ETABLIERUNG DER
MIKRODIALYSE ZUR MESSUNG VON ANTIINFEKTIVA-KONZENTRATIONEN
IN DER LUNGE VON SCHWEINEN UND VERGLEICH MIT ANDEREN
UNTERSUCHUNGSMODELLEN
INAUGURAL-DISSERATION zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.) vorgelegt von Ann-Sophie Croneberger
aus Mainz
ETABLIERUNG DER
MIKRODIALYSE ZUR MESSUNG VON ANTIINFEKTIVA-KONZENTRATIONEN
IN DER LUNGE VON SCHWEINEN UND VERGLEICH MIT ANDEREN
UNTERSUCHUNGSMODELLEN
INAUGURAL-DISSERATION zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Ann-Sophie Croneberger
aus Mainz
Hannover 2009
1. Gutachter: Univ. Prof. Dr. M. Kietzmann 2. Gutachter: Univ. Prof. Dr. M. Wendt
Tag der mündlichen Prüfung: 27. April 2009
1 Einleitung
2 Literaturübersicht
2.1 Untersuchungsmodelle zur Bestimmung von Antiinfektiva- Konzentrationen in Zielgeweben
2.1.1 Notwendigkeit der direkten Bestimmung von Antiinfektiva- Konzentrationen in Zielgeweben
2.1.2 Konzentrationsbestimmung in Gewebeproben 2.1.3 Hautblasenversuch
2.1.4 Gewebekäfige
2.1.5 Bronchoalveoläre Lavage
2.1.6 Entnahme von Sekret des Bronchialepithels mittels Blättchenmethode 2.1.7 Bildgebende Verfahren
2.1.8 Mikrodialyse
2.2 Das Schwein als Modelltier 2.2.1 Auswahl des Modelltiers 2.2.2 Anatomische Grundlagen
2.2.3 Gewebepenetration von Antiinfektiva – Anreicherung in der Lunge 2.2.4 Bestimmung von Antiinfektiva-Konzentrationen im Respirationstrakt 2.2.5 Bakterielle Erkrankungen des Respirationstraktes
2.3 Cefpirom als Modellsubstanz 2.3.1 Struktur und Klassifizierung
2.3.2 Pharmakodynamische Eigenschaften 2.3.3 Pharmakokinetische Eigenschaften
2.3.4 Pharmakokinetik-Pharmakodynamik-Parameter 2.3.5 Resistenzen
2.3.6 Präparat
3 Material und Methoden
3.1 Zielsetzung und Beschreibung der In-vivo-Versuche 3.1.1 Versuch 1: Vorversuch - Etablierung der Mikrodialyse
3.1.2 Versuch 2: Hauptversuch - Vergleich der Mikrodialyse mit anderen Untersuchungsmodellen
3.1.3 Versuch 3: Zusatzversuch – Anwendung der Mikrodialyse in wachen Tieren
1
5 6 6 8 9 10 11 14 14 18 32 32 32 35 38 42 45 45 47 48 49 49 50
51 52 52 52 53
3.2 In-vitro-Vorversuche und allgemeine Versuchsinformationen 3.2.1 Bedingungen der Versuchsdurchführung
3.2.2 Mikrodialysezubehör
3.2.3 Bestimmung der relativen Wiederfindung
3.2.4 Pflege und Aufbewahrung der Mikrodialysekatheter 3.2.5 Testsubstanz
3.2.6 Versuchstiere und ihre Haltung
3.3 Durchführung Versuch 1 3.3.1 Versuchsablauf
3.3.2 Narkose
3.3.3 Thorakotomie und Implantation des Mikrodialyskatheters in die Lunge 3.3.4 Applikation von Cefrom®
3.3.5 Entnahme und Verarbeitung von Lungen-Mikrodialysat und Blut 3.3.6 Einschläfern der Versuchstiere
3.4 Durchführung Versuch 2 3.4.1 Versuchsablauf
3.4.2 Narkose
3.4.3 Thorakotomie und Implantation des Mikrodialysekatheters 3.4.4 Applikation von Cefrom®
3.4.5 Entnahme und Verarbeitung von Lungen-Mikrodialysat, Blut, Sekret des Bronchialepithels und Lungengewebe
3.4.6 Pathologisch-makroskopische Untersuchung und Entnahme, Bearbeitung und Untersuchung von Gewebeproben 3.4.7 Einschläfern der Versuchstiere
3.5 Durchführung Versuch 3 3.5.1 Versuchsablauf
3.5.2 Narkose, Aufwachphase und post-anästhetische Überwachung 3.5.3 Thorakotomie und Implantation des Mikrodialysekatheters 3.5.4 Applikation von Cefrom®
3.5.5 Entnahme und Verarbeitung von Lungen-Mikrodialysat und Blut 3.5.6 Pathologisch-makroskopische Untersuchung und Entnahme,
Bearbeitung und Untersuchung von Gewebeproben 3.5.7 Einschläfern der Versuchstiere
3.6 Aufarbeitung und Analyse der Proben 3.6.1 Analytische Methode
3.6.2 Mikrodialysat-Proben und Proben der Stammlösungen aus den Wiederfindungsversuchen und Lungen-Mikrodialysat-Proben 3.6.3 Blutplasma-Proben
54 54 54 56 58 59 59
60 60 61 63 65 66 67 68 68 69 69 69 70 72 72 73 73 74 75 75 76 78 78 79 79 80 81
3.6.4 Proben von Sekret des Bronchialepithels 3.6.5 Lungenhomogenat-Proben
3.7 Berechnungen und statistische Auswertung 3.7.1 Relative Wiederfindung der Mikrodialysekatheter
3.7.2 Cefpirom-Konzentrationen in der Extrazellulären Flüssigkeit der Lunge, im Blutplasma, Sekret des Bronchialepithels und Lungengewebe 3.7.3 Statistische Testverfahren
3.7.4 Pharmakokinetische Auswertung
4 Ergebnisse
4.1 Versuch 1
4.1.1 Relative Wiederfindung der Katheter Nr. 1 bis 4
4.1.2 Cefpirom-Konzentrationen in der Extrazellulären Flüssigkeit der Lunge und im Blutplasma von narkotisierten Schweinen
4.1.3 Pharmakokinetische Parameter 4.2 Versuch 2
4.2.1 Relative Wiederfindung der Katheter Nr. 5 bis 12
4.2.2 Cefpirom-Konzentrationen in der Extrazellulären Flüssigkeit der Lunge, im Blutplasma, Sekret des Bronchialepithels und Lungen- gewebe von narkotisierten Schweinen
4.2.3 Pharmakokinetische Parameter 4.2.4 Pathologische Untersuchung
4.3 Versuch 3
4.3.1 Relative Wiederfindung der Katheter Nr. 13 bis 20
4.3.2 Cefpirom-Konzentrationen in der Extrazellulären Flüssigkeit der Lunge und im Blutplasma von wachen Schweinen
4.3.3 Pharmakokinetische Parameter 4.3.4 Pathologische Untersuchung
4.4 Vergleichende Betrachtung der Versuche 1, 2 und 3
4.4.1 Auswirkung der Operation und Katheter-Implantation auf die Tiere 4.4.2 Cefpirom-Konzentrationen in der Extrazellulären Flüssigkeit der Lunge 4.4.3 Auswertung der statistischen Testverfahren
4.4.4 Pharmakokinetische Parameter
82 83 84 84 84 86 86
87 88 88 88 96 97 97 97
113 114 119 119 119 130131
134 134 135 137 138
5 Diskussion
5.1 Auswahl des Mikrodialysezubehörs und Bestimmung der relativen Wiederfindung
5.2 Auswirkungen der Thorakotomie und der Katheterimplantation 5.3 Vergleich von Cefpirom-Konzentrationen in der Extrazellulären
Flüssigkeit der Lunge und im Blutplasma von Menschen und Schweinen
5.4 Analyse der Lungen-Mikrodialysat-Proben und Vergleich der Cefpirom-Konzentrationen in der Extrazellulären Flüssig- keit der Lunge der Versuche 1, 2 und 3
5.5 Vergleich der Cefpirom-Konzentrationen in der Extrazellulären Flüssigkeit der Lunge, in Blutplasma, Sekret des Bronchial- epithels und Lungengewebe
5.6 Einsatz der Mikrodialyse für Pharmakokinetik-Pharma- kodynamik-Korrelationen
5.7 Schlussfolgerungen
6 Zusammenfassung / Summary
6.1 Zusammenfassung 6.2 Summary
7 Anhang
7.1 Nicht im Text aufgeführte Tabellen
7.2 Ergebnisse der pathologischen Untersuchungen einzelnen Tiere
8 Verzeichnisse
8.1 Literaturverzeichnis 8.2 Abkürzungsverzeichnis 8.3 Abbildungsverzeichnis 8.4 Tabellenverzeichnis
139 140 143 147
149
152
155 156
157 158 160
163 164 172
185 186 202 204 206
Einleitung 1
Einleitung
Bakterielle Infektionen des Respirationstrakts zählen zu den bei lebensmittelliefernden Tieren am häufigsten diagnostizierten Erkrankungen. Die Behandlung dieser Erkrankungen erfolgt durch die Verabreichung von Antiinfektiva. Durch intensiven, nicht immer gezielten Einsatz von Antiinfektiva entwickeln bakterielle Erreger zunehmend wirksame Resistenzmechanismen ge- genüber antibakteriellen Substanzen. Um die Entstehung und Verbreitung von Resistenzen zu verhindern, sollte die antibakterielle Therapie neben der klinischen Heilung auch eine vollständi- ge bakteriologische Heilung zum Ziel haben. Dies kann nur erreicht werden, wenn Antiinfektiva gezielt und in adäquater Dosierung eingesetzt werden.
Bei der Entwicklung von Dosierungsschemata gewinnen Pharmakokinetik-Pharmakodynamik- Korrelationen zunehmend an Bedeutung. Hierbei werden pharmakokinetische Parameter häufig basierend auf im Blutplasma gemessenen Wirkstoffkonzentrationen berechnet. Bakterielle Infek- tionen sind jedoch bis auf wenige Ausnahmen in anderen Kompartimenten als dem vaskulären Kompartiment lokalisiert. Da sich die meisten Substanzen nicht gleichmäßig im Organismus ver- teilen, können Konzentrationen im Blutplasma und Zielgewebe stark voneinander abweichen.
Die Messung von Wirkstoffkonzentrationen direkt im Zielgewebe kann jedoch für anatomisch schwer zugängliche Organe, wie z. B. die Lunge, schwierig sein. Weiterhin ist bei der Bestim- mung von Zielgewebskonzentrationen wichtig, in welchen Kompartimenten eines Gewebes die Wirkstoffkonzentrationen gemessen werden. Denn innerhalb eines Gewebes befinden sich bak- terielle Erreger in für sie spezifischen Kompartimenten. Beispielsweise sind zahlreiche Erreger in der extrazellulären Flüssigkeit lokalisiert. Auch kann prinzipiell nur die nicht-proteingebundene Fraktion eines Wirkstoffs antimikrobielle Aktivität entfalten. In vielen Fällen ist somit für den Erfolg einer antibakteriellen Therapie die nicht-proteingebundene Fraktion eines Wirkstoffs in der extrazellulären Flüssigkeit des jeweiligen Zielgewebes entscheidend.
Die in der Veterinärmedizin etablierten Untersuchungsmodelle zur Messung von Wirkstoffkon- zentrationen in Zielgeweben sind unzureichend, da sie weder eine separate Konzentrationsbe- stimmung in der extrazellulären Flüssigkeit noch die direkte Bestimmung des nicht-proteinge- bundenen, pharmakologisch aktiven Wirkstoffanteils erlauben.
Ziel dieser Arbeit ist die Etablierung eines Untersuchungsmodells, der Mikrodialyse, zur Bestim- mung der nicht-proteingebundenen Fraktion eines Beta-Laktam-Antibiotikums in der extrazel- lulären Flüssigkeit der Lunge von narkotisierten Schweinen und der Vergleich von Konzentra- tionen dieses Beta-Laktam-Antibiotikums in der extrazellulären Flüssigkeit der Lunge, im Sekret des Bronchialepithels, Lungengewebe und Blutplasma. Des Weiteren wird die Mikrodialyse zu Konzentrationsbestimmungen in der Lunge von wachen Schweinen angewendet.
Literaturübersicht 2
2.1 Untersuchungsmodelle zur Bestimmung von Antiinfektiva-Konzentrationen in Zielgeweben
2.1.1 Notwendigkeit der direkten Bestimmung von Antiinfektiva-Konzentrationen in Zielgeweben
Meist ist das Ziel einer antibakteriellen Therapie neben der klinischen Heilung auch eine voll- ständige Eradikation der Bakterien (bakteriologische Heilung) zu erreichen. Nur so kann die Entstehung und Verbreitung von Resistenzen gegenüber antibakteriellen Substanzen und ein Wiederaufflammen der Erkrankung verhindert werden. Ohne eine vollständige bakteriologische Heilung dominieren diejenigen Erreger den Rekolonisationsprozess, welche gegenüber der ein- gesetzten antibakteriellen Substanz weniger empfindlich sind. Als Folge davon kann eine resis- tente Population entstehen. Sowohl eine Minimierung der Entstehung von Resistenzen, als auch eine Steigerung der klinischen Effektivität kann vor allem durch adäquate, auf wissenschaftlicher Basis ausgearbeitete Dosierungsschemata von Antiinfektiva erreicht werden (TOUTAIN et al.
2002; TOUTAIN 2003).
Bei der Entwicklung von veterinärmedizinischen Antiinfektiva werden im Rahmen präklini- scher Studien Dosierungsschemata erstellt, welche in klinischen Studien (Feldstudien) verifiziert werden (MCKELLAR et al. 2004; TOUTAIN u. LEES 2004). Lange Zeit basierte die präkli- nische Dosisfindung auf Dosistitrations- und Dosisbestätigungsstudien. Hierbei wird die zu un- tersuchende Substanz infizierten Tieren der jeweiligen Zieltierspezies in mehreren Dosierungen verabreicht und die klinischen Ergebnisse werden mittels statistischer Testverfahren miteinander verglichen. Diese Art der Dosisfindung birgt eine Reihe von Nachteilen. Zum einen muss eine große Anzahl von Tieren verwendet werden, was sowohl aus ethischer als auch ökonomischer Sicht unerwünscht ist. Zum anderen kann nicht immer eine valide Aussage darüber getroffen werden, ob eine bakteriologische Heilung stattgefunden hat, da der Erfolg der Therapie alleine an den klinischen Ergebnissen gemessen wird (TOUTAIN 2003; TOUTAIN u. LEES 2004).
Das Pollyanna-Phänomen besagt, dass Antibiotika mit guter klinischer Effektivität eine geringe antibakterielle Aktivität aufweisen können. Umgekehrt können antibakteriell exzellent wirksa- me Substanzen oder Dosierungsschemata klinisch nicht zum erwarteten Ergebnis führen. Eine vollständige klinische Heilung garantiert also keineswegs eine gutes bakteriologisches Ergebnis (MCKELLAR et al. 2004). Somit zeigt sich, dass es allein durch Dosistitrationsstudien, Dosis-
bestätigungsstudien und Feldstudien nicht immer möglich ist, optimale Dosierungsschemata be- züglich der bakteriologischen Heilung zu entwickeln. Aus diesem Grund gewinnen Pharmako- kinetik-Pharmakodynamik (PK-PD)-Korrelationen immer mehr an Bedeutung (TOUTAIN et al. 2002; EMEA GUIDELINE 627 2003; MCKELLAR et al. 2004).
PK-PD-Korrelationen basieren auf dem Grundsatz, dass das Ergebnis jeder antimikrobiellen Therapie von 2 Faktoren abhängig ist, zum einen von der Exposition des Erregers gegenüber der Substanz am Ort des infektiösen Geschehens (Pharmakokinetik), zum anderen von der Emp- findlichkeit des Erregers gegenüber dieser Substanz (Pharmakodynamik). Die Kombination von PK- und PD-Parametern wird als PK-PD-Korrelation bezeichnet (TOUTAIN 2003). Durch PK-Studien im Zieltier werden Konzentrations-Zeitprofile erstellt und pharmakokinetische Pa- rameter wie die maximale Konzentration (Cmax), die Zeit bis zum Erreichen der maximalen Kon- zentration (Tmax) und die Fläche unter der Konzentrations-Zeitkurve (Area Under the Curve [AUC]) berechnet. Pharmakodynamische Parameter dienen als Indikator für die Wirksamkeit ei- ner Substanz. Als pharmakodynamischer Parameter für Antiinfektiva wird in in vitro durchgeführ- ten PD-Studien insbesondere die minimale Hemmkonzentration (MHK) bestimmt (TOUTAIN u. LEES 2004). Die wichtigsten und meist verwendeten PK-PD-Parameter zur Vorhersage eines klinischen und bakteriologischen Ergebnisses sind das Verhältnis der Fläche unter der Konzen- trations-Zeitkurve zur minimalen Hemmkonzentration (AUC/MHK, angewendet bei Chino- lonen), das Verhältnis der maximalen Konzentration zur minimalen Hemmkonzentration (Cmax/ MHK, angewendet bei Aminoglykosiden) und die Zeitspanne in welcher die Konzentration der antibakteriellen Substanz die minimale Hemmkonzentration übersteigt (T>MHK, angewendet bei Makroliden und Beta-Laktam-Antibiotika) (TOUTAIN 2003).
In der Entwicklung von Antiinfektiva basieren pharmakokinetische Untersuchungen häufig auf Messungen von Konzentrationen im Blutplasma, da Blutproben vergleichsweise einfach zu ent- nehmen sind (JOUKHADAR u. MÜLLER 2005). Das infektiöse Geschehen ist jedoch bis auf wenige Ausnahmen (z. B. Bakteriämie mit intravaskulärer Infektion) in den peripheren Gewe- ben lokalisiert. Genauer befinden sich die meisten Bakterien in der extrazellulären Flüssigkeit (EZF) der Gewebe. Deshalb ist meist die EZF Zielraum der antibakteriellen Therapie (JOUK- HADAR et al. 2001; LIU u. DERENDORF 2003; BRUNNER et al. 2005). Bei der Ableitung von Zielgewebskonzentrationen von im Blutplasma gemessenen Konzentrationen werden einige Gegebenheiten nicht ausreichend berücksichtigt. Erstens wird davon ausgegangen, dass eine gleichmäßige Verteilung einer Substanz zwischen Blut und Zielgewebe stattfindet. Tatsächlich aber können Blutplasma- und Gewebekonzentrationen stark voneinander abweichen (MOU- TON et al. 2008). Denn zum einen kann nur derjenige Anteil einer Substanz, welcher nicht an Plasmaproteine gebunden ist (nicht-proteingebundene Fraktion), die systemische Zirkulation verlassen und sich im Zielgewebe anreichern (PLOCK u. KLOFT 2005). Zum anderen kann bei einigen klinischen Gegebenheiten die Penetration von Antiinfektiva in das Zielgewebe verändert sein. Hierbei wird angenommen, dass der transendotheliale Membrantransfer in das Interstitium peripherer Gewebe durch unspezifische Mechanismen und Schranken (wie beispielsweise Barri-
eren durch fibröse Kapseln oder perifokale Ödeme bei chronischen oder akuten Entzündungs- prozessen) oder durch Veränderungen des Blutflusses, der kapillären Dichte und Permeabilität, des pH-Werts im Entzündungsareal oder durch Änderungen des transkapillären osmotischen Druckgradienten verändert sein kann (JOUKHADAR u. MÜLLER 2005; THALLINGER u.
JOUKHADAR 2005). Zweitens werden Arzneimittelwirkungen durch Wechselwirkungen mit verschiedenen Strukturen in den Zielgeweben wie Enzymen, Arzneimitteltransportsystemen oder Rezeptorproteinen beeinflusst, welche im Blutplasma nicht zu finden sind (BRUNNER u. LANGER 2006). Daraus folgt, dass die minimale Hemmkonzentration, welche notwendig ist, um die Zielerreger zu eliminieren, im Blutplasma durchaus erreicht werden kann, obwohl sie im Zielgewebe nicht erreicht wird (JOUKHADAR u. MÜLLER 2005; MOUTON et al. 2008).
Werden also mit Hilfe pharmakokinetischer Parameter, die basierend auf Blutplasma-Konzen- trationen berechnet wurden, Dosierungsschemata erstellt, kann durch Anwendung dieser Dosier- ungsschemata oft keine vollständige Abtötung der Bakterien erreicht werden.
Somit ist es zur Vermeidung von Resistenzbildungen und zur Steigerung der klinischen Effekti- vität von essentieller Bedeutung, Konzentrationen von Antiinfektiva direkt am Ort des infektiö- sen Geschehens, das heißt in den meisten Fällen in der EZF peripherer Gewebe, zu messen.
Im Folgenden wird eine Auswahl an Methoden zur Konzentrationsbestimmung von Antiinfekti- va in Zielgeweben beschrieben.
2.1.2 Konzentrationsbestimmung in Gewebeproben
Antiinfektiva-Konzentrationen werden in Gesamtgewebeproben wie folgt bestimmt: beim Mensch werden Gewebeproben mittels Biopsie entnommen; beim Tier werden die Proben meist direkt post mortem gewonnen. Anschließend homogenisiert man die Proben mit einer Gewebe- zerkleinerungsmaschine und bestimmt die Konzentration des Arzneimittels im Homogenat mit analytischen Methoden (NIX 1998).
Die Vorteile der Methode sind die einfache technische Durchführung und die prinzipielle Mög- lichkeit der Gewinnung von Homogenatproben aus jedem Gewebe.
Es gibt jedoch eine Reihe von Nachteilen. Da die Entnahme von Gewebeproben invasiv ist, gibt es sowohl beim Tier als auch beim Mensch eine ethische Limitierung (BRUNNER et al. 2005).
Beim Mensch ist schon die Anzahl an Biopsieentnahmen in leicht zugänglichen Geweben (z. B.
Haut) begrenzt. Eine Biopsienentnahme in schwer zugänglichen Geweben (z. B. Leber oder Niere) ist überhaupt nur aus einer klinischen Indikation heraus rechtfertigbar. Beim Tier müssen pro Probenentnahmezeitpunkt mindestens 1, meist aber mehrere Tiere getötet werden. Daher ist die Anzahl der Probenentnahmezeitpunkte aus Tierschutzaspekten limitiert (HANSEN et al. 1999). Aus der begrenzten Anzahl von Probenentnahmen ergibt sich folgender Nachteil: da aus ethischen Aspekten nicht mehrerer Proben zu verschiedenen Zeitpunkten von einem Indi-
viduum entnommen werden sollten, ist die Erstellung eines Konzentrations-Zeitverlaufs mittels Daten von einem Tier nicht möglich. Aus diesem Grund werden Gewebeproben zu unterschied- lichen Zeitpunkten von verschiedenen Individuen entnommen, was allerdings zur Entstehung interindividueller Variabilitäten führt (MOUTON et al. 2008). Gewebeproben setzen sich aus verschiedenen Bestandteilen, wie Blut, EZF, einer Vielfalt an Zellen und je nach Geweben auch intraluminalen Komponenten zusammen (NIX 1998). Da der Anteil von Blut im Homogenat nicht quantifizierbar ist, besteht besonders in gut durchbluteten Geweben (z. B. Lunge) die Ge- fahr der Verfälschung der gemessenen Konzentrationen. Eine ähnliche Problematik ergibt sich aus der Kontamination des Homogenats einiger Gewebe mit intraluminalen Komponenten. Im Homogenat von Organen wie Leber und Niere sind auch Gallenflüssigkeit beziehungsweise Urin enthalten. Da beispielsweise Beta-Laktam-Antibiotika hohe Konzentrationen in diesen Flüssigkeiten erreichen können, werden deshalb auch höhere Konzentrationen im Homogenat gemessen (WISE 1986). Des Weiteren geht man bei der Interpretation von im Gesamtgewebe gemessenen Konzentrationen fälschlicherweise davon aus, dass die zu untersuchende Substanz gleichmäßig zwischen den Gewebekomponenten verteilt ist. Dies ist in der Realität jedoch nicht der Fall. Verschiedene Substanzklassen von Antiinfektiva reichern sich in den einzelnen Kompar- timenten unterschiedlich an. Während Beta-Laktam-Antibiotika beispielsweise fast ausschließlich in der EZF angereichert sind, akkumulieren Makrolide und Chinolone auch intrazellulär. Da die meisten Infektionen im extrazellulären Kompartiment lokalisiert sind, ist die dort vorherrschen- de Konzentration des Antiinfektivums entscheidend. Deshalb werden bei der Konzentrationsbe- stimmung von auf den Extrazellulärraum beschränkten Substanzen im Gewebehomogenat die zur Eradikation der Bakterien entscheidenden Konzentrationen durch Verdünnung mit intrazel- lulären Komponenten unterschätzt. Konzentrationen von intrazellulär angereicherten Substanzen werden jedoch überschätzt (NIX 1998). Weiterhin ist bei dieser Methode keine Differenzierung zwischen proteingebundener und nicht-proteingebundener Fraktion des Arzneimittels möglich.
Dies ist ein entscheidender Nachteil, denn nur die nicht-proteingebundene Fraktion kann anti- mikrobielle Aktivität entfalten (MÜLLER et al. 2004).
2.1.3 Hautblasenversuch
Im Hautblasenversuch werden Arzneimittelkonzentrationen in der Flüssigkeit einer artifiziell erzeugten Hautblase gemessen. Diese Hautblase entsteht durch Trennung von Epidermis und Dermis entlang der Lamina lucida. Es gibt 2 Möglichkeiten diese Trennung herbeizuführen: zum einen mechanisch, durch Erzeugung von Unterdruck, zum anderen chemisch unter Verwendung von Kantharidin. Kantharidin ist ein Terpenoid, welches in verschiedenen Käferarten vorkommt.
Es wird in Form von Pflastern auf die Haut aufgeklebt. Durch starke Reizung der Haut entsteht dann eine subepidermal lokalisierte Blase. In dem erzeugten Hohlraum, der den Interstitialraum repräsentieren soll, sammelt sich Flüssigkeit an. Diese wird aspiriert und die Konzentration des zu
untersuchenden Arzneimittels wird bestimmt (BRUNNER et al. 1998; HOCHT et al. 2006).
Die Entnahme von Hautblasenflüssigkeit ist eine häufig angewendete Methode in der Human- medizin. Es existiert eine Fülle von Daten zur Penetration von zahlreichen Antibiotika in kan- tharidin- und unterdruckinduzierter Hautblasenflüssigkeit (MÜLLER et al. 2004).
Die Vorteile der Methode sind zum einen die einfache technische Durchführung, zum an- deren ist die Methode wenig invasiv und verursacht geringe Kosten (BRUNNER u. LAN- GER 2006).
Aus der Methodik entstehen jedoch folgende Nachteile: einerseits ist die Arzneimittelkonzent- ration in der Hautblasenflüssigkeit abhängig von der Lokalisation und Größe der Blase, der Dif- fusionskapazität über die Blasenbasis und dem Oberflächen-Volumenverhältnis; es besteht also eine hohe Variabilität und Ergebnisse sind somit kaum reproduzierbar (LIU u. DERENDORF 2003; MÜLLER et al. 2004; BRUNNER u. LANGER 2006). Andererseits sind die Hautblasen sehr unangenehm, deshalb können Messungen nur über kurze Zeiträume durchgeführt werden.
Eine kontinuierliche Probenentnahme von einem Individuum über einen längeren Zeitraum ist daher nicht möglich (HOCHT et al. 2006). Ein weiterer Nachteil der Methode ist, dass so- wohl bei chemisch als auch bei mechanisch induzierten Hautblasen eine starke Manipulation stattfindet. Das Risiko einer Entzündung ist groß; daher gleicht die Hautblasenflüssigkeit mehr einem inflammatorischen Exsudat als dass sie der EZF gleicht (LIU u. DERENDORF 2003;
BRUNNER u. LANGER 2006). Zudem ist die Hautblasenflüssigkeit lediglich repräsentativ für die EZF der Haut (MÜLLER et al. 2004). Weiterhin ist keine Differenzierung zwischen prote- ingebundener und nicht-proteingebundener Fraktion des Arzneimittels möglich, da sich in der Hautblasenflüssigkeit auch Proteine anreichern können (HOCHT et al. 2006).
2.1.4 Gewebekäfige
Ein Gewebekäfig ist ein teilperforierter Hohlkörper, welcher in subkutanes Gewebe eingesetzt wird.
Nach der Implantation wird der Käfig von stark vaskularisiertem Granulationsgewebe umgeben, be- ziehungsweise partiell gefüllt. In dem verbleibenden Hohlraum sammelt sich eine Flüssigkeit an, die der EZF ähnelt. Nach Entnahme dieser Flüssigkeit kann die Konzentration des zu untersuchenden Arznei- mittels bestimmt werden. Gewebekäfige können bezüglich Zusammensetzung, Größe und Form stark variieren. Häufig verwendete Formen und Materialien sind Methakrylatschläuche, Silikonschläuche, Stahlzylinder und Polypropylenkugeln (SIDHU et al. 2003).
Gewebekäfige wurden erstmals von GUYTON (1963) verwendet, um die Physiologie und Zu- sammensetzung der EZF zu untersuchen. Bisher wurden zahlreiche Studien mit vielen Wirk- stoffen in verschiedenen Spezies durchgeführt (SIDHU et al. 2003). Beispielsweise wurden Kon- zentrationen der Antiinfektiva Cefradin und Cefalothin (Mensch), Oxytetracylin und Ceftiofur (Kalb) und Ampicillin (Kaninchen) in Gewebekäfigflüssigkeit bestimmt (CARBON et al. 1978;
BENGTSSON et al. 1986; HALSTEAD et al. 1992).
Die Methode bietet einige Vorteile: eine einfache technische Durchführung, geringe Invasivität, gute Toleranz und somit auch die Möglichkeit mehrerer Probenentnahmen über längere Zeit- räume von einem Individuum, und die Entnahme einer Flüssigkeit, die auf Grund ihres geringen Proteingehalts der EZF ähnlich ist (ADAM et al. 1978).
Ein entscheidender Nachteil der Methode ist die hohe Variabilität, bedingt durch die variierende Zusammensetzung der Gewebekäfigflüssigkeit. Die Zusammensetzung der Flüssigkeit wird zum einen durch Größe und Form des Käfigs sowie Größe und Anzahl der Perforationen beeinflusst, da die Konzentration des zu untersuchenden Arzneimittels in der Flüssigkeit von der Diffusions- fläche und vom Volumen des Käfigs abhängig ist (BENGTSSON u. GREKO 2002). Zum an- deren nimmt die Penetration des Arzneimittels in die Gewebekäfigflüssigkeit mit dem Alter der Käfige (Länge der Zeitspanne nach Implantation) ab, da das entstehende Granulationsgewebe in und um den Käfig einen großen Einfluss auf die Arzneimittelpenetration und –elimination hat.
Das Granulationsgewebe ist durch Fibrin verbunden. Je nach Dicke der Fibrinschicht ändert sich das Flüssigkeitsvolumen und somit auch die Arzneimittelkonzentration (BENGTSSON et al.
1986; BENGTSSON u. GREKO 2002; SIDHU et al. 2003). Die Eliminationsrate des zu unter- suchenden Arzneimittels aus dem Gewebekäfig wird zusätzlich durch die Anzahl und Häufigkeit der Probenentnahmen beeinflusst. Somit können Schwankungen nicht nur zwischen Käfigen unterschiedlicher Größe und Bauart auftreten, sondern auch zwischen identisch gefertigten Kä- figen (BENGTSSON u. GREKO 2002). Jeder Käfig ist daher einzigartig und spezifische Kon- zentrations-Zeitprofile können schwer reproduziert werden (GREKO et al. 2003).
2.1.5 Bronchoalveoläre Lavage
Mittels bronchoalveolärer Lavage (BAL) wird Sekret des Bronchialepithels (Epithelial Lining Fluid [ELF]) gewonnen (REINHOLD et al. 2005). Die ELF besteht neben epithelialem Sekret aus Mucus und verschiedenen Zellen (CRUCIANI et al. 1996). Bei der BAL wird zunächst ein flexibles fiberoptisches Endoskop mit Spülkanal unter Sichtkontrolle durch die Trachea in die Bronchien vorgeschoben. Nun wird eine bekannte Menge an Flüssigkeit, meist isotone Natri- umchloridlösung, über den Spülkanal eingegeben. Dabei wird die Gesamtmenge an einzugeben- der Flüssigkeit auf mehrere Aliquots verteilt. Die Anzahl und das Volumen der Aliquots können je nach Spezies und Indikation variieren. Als Standardverfahren beim Mensch ist die Verwen- dung von 5 Aliquots à 20 bis 50 Milliliter beschrieben (BAYAT et al. 1998). Beim Fohlen kann beispielsweise ein Installationsvolumen von 200 Milliliter verteilt auf 2 Aliquots à 100 Milliliter verwendet werden (HÖHENSTEIGER 2005). Ein Teil des installierten Flüssigkeitsvolumens, meist zwischen 50 und 70 Prozent, kann nun durch sofortige Aspiration zurückgewonnen wer- den. Das gewonnene Aspirat setzt sich aus der eingegebenen Flüssigkeit, Mucus, epithelialem Sekret und verschiedenen Zellarten, wie alveolären Makrophagen, Lymphozyten, Granulozyten und epithelialen Zellen, zusammen. Das Aspirat wird zur Trennung der zellulären und azellulären
Bestandteile zentrifugiert und die Konzentration des zu untersuchenden Arzneimittels kann nun im separierten Überstand bestimmt werden (REBUCK u. BRAUDE 1984; EISENBERG et al.
1993)
Die BAL ist sowohl in der Human- als auch in der Veterinärmedizin als diagnostische Routi- netechnik in der Pneumologie etabliert (BAYAT et al. 1998; REINHOLD et al. 2005). Seit Beginn der achtziger Jahre wird die BAL auch zur Konzentrationsbestimmung von Arzneimit- teln verwendet (REBUCK u. BRAUDE 1984). Beispielsweise wurden Konzentrationen von Beta-Laktam-Antibiotika (z. B. Amoxicillin, Cefpodoxim), Makroliden (z. B. Azithromycin, Clarithromycin) und Fluorochinolonen (z. B. Ciprofloxacin, Enrofloxacin) in bronchoalveolä- rer Lavageflüssigkeit von Menschen und Konzentrationen von Tulathromycin in bronchoalve- olärer Lavageflüssigkeit von Fohlen bestimmt (NIX 1998; HÖHENSTEIGER 2005).
Der Vorteil der Methode ist ihre geringe Invasivität (REINHOLD et al. 2005).
Bezüglich der Konzentrationsbestimmung von Arzneimitteln zeigen sich jedoch erhebliche Nachteile. Wie bereits beschrieben, kann das installierte Flüssigkeitsvolumen nur partiell wieder- gewonnen werden. Hierbei kann die Menge der aspirierten Flüssigkeit stark variieren (REBUCK u. BRAUDE 1984; BAYAT et al. 1998). Auch die Zusammensetzung des Aspirats ist variabel.
Erhöht man beispielsweise das Spülvolumen, so sinkt die Rückgewinnungsrate des Gesamtvo- lumens, der Anteil an zellulären Bestandteilen nimmt jedoch zu (REINHOLD et al. 2005). Ein weiterer Nachteil der Methode ist, dass sich die installierte Flüssigkeit nicht in einem bestimmten Gebiet ansammelt, sondern sich während des Lavageprozesses frei über den verfügbaren Raum verteilt. Somit kann die entnommene ELF keiner speziellen anatomischen Struktur zugeordnet werden. Sie kann beispielsweise sowohl aus den größeren Bronchien als auch aus den Bronchuli stammen (EISENBERG et al. 1993). Die ELF ist im gewonnenen Aspirat hochgradig durch Spül- flüssigkeit verdünnt. Oftmals liegt eine mehr als hundertfache Verdünnung vor (EISENBERG et al. 1993; NIX 1998). Die größte Schwierigkeit bei der Bestimmung von Arzneimittelkonzentra- tionen mittels BAL ist die Bestimmung des Verdünnungsfaktors (REBUCK u. BRAUDE 1984;
EISENBERG et al. 1993; BAYAT et al. 1998). Die Kenntnis des Verdünnungsfaktors ist jedoch unbedingt notwendig, um Arzneimittelkonzentrationen verlässlich bestimmen zu können (EI- SENBERG et al. 1993). Eine Möglichkeit zur Bestimmung des Verdünnungsfaktors ist die Zuga- be einer Referenzsubstanz (Verdünnungsmarker) zur Spülflüssigkeit in einer bekannten Konzen- tration. Die Konzentration dieser Substanz im Aspirat wird bestimmt und der Verdünnungsfaktor kann ermittelt werden. Eine derartige Referenzsubstanz darf keinesfalls die Fähigkeit besitzen in das Blut oder Lungeninterstitium zu diffundieren. Ein Beispiel für eine solche Referenzsubstanz ist Methylenblau. Jedoch kann sich auch bei der Verwendung von Methylenblau zur Bestimmung des Verdünnungsfaktors eine mögliche Fehlerquelle ergeben. Methylenblau diffundiert zwar we- der in das Blut noch in das Lungeninterstitium, möglicherweise aber die Spülflüssigkeit, der es zugesetzt ist, was zu einer Änderung der Konzentration von Methylenblau im Aspirat führt (RE- BUCK u. BRAUDE 1984). Eine andere Möglichkeit der Bestimmung des Verdünnungsfaktors ist die intravenöse Gabe einer Substanz von der man annimmt, dass sie sich gleichmäßig zwischen
Blut und ELF verteilt. Hierzu wird häufig Harnstoff (Urea) verwendet. Nach Bestimmung der Harnstoff-Konzentration im Blutplasma und im Aspirat können das ELF-Volumen sowie die Arzneimittelkonzentration in der ELF dann wie folgt bestimmt werden:
Eine Fehlerquelle hierbei ist die Verdünnung des Harnstoffs mit Spülflüssigkeit während des Lavageprozesses und eine damit einhergehende vermehrte Diffusion von Harnstoff aus den Ge- fäßen in das Aspirat auf Grund des Konzentrationsgradienten. Die Harnstoff-Konzentration im Aspirat wäre dann höher als die tatsächliche Harnstoffkonzentration in der ELF. Somit würde das Volumen der ELF überschätzt und die Konzentration des zu untersuchenden Arzneimittels in der ELF unterschätzt (NIX 1998). An den genannten Beispielen zeigt sich, dass eine exakte Bestim- mung des Verdünnungsfaktors nahezu unmöglich ist. Die hohe Verdünnung der ELF im Aspirat durch Spülflüssigkeit führt weiterhin dazu, dass die zu messenden Arzneimittelkonzentrationen häufig unterhalb der analytischen Detektionsgrenze liegen; es wird also eine sehr sensitive analy- tische Methode benötigt (EISENBERG et al. 1993; NIX 1998). Eine zusätzliche Schwierigkeit bei der Konzentrationsbestimmung von Arzneimitteln mittels BAL ist, dass die Genauigkeit der Messung durch Influx von Flüssigkeit aus dem Lungeninterstitium beeinflusst werden kann, da während des Lavageprozesses ein signifikanter Flüssigkeitsaustausch zwischen Lungeninterstitium und den luftführenden Wegen möglich ist (EISENBERG et al. 1993; BAYAT et al. 1998). Bei der Konzentrationsbestimmung intrazellulär akkumulierender Antiinfektiva mittels BAL wird von einigen Autoren die Freisetzung von Konzentrationen aus den alveolären Makrophagen als wei- tere mögliche Fehlerquelle beschrieben (ZEITLINGER et al. 2005). Ein anderer Nachteil der BAL ist die begrenzte Anzahl von Probenentnahmen von einem Individuum. Die Limitierung der Probenentnahmen ergibt sich zum einen aus der Technik, mit welcher bei häufigem Einsatz die Epithelien der Atemwege geschädigt werden, zum anderen verändert sich durch jeden Lava- geprozess die Zusammensetzung der ELF. Es kann also kein vollständiges Konzentrations-Zeit- profil mit Daten von einem Individuum erstellt werden (EISENBERG et al. 1993; REINHOLD et al. 2005). Weiterhin ist bei dieser Methode keine Differenzierung zwischen proteingebundener und nicht-proteingebundener Fraktion eines Arzneimittels möglich (EISENBERG et al. 1993).
VolumenELF = Urea - KonzentrationAspirat × VolumenAspirat
Urea - KonzentrationBlutplasma
ArzneimittelkonzentrationELF = ArzneimittelkonzentrationBAL× VolumenBAL VolumenELF
2.1.6 Entnahme von Sekret des Bronchialepithels mittels Blättchenmethode
Eine weitere Möglichkeit zur Gewinnung von ELF ist die Verwendung von Filterpapierblätt- chen. Hierbei wird zunächst ein Endotrachealtubus durch die Trachea in die Bronchien einge- führt. Zur Vermeidung von Verunreinigungen der Proben, z. B. mit Sekret oder Nahrungsresten aus dem Mund-Rachenraum, wird dann ein kleiner Baumwolltupfer mit einer endoskopischen Biopsiezange bis zum distalen Ende des Tubus vorgeschoben und wieder entnommen. Nun wird ein vorgewogenes Filterpapierblättchen mittels Biopsiezange durch den Tubus in die Bronchien eingeführt bis ein Widerstand auftritt. Das Blättchen verbleibt kurze Zeit auf dem Bronchial- epithel und wird dann entnommen. Nach erneutem Wiegen und Subtraktion des Gewichtes des Blättchens vor der Probenentnahme kann nach entsprechender Probenaufarbeitung eine Kon- zentrationsbestimmung in der auf dem Blättchen befindlichen ELF durchgeführt werden.
Mittels Blättchenmethode wurden beispielsweise Konzentration der antibakteriellen Substanz Ceftiofur in der ELF von Kälbern bestimmt (HALSTEAD et al. 1992).
Der Vorteil dieser Methode gegenüber der BAL ist, dass alle Schwierigkeiten der BAL, welche ihren Ursprung in der Verdünnung der ELF mit Spülflüssigkeit haben, nicht auftreten (HAL- STEAD et al. 1992).
Andere Nachteile der BAL wie die begrenzte Anzahl von Probenentnahmen von einem Indi- viduum, die Freisetzung von Konzentrationen aus alveolären Makrophagen und die nicht vor- handene Möglichkeit der Differenzierung zwischen proteingebundener und nicht-proteinge- bundener Arzneimittelkonzentration lassen sich auch auf die Blättchenmethode übertragen. Eine weitere Einschränkung der Methode entsteht dadurch, dass es sich bei der entnommenen Probe nicht zwangsläufig um frisch sekretierte Flüssigkeit handelt, sondern dass diese sich über längere Zeit auf dem Bronchialepithel angesammelt haben kann. Eine exakte Korrelation zwischen Kon- zentration und Zeit ist somit nicht möglich (CRUCIANI et al. 1996).
2.1.7 Bildgebende Verfahren
Folgende bildgebende Verfahren können zur Bestimmung von Arzneimittelkonzentrationen in Ge- weben eingesetzt werden: Planare Gamma-Szintigraphie (PGS), Single-Photon-Emissions-Com- putertomographie (Single Photon Emission Computed Tomographie [SPECT]), Positronen-Emis- sions-Tomographie (PET) und Magnetresonanzspektroskopie (MRS). Diese lassen sich bezüglich der Darstellung in zwei- oder dreidimensionale Bildgebung unterteilen (MÜLLER et al. 2004):
• zweidimensional: PGS
• dreidimensional: SPECT, PET, MRS
Die bildgebenden Verfahren wurden ursprünglich für den Einsatz in der Diagnostik und für Untersuchungen zu Gewebemetabolismus und Blutfluss entwickelt. Seit neuerer Zeit werden
sie auch in Untersuchungen zur Verteilung von Arzneimitteln in verschiedenen Geweben in der humanmedizinischen Forschung eingesetzt (MÜLLER et al. 2004).
PGS und SPECT
PGS und SPECT basieren auf dem Prinzip der Szintigraphie. Das zu untersuchende Arzneimittel wird hierzu mit einem gamma-emittierenden Radionuklid (z. B. 99mTechnetium) markiert und intravenös appliziert. Die Photonen, welche beim Zerfall der gamma-emittierenden Radionuk- lide entstehen, werden mit Gamma-Kameras detektiert mit dem Unterschied einer zweidimen- sionalen Bildgebung bei PGS und einer dreidimensionalen Bildgebung bei SPECT. Die Markie- rungsdichte kann so in verschiedenen Geweben untersucht werden.
Bisher wurden mit diesen Methoden hauptsächlich Untersuchungen zur Verteilung von Inhala- tiva in der Lunge durchgeführt. Beispielsweise wurden Tobramycin-Konzentration mittels PGS und Ciprofloxacin-Konzentrationen mittels SPECT bestimmt. PGS war das erste verfügbare bildgebende Verfahren (LANGER u. MÜLLER 2004; MÜLLER et al. 2004).
Der Nachteil von PGS im Vergleich zu SPECT ist, dass durch die zweidimensionale Darstellung Fehler und Artefakte durch Überlagerung entstehen können, da sich überlagernde Gewebe nicht unterscheiden lassen (LANGER u. MÜLLER 2004). Im Vergleich zu PET weisen PGS und SPECT einige Nachteile auf: die Bestimmung der lokalen Radioaktivität ist schwieriger und so- wohl die Sensivität als auch das räumliche Auflösungsvermögen sind geringer. Vorteilhaft im Ver- gleich zu PET ist, dass die eingesetzten Radionuklide langlebiger sind und somit kein Zyklotron vor Ort vorhanden sein muss; PGS und SPECT sind also vergleichsweise weniger aufwendig und kostengünstiger. Die Anwendung bei Untersuchungen zur Gewebeverteilung von Arzneimitteln ist jedoch begrenzt, da die Markierung von Molekülen mit verfügbaren PGS- und SPECT-Ra- dionukliden schwierig ist und grundsätzlich nur bestimmte Moleküle radioaktiv markierbar sind (LANGER u. MÜLLER 2004).
PET
PET basiert ebenfalls auf dem Prinzip der Szintigraphie. Dabei wird eine mit positronen-emit- tierenden Radionukliden markierte Substanz intravenös appliziert. Im Körper verbinden sich die in unterschiedliche Richtungen emittierten Positronen mit Elektronen (Annihilierung), wobei je Elektronen-Positronen-Paar 2 kolineare Photonen entstehen. Diese Photonen werden nun mit einem PET-Gerät aufgezeichnet. Das PET-Gerät besteht aus mehreren Detektoren in Ringan- ordnung, welche Szintillationskristalle enthalten. Diese werden um das zu untersuchende Gewebe platziert und die Photonen werden simultan von Detektorpaaren aufgezeichnet, welche sich in einem Winkel von 180 Grad zueinander befinden. Die resultierenden dreidimensionalen PET-Bil- der enthalten Informationen über die Gewebeverteilung der positronen-emittierenden Moleküle (LANGER u. MÜLLER 2004; BRUNNER u. LANGER 2006). Die meist verwendeten Marker- Radioisotope sind 15Sauerstoff (15O), 13Stickstoff (13N), 11Kohlenstoff (11C) und 18Fluor (18F). 15O und
13N können für Konzentrationsmessungen in Geweben nicht eingesetzt werden, da sie eine sehr
kurze Halbwertszeit besitzen. 18F ist das am besten geeignete Radioisotop, da es eine relativ lange Halbwertszeit (110 Minuten) hat und dadurch eine Bildgebung bis zu 10 Stunden nach Applikation möglich ist. Wenige Arzneimittel enthalten jedoch Fluor in ihrer Struktur, deshalb werden die meis- ten Studien unter Verwendung von 11C durchgeführt, obwohl die Halbwertszeit kürzer (circa 20 Minuten) und somit nicht ideal ist (LANGER u. MÜLLER 2004). Bezüglich pharmakokinetischer Untersuchungen zur Gewebeverteilung von Arzneimitteln gibt es 2 verschiedene Möglichkeiten PET einzusetzen. Zum einen ist eine direkte Bestimmung der Gewebeverteilung von 11C oder 18F markierten Arzneimitteln möglich. Zum anderen gibt es einen indirekten Ansatz, wobei die Inter- aktion eines Arzneimittelmoleküls mit einer Zielstruktur im Körper wie z. B. Rezeptoren oder En- zymen untersucht wird. Dazu wird ein validierter PET-Radioaktivmarker verwendet, welcher sich von der zu untersuchenden Substanz unterscheidet. Mit diesem ist die Quantifikation von Parame- tern möglich, die im Zusammenhang mit der Zielstruktur stehen (z. B. die Bindungsstellendichte).
Die zu untersuchende Substanz (unmarkiert) wird nun in verschiedenen Dosierungen verabreicht und die Anzahl der besetzten Bindungsstellen kann bestimmt werden.
Von den verschiedenen antibakteriellen Substanzklassen eignen sich Fluorochinolone besonders gut für pharmakokinetische Untersuchungen mittels PET, da diese einen hohen Grad an radio- aktiver Aktivität besitzen und Fluor in ihrer Struktur enthalten (LANGER u. MÜLLER 2004).
Beispielsweise wurden Studien zur Gewebepharmakokinetik von Ciprofloxacin durchgeführt (BRUNNER u. LANGER 2006). Untersuchungen zur Gewebeverteilung von anderen antibi- otischen Substanzklassen mittels PET wurden beispielsweise in Studien mit 11C-Erythromycin und antibiotischen Inhalativa in der Lunge von Menschen durchgeführt (LANGER u. MÜL- LER 2004).
Die Vorteile von PET im Vergleich zu anderen bildgebenden Verfahren sind eine sehr gute räum- liche Auflösung und eine hohe Sensivität.
Nachteilig ist jedoch der Einsatz von Radionukliden mit kurzer Halbwertzeit und die damit verbundene Notwendigkeit eines Zyklotrons vor Ort. Dadurch ist die Anwendung von PET auf spezielle Zentren beschränkt, welche diese Voraussetzung erfüllen (LANGER u. MÜLLER 2004; BRUNNER u. LANGER 2006). Zudem ist die Methode nicht invasiv, jedoch ist eine Exposition gegenüber radioaktiven Substanzen gegeben. Weiterhin ermöglicht PET kontinuier- liche Messungen, wobei aber die Dauer von der Halbwertszeit des verwendeten Radionuklids abhängig ist (BRUNNER u. LANGER 2006). Ein anderer Nachteil der Methode besteht darin, dass das aufgezeichnete Signal nicht zwangsläufig die intakte Arzneimittelfraktion darstellt, da auch Metaboliten erfasst werden. Damit ist ein Teil der erfassten Substanzmenge nicht notwen- digerweise biologisch aktiv (REINHOLD et al. 2005). Eine weitere Einschränkung ergibt sich aus der begrenzten Auswahl an verfügbaren Markern, sowie daraus, dass sich nicht alle Arznei- mittelmoleküle, darunter auch zahlreiche Antiinfektiva, für eine radioaktive Markierung eignen (MÜLLER et al. 2004; BRUNNER u. LANGER 2006). Weiterhin ist bei dieser Methode keine Differenzierung zwischen proteingebundener und nicht-proteingebundener Fraktion eines Arz- neimittels möglich (BRUNNER u. LANGER 2006).
MRS
MRS basiert auf dem physikalischen Prinzip der Kernspinresonanz (Nuclear Magnetic Reso- nance [NMR]). Dabei nutzt man den Eigendrehimpuls von Protonen und Neutronen und das magnetische Feld von Atomkernen. Einige Atomkerne (1Wasserstoff [1H], 13Kohlenstoff [13C],
19Fluor [19F], 31Phosphor [31P]) werden durch Anlegen eines starken magnetischen Gegenfelds (Feld 1) in Richtung dieses Feldes ausgerichtet. Durch das Ausrichten beginnt der Kern mit einer Präzessionsbewegung, welche auftritt, wenn der Atomkern aus seiner Ruhelage gebracht wird. Wird das Feld 1 entfernt, fällt der Atomkern in seine Ruhelage zurück. Um den Atomkern dauerhaft anzuregen, wird ein zweites hochfrequentes Wechselfeld (Feld 2) im rechten Winkel zu Feld 1 angelegt. Der Kern beginnt zu präzedieren bis sich ein Gleichgewichtszustand einstellt.
Für die Präzessionsbewegung existiert eine Resonanzfrequenz. Sie ist abhängig vom Aufbau des Atomkerns. Durch die Wahl der Stärke von Feld 1 und die Wahl der Frequenz von Feld 2 kann genau bestimmt werden, welche Kerne in Resonanz geraten sollen. Nach Abschalten von Feld 2 wird der Gleichgewichtszustand des Kerns unter Emission eines Radiosignals, welches der Re- sonanzfrequenz entspricht, wiederhergestellt. Dies ist die hauptsächliche Informationsquelle, die durch MRS genutzt wird. Die Amplitude dieses Signals ist proportional zur Anzahl der Kerne mit einer entsprechenden Resonanzfrequenz, die im zu untersuchenden Objekt vorhanden sind.
Abhängig von der chemischen Umgebung des Kerns in einem Molekül unterscheidet sich das emittierte Resonanzsignal, was für die chemische Identifikation entscheidend ist. Mittels MRS können chemische Einheiten wie z. B. Arzneimittelmoleküle in einem spezifischen Gewebe ge- messen werden (LANGER u. MÜLLER 2004).
MRS eignet sich besonders für Untersuchungen zur Gewebeverteilung von Arzneimitteln, wel- che Fluor in ihrer Struktur enthalten, da 19F eines der am besten geeigneten Isotope ist (MÜL- LER et al. 2004; BRUNNER u. LANGER 2006). Beispielsweise wurden Studien zur Gewebe- verteilung von Flerofloxacin in Leber und Muskel von Kälbern durchgeführt (MÜLLER et al.
2004).
MRS bietet im Gegensatz zu anderen bildgebenden Verfahren einen wichtigen Vorteil: es ist eine Unterscheidung von verschiedenen chemischen Strukturen wie beispielsweise Metaboliten möglich. Des Weiteren ist die Methode nicht invasiv und ermöglicht serielle Messungen in kur- zen Abständen (LANGER u. MÜLLER 2004; BRUNNER u. LANGER 2006). Ein zusätzlicher Vorteil ist die Möglichkeit der Differenzierung zwischen proteingebundener und nicht-protein- gebundener Arzneimittelfraktion (BRUNNER u. LANGER 2006).
Einen Nachteil von MRS im Vergleich zu PET stellt die 107- bis 109-fach geringere Sensivität dar. Aus diesem Grund sind nur Bestimmungen von hohen Arzneimittelkonzentrationen möglich (LANGER u. MÜLLER 2004; BRUNNER u. LANGER 2006). Weiterhin ist die Anwendung der Methode auf Studien mit Arzneimitteln beschränkt, bei denen eine ausreichende magneti- sche Antwort induziert werden kann (MÜLLER et al. 2004; BRUNNER u. LANGER 2006).
Bei den hier aufgeführten bildgebenden Methoden stehen folgende Vorteile im Vordergrund: sie sind nicht invasiv und es sind kontinuierliche Messungen in allen Geweben möglich (LANGER u. MÜLLER 2004; BRUNNER u. LANGER 2006).
Nachteilig ist jedoch, dass innerhalb eines Gewebes keine Aussage bezüglich Konzentrationen in einzelnen Kompartimenten wie der EZF getroffen werden kann (MÜLLER et al. 2004). Des Weiteren liegen diesen Verfahren jeweils eine komplexe Technik und ein anspruchsvoller Ver- suchsaufbau (z. B. Umgang mit radioaktiven Substanzen bei PGS, SPECT und PET) zu Grunde, weshalb sie auf spezielle Zentren beschränkt sind (BRUNNER u. LANGER 2006). Zusätzliche Nachteile entstehen durch den enormen Kosten- und Arbeitsaufwand (LIU u. DERENDORF 2003). Weiterhin nachteilig ist, dass pharmakokinetische Studien nicht mit beliebigen Substanzen durchgeführt werden können, denn es können nur Arzneimittel untersucht werden, die radio- aktiv markierbar sind (PGS, SPET und PET) beziehungsweise bei denen die Induktion einer ausreichenden magnetischen Antwort möglich ist (MRS) (MÜLLER et al. 2004; BRUNNER u. LANGER 2006).
2.1.8 Mikrodialyse
Prinzip
Die Mikrodialyse ist eine semiinvasive Technik, welche die passive Funktion eines kapillären Blutgefäßes nachahmt (UNGERSTEDT 1991; DE LA PENA et al. 2000). Sie basiert auf dem Dialyseprinzip. Der Begriff Dialyse ist vom griechischen Wort „dialysis“ abgeleitet und bedeutet
„Trennung“ (CHAURASIA 1999). Der Dialyse liegt zu Grunde, dass bei der Trennung von 2 Kompartimenten durch eine semipermeable Membran eine Diffusion von Molekülen in Rich- tung der niedrigsten Konzentration erfolgt (KEHR 1993; ELMQUIST u. SAWCHUK 1997).
Die Hauptelemente des Mikrodialysesystems (siehe Abbildung 1) sind: eine Mikrodialysepumpe, ein Mikrodialysekatheter mit einer semipermeablen Membran am distalen Ende (durchlässig für Wasser und niedermolekulare Substanzen) und ein Probensammelgefäß (auch als Microvial be- zeichnet) (CHAURASIA 1999; PLOCK u. KLOFT 2005).
Zunächst wird der Mikrodialysekatheter in ein bestimmtes Gewebe oder eine bestimmte Matrix (z. B. Zerebrospinalflüssigkeit) eingesetzt. Dann wird der Katheter durch einen Eingangsschlauch mit einer Flüssigkeit (Perfusat), welche sich isoosmotisch zu der die Membran umgebenden Flüssigkeit verhält, in einer bestimmten konstanten Geschwindigkeit (meist zwischen 0,5 und 5 Mikroliter pro Minute) perfundiert (PLOCK u. KLOFT 2005). Das Perfusat ist eine wässrige Lösung, welche der die Membran umgebenden Flüssigkeit bezüglich pH-Wert und ionischer Zusammensetzung möglichst ähnlich sein sollte, um unerwünschte Änderungen in der Zusam- mensetzung der umgebenden Flüssigkeit durch Drainage oder Einbringen von Molekülen zu vermeiden (DE LANGE et al. 2000). Je nach Orientierung des Konzentrationsgradienten kön-
nen nun endogene (z. B. Hormone, Neurotransmitter) oder exogene Stoffe (z. B. Arzneimittel- moleküle) in das Perfusat, beziehungsweise der Perfusionsflüssigkeit zugesetzte Substanzen aus dem Perfusat diffundieren. Das System kann sowohl zum Sammeln als auch zur Abgabe von Sub- stanzen (auch als Retrodialyse bezeichnet) genutzt werden (CHAURASIA et al. 2007). In den in dieser Arbeit durchgeführten Versuchen wird die Mikrodialyse zum Sammeln von exogenen Substanzen eingesetzt. Das Perfusat, welches nach Passage der Membran die zu untersuchende Substanz enthält und nun als Dialysat bezeichnet wird, wird über einen Ausgangsschlauch in ei- nem Probensammelgefäß gesammelt und in bestimmten Zeitintervallen entnommen. Die Kon- zentration der zu untersuchenden Substanz im Dialysat kann nun bestimmt werden (PLOCK u.
KLOFT 2005; BRUNNER u. LANGER 2006). Die Konzentration im Dialysat reflektiert die Konzentration in der die semipermeable Membran umgebenden Flüssigkeit (bei Implantation des Katheters in ein Gewebe ist dies die EZF) (DE LA PENA et al. 2000; DE LANGE et al.
2000). Abbildung 2 zeigt den Dialyseprozess an der Membran.
Abb. 1: Aufbau eines Mikrodialysesystems (mod. nach CMA MICRODIALYSIS) 1 Mikrodialysekatheter
2 Mikrodialysepumpe 3 Probensammelgefäß
4 Membran des Mikrodialysekatheters
Abb. 2: Dialyseprozess and der Membran (mod. nach ZEITLINGER et al. 2005)
Historie
Der Begriff „Mikrodialyse“ stammt aus den späten fünfziger Jahren und wurde zur Beschreibung einer Methode verwendet, mit welcher polare Steroide simultan aus dem Blutplasma dialysiert und extrahiert werden konnten. Diejenige Methode, für die wir heute den Begriff „Mikro- dialyse“ verwenden, wurde Mitte der siebziger Jahre von Professor Ungerstedt entwickelt (UN- GERSTEDT 1991; PLOCK u. KLOFT 2005). Das Konzept der Mikrodialyse, das heißt die Implantation eines von einer Dialysemembran umgebenen „Kompartiments“, welches sich im Gleichgewicht mit dem extrazellulären Umfeld befindet, in ein Gewebe geht jedoch schon zurück bis in die frühen sechziger Jahre (UNGERSTEDT 1991; CHAURASIA et al. 2007). GADDUM (1961) setzte eine Push-Pull-Technik ein, bei welcher eine Flüssigkeit durch eine Sonde direkt in zerebrales Gewebe gepumpt wurde (Push) und simultan mit einer zweiten angrenzenden Sonde entnommen werden konnte (Pull). BITO et al. (1966) implantierten mit Natriumchlorid und Dextran gefüllte Dialysesäcke in subkutanes Nackengewebe und zerebrales Gewebe von Hunden. Diese wurden einige Wochen später wieder entfernt und der Gehalt an Aminosäuren in der luminalen Flüssigkeit bestimmt. DELGADO et al. (1972) entwickelten eine Push-Pull- Dialytrode, bestehend aus 2 Stahlsonden mit einer kleinen permeablen Tasche mit der Funktion einer Dialysememebran an der Spitze zur Anwendung im Gehirn von Affen. UNGERSTEDT und PYCOCK (1974) berichten schließlich über die Implantation von Hohlfasersonden, welche die Funktion von Blutgefäßen nachahmen sollten, in zerebrales Gewebe zur Konzentrationsbe-
1 Mikrodialysekatheter 2 Perfusat
3 Mikrodialysat
4 Dialyseprozess an der Membran 5 Extrazelluläre Flüssigkeit 6 Zu untersuchende Substanz 7 Zellen
8 Blutkapillare
stimmung von Neurotransmittern. Diese Hohlfasersonden wurden bald zu Nadelkathetern mit einer Hohlfasermembran an der Spitze weiterentwickelt (UNGERSTEDT 1991). Man setzte die Mikrodialyse zunächst experimentell zur Konzentrationsbestimmung endogener Substanzen in der ZNS-Forschung ein (STAHLE 1992). Eine weitere Anwendung fand die Mikrodialyse in pharmakokinetischen Studien (Messung von Konzentrationen von exogenen Substanzen) in verschiedenen Geweben von Nagern (CHAURASIA et al. 2007). 1987 wurde die Mikrodialy- se erstmals im Mensch zur Bestimmung interstitieller Glukosekonzentrationen im subkutanen Fettgewebe eingesetzt (MÜLLER 2000). Es folgten Messungen von endogenen Metaboliten und Transmitterkonzentrationen im menschlichen Gehirn. Erste pharmakokinetische Untersu- chungen zu Konzentrationen von exogenen Substanzen wurden zu Beginn der neunziger Jahre publiziert (CHAURASIA et al. 2007). Die erste Publikation zur Messung peripherer Gewebe- konzentrationen von Antiinfektiva erschien 1995 (BRUNNER et al. 2005). Die Mikrodialyse hat sich zu einer Standardtechnik in der ZNS-Forschung entwickelt (DAVIES 1999). Sie kann inzwischen auch in fast allen anderen Geweben des Körpers eingesetzt werden (CHAURASIA et al. 2007). Die Mikrodialyse findet Anwendung in pharmakokinetischen Untersuchungen in Mensch und Tier zu einer Vielzahl von Substanzen in unterschiedlichen Geweben, wie z. B. Le- ber, Muskel, Augen, Knochen und Lunge (CHAURASIA 1999; MÜLLER 2000). Inzwischen sind U. S. Food and Drug Administration (FDA) und European Union Conformite-genehmigte Katheter für den Einsatz im Mensch erhältlich und es wurden bisher mehr als 10.000 Publikati- onen zum Thema Mikrodialyse veröffentlicht. 1600 davon beschäftigen sich mit dem Einsatz der Mikrodialyse im Menschen (CHAURASIA et al. 2007).
Mikrodialysekatheter
Je nach Anwendung, das heißt in welchem Gewebe oder Matrix ein Mikrodialyseversuch durch- geführt und welche Substanzen untersucht werden sollen, können Katheter verschiedener Form und verschiedenen Aufbaus verwendet werden (DE LANGE et al. 2000).
Es gibt eine Reihe von unterschiedlichen Katheterformen, unter anderem linear, u-förmig und konzentrisch aufgebaute Katheter (siehe Abbildung 3) (CHAURASIA et al. 2007).
1 Linear 2 U-förmig 3 Konzentrisch
Abb. 3: Katheterformen (mod. nach CHAURASIA 1999)
Die ersten, von UNGERSTEDT und PYCOCK (1974) entwickelten Katheter hatten ein linea- res Design und der Dialyseprozess erfolgte über eine Hohlfasermembran. Lineare Sonden haben den Nachteil, dass das zu untersuchende Gewebe zweimal durchstochen werden muss, wohinge- gen bei der u-förmigen und konzentrischen Katheterform Ein- und Ausgangsschlauch parallel angeordnet sind und so nur ein Eingangspunkt in das Gewebe benötigt wird (CHAURASIA 1999). Am häufigsten werden Katheter konzentrischen Aufbaus verwendet. Diese bestehen aus einer Membran am distalen Ende des Katheters und einem doppellumigen Schaft, der sich in ei- nen Eingangs- und Ausgangsschlauch aufzweigt. Der Eingangsschlauch ist mit der Mikrodialyse- pumpe verbunden, der Ausgangsschlauch mit dem Probensammelgefäß. Der Schaft des Katheters kann je nach Anwendung aus starrem oder flexiblem Material gefertigt sein. Bei Mikrodialyseex- perimenten im Gehirn werden vorrangig Katheter mit einem starren Schaft verwendet, wohin- gegen flexibel geformte Katheter ihre Anwendung bei Mikrodialysestudien in Weichteilgeweben finden (DE LANGE et al. 2000; JOUKHADAR u. MÜLLER 2005; PLOCK u. KLOFT 2005).
Abbildung 4 zeigt einen flexibel geformten Katheter zur Anwendung in der Leber.
Abb. 4: Konzentrisch aufgebauter flexibler Katheter zur Anwendung in der Leber (mod. nach CMA MICRODIALYSIS 2006)
1 Membran
2 Doppellumiger Schaft 3 Ausgangsschlauch
4 Eingangsschlauch 5 Probensammelgefäß 6 Luerlockanschluss
Um Schäden an der Membran zu vermeiden, setzt man die Katheter meist mit Hilfe von Füh- rungskanülen in das zu untersuchende Gewebe ein (JOUKHADAR u. MÜLLER 2005). Je nach Anwendung variiert die Mikrodialysemembran in Länge (üblicherweise zwischen 1 und 30 Millimeter), Durchmesser (üblicherweise zwischen 300 und 600 Mikrometer) und Material, aus dem sie gefertigt wird. Die Auswahl des Membranmaterials ist für ein Mikrodialyseexperiment von großer Bedeutung, da die zu untersuchende Substanz und das Membranmaterial nicht mit- einander agieren dürfen. Häufig verwendete Membranmaterialien sind Cellulose, Polykarbonat, Polyethersulfon und Cuprophan. Jeder Mikrodialysekatheter hat eine bestimmte Molekularge- wichtsdurchlässigkeit (Cut-off), die durch die Größe der Poren in der Membran bestimmt wird.
Der Cut-off der Mikrodialysekatheter liegt meist zwischen 6 und 100 Kilodalton, weshalb sie für große Moleküle, wie z. B. Proteine undurchlässig sind (SARRE et al. 1993).
Wiederfindung
In einem Mikrodialyseversuch zu Konzentrationsbestimmung von exogenen Substanzen diffun- diert die zu untersuchende Substanz durch die Membran aus dem den Katheter umgebenden Medium (bei Untersuchungen in Geweben ist dies die EZF) auf Grund eines Konzentrations- gradienten in das im Katheter befindliche Perfusat. Das Perfusat wird durch die Mikrodialyse- pumpe in einer konstanten kontinuierlichen Fließgeschwindigkeit (bestimmt durch die Flussra- te) durch den Katheter gepumpt. Dieser Fluss verhindert, dass sich ein Gleichgewicht zwischen der Konzentration der Substanz im Dialysat (CD) und der Konzentration der Substanz in der EZF (CEZF) einstellen kann. Somit ist die gemessene Konzentration im Dialysat nur eine Fraktion der nicht-proteingebundenen Konzentration in der EZF. Das Verhältnis von CD zu CEZF wird als relative Wiederfindung (rW) bezeichnet und üblicherweise in Prozent angegeben. Die relative Wiederfindung lässt sich durch folgende Gleichung beschreiben (CHAURASIA 1999; CHAU- RASIA et al. 2007):
Von der relativen Wiederfindung ist der Begriff der absoluten Wiederfindung (aW) abzugrenzen, welcher die Menge der zu untersuchenden Substanz, die pro Zeiteinheit im Dialysat vorgefun- den wird, beschreibt. Die absolute Wiederfindung kann mit Hilfe folgender Gleichung dargestellt werden (BENEVISTE u. HÜTTEMEIER 1990; KOVAR et al. 1997):
Die relative Wiederfindung wird von den folgenden Faktoren beeinflusst:
• Diffusion über die Membran: ihrerseits direkt abhängig von - Temperatur
- Beschaffenheit der Membran (Cut-off, Membranmaterial, Oberfläche der Membran)
- Größe der zu untersuchenden Substanz
• Zusammensetzung Perfusat
• Flussrate
• Beschaffenheit der Matrix
aW = × 100 [aW ] = Masse / Volumen
CD rW
rW = × 100 [rW ] = %
CD CEZF
Die Diffusion über die Membran ist direkt proportional zur Temperatur. Bei steigender Tem- peratur erhöht sich die Diffusionsrate der zu untersuchenden Substanz über die Membran in das Perfusat und somit auch die relative Wiederfindung. In-vitro-Versuche sollten deshalb immer bei einer konstanten Temperatur (Körpertemperatur) durchgeführt werden (DE LANGE et al. 2000;
PLOCK u. KLOFT 2005). Voraussetzung für die Diffusion einer Substanz über die Membran ist, dass ihr Molekulargewicht kleiner als der Cut-off der Membran ist. Eine akzeptable relative Wiederfindung wird erreicht, wenn das Molekulargewicht der Substanz ein Viertel des Cut-offs beträgt (PLOCK u. KLOFT 2005). Durch eine Verlängerung der Membran und somit auch einer Vergrößerung der Membranoberfläche erhöht sich die relative Wiederfindung. Bei kurzen Membranen ist der Anstieg der relativen Wiederfindung linear zur Verlängerung der Membran.
Bei sehr langen Membranen jedoch erhöht sich die Wiederfindung kaum, da sich der Konzen- trationsunterschied zwischen EZF und Dialysat durch die steigende Membranlänge verkleinert (DE LANGE et al. 2000; PLOCK u. KLOFT 2005). Der Diffusionskoeffizient verhält sich um- gekehrt proportional zur Größe der Substanz. Dies bedeutet, dass die relative Wiederfindung mit steigendem Molekulargewicht abnimmt. Substanzen mit einem Molekulargewicht größer als 1 Kilodalton sind daher für herkömmliche Mikrodialyseexperimente eher ungeeignet (CHAU- RASIA 1999).
Auch die Zusammensetzung des Perfusats kann die relative Wiederfindung beeinflussen. Das Perfusat sollte der EZF möglichst ähnlich sein, denn Unterschiede der osmotischen Eigenschaf- ten lösen eine Flüssigkeitsbewegung aus, die die Diffusion über die Membran behindern oder verstärken kann (DE LANGE et al. 2000).
Mit sinkender Flussrate erhöht sich die relative Wiederfindung und umgekehrt. Bei einer nied- rigen Flussrate nähern sich die Konzentrationen in der EZF und im Dialysat einem Gleichge- wichtszustand an. Je weiter die Flussrate gegen 0 geht, desto mehr nähert sich die relative Wieder- findung 100 Prozent an. Mit steigender Flussrate nimmt die Wiederfindung exponentiell ab. Bei Flussraten höher als 10 Mikroliter pro Minute findet auf Grund des Flüssigkeitsdrucks ein Verlust von Perfusat über die Membran statt. Dadurch wird die Diffusion über die Membran in das Ka- theterlumen behindert. Das Herabsetzen der Flussrate wird durch die dabei abnehmenden Pro- benvolumina und die Quantifikationsgrenze der verwendeten analytischen Methode limitiert.
Ein weiterer Einflussfaktor bezüglich der relativen Wiederfindung ist die Beschaffenheit der Matrix beziehungsweise des Gewebes, in der oder dem sich der Katheter befindet. Damit die zu untersuchende Substanz über die Membran in den Katheter diffundieren kann, muss sie zunächst durch das Gewebe diffundieren. Dies ist abhängig vom Grad der intrazellulären Anreicherung, der metabolischen Umsatzrate, vom aktiven Transport über Membranen und der Vaskularisation des Gewebes. Generell gilt, dass durch diese Eigenschaften von Geweben die relative Wiederfin- dung im Vergleich zu In-vitro-Experimenten reduziert wird (CHAURASIA 1999; DE LANGE et al 2000; PLOCK u. KLOFT 2005).
Bei quantitativen Untersuchungen, wie Untersuchungen zur Pharmakokinetik von Arzneimit- teln in Geweben mittels Mikrodialyse, ist die Kenntnis der relativen Wiederfindung zur Bestim-
mung von CEZF von essentieller Bedeutung. Bei Kenntnis der relativen Wiederfindung berechnet sich CEZF wie folgt (KOVAR et al. 1997; CHAURASIA et al. 2007):
Die relative Wiederfindung kann mit Hilfe der folgenden Kalibrierungsmethoden bestimmt werden:
• Bestimmung der relativen Wiederfindung in vitro:
- Dialyse - Retrodialyse
• Bestimmung der relativen Wiederfindung in vivo:
- Extrapolation zur Flussrate 0 - No-net-flux
- Dynamischer No-net-flux
- Retrodialyse mit oder ohne Verwendung einer Eichsubstanz
Bei der Bestimmung der relativen Wiederfindung kann zunächst zwischen in vitro oder in vivo durchgeführten Kalibrierungsmethoden unterschieden werden (KOVAR et al. 1997). Bei der In-vitro-Dialysemethode wird der Mikrodialysekatheter kontinuierlich bei einer konstanten Flussrate perfundiert, während er in eine Lösung eingetaucht ist, welche die zu untersuchende Substanz in bekannter Konzentration enthält. Das Dialysat wird gesammelt und zu festgelegten Zeitpunkten entnommen (meist alle 10 bis 20 Minuten). Die relative Wiederfindung berechnet sich dann wie folgt:
wobei CL die Konzentration der Substanz in der Lösung darstellt. Auch die später beschriebene Retrodialysemethode kann in vitro durchgeführt werden (BENVENISTE u. HÜTTEMEIER 1990; SARRE et al. 1993; KOVAR et al. 1997; PLOCK u. KLOFT 2005).
Die im Folgenden beschriebenen Kalibrierungsmethoden werden in vivo durchgeführt. Die Ex- trapolation-zur-Flußrate-0-Methode wurde von JACOBSON et al. (1985) eingeführt. Hier- bei wird die Konzentration im Dialysat bei verschiedenen Flussraten bestimmt. Die jeweilige Flussrate wird mit der gemessenen Konzentration durch die folgende Exponentialfunktion in Verbindung gesetzt:
CEZF = × 100CD rW
rW = × 100,CD CL
wobei K0 den Massentransportfaktor, A die Membranoberfläche und F die Flussrate darstellt.
CEZF und K0 x A können durch nicht-lineare Regression mit Hilfe pharmakokinetischer Soft- wareprogramme bei verschiedenen Flussraten ermittelt werden. Die graphische Darstellung der gemessenen Konzentrationen gegen die Flussraten ergibt eine von K0 x A abhängige Steigung.
Der Ordinatenschnittpunkt ist CEZF bei einer Flussrate von 0 und entspräche einer relativen Wie- derfindung von 100 Prozent. Die zur jeweiligen Flussrate korrespondierende relative Wiederfin- dung erhält man durch folgende Umformung der oben genannten Gleichung:
Die Nachteile dieser Methode sind zum einen lange Sammelperioden bei niedrigen Flussraten und die daraus resultierenden niedrigen Probenvolumina. Zum anderen wird hier eine Extra- polation zum 0-Fluss durchgeführt; die relative Wiederfindung wird somit nur geschätzt ohne dass die Bestimmung des exakten Wertes möglich ist (KOVAR et al. 1997; PLOCK u. KLOFT 2005).
Die No-net-flux-Methode wurde von LONNROTH et al. (1987) entwickelt. Bei dieser Me- thode wird die zu untersuchende Substanz dem Perfusat in verschiedenen bekannten Konzent- rationen zugegeben und die Konzentration im Dialysat wird bestimmt. Wenn die Konzentration im Perfusat (CP) kleiner als CEZF ist, ist der Diffusionsprozess in Richtung Perfusat gerichtet und CD > CP. Wenn CP > CEZF ist, dann ist CD < CP. Wenn CD und CP gleich sind, dann ist auch CEZF gleich CP, der Nettofluss ist also gleich 0. Der jeweilige Substanzverlust oder –gewinn (CD - CP) wird gegen CP aufgetragen. Der Schnittpunkt mit der Abszisse ergibt CEZF und die relative Wie- derfindung wird durch die Steigung der Regressionsgeraden bestimmt. Diese Methode ist sehr zeitintensiv (KOVAR et al. 1997; PLOCK u. KLOFT 2005).
Die Methode des dynamischen No-net-flux wurde von OLSON und JUSTICE (1993) ein- geführt und der Unterschied zur No-net-flux-Methode besteht darin, dass mindestens 3 Grup- pen mit je 3 bis 4 Individuen mit einer Konzentration pro Gruppe perfundiert werden. Die Daten werden dann zur Auswertung zusammengefasst. Die Methode des dynamischen No-net- flux ist weniger zeitintensiv als die No-net-flux-Methode, jedoch entsteht durch das Zusammen- fassen von Daten verschiedener Katheter eine zusätzliche Variabilität (PLOCK u. KLOFT 2005;
CHAURASIA et al. 2007).
Die Retrodialysemethode wird auch als Delivery-Methode bezeichnet (STAHLE et al. 1991).
Sie basiert auf der Annahme, dass der Diffusionsprozess über die Membran in beide Richtungen gleich ist. Bei dieser Methode wird das Verfahren der Mikrodialyse umgekehrt, das heißt die zu untersuchende Substanz wird dem Perfusat in bekannter Konzentration zugegeben. Die relative
rW = = 1- e .-KO×
AF
CD CEZF
CD = CEZF - CEZF × e ,-KO× AF
