = 7,4 bei RT PBS ! 8 g NaCl ! 0,2 g KCL ! 1,44 g Dinatriumhydrogenphosphat ! 0,2 g Kaliumhydrogenphosphat ! 1 L Aqua dest. ! pH = 7,4 bei RT alternativ: ! 1 PBS Tablette ! 500 ml Aqua dest.

! Titration bis pH=7,4 bei RT mit NaOH (1 mol/l) bzw. HCL (1 mol/l)

PFA, 4%ig ! 4 g Paraformaldehyd ! 100 ml PBS ! pH = 7,4 bei RT Saccharose-Lösung, 25%ig ! 25 g Sacchararose ! 100 ml PBS

(23)

Methoden 21

4. Methoden

4.1 Hippocampale Dispersions- und Slicekulturen

4.1.1 Verwendete Tiere

In den Experimenten wurden 5 Tage alte, von der zentralen Tierhaltung des Universitätsklini-kums Hamburg-Eppendorf zur Verfügung gestellte Ratten des Zuchtstamms WISTAR ver-wendet. Die Tiere wurden unter kontrollierten Bedingungen gehalten, Futter und Wasser wa-ren ad libitum verfügbar. Alle Experimente wurden unter Einhaltung einheitlicher Richtlinien des Tierschutzes durchgeführt.

4.1.2 Präparation des Hippocampus aus der Ratte

Die Präparation des Hippocampus erfolgte unter semisterilen Bedingungen. Dazu wurde die Ratte dekapitiert und die Haut über der Schädelkalotte entfernt. Anschließend wurde mit einer feinen, geraden Schere das Schädeldach median sagittal eröffnet und die Schädelknochen mit einer gebogenen Pinzette entfernt. Das freigelegte Gehirn wurde dann vorsichtig mit Hilfe eines Heidemannspatels entnommen und auf ein mit PBS getränktes Schwammtuch gelegt. Nach Entfernung von Kleinhirn und Hirnstamm mit einem Skalpell wurden beide Großhirn-hemisphären ebenfalls mit dem Skalpell voneinander getrennt. Aus den Hirnhälften wurden nun nacheinander die Hippocampi mit einem Heidemannspatel herausgeschält und in gekühl-tes PBS gegeben.

4.1.3 Dispersionskulturen

Der Präparation hippocampaler Dispersionskulturen diente die von Brewer (1997) beschrie-bene Methode, welche von Prange-Kiel et al. (2003) geringfügig modifiziert wurde. Einen Tag vor der Präparation der Hippocampi wurde in jede Kavität einer 24 Well Titerplatte ein rundes Glasplättchen platziert und anschließend für eine Stunde mit 600 µl Poly-d-Lysin

(24)

be-Methoden 22

schichtet. Nach Absaugen des Poly-d-Lysins mit einer Pipette und Spülen jeder Kavität mit Neurobasal A, wurden die Titerplatten über Nacht unter sterilen Bedingungen bei Raumtem-peratur getrocknet.

Die Weiterbehandlung der zuvor entnommenen Hippocampi fand unter sterilen Bedingungen unter der Sicherheitswerkbank statt. Um Meningen- und Gefäßreste zu entfernen, wurden die präparierten Hippocampi mehrmals mit PBS gespült. Daraufhin wurden die Hippocampi in einer Petrischale mit einer Klinge grob zerkleinert und in ein 50 ml Falconröhrchen, das 25 ml PBS enthielt, überführt. Das zerkleinerte Gewebe wurde bei 4 °C mit 5000 U/min für fünf Minuten zentrifugiert und der Überstand anschließend verworfen.

Nun erfolgte der Verdau der extrazellulären Proteine mit dem Ziel Einzelzellen zu gewinnen. Dem Pellet wurde pro Hippocampus 250 µl Trypsin/EDTA (auf 37 °C erwärmt) zugefügt und die Suspension wurde unter mehrmaligem, heftigen Schütteln in einem 37°C warmen Was-serbad für 2,5 Minuten inkubiert. Der Verdau wurde schließlich durch Zugabe von 25 ml Neurobasal A gestoppt und die Zellsuspension durch ein Nylon-Sieb (Cell-Strainer, 40 µm Maschenweite) in ein neues Falconröhrchen filtriert, um unverdaute Gewebestücke zurückzu-halten. Es folgte eine weitere Zentrifugation bei 4°C mit 5000 U/min für fünf Minuten. Der Überstand wurde erneut verworfen und durch Phenolrot-freies Neurobasal A Medium ersetzt, in diesem wurde das Pellet resuspendiert. Auf Phenolrot wurde verzichtet, da es E2-ähnliche

Wirkung hat (Berthois et al., 1986). Der eben beschriebene Waschschritt wurde noch einmal wiederholt.

Anschließend erfolgte die Bestimmung der Zellzahl mit Hilfe einer Neubauer-Zählkammer. Für alle Versuche wurde eine Zellsuspension mit einer Dichte von 100.000 Zellen/ml einge-stellt. Jeweils 1 ml dieser Suspension wurde nach vorherigem Vortexen auf die mit Poly-d-Lysin beschichteten Glasplättchen in die Wells gegeben.

4.1.4 Stimulation und Inhibition der Dispersionskulturen

Die Vorkultur bei den Dispersionskulturen betrug 4 Tage. Danach wurde dem Dispersionskul-turmedium im folgenden Versuchsansatz in abstufenden Konzentrationen 1 nM, 10 nM, 100 nM und 500 nM GnRH zugegeben. In dem anschließenden Experiment wurden die Dispersi-onskulturen mit jeweils 10 nM GnRH, bzw. 100 nM Antide, der Kombination aus 10 nM GnRH und 100 nM Antide oder mit 100 nM Letrozol behandelt. Im letzten Versuchsansatz

(25)

Methoden 23

wurde dem Kulturmedium der Dispersionskulturen 10 nM GnRH, bzw. 100 nM Letrozol oder jeweils beides in Kombination zugesetzt.

Bei allen Versuchsansätzen wurde das Kulturmedium sowie die Zusätze jeden zweiten Tag gewechselt.

4.1.5 Fixierung der Dispersionskulturen

Das Nährmedium wurde aus jedem Well vorsichtig abgesaugt und zur Fixierung durch 1 ml 3,7-prozentige Formaldehydlösung ersetzt. Nach zehn Minuten wurde die Fixierlösung durch PBS ausgetauscht und die Zellen 3 x 5 Minuten mit PBS gespült. Nach nochmaligem Absau-gen der Waschlösung erfolgte nach dem letzten Waschschritt die Zugabe von jeweils 1 ml PBS in jede Kavität und die anschließende Lagerung der Kulturplatte im Kühlschrank bei 4°C.

4.1.6 Organotypische Schnittkulturen

Die für die Slicekulturen verwendeten Hippocampi stammten von 5 Tage alten Ratten und wurden wie in Abschnitt 4.1.2 beschrieben präpariert. Anschließend wurden die Hippocampi mit Hilfe eines tissue choppers rechtwinklig zur longitudinalen Achse in 400 µm dünne Slices geschnitten und nach der von Stoppini et al. (1991) beschriebenen Methode weiterbehandelt. Die ausgewählten Slices wurden in geringem Abstand zueinander auf zuvor mit sterilem PBS befeuchtete Membraneinsätze (0,4 µm Maschenweite, 30 mm Durchmesser) platziert. Die Kavitäten von 6-Well-Platten (35 mm Durchmesser) wurden mit jeweils 0,8 ml Medium be-füllt und die mit den Slices bestückten Membraneinsätze darin eingelassen, so dass sich die Slices an der Luft-Medium-Grenze befanden. Die Kulturen wurden unter sterilen Bedingun-gen für 14 Tage bei 37°C und befeuchteter, CO2-angereicherter Atmosphäre inkubiert und das

(26)

Methoden 24

4.1.7 Stimulation und Inhibition der organotypischen Schnittkulturen

Nach 14-tägiger Vorkultur der Slicekulturen wurden dem jeden zweiten Tag gewechselten Inkubationsmedium für weitere 8 Tage GnRH zugesetzt. Dabei wurden vier verschiedene GnRH-Konzentrationen (1 nM, 10 nM, 100 nM und 500 nM) verwendet. In einem weiteren Versuchsansatz wurden die Slicekulturen auf gleiche Weise mit GnRH behandelt und Antide (100nM) zugesetzt. Im dritten Versuchsansatz wurden nach gleicher Vorkulturzeit die Slice-kulturen mit 10 nM GnRH inkubiert oder der Aromatasehemmer Letrozol zugesetzt und wei-tere Kulturen gleichzeitig mit einer Mischung aus 10 nM GnRH und 100 nM Letrozol, bzw. 10 nM GnRH, 100 nM Letrozol und 17-β Estradiol (E2) behandelt.

4.1.8 Fixierung und Zuschnitt der Slicekulturen

Nach Absaugen des Nährmediums aus jedem Well wurden den Slicekulturen zur Fixierung über Nacht 4% PFA zugesetzt. Anschließend wurde das PFA durch 25%ige Saccharose (in PBS) ersetzt und die Kultur für weitere 6 Stunden inkubiert.

Nach Entfernen der Saccharose wurden die Slicekulturen auf Glasplättchen überführt, mit Tissue-Tek ® bedeckt und in durch Flüssigstickstoff gekühltem Methylbutan schnellgefroren. Die Lagerung der Slicekulturen erfolgte bei -80°C.

Einzelne Slicekulturen wurden ohne die Kühlkette zu unterbrechen am Kryostaten in 12 µm dünne Slices geschnitten. Daraufhin wurden diese auf Objektträger gezogen, luftgetrocknet und schließlich für 15 Minuten in kaltem (-20ºC) Aceton fixiert. Die Lagerung der Schnitte erfolgte in Gefrierboxen bei -25°C.

4.2 Immunhistochemie

Nach Entnahme aus den Gefrierboxen, wurden die Slices noch mal für 10 Minuten in 4% PFA fixiert und anschließend für weitere 3 x 5 Minuten in PBS gewaschen. Die bereits fixier-ten Zellen der Dispersionskulturen wurden ebenso wie im letztgenannfixier-ten Vorgang nochmals mit PBS gespült. Die nun folgenden Schritte der Immunhistochemie waren für Slice- und Dispersionskulturen identisch.

(27)

Methoden 25

Nach dem Waschvorgang wurden die Kulturen mit 2% Normal Goat Serum (NGS) für 30 Minuten bei Raumtemperatur blockiert, um unspezifische Antikörperreaktionen zu verhin-dern. Danach wurden die Kulturen mit dem Primär-Antikörper behandelt. Synaptophysin wurde dabei im Verhältnis 1:1000 und Spinophilin im Verhältnis 1:750 angewandt. Die Pri-mär-Antikörper wurden jeweils in PBS verdünnt und nach Absaugen der NGS-Lösung wur-den in jede Kavität, bzw. auf jewur-den Objektträger 50 µl der Antikörperlösung gegeben. Die Inkubation der mit Parafilm verschlossenen Dispersionskultur und der in einer feuchten Kammer befindlichen Slicekultur-Objektträger erfolgte über Nacht bei 4 °C.

Am folgenden Tag wurde die Primär-Antikörperlösung entfernt und die Kulturen erneut 3 x 5 Minuten in PBS gewaschen. Der Fluorochrom-markierte Sekundär-Antikörper wurde im fol-genden Arbeitsschritt in einem Verhältnis von 1:500 in PBS verdünnt und 50µl in jede Kavi-tät der Dispersionskulturen, bzw. auf jeden Slicekultur-Objektträger gegeben. Bei dem Zwei-tantikörper für Synaptophysin handelte es sich um einen Cy3-markierten goat-anti-mouse-Antikörper, bei Spinophilin wurde ein ebenfalls Cy3-markierter goat-anti-rabbit-Antikörper benutzt. Die Inkubation mit dem Zweitantikörper dauerte eine Stunde bei Raumtemperatur und unter abgedunkelten Bedingungen, da die fluoreszenz-markierten Antikörper lichtemp-findlich sind.

Im letzten Schritt wurde nach Ablauf der Inkubationszeit die Zweitantikörper-Lösung entfernt und es folgten drei Spülschritte (je 5 Minuten) mit PBS. Für die Kernfärbung der Kulturen diente DAPI in einer Verdünnung von 1:10 000 in PBS. Dabei wurde nach einminütiger In-kubation die Färbelösung entfernt und die Zellen bzw. Schnitte dreimal gründlich mit PBS gespült.

Die Glasplättchen der Dispersionskulturen wurden auf einen Objektträger überführt, diese und die Objektträger der Slicekulturen mit einem Tropfen DAKO beschichtet und mit Deck-gläschen bedeckt.

(28)

Methoden 26

4.3 Dokumentation mit konfokalem Lasermikroskop und Bildanalyse mittels

Improvision

Die Dokumentation der immunhistochemischen Färbungen wurde mit Hilfe des LEICA La-ser-Scanning Microscope SP2 durchgeführt. Dabei wurden einmal gewählte Einstellungen des Mikroskops (Laserintensität, Belichtungszeit, etc.) nicht mehr variiert, sodass für die ver-schiedenen Versuchsgruppen gleiche Bedingungen herrschten. Die Signale der Fluorochrom-markierten Antikörper wurden bei jeweils gleicher Wellenlänge – d. h. 370 nm für DAPI und 546 nm für Cy3 - und gleicher Belichtungszeit detektiert, wobei ein 63x-Öl-Immersionsobjek-tiv verwendet wurde.

Einzelne willkürlich gewählte Zellen der Dispersionskulturen wurden digital aufgenommen, wobei die 4fach-Zoom Einstellung des Mikroskops verwendet wurde. Pro Versuchsgruppe wurden 15 Zellen fotografiert und anschließend analysiert.

Bei den Slicekulturen analysierten wir die CA1 und CA3 Region des Stratum pyramidale. Unter Verwendung des 2fach-Zooms wurden bei den Versuchen mit GnRH und GnRH mit Letrozol aus 3 Slices, bzw. bei dem Versuch mit GnRH und Antide aus 4 Slices, pro Behand-lung jeweils 3 Bilder aus jeder Region pro Slice aufgenommen.

Die semiquantitative Auswertung der gescannten Bilder wurde mit dem Programm OPENLAP 2.2.5 (Improvision) auf einem Macintosh (Betriebssystem: OS 9.1) durchgeführt.

Hierbei legten wir zunächst, unter Nutzung der wie oben beschrieben ohne Primärantikörper inkubierten Kontrollgruppen, einen Schwellenwert fest um den spezifischen staining index für jede Behandlungsreihe zu definieren und Hintergrundfärbung zu unterscheiden. Dazu wurden Ausschnitte der Kontrollgruppe ausgewählt und die geringfügig über der Hintergrundfärbung liegenden Färbeintensität als Schwellenwert für alle nachfolgenden Bildanalysen der jeweili-gen Behandlungsreihe festgelegt.

Anschließend wurden jeweils fünf zufällig gewählte Areale definierter Größe pro Nervenzelle der Dispersionskulturen, bzw. des Slice Ausschnittes der CA-Region der Slicekulturen aus-gewählt, welche die Größe der fluorochrom-markierten Fläche (dargestellt durch die Menge der Pixel) präsentieren. Die Fläche jedes Synaptophysin- und Spinophilin-Signals wurde mit der jeweiligen Intensität multipliziert und ergab so den staining-index.

(29)

Methoden 27

Mit dem Windows-Programm SPSS erfolgte schließlich die statistische Auswertung.

Dabei wurden zunächst der Mittelwert und der Standardfehler des Mittelwertes (SEM) aus allen Bildern aller Slices, bzw. Zellen der Dispersionskulturen aller Versuche pro Behand-lungsgruppe berechnet. Aus der Zahl der Bilder/Behandlung multipliziert mit der Anzahl der Versuchsansätze ergibt sich somit n, welches jeweils unterhalb der Grafiken angegeben ist. Die Unterschiede in den Messwerten der verschieden behandelten Kulturen jeder Behand-lungsreihe untereinander und im Vergleich zur Kontrollreihe wurden mit Hilfe von ANOVA und durch einen anschließenden post-hoc-Test (Dunnett, LSD) auf Signifikanz (p<0,05) über-prüft.

Die grafische Darstellung der Ergebnisse erfolgte im letzten Schritt mit dem Windows-Programm Excel.

4.4 Quantitative Bestimmung der E

2

-Konzentration aus Nährmedium

Die quantitative Ermittlung der E2-Konzentration im Nährmedium der Dispersions- und

Sli-cekulturen wurde mittels Radio-Immun-Assay (RIA) durchgeführt. Der RIA zeichnet sich durch seine hohe analytische Sensitivität und die nur im geringen Maße vorhandene Kreuzre-aktivität mit anderen Steroiden aus (von Schassen et al., 2006).

Für die Bestimmung der E2-Konzentration wurde das Medium der Dispersions- und

Slicekul-turen bei dem jeden zweiten Tag durchgeführten Mediumwechsel gesammelt. Da für die E2

-Messungen mindestens 3,5 ml Medium benötigt wurden, wurde das Medium jedes einzelnen Wells über den gesamten Behandlungszeitraum gesammelt und anschließend zusammenge-führt. Die Vorbehandlung des Mediums und die E2-Messung wurden nach der von Schassen

et al. (2006) beschrieben Methode durchgeführt.

Zunächst erfolgte die Probenaufreinigung. Für diesen Schritt wurden 3,5 ml des Kulturmedi-ums auf eine SEP-PAK-C18 Säule (Millipore, Bedford, MA) gegeben, welche zuvor mit 5 ml

Methanol und 5 ml Wasser äquilibriert wurde. Danach erfolgte ein Waschvorgang mit Am-moniumacetat-Puffer (0,1 M; pH 4; 5 ml) um hydrophile Komponenten zu entfernen. An-schließend wurde die Säule mit 2 ml Methanol eluiert und das Eluat vakuum-getrocknet. Im letzten Vorbereitungsschritt wurde das getrocknete Eluat in 250 µl RIA-Puffer wieder gelöst. 25 µl der Probe wurden mittels E2-RIA unter Verwendung eines Standartprotokolls und mit

(30)

Methoden 28

Bestimmung des Hintergrundsignals genauso behandelt wie die Zellkulturüberstände. Die Messwerte dieser Proben wurden von den Werten der Kulturüberstandproben subtrahiert. Für jede Behandlungsreihe und jede Dosis wurden 10 wells untersucht. Für die statistische Aus-wertung wurden zunächst die Mittelwerte jeder Dosis pro Behandlungsreihe ermittelt. An-schließend wurde das Mittel der Mittelwerte, sowie der Standardfehler des Mittelwertes (SEM) der unterschiedlichen Versuchsansätze errechnet. Um die Prozentwerte der E2-Werte

zu berechnen wurde die durchschnittliche E2-Konzentration des Mediums unbehandelter

Dis-persionskulturen bestimmt und auf 100% gesetzt. Die ermittelten E2-Konzentrationen der

behandelten Dispersionskulturen wurden in Relation dazu gesetzt und mit dem Microsoft-Programm Excel grafisch dargestellt und die Anzahl der ausgewerteten Versuche = n in der Tabellenlegende beschrieben.

Auch hier wurden die Unterschiede in den Messwerten der verschieden behandelten Kulturen jeder Behandlungsreihe untereinander und im Vergleich zur Kontrollreihe mit Hilfe von ANOVA und durch einen anschließenden post-hoc-Test (Dunnett, LSD) auf Signifikanz (p<0,05) überprüft.

(31)

Ergebnisse 29

5. Ergebnisse

5.1 E

2

-Synthese unter Einfluss von GnRH bei Slicekulturen

Im ersten Teil unserer Versuchsreihe wurde Kulturmedium aus Slicekulturen auf die Frage hin untersucht, ob GnRH in unterschiedlichen Konzentrationen Einfluss auf die Östrogensyn-these hippocampaler Neurone nimmt. Wie im Abschnitt 4.1 des Methodenteils bereits aus-führlich dargestellt, wurden die hierbei untersuchten Slicekulturen nach 14tägiger Vorkultur über 8 Tage mit GnRH in Konzentrationen zwischen 1 nM und 500 nM behandelt und das in das Kulturmedium freigegebene E2 mittels Radio-Immun-Assey gemessen.

Abb. 6: E2-Synthese, gemessen im Medium von Slicekulturen, Angaben in % der Kontrolle. Die Linien

zeigen die Signifikanz: p < 0,05 = *, p < 0,01 = **, p < 0,001 = ***; (Mittelwert ± SEM, n = 8).

Die Ergebnisse dieser Messungen machen deutlich, dass GnRH dosisabhängig Einfluss auf die E2-Synthese nimmt (Abb. 6). Unsere Messungen des ins Medium abgegebenen E2 nach

8tägiger Behandlung der hippocampalen Slicekulturen wiesen bei einer mittleren Dosis von 10 nM GnRH einen, im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle, signifikanten Anstieg der E2

-Synthese nach. Umgekehrt dagegen fiel bei der mit der Höchstdosis von 500 nM GnRH be-handelten Gruppe im Vergleich zur Kontrolle und zu allen bebe-handelten Kulturgruppen, ein leichter Rückgang der E2-Synthese auf. Allerdings ist lediglich der Unterschied gegenüber der

10 nM Gruppe statistisch signifikant. Die übrigen Kulturgruppen, welche mit 1 nM bzw. 100 nM GnRH behandelt wurden, zeigten keinerlei Veränderungen in der Quantität des ins

Kul-0 20 40 60 80 100 120 140 Kontrolle 1 nM GnRH 10 nM GnRH 100 nM GnRH 500 nM GnRH Es tr ad io l-Sy n th es e (% d er K o n tr o lle )

*

**

(32)

Ergebnisse 30

turmedium freigegebenen E2, weder im Bezug auf die Kontrollgruppe noch im Bezug auf

andere Behandlungsgruppen.

5.2 E

2

-Synthese unter Einfluss von GnRH bei Dispersionskulturen

In diesem Versuchsansatz wurden wie im Methodenabschnitt 4.1.4 beschrieben, den Disper-sionskulturen in den Konzentrationen 1 nM, 10 nM, 100 nM und 500 nM über einen Zeitraum von 8 Tagen GnRH zugesetzt. Anschließend erfolgte die Messung der E2-Konzentration im

Medium nach dem in Abschnitt 4.4 dargestellten Verfahren. In diesem Versuch sollte her-ausgefunden werden ob und bei welcher Konzentration sich GnRH auf die E2-Synthese in

Dispersionskulturen auswirkt.

Abb. 7: Menge der E2-Synthese aus Dispersionskultur-Medium in % der Kontrolle. Die Linien zeigen die

Signifikanz: p < 0,05 = *, p < 0,01 = **, p < 0,001 = ***; (Mittelwert ± SEM, n = 5).

Die E2-Messungen ergaben (Abb. 7), dass es bei einer Stimulation von 10 nM und 100 nM

GnRH zu einem signifikanten Anstieg der E2-Synthese kommt, wobei die größte

Synthese-leistung, ähnlich den Ergebnissen der Slicekulturen, bei der mit 100 nM GnRH behandelten Dispersionskultur-Gruppe nachgewiesen wurde.

Die mit 1 nM und 500 nM GnRH stimulierten Gruppen zeigen hingegen keinen signifikanten Unterschied zur unbehandelten Kontrolle.

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 Kontrolle 1 nM GnRH 10 nM GnRH 100 nM GnRH 500 nM GnRH Es tr ad io l-Sy n th es e (% d er K o n tr o lle )

*******

*

(33)

Ergebnisse 31

5.3 E

2

-Synthese unter Einfluss von GnRH, Antide und Letrozol bei

Dispersions-kulturen

In diesem Experiment wurde die Frage untersucht, ob der beobachtete Effekte von GnRH auf die E2-Synthese spezifisch ist. Für diese Untersuchung wurden Dispersionskulturen über 8

Tage mit 10 nM GnRH, 100 nM Antide, 100 nM Letrozol und jeweils der Kombination aus 10 nM GnRH und 100 nM Antide, bzw. 10 nM GnRH und Letrozol behandelt und die E2

-Menge im Medium bestimmt.

Abb. 8: Menge der E2-Synthese aus Dispersionskultur-Medium in % der Kontrolle. Die Linien zeigen die

Signifikanz: p < 0,05 = *, p < 0,01 = **, p < 0,001 = ***; (Mittelwert ± SEM, n = 4).

Die Ergebnisse dieser Untersuchungsreihe (Abb. 8) konnte eine signifikante Erhöhung der E2

-Konzentration im Nährmedium nach der Stimulation mit 10 nM GnRH im Vergleich zur Kontrolle und allen anderen, mit Antide, bzw. Letrozol behandelten Gruppen nachweisen. Bei den mit 100 nM Letrozol behandelten Dispersionskulturen kam es zu einer signifikanten Verminderung der E2-Synthese gegenüber der Kontrollgruppe. In den übrigen Gruppen dieser

Untersuchungsreihe waren untereinander keine signifikanten Unterschiede der E2

-Konzentration messbar. 0 100 200 300 400 Kontrolle 10 nM GnRH 100 nM Antide 10 nM GnRH +

100 nM Antide 100 nM Letrozol 10 nM GnRH + Letrozol

Es tr ad io l-Sy n th es e (% d er K o n tr o lle )

*

**

*

(34)

Ergebnisse 32

5.4 Spinophilin-Expression unter Einfluss von GnRH und Letrozol bei

Dispersi-onskulturen

In dieser Versuchsreihe sollte die Wirkung von GnRH und Letrozol auf die Expression des Markerproteins Spinophilin bestimmt werden. Die Dispersionskulturen wurden über 8 Tage mit GnRH, Letrozol und der Kombination aus GnRH und Letrozol behandelt. Anschließend wurde nach der in Abschnitt 4.2 beschriebenen Methode, der staining index für das Marker-protein Spinophilin mittels Immunhistochemie, anschließender LSM und digitaler Bildanaly-se in den Dispersionskulturen bestimmt.

Abb. 9: Spinophilin-Signale (rot dargestellt) aus der CA1-Region (Stratum radiatum) des Hippocampus.

Die Nuklei der Neurone erscheinen durch die DAPI-Färbung blau. Der Maßstab entspricht 10µm.

Abbildung 9 zeigt die Immunreaktivität des mit Cy3-markierten synaptischen Proteins Spino-philin an einzelnen Neuronen der Dispersionskulturen. Die Nuclei der Neurone sind durch die DAPI-Färbung blau dargestellt. Die unterschiedliche Intensität der Spinophilin-Signale ist deutlich zu erkennen, wobei unter GnRH eine deutliche Zunahme und unter Letrozol eine Abnahme der Färbung im Vergleich zur Kontrolle zu erkennen ist.

(35)

Ergebnisse 33

Abb. 10: Auswertung der Immunreaktion mit Anti-Spinophilin-Antikörper in Dispersionskulturen nach

Be-handlung mit GnRH und Letrozol. Die Linien zeigen die Signifikanz (Signifikanzniveau ab 0,05); (Mittelwert ± SEM, n = 30).

Die Berechnungen des staining index zeigen, dass es im Vergleich zur unbehandelten Kon-trolle nach einer Stimulation mit 10 nM GnRH zu einem signifikantem Anstieg der Spinophi-lin-Expression in Dispersionskulturen kam, wohingegen die Behandlung mit Letrozol, als auch die Kombination aus GnRH und Letrozol sowohl zu der mit 10 nM GnRH als auch zu der unbehandelten Kontrollgruppe zu einer signifikanten Herunterregulation der Markerprote-ine führte (Abb. 10).

0 50 100 150 200 250

Kontrolle 10 nM GnRH 100 nM Letrozol Letrozol + GnRH

R el ati ve r sta in in g in d ex (% d er K o n tr o lle ) p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001 p = 0,002 p = 0,002

(36)

Ergebnisse 34

5.5 Spinophilin-Expression der Slicekulturen

5.5.1 Spinophilin-Expression unter Einfluss von GnRH

Um die Spinophilin-Expression unter dem Einfluss verschiedener Stimulationen an hippo-campalen Kulturen zu untersuchen, wurden in den folgenden Experimenten Slicekulturen, wie unter Abschnitt 4.1.6 Methoden bereits beschrieben, kultiviert. Jeweils eine Versuchsgruppe wurde mit 1 nM, 10 nM, 100 nM und 500 nM GnRH über einen Zeitraum von 8 Tagen stimu-liert. Eine über diesen Zeitraum unbehandelte Kultur diente als Vergleich. Nach Fixierung und Zuschnitt der Slicekulturen wurde an den Schnitten eine immunhistochemische Färbung für Spinophilin durchgeführt und wie unter Abschnitt 4.3 beschrieben mikroskopisch ausge-wertet. Die mit dem LSM angefertigten Fotos sind in Abbildung 11 gezeigt. In beiden Regio-nen, sowohl in der CA1- (siehe Abb. 11), als auch in der CA3-Region (hier nicht dargestellt), ist eine deutliche Signal-Anreicherung nach einer Stimulation mit 10 nM GnRH zu erkennen.

Abb. 11: Spinophilin-Signale aus der CA1-Region (Stratum radiatum) des Hippocampus

Die dazugehörigen Graphiken (Abbildungen 12 und 13) zeigen die Messwerte der CA1- und CA3-Region des Hippocampus als staining index nach 8tägiger Stimulation mit GnRH. In der

(37)

Ergebnisse 35

CA1-Region konnten wir eine im Vergleich zur Kontrollgruppe als auch zu der 1 nM und 500 nM GnRH-Gruppe, signifikante Erhöhung der Spinophilin-Expression bei einer Stimulation von 10 nM GnRH nachweisen. Auch in der CA3-Region war die Spinophilin-Expression bei einer Stimulation von 10 nM GnRH signifikant am höchsten. Daneben ergab die Auswertung der Gruppen untereinander, dass der Spinophilin staining index bei 1 nM, 10 nM und 100 nM GnRH signifikant größer ist verglichen mit der mit 500 nM GnRH stimulierten Slicegruppe.

Abb. 12: Auswertung der Immunreaktion mit Anti-Spinophilin-Antikörper in Slicekulturen (CA1-Region)

nach Behandlung mit GnRH. Die Linien zeigen die Signifikanz (Signifikanzniveau ab 0,05); (Mittel-wert ± SEM, n = 18).

nach Behandlung mit GnRH. Die Linien zeigen die Signifikanz (Signifikanzniveau 0,05); (Mittelwert ± SEM, n = 27). 0 50 100 150 200 250 300 Kontrolle 1 nM GnRH 10 nM GnRH 100 nM GnRH 500 nM GnRH R el ati ve r sta in in g in d ex (% d er K o n tr o lle ) p = 0,011 p = 0,001 p = 0,041 p = 0,024 0 50 100 150 200 250 300 Kontrolle 1 nM GnRH 10 nM GnRH 100 nM GnRH 500 nM GnRH R el ati ve r sta in in g in d ex (% d er K o n tr o lle ) p = 0,010 p = 0,009 p = 0,003 p = 0,021

(38)

Ergebnisse 36

5.5.2 Spinophilin-Expression unter Einfluss von GnRH und Antide

In dieser Untersuchungsreihe verglichen wir die Wirkung von GnRH und dem GnRH-Antagonisten Antide untereinander, um die Spezifität stimulierender Effekte von GnRH auf die E2-Synthese und damit Auswirkungen auf die Markerprotein-Expression (in diesem Falle

Spinophilin) zu beurteilen.

Abbildung 14 zeigt das mit Cy3-markierte synaptische Protein Spinophilin im Stratum radia-tum der CA3-Region des Hippocampus nach Stimulation von Slicekulturen mit GnRH in un-terschiedlicher Abstufung (1 nM, 10 nM, 100 nM und 500 nM) und vergleichend hierzu GnRH in gleicher Abstufung in Kombination mit Antide in einer Konzentration von 100 nM. Dabei ist eine Zunahme des Signals bei den mit 1 nM, 10 nM und 100 nM GnRH behandelten Slicekulturen im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle zu erkennen. Bei 10 nM GnRH ist die Signalintensität am stärksten, was im Wesentlichen dem Ergebnis vorangegangenen Un-tersuchungen der nur mit GnRH behandelten Slicekulturen entspricht. Des Weiteren ist bei den mit Antide behandelten Kulturen, bis auf jene mit 500 nM GnRH und 100 nM Antide behandelten Gruppe, eine deutliche Verminderung der Spinophilin-Signalintensität im Ver-gleich zur Kontrolle festzustellen. Stellt man die ausschließlich mit GnRH stimulierten Grup-pen jenen gegenüber, die sowohl mit GnRH in gleicher Abstufung, als auch mit 100 nM An-tide behandelt wurden, zeigt sich bis auf letztgenannte in allen Gruppen nach zusätzlicher Antide-Behandlung eine Verminderung der Markerprotein-Expression. Lediglich bei der Be-handlung mit 500 nM GnRH führte die zusätzliche Gabe von Antide zu einer verstärkten Ex-pression.

Die allein mit Antide behandelte Slicekulturgruppe zeigte gegenüber der Kontrollgruppe kei-ne wesentliche Verminderung der Spinophilikei-nexpression.

Die mit dem Lasermikroskop aufgenommenen Bilder wurden anschließend semiquantitativ mit dem Openlap-Programm ausgewertet. Die errechneten Werte sind in den Abbildungen 15 und 16 dargestellt, wobei die prozentuale Veränderung des relativen staining index der aus-schließlich mit GnRH behandelten Gruppen und jenen zusätzlich mit 100 nM Antide behan-delten Gruppen dargestellt wird.

(39)

Ergebnisse 37

(40)

Ergebnisse 38

nach Behandlung mit GnRH und Antide. Die Linien zeigen die Signifikanz: p < 0,05 = *, p < 0,01 = **, p < 0,001 = ***; (Mittelwert ± SEM, n = 4).

In beiden CA Regionen des Hippocampus zeigte sich unter der Behandlung mit Antide eine auffallende Verminderung der Spinophilin-Expression in der Mehrzahl der Gruppen (Abb. 15 und 16). Eine Ausnahme bildete die mit 500 nM GnRH und 100 nM Antide behandelte Grup-pe in der CA3-Region, wo es als einziges zu einer leichten, aber nicht signifikanten Erhöhung der Markerprotein-Expression kam. Die Ergebnisse der Signifikanzberechnungen mittels Post-Hoc-Test LSD demonstrieren, dass die Abnahme des staining index in den Gruppen 1 nM GnRH (+Antide), 10 nM GnRH (+Antide) und 100 nM GnRH (+ Antide) in der

CA1-0 20 40 60 80 100 120 140 Kontrolle 100 nM Antide GnRH 1 nM GnRH + 1 nM Antide 10 nM GnRH GnRH + 10 nM Antide 100 nM GnRH GnRH + 100 nM Antide 500 nM GnRH GnRH + 500 nM Antide R el ati ve r sta in in g in d ex (% d er K o n tr o lle /G n R H -G ru p p en )

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**

0 50 100 150 200 Kontrolle 100 nM Antide GnRH 1 nM GnRH + 1 nM Antide 10 nM GnRH GnRH + 10 nM Antide 100 nM GnRH GnRH + 100 nM Antide 500 nM GnRH GnRH + 500 nM Antide R el ati ve r sta in in g in d ex (% d er K o n tr o lle /G n R H -G ru p p en )

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Ergebnisse 39

Region signifikant ist. Ein vergleichbares Ergebnis findet sich in der CA3-Region, wo es in den Gruppen 1 nM GnRH (+ Antide) und 10 nM GnRH (+ Antide) zu einer signifikanten Verminderung der Spinophilinsynthese unter Antide kam.

In den übrigen Vergleichsgruppen beider Regionen zeigte sich bis auf o.g. Ausnahme ebenso ein verringerter staining index unter Antide im Vergleich zu den allein mit GnRH behandelten Gruppen, diese war jedoch nicht signifikant.

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Ergebnisse 40

5.6 Synaptophysin-Expression der Slicekulturen

5.6.1 Synaptophysin-Expression unter Einfluss von GnRH

Wie bereits zuvor unter dem Abschnitt 4.1.7 Methoden beschrieben, wurden die Slicekulturen nach 14 Tagen Vorkultur für weitere 8 Tage mit 1 nM, 10 nM, 100 nM und 500 nM GnRH stimuliert. In diesem Versuch sollte vergleichend dem oben beschriebenen Versuch mit Spinophilin unter 5.5.1 herausgefunden werden, bei welcher Konzentration GnRH fördernden Effekt auf die Expression des synaptischen Markerproteins Synaptophysin aufweist.

Nach immunhistochemischer Färbung mit Anti-Synaptophysin (rot), erfolgte die wie im Ab-schnitt 4.3 Methoden beschriebene Auswertung.

In Abbildung 17 werden die unterschiedlichen Synaptophysin-Signale am Beispiel der CA3-Region des Hippocampus gezeigt. Die mit 10 nM GnRH behandelten Slicekulturen zeigten im Vergleich zu den anderen GnRH-Verdünnungen und der Kontrolle in der CA1- als auch der CA3-Region eine deutlich stärke Färbung.