Aus dem Institut für Anatomie und Zellbiologie der Medizinischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg (Direktor: Prof. Dr. med. Dr. agr. Bernd Fischer)
Die Relaxin-Familie im Reproduktionstrakt von Mammaliern
Habilitation
zur Erlangung des akademischen Grades Dr. med. habil.
vorgelegt dem Rat der Medizinischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
von: Dr. med. Thomas Klonisch geb. am 18.10.1960 in Dülken
Verteidigung: 09.12.1999 Antrittsvorlesung: 11.01.2000
Gutachter:
1. Professor Dr. med. Dr. agr. Bernd Fischer 2. Professor Dr. med. vet. Rudolph Leiser
für
Susanne, Tobias, Sabine,
Inhaltsverzeichnis
Seite
1. Einleitung und Fragestellung
6 - 8
2. Überblick
8 - 17
2.1. Relaxin 8 - 15
2.1.1. Molekulare Struktur und genomische Organisation 8
2.1.2. Syntheseorte im Reproduktionstrakt 10
2.1.3. Sekretion des Relaxins 11
2.1.4. Biologische Funktionen des Relaxins im Reproduktionstrakt 13
2.2. Relaxin-like Factor (RLF) 15 - 17
2.2.1. Molekulare Struktur und genomische Organisation 15
2.2.2. Expression von RLF 16
2.2.3. Biologische Funktionen des RLF 17
3. Material und Methoden
18 - 35
3.1. Allgemeiner Teil 18 - 23
3.1.1. Gewebe 18
3.1.2. Molekularbiologische Methoden 18
3.1.2.1. RNA-Isolierung 18
3.1.2.2. Northern Analyse 18
3.1.2.3. RT-, RACE- und Capfinder-PCR Methoden zur cDNA Klonierung 19
3.1.2.4. Vergleichende Sequenzanalyse 19
3.1.2.5. Herstellung Digoxigenin-markierter cRNA Sonden 19
3.1.2.6. Nichtradioaktive in-situ Hybridisierung 20
3.1.2.7. Isolierung genomischer DNA und Southern Analyse 21
3.1.3. Proteinnachweis 21
3.1.3.1. Fixierung und Schnittechnik 21
3.1.3.2. Immunhistochemie 22
3.2.1. Relaxin 24 - 29
3.2.1.1. Equiden 24
3.2.1.1.1. Klonierung des Prorelaxins des Pferdes (Equus caballus) 24
3.2.1.1.2. Ovar 24
3.2.1.1.3. Präimplantationsembryonen und uteroplazentares Gewebe 24
3.2.1.2. Dromedar (Camelus dromedarius) 25
3.2.1.2.1. Klonierung des Präprorelaxins 25
3.2.1.2.2. Ovar und uteroplazentares Gewebe 26
3.2.1.3. Katze (Felis catus) 26
3.2.1.3.1. Klonierung des Präprorelaxins 26
3.2.1.3.2. Uteroplazentares Gewebe 27
3.2.1.4. Hund (Canis domesticus) 27
3.2.1.4.1. Klonierung des Präprorelaxins 27
3.2.1.4.2. Uteroplazentares Gewebe 28
3.2.1.5. Galago crassicaudatus und Varecia variegata 28
3.2.1.5.1. Klonierung der Präprorelaxine 28
3.2.1.5.2. Plazenta 29
3.2.2. Relaxin-like Faktor (RLF) in unterschiedlichen Spezies 30 - 33
3.2.2.1. Ziege (Capra hircus) 30
3.2.2.1.1. Klonierung des RLF 30
3.2.2.1.2. Testikuläre Expression 30
3.2.2.2. Damwild (Dama dama) 31
3.2.2.2.1. Klonierung des RLF 31
3.2.2.2.2. Testikuläre, ovarielle, uterine und uteroplazentare Expression 31
3.2.2.3. Galago crassicaudatus 31
3.2.2.3.1. Klonierung des RLF und genomische Organisation 31
3.2.2.3.2. Testikuläre Expression 32
3.2.2.4. Mensch (Homo sapiens) 32
3.2.2.4.1. Klonierung des RLF 32
3.2.2.4.2. Testikuläre Leydigzell-Neoplasien 33
3.2.2.4.4. Uteroplazentares Gewebe 33 3.2.3. Tabellarische Zusammenfassung der eingesetzten Methodiken 34
4. Ergebnisse
36 - 914.1. Relaxin 36 - 69
4.1.1. Equiden 36
4.1.1.1. Molekulare Charakterisierung 36
4.1.1.1.1. Prorelaxin cDNA-Sequenz 36
4.1.1.2. Expression und Lokalisation im Gewebe 37
4.1.1.2.1. Präimplantationsembryonen 37
4.1.1.2.2. Uteroplazentares Gewebe 39
4.1.1.2.3. Ovar 42
4.1.1.3. Relaxinkonzentrationen in ovarieller Follikelflüssigkeit 44
4.1.1.4. Zusammenfassung 46
4.1.2. Dromedar 46
4.1.2.1. Molekulare Charakterisierung 46
4.1.2.1.1. Präprorelaxin cDNA-Sequenz 46
4.1.2.2. Expression und Lokalisation im Gewebe 47
4.1.2.2.1. Uteroplazentares Gewebe 47
4.1.2.2.2. Ovar 49
4.1.2.3. Zusammenfassung 49
4.1.3. Die Halbaffen G. crassicaudatus und V. variegata 52
4.1.3.1. Molekulare Charakterisierung 52
4.1.3.1.1. Präprorelaxin cDNA-Sequenzen 52
4.1.3.2. Expression und Lokalisation im Gewebe 57
4.1.3.2.1. Plazentares Gewebe 57
4.1.3.3. Zusammenfassung 57
4.1.4. Katze 59
4.1.4.2.1. Uteroplazentares Gewebe 61
4.1.4.3. Zusammenfassung 62
4.1.5. Hund 64
4.1.5.1. Molekulare Charakterisierung 64
4.1.5.1.1. Präprorelaxin cDNA-Sequenz 64
4.1.5.2. Expression und Lokalisation im Gewebe 66
4.1.5.2.1. Uteroplazentares Gewebe 66
4.1.5.3. Zusammenfassung 67
4.1.6. Zusammenfassung der Ergebnisse der Relaxin-Studien 69
4.2. Relaxin-like Faktor (RLF) 70 - 91
4.2.1. Ziege 70
4.2.1.1. Molekulare Charakterisierung 70
4.2.1.1.1. RLF cDNA 70
4.2.1.1.2. Genomische Struktur 72
4.2.1.2. Expression und Lokalisation im Gewebe 72
4.2.1.2.1. Hoden 72
4.2.1.2.2. Uteroplazentares Gewebe 73
4.2.1.3. Zusammenfassung 73
4.2.2. Damwildes (Dama dama) 75
4.2.2.1. Molekulare Charakterisierung 75
4.2.2.1.1. RLF cDNA und genomische Struktur 75
4.2.2.2. Expression und Lokalisation im Gewebe 77
4.2.2.2.1. Hoden 77
4.2.2.2.2. Ovar 77
4.2.2.2.3. Uterus und uteroplazentares Gewebe 79
4.2.2.3. Zusammenfassung 80
4.2.3. Galago crassicaudatus 81
4.2.3.1. Molekulare Chrakterisierung 81
4.2.3.1.1. RLF cDNA 81
4.2.3.1.2. Genomische Organisation 83
4.2.3.2.1. Hoden 84
4.2.3.3. Zusammenfassung 85
4.2.4. Mensch (Homo sapiens) 86
4.2.4.1. Expression und Lokalisation im Gewebe 86
4.2.4.1.1. Testikuläre Leydigzell-Neoplasien 86
4.2.4.1.2. Ovarieller Sertoli-Leydigzell-Tumor (SLCT) 87
4.2.4.1.3. Uteroplazentares Gewebe 89
4.2.4.2. Zusammenfassung 90
4.2.5. Zusammenfassung der Ergebnisse der RLF-Studien 91
5. Diskussion
92 - 1115.1. Relaxin 92 - 102
5.1.1. Struktur 92
5.1.2. Mögliche Rolle des Relaxins im Ovar 95
5.1.3. Möglicher Zusammenhang zwischen Relaxin-Expression und der
Invasivität von Trophoblast-Zellen 97
5.2. Relaxin-like Faktor 102 - 110 5.2.1. Struktur 102 5.2.2. Hoden 104 5.2.3. Ovar 106 5.2.4. Uteroplazentares Gewebe 107 5.3. Ausblick 110
6. Zusammenfassung
111 - 1137. Literatur
114 - 1418. Anhang
142 - 148 8.1. Lebenslauf 142 8.2. Erklärungen 143 8.3. Danksagung 144 8.4. Thesen 145 - 1481. Einleitung und Fragestellung
Innerhalb der Familie der Insulin-artigen Moleküle, zu denen neben Relaxin und Insulin auch die Insulin-like Growth Factors I und II (IGF I und IGF II), Relaxin-like Factor (RLF, Ley-I-L oder INSL3) und Placentin (INSL4; Koman et al., 1996) zählen, nimmt Relaxin eine Sonderstellung ein. Kein anderes Polypeptidhormon zeigt eine solche Heterogenität in seiner Peptidsequenz, den unterschiedlichen Syntheseorten sowie dem pleiomorphen physiologischen Wirkspektrum. Die Erstbeschreibung des Relaxin-like Factor (RLF; Adham 1993) sowie der Nachweis, daß RLF wie Relaxin spezifisch an den Relaxinrezeptor, nicht aber an den Insulinrezeptor, bindet, hat zur Etablierung der Familie Relaxin-artiger Moleküle geführt. Diese neue Molekülfamilie wächst stetig und umfaßt derzeit neben dem Relaxin und dem RLF das SQ10-Molekül des Kaninchens (Fields et al., 1995), die kürzlich beim Menschen und Chimpansen beschriebenen trunkierten Relaxinvarianten (Gunnersen et al., 1996) sowie eine im Neuweltaffen Callithrix jacchus (Marmoset; Zarreh-Hoshyari-Khah et al., 1999) nachge-wiesene RLF-Mutante.
Relaxin und RLF werden im weiblichen und männlichen Reproduktionstrakt exprimiert (Ivell, 1997a; Sherwood, 1994). In einigen Spezies ist die Plazenta der Hauptsyntheseort für Relaxin, verantwortlich für die hohen während der Gravidität gemessenen Relaxinwerte und ein geeigneter Indikator für die plazentare Funktion (Stewart et al., 1992a; Steinetz et al., 1987). Ein wichtiger Syntheseort für RLF sind die interstitiellen Leydigzellen des Hodens, bei denen bis zu 5% aller exprimierten Transkripte für RLF mRNA kodieren (Bathgate et al., 1996).
Die verwirrende Vielfalt von Relaxin und RLF in Struktur, Vorkommen, Sekretion, Funktion und endokrinen Interaktionen (vgl. 2.1.1.-2.1.4.), die durch auffällige Unterschiede zwischen den Spezies noch weiter gesteigert wird, machen diese Hormone zu einem spannenden, aber komplexen und nicht einfach zu bearbeitenden Untersuchungsgegenstand. Sowohl klinische als auch grundlagenorientierte Fragestellungen bedürfen dringend einer Klärung. Die vorliegende Arbeit will dazu einen Beitrag leisten. Ich habe mich in dieser Arbeit von folgenden Fragen leiten lassen:
• Erlauben die cDNA-Sequenzen der hier klonierten neuen Relaxine und RLF-Moleküle einen tieferen Einblick in die molekulare Struktur dieser Hormone und die Interaktion mit ihren bislang nicht isolierten Rezeptoren?
• Kann das von mir untersuchte breite Spektrum an Spezies und an Organen Hinweise auf wichtige biologische Funktionen von Relaxin und RLF geben?
• Wie sind Mitglieder der Relaxin-Familie in pathologisch veränderten Geweben exprimiert und können diese Informationen helfen, mögliche Funktionen dieser Hormone für die Pathogenese der Krankheitsbilder aufzudecken?
Trotz und wegen der Breite der Fragestellung habe ich mich auf einige Phasen der Fortpflanzung konzentriert. Die Untersuchungen zur ovariellen Expression von Relaxin und RLF dienten der Beantwortung der folgenden konkreten Fragen:
Existiert eine lokale Expression von equinem Relaxin im Ovar mit seiner einzigartigen anatomischen Struktur und erlaubt das Expressionmuster Rückschlüsse auf die Funktion des Relaxins im Ovar des Pferdes?
Wird das erste in Wiederkäuern klonierte Relaxin im Ovar des Dromedars exprimiert und wie verändert sich das ovarielle Expressionsmuster im Verlauf der Trächtigkeit?
Wo wird RLF im Ovar des trächtigen Damwildes exprimiert?
Wird RLF in ektopen Leydigzellen ovarieller Sertoli-Leydigzell-Tumoren exprimiert?
Die Untersuchungen zur plazentaren Expression von Relaxin dienten der Beantwortung der Frage, ob ein Zusammenhang besteht zwischen dem Plazentationstyp der jeweiligen Spezies und den Relaxin-exprimierenden Zelltypen in den untersuchten Plazenten. Von den in dieser Arbeit untersuchten Spezies war bislang weder eine Relaxin-cDNA kloniert worden noch Informationen zur zellulären Lokalisation der Relaxin-Expression in der Plazenta bekannt. Die Equiden, das Dromedar und der Halbaffe Galago crassicaudatus haben einen epitheliochorialen und der Hund und die Katze einen endotheliochorialen Plazentationstyp.
Informationen zur zellulären Lokalisation von RLF Transkripten in der Plazenta existieren bislang nicht. Daher war ein weiteres Ziel dieser Arbeit, sowohl in den synepitheliochorialen Plazenten von Ziege und Damwild wie der hämochorialen Plazenta des Menschen RLF Transkripte nachzuweisen und RLF-exprimierende Zellen in den Plazenten des Damwildes und des Menschen zu identifizieren. Schließlich sollten die Untersuchungen zur testikulären Expression von RLF klären, ob in allen untersuchten Spezies die Leydigzellen des adulten Hodens spezifisch RLF exprimieren und die konstitutive RLF-Expression der normalen humanen Leydigzelle in Leydigzell-Tumoren sowie in humanen Leydigzellen ektoper ovarieller Lokalisation verändert ist.
Neue bislang unveröffentlichte Ergebnisse betreffen die Klonierungen und zelluläre Lokalisation der Relaxine des Dromedars, der Halbaffen Galago crassicaudatus und Varecia variegata sowie der RLF-Moleküle des Damwildes und von Galago crassicaudatus. Auch die Daten zur plazentaren Lokalisation von RLF-Transkripten in menschlichen Plazenten sind bislang noch nicht veröffentlicht.
2. Überblick
2.1. Relaxin2.1.1. Molekulare Struktur und genomische Organisation
Relaxin wird als Präprohormon synthetisiert und besteht aus einem Signalpeptid, einer B-, C- und einer A-Domäne (vom N´- zum C´-Terminus). Bedingt durch sein wesentlich längeres C-Peptid ist das Präprorelaxin etwa doppelt so groß wie das Präproinsulin (Gast, 1983). Die enzymatische Abspaltung des Signalpeptids erfolgt, wie bei anderen Proteinen (Steiner et al., 1980), an einer Aminosäure mit kurzer Seitenkette und überführt das Präprorelaxin in das Prorelaxin. Vor seiner enzymatischen Entfernung aus dem Prorelaxin durch die Subtilisin-artige Serinprotease Prohormon Convertase 1 (Marriott et al., 1992) und möglicherweise zusätzliche Chymotrypsin-artige Enzyme (Haley et al., 1987) hat das C-Peptid vermutlich die Aufgabe, die korrekte Molekülkonformation zu stabilisieren, um so die Ausbildung der Disulfidbrücken zwischen A- und B-Domäne (im H2-Relaxin: CysB11-CysA11 und CysB23-CysA24) sowie der Disulfidbrücke innerhalb der A-Domäne (im H2-Relaxin: CysA10-CysA15) zu ermöglichen.
Strukturelle und funktionelle Befunde belegen die eigenständige Position des Relaxins innerhalb der Familie der Insulin-artigen Moleküle. Trotz ähnlicher α-Helix- und β-Faltblatt-Sekundärstrukturen (Eigenbrot et al., 1991; Du et al., 1982; Rawitch et al., 1980; Schwabe und Harmon, 1978) projizieren die A- und B-Kette der ca. 6 kD großen Relaxin- und Insulin-Dimere unterschiedlich aufeinander (Eigenbrot et al., 1991). Der Anteil identischer Aminosäuren zwischen Relaxin und Insulin beträgt nur ca. 25% und umfaßt die Cysteine, die an der Bildung der bei beiden Hormonen identischen Disulfidbrücken beteiligten sind. Die Oberfläche von Relaxin und Insulin präsentiert keine gemeinsamen immunologischen Epitope und Relaxin interagiert sehr viel schwächer als Insulin mit Insulin-degradierenden Enzymen (Ding et al., 1992; Pilistine et al., 1986). Relaxin bindet nicht an den Insulin- oder IGF-I-Rezeptor (Ohleth und Bagnell, 1995; Hofig et al., 1991; Hernandez et al., 1988) und dies erklärt die unterschiedlichen biologischen Aktivitäten von Relaxin und Insulin. Acht von zehn
der bei den Insulinen verschiedener Spezies konservierten und für die Funktion essentiellen Aminosäuren sind, wie das AsnA21 im humanen Insulin, entweder nicht im Relaxin vorhanden oder nicht konserviert (Sherwood, 1994; Dodson et al., 1983).
Die Anwesenheit der A- und B-Domäne des Relaxins sowie ihre korrekte Konformation sind wesentlich für die Relaxin-Bioaktivität. Die Aminosäuren GlyB12, ArgB13 und ArgB17 in dem hexameren konservierten Motiv -GRELVR- und GlyB24 in der Relaxin B-Domäne sowie GlyA14 in der A-Domäne (Numerierung der Aminosäuren entsprechend dem H2-Relaxin) sind hoch konserviert, trotz der für die Relaxine unterschiedlicher Spezies typischen hohen Heterogenität in ihren Aminosäuresequenzen (Schwabe und Büllesbach, 1990). Drei dieser Aminosäuren sind wesentlich für die Bioaktivität des Relaxins (Büllesbach et al., 1996). Die chemische Modifikation der beiden Arginine in den Positionen B13 und B17 (Büllesbach und Schwabe, 1988) sowie die chemische Synthese von Relaxinderivaten, bei denen ein Arginin oder beide Arginine durch das isosterisch ähnliche, ungeladene Citrullin oder das positiv geladene, basische Lysin ersetzt wurden, resultieren in einem kompletten Verlust der Rezeptorbindung (Büllesbach et al., 1992). Die wie Zacken aus der Oberfläche der B-Domäne projizierenden Guanidino-Seitengruppen beider ArgB13 und ArgB17 interagieren direkt mit dem membranständigen Relaxinrezeptor. Diese als „two-prong“ bezeichnete Relaxin-Rezeptor-bindung stellt eine neue Form der Hormon-Rezeptor-Interaktion dar (Büllesbach et al., 1992). Während ArgB13 und ArgB17 essentiell für den Rezeptorkontakt sind, ist die in der A-Domäne aller Relaxine konservierte Aminosäure GlyA14 wichtig für die korrekte Konformation des Gesamtrelaxins (Büllesbach und Schwabe, 1994). Ein Austauch von GlyA14 durch das in vergleichbarer Position im Insulin vorkommende Isoleucin mit größerer Seitenkette vermindert die Relaxinbioaktivität und die Rezeptorbindung 100-fach, während das kleinere Alanin an gleicher Stelle nur zu einer 3-fach reduzierten Bioaktivität führt (Büllesbach und Schwabe, 1994). Die schrittweise Verkürzung der N-terminalen α-Helix der A-Domäne führt ebenfalls zu Konformationsänderungen und dem Verlust an Bioaktivität (Büllesbach und Schwabe, 1994). Der Austausch dieser N-terminalen α-Helix des Relaxins durch das entsprechende Insulinsegment oder eine Penta-Alaninsequenz stellt die Bioaktivität dieser Relaxinderivate wieder her (Büllesbach et al., 1996). Unprozessiertes Prorelaxin ist das Hauptsekretions-produkt im Ovar der Ratte während der späten Phase der Trächtigkeit (Soloff et al., 1992). Prorelaxin ist auch in endometrialen Drüsen bei
1980). Die Anwesenheit der C-Domäne hat keinen Einfluß auf die Rezeptorbindung. Relaxin und Prorelaxin des Schweines binden mit gleicher Affinität an den Relaxinrezeptor (Tan et al., 1998). Mit Ausnahme des Menschen und der Menschenaffen, kodiert das Genom aller bislang untersuchten Spezies für ein Relaxingen, das aus zwei Exonen und einem ca. 4 kb großen Intron aufgebaut ist. Die Position dieses Introns ist einem der beiden Introne des Insulins ähnlich (Bell et al., 1980). In den humanen Relaxinen kodiert Exon 1 für das Signalpeptid, die B-Domäne und den Anfangsteil der C-Domäne bis zur Aminosäure Glu46, während Exon 2 für den Rest der C- und die gesamte A-Domäne kodiert (Crawford et al., 1989; Haley et al., 1987; Hudson et al., 1984). Der Mensch besitzt, wie die Menschenaffen, zwei nichtallele Relaxingene H1 und H2, die auf dem kurzen Arm des Chromosoms 9 lokalisiert sind (Crawford et al., 1984). Im Corpus luteum und der Placenta gelang kürzlich der Nachweis von ca. 100 bp längeren Transkripten für beide humanen Relaxine (H1 und H2) sowie für das Relaxin-2 des Chimpansen (Gunnersen et al., 1996). Diese durch alternatives Splicing erzeugten Transkripte beinhalten ein weiteres Exon und kodieren aufgrund eines vorzeitigen Stopkodons für trunkierte Relaxinprodukte, über deren physiologische Rolle nichts bekannt ist.
2.1.2. Syntheseorte im Reproduktionstrakt
Höchste Konzentrationen an Relaxin werden im weiblichen Reproduktionstrakt während der Gravidität nachgewiesen. Hauptsyntheseorte für Relaxin sind das Corpus luteum, die Placenta und der Uterus (Tab. 1). Neben dem jeweiligen Hauptsyntheseort gibt es im weiblichen Reproduktionstrakt sekundäre Syntheseorte für Relaxin. Die hier produzierten Relaxinmengen scheinen vor allem lokale auto- und parakrine Funktionen zu erfüllen.
Im männlichen Reproduktionstrakt wird Relaxin im glandulären Epithel der Prostata verschiedener Spezies, einschließlich des Menschen, sekretiert (Weiss, 1989; Ivell et al., 1989; De Cooman et al., 1983; Cameron et al., 1982). Immunoreaktives Relaxin wird im Ejakulat (Essig et al., 1982; Loumaye et al., 1980) sowie im Serum des Ebers (Juang et al., 1988), nicht jedoch im Serum des Mannes (O´Byrne et al., 1978), nachgewiesen.
Tabelle 1. Syntheseorte für Relaxin im weiblichen Reproduktionstrakt von Säugetieren (modifiziert nach Sherwood, 1994; * entsprechend der Numerierung im Literaturverzeichnis).
Spezies Ovar essentiell für die Aufrechterhaltung der Gravidität Hauptsyntheseort für Relaxin Sekundäre Syntheseorte für Relaxin
Mensch (Homo sapiens) nein C. luteum (323)* Decidua, Placenta
(287)
Pferd (Equus caballus) nein Placenta (185; 320) C. luteum (281)
Katze (Felis catus) nein Placenta (1; 180)
Meerschweinchen (Cavia porcellus)
nein Uterus (256)
Schwein (Sus scrofa) ja C. luteum (9) Uterus (186)
Hund (Canis familiaris) ja Placenta (181; 309) Ovar (309)
Ratte (Rattus norvegicus) ja C. luteum (105; 117) Uterus (105)
Maus (Mus musculus) ja C. luteum (8)
Kaninchen (Oryctolagus cuniculus) ja Placenta (93; 104) Uterus (94) Goldhamster (Mesocricetus auratus) ja Placenta (277)
2.1.3. Sekretion des Relaxins
Während der Gravidität in verschiedenen Spezies ist Relaxin ein frühes Sekretionsprodukt (Steinetz et al., 1996; Stewart et al., 1992a; Stewart, 1986). In der schwangeren Frau sowie in trächtigen Makaken fällt der Serumanstieg des Relaxins mit dem des Choriongonadotropins zusammen (Stewart et al., 1993; Stewart et al., 1990). Im Verlauf der Schwangerschaft werden Relaxin-Serumwerte von 1 ng/ml gemessen (Bell et al.,1987). Ein präpartaler Anstieg der Relaxin-Serumwerte, wie er beim Schwein (Sherwood et al., 1981) und bei der Ratte (Sherwood et al., 1983) nachweisbar ist, existiert weder bei der Frau noch bei den bisher untersuchten Affenspezies (Steinetz et al., 1995; Castracane et al., 1985; Nixon et al., 1983; Weiss et al., 1981; Quagliarello et al., 1980b). Das im Serum der Schwangeren nachweisbare Relaxin ist ein Sekretionsprodukt des Corpus luteum und ein geeigneter Indikator für dessen Aktivität (Lucas et al., 1989). Im Unterschied zur Ratte, der Maus und dem Schwein, bei denen Relaxin für die Zervix-Dilatation und den normalen Geburtsvorgang wichtig ist (Sherwood, 1994), können Frauen, die durch die Einnistung einer in-vitro befruchteten Eizelle schwanger werden, Progesteron-substitutiert werden und aufgrund des fehlenden Corpus
die häufigste Ursache für Mehrlingsschwangerschaften. Die erhöhte Zahl an Corpora lutea bedingt eine Hyperrelaxinämie (Haning et al., 1985; Weiss et al., 1993). Hyperrelaxinämie im ersten Trimenon ist ein geeigneter prognostischer Parameter zur Vorhersage einer möglichen Frühgeburt (Weiss et al., 1993). Therapiebedürftige diabetische Schwangere zeigen ebenfalls bis zu 3-fach erhöhte Relaxin-Serumspiegel im Vergleich zu gesunden Schwangeren (Tan et al., 1992; Steinetz et al., 1992a). In beiden Fällen sind die Ursachen hierfür unbekannt.
Wenig ist bekannt über die Faktoren, die auf die Sekretion von Relaxin Einfluß nehmen. Humanes Choriongonadotropin (hCG) stimuliert die Sekretion von Relaxin in Primaten. Die Applikation von hCG während der Lutealphase des normalen Menstruationszyklus bei der Frau, dem Rhesusaffen und dem Pavian bewirkt die Freisetzung von Relaxin aus dem Corpus luteum (Ottobre et al., 1991; Castracane et al., 1983; Quagliarello et al., 1980a; Thomas et al., 1980). Die hCG-Gabe in der späten Lutealphase ist hierbei besonders wirksam (Ottobre et al., 1984; Thomas et al., 1980). Injektionen von hCG im Rahmen einer in-vitro Fertilisation am Tag des Embryotransfers und drei Tage danach führen zu signifikant erhöhten Relaxin-Serumspiegeln am 22. Tag nach dem Embryotransfer (Johnson et al., 1991a). Humane luteinisierte Granulosazellen, die im Rahmen einer
in-vitro Fertilisation nach kontrollierter hCG-Hyperstimulation gewonnen wurden, exprimieren
Relaxin in-vitro nach weiterer 10-tägiger Stimulation mit hCG (Gagliardi et al., 1992). Nach operativer Entbindung gewonnene und kultivierte humane Lutealzellen sekretierten Relaxin ins Medium 2 Tage nach hCG-Gabe (Goldsmith et al., 1981).
Das strukturell dem hCG sehr ähnliche Luteinisierende Hormon (LH), das ebenfalls luteotrope Prolaktin sowie der Insulin-like Growth Factor I (IGF-I) fördern, alleine oder in Synergie mit LH, die Sekretion von Relaxin in kultivierten Lutealzellen des Schweines (Huang et al., 1992; 1991; Felder et al., 1988). Das luteolytisch wirkende Prostaglandin F2α induziert im trächtigen Schwein eine Erhöhung der Relaxinserumspiegel (Sherwood et al., 1979). Die Gabe des Cyclooxygenase-Inhibitors Indomethacin in der späten Trächtigkeitsphase beim Schwein verzögert die Luteolyse, den bei Schweinen typischen starken Relaxinanstieg kurz vor der Austreibungsphase sowie die Geburt für 2-5 Tage nach Absetzen von Indomethacin (Nara und First, 1981; Sherwood et al., 1979; Taverne et al., 1982). Bei der Frau scheinen Prostaglandine keine modulierende Funktion auf die Relaxinsekretion zu besitzen. Das Peptidhormon Oxytocin bewirkt ebenfalls keine Stimulation der Relaxinsekretion bei der Frau (Hochman et al., 1978).
Bei der Ratte besteht in der zweiten Hälfte der Trächtigkeit eine direkte Beziehung zwischen der Anzahl der Feten und der Konzentration von immunoreaktivem Relaxin sowie der Menge an Präprorelaxin mRNA im Ovar (Golos und Sherwood, 1982). Eine intakte Plazenta ist wesentlich für die luteale Relaxinsynthese (Crish et al., 1986) und plazentar synthetisiertes luteotropes 17β -Östradiol scheint hierfür verantwortlich zu sein (Lao Guico-Lamm und Sherwood, 1985).
2.1.4. Biologische Funktionen des Relaxins im Reproduktionstrakt
Die modulierende Wirkung des Relaxins auf das Bindegewebe der Symphyse (Samuel et al., 1996) und auf das kollagene Bindegewebe zahlreiche Strukturen des weiblichen Reproduktionstraktes (Sherwood, 1994), einschließlich des Ovars, beinhaltet die Aktivierung eines die extrazelluläre Matrix degradierenden enzymatischen Systems, die Matrix-Metalloproteinasen und Serin-Proteasen. Hierdurch nimmt Relaxin Einfluß auf den Prozeß der Ovulation. In kultivierten Granulosa-Zellen des Rattenovars stimuliert Relaxin die Sekretion der ovulationsfördernden Enzyme Collagenase Typ-I, Plasminogen-Aktivator und Proteoglykanase (Too et al., 1984). Rattengranulosa- und Theka-interna-Zellkulturen zeigen eine differentielle Induktion unterschiedlicher Gelatinasen nach Relaxingabe (Hwang et al., 1996). Humanes Relaxin (H2) induziert die Ovulationen in in-vitro perfundierten Ovarien Östrogen-vorbehandelter Ratten (Brännström und McLennan, 1993). Im Schwein vermittelt der Insulin-like Growth Factor-I (IGF-I) die proliferativen Effekte des Relaxins auf die Granulosa- und Theca-interna-Zellen des Follikels (Ohleth und Bagnell, 1995). Ob IGF-I im Rattenovar ebenfalls als parakriner Vermittler der Relaxinwirkung auf Zellen des Follikels wirkt ist nicht bekannt.
Bei den Nagern und dem Schwein wirkt Relaxin wachstumsfördernd auf den Uterus (Hall et al., 1992; 1990; Galvin et al., 1991; Bylander et al., 1987), den uterinen Zervix (Winn et al., 1994; Hwang et al., 1989; O´Day et al., 1989; Vasilenko und Mead, 1987) und die Vagina (Min et al., 1997; Burger und Sherwood, 1995). Im Schweineuterus induziert Relaxin die Sekretion von IGF-I und IGF-II sowie der IGF-Bindungsproteine IGFBP-2 und IGFBP-3 (Ohleth et al., 1997). Diese Mitglieder des IGF-Systems vermitteln im Uterus den proliferativen Effekt des Relaxins. Neben seiner proteolytischen Funktion im Rahmen der extrazellulären Matrix-Degradation (Littlefield, 1991)
(EGF)-artige Domäne, mit der diese Serinprotease an den EGF-Rezeptor bindet (Appella et al., 1987) und mitogen wirken kann (Kirchheimer et al., 1987). Dies ist der erste Hinweis auf Relaxin-induzierte Proliferationsprozesse, die, mit oder ohne Einschluß des IGF-Systems, über den EGF-Rezeptor vermittelt werden.
Seit über 35 Jahren ist die Bestimmung zweier für eine erfolgreiche Gravidität wichtige Funktionen des Relaxins Grundlage von in-vivo-Bioassays: die Erweiterung des Symphysenspaltes sowie die Relaxation der glatten Muskulatur des Uterus, (Steinetz et al., 1960; Wiqvist und Paul, 1958). Eine präpartal erhöhte Elastizität und Dehnbarkeit des zervikalen Uterussegmentes ist eine wesentliche Voraussetzung für eine unkomplizierte Geburt bei Nagern (Lao Guico-Lamm und Sherwood, 1988; Downing und Sherwood, 1985; Kroc et al., 1959) und beim Schwein (Nara et al., 1982). In der Ratte geht die Relaxin-vermittelte Erweichung der zervikalen Uterusmuskulatur einher mit einer erhöhten Sekretion von Kollagenase und Proteoglykanase (Too et al., 1986). Die Relaxin-vermittelten Zervix-veränderungen beim Schwein resultieren ebenfalls in einer Reduktion der zervikalen Kollagenmenge (Hall und Anthony, 1993; O´Day et al., 1991). Im humanen Zervix führt die Relaxingabe zur Reduktion der Kollagensynthese (Wiqvist et al., 1984). Eine verminderte Kollegensynthese in Kombination mit der Induktion aktiver Kollagen-abbauender Enzyme ist auch in Relaxin-stimulierten in-vitro kultivierten humanen dermalen Fibroblasten nachweisbar (Unemori et al., 1996; 1992).
Relaxin wirkt direkt über spezifische Rezeptoren auf die glatte Uterusmuskulatur (Osheroff et al., 1990; Mercado-Simmen et al., 1982b; Weiss und Bryant Greenwood, 1982) und reduziert die Frequenz sowie in geringerem Maße auch die Amplitude spontaner und provozierter Kontraktionen im Myometrium verschiedener Spezies (Downing und Hollingworth, 1993; Porter und Watts, 1986; Porter et al., 1979; Porter, 1971). Demgegenüber haben H1- und H2-Relaxin in-vitro kaum eine Wirkung auf das humane Myometrium (MacLennan et al., 1995; Petersen et al., 1991). Östrogen induziert den myometrialen Relaxinrezeptor (Mercado-Simmen et al., 1982a+b) und seine Expression wird bei langer Relaxinexposition in-vivo (Downing und Hollingsworth, 1992; Cheah und Sherwood, 1981) und in-vitro (Chamley und Parkington, 1984; Wiqvist, 1959) im Sinne einer Tachyphylaxie herunterreguliert.
Isolierte humane Fibroblasten aus dem unteren uterinen Segment besitzen eine einzige Klasse hochaffiner, membranständiger Bindungsstellen von ca. 220 kD, an die H2-Relaxin mit einer Dissoziationskonstanten von ca. 4 x 10-9 M bindet. Dieser bislang nicht klonierte Relaxinrezeptor hat
Kinaseaktivität (Palejwala et al., 1998). Die Signaltransduktionswege der Relaxinwirkung auf die Uterusmuskulatur sind unklar (Hughes und Hollingsworth, 1996; 1995). In der Ratte wirkt Relaxin über einen cAMP-unabhängigen Mechanismus auf die longitudinal verlaufende Myometriumfasern (Hughes et al., 1997). Eine Adenylatzyklase-abhängige Relaxin-vermittelte Signalkaskade in den zirkulären Myometriumfasern wird vermutet (Hughes et al., 1997). Weitere Mechanismen, über die Relaxin Einfluß auf den Kontraktionszustand des Myometriums zu nehmen scheint, sind die inhibitorische Beeinflußung des Aktionspotentials (Osa et al., 1991; Chamley und Parkington, 1984) sowie eine Erniedrigung des intrazellulären Ca2+-Spiegels (Anwer et al., 1989) mit einer möglichen Reduktion der Aktivität der Myosin-Leichtketten-Kinase (MLCK).
Als potentielle Erfolgsorgane für mögliche para- und autokrine Wirkungen sind das Endometrium (Knox et al., 1994; Fields et al., 1992; Yki-Jarvinen et al., 1985) und die Decidua (Sakbun et al., 1990; Castracane et al., 1985) sowohl lokale Produzenten als auch Zielgewebe für Relaxin. Beide Gewebe besitzen Rezeptoren für Relaxin (Qin et al., 1997a; Garibay-Tupas et al., 1995; Weiss und Bryant-Greenwood, 1982). In Synergie mit Progesteron induziert Relaxin in kultivierten humanen endometrialen Stromazellen die Expression von IGFBP-1 (Gao et al., 1994; Tseng et al., 1992), Prolaktin (Huang et al., 1987) sowie Aromatase (Tseng et al., 1987) und bewirkt eine intrazelluläre Translokation der Proteinkinase C vom Cytosol zur Plasmamembran in endometrialen Zellen während der Sekretionsphase (Kalbag et al., 1991). In kultivierten humanen Decidualzellen erhöht Relaxin ebenfalls die Expression von IGFBP-1 (Thrailkill et al., 1990), Prolaktin (Handwerger et al., 1991) und auch Prorenin (Poisner et al., 1990).
2.2. Relaxin-like Factor (RLF)
2.2.1. Molekulare Struktur und genomische Organisation
Der Relaxin-like Factor (RLF), auch als Leydig cell-insulin-like factor (Ley-I-L) oder Insulin-like factor 3 (Insl3) bezeichnet (Adham et al., 1993), ist ein junges Mitglied der Insulin-IGF-Relaxin-Familie. Es wird jedoch nicht, wie früher angenommen, ausschließlich in Leydigzellen exprimiert (Ivell, 1997a+b). In dieser Arbeit wird die Bezeichnung RLF verwendet, da dieses Molekül strukturell sowie im Rezeptorbindungsverhalten dem Relaxin näher steht als dem Insulin. Wie das
Zimmermann et al., 1997; Burkhardt et al., 1994a). Das humane RLF-Gen liegt auf dem kurzen Arm von Chromosom 19, 13.2-p12 (Burkhardt et al., 1994b).
Die RLF-Transkripte verschiedener Spezies (Mensch: Burghardt et al., 1994a; Schwein: Adham et al., 1993; Maus: Pusch et al., 1996; Rind: Bathgate et al., 1996; Schaf: Roche et al., 1996; Marmoset: Zarreh-Hoshyari-Khah et al., 1999) kodieren für ein ca. 14,5 kD großes Polypeptid mit einem für alle Mitgieder der Relaxin-Familie einheitlichen molekularen Aufbau. Derzeit erfolgt die Untergliederung des RLF-Moleküls in ein Signalpeptid und die B-, C- und A-Domäne (vom N´-zum C´-Terminus) aufgrund analoger Daten zur enzymatischen Prozessierung des Relaxins sowie der Lage der Cysteine und potentiellen Endopeptidase-Spaltstellen (Renegar et al., 1996) im RLF-Molekül. Geeignete Antikörper zur Detektion von RLF stehen erst seit kurzem zur Verfügung (Zarreh-Hoshyari-Khah et al., 1999; Ivell et al., 1997b) und erlauben derzeit keine Aussagen darüber, ob RLF als A-B-Heterodimer oder als N´B-C-A-C´-Prohormon sekretiert wird. Chemisch synthetisierte A-B-Heterodimere des RLF binden sowohl an den Relaxinrezeptor als auch an einen weiteren, noch nicht charakterisierten RLF-Rezeptor (Büllesbach und Schwabe, 1995). Analog der Rezeptorbindungssequenz beim Relaxin besitzt RLF in der B-Domäne das stark konservierte Peptidmotiv -x-R-x-x-x-R-x- (R=Arginin), welches im Unterschied zu Relaxin vier Aminosäuren weiter C´-terminal lokalisiert ist (Büllesbach et al., 1992).
2.2.2. Expression von RLF
Bei der Suche nach gewebespezifischen, differentiell exprimierten cDNA-Molekülen wurde das RLF im Hoden des Schweines (Adham et al., 1993) und der Maus (Pusch et al., 1996) kloniert. In allen bislang untersuchten Spezies ist RLF ein spezifisches und häufiges Transkriptionsprodukt interstitieller testikulärer Leydigzellen. Eine ca. 0.7 kb lange Gen-sequenz im 5´-untranslatierten Bereich oberhalb der transkriptionellen Startposition ermöglicht eine spezifische Expression des RLF-Genes in Leydigzellen (Koskimies et al., 1997).
Die Aktivität des RLF-Genes ist abhängig vom Entwicklungsgrad der Leydigzellen. Präpuberale Leydigzellen zeigen nur eine schwache Expression des RLF-Genes, die erst während der Pubertät stark ansteigt (Balvers et al., 1998; Zimmermann et al., 1997). Humanes Choriongonadotropin (hCG), das fördernd auf die Sekretion von Relaxin wirkt, hat keinen Einfluß auf die RLF-Expression in der murinen Leydigzellinie MA10 sowie in primären Leydigzellen der Maus (Pusch et al., 1996). Bei der adulten hypogonadalen Maus (hpg), bei der die Gonaden aufgrund einer Deletion im Gen für
Gonadotropin Releasing Hormone (GnRH) in einem präpuberalen Zustand verharren, bewirkt eine mehrtägiger hCG-Behandlung eine langsame Differenzierung des testikulären Leydigzellen mit Induktion der RLF-Expression (Balvers et al., 1998).
RLF-Transkripte sind in Geweben des weiblichen Reproduktionstraktes mittels RT-PCR und Northern Analysen nachgewiesen worden (Zarreh-Hoshyari-Khah et al., 1999; Bathgate et al., 1996; Tashima et al., 1995). Northern Analysen verschiedener Rindergewebe ergaben außerdem schwache Hybridisierungssignale im Herzen, in der Lunge und im Hypothalamus (Bathgate et al., 1996).
2.2.3. Biologische Funktionen des RLF
Über mögliche Funktionen des RLF ist bislang sehr wenig bekannt. Geeignete Bioassays für RLF existieren derzeit nicht. RLF kann sowohl an den Relaxinrezeptor als auch an einen ebenfalls nicht charakterisierten RLF-Rezeptor binden (Büllesbach und Schwabe, 1995). Relaxinrezeptoren im Uterus, dem Gehirn (Osheroff et al., 1991; 1990) und dem Herzen der Ratte (Osheroff et al., 1992) sowie spezifische RLF-Rezeptoren im Uterus und dem Gehirn der Maus (Büllesbach und Schwabe, 1995) lassen komplexe, überlappende Funktion für beide Peptidhormone in unterschiedlichen Organsystemen vermuten. Bei homozygoten RLF-knock-out-Mäusen mit einer gezielten Inaktivierung des RLF-Genes sind nur die männlichen Tiere phänotypisch auffällig und zeigen einen bilateralen Kryptorchismus (Zimmermann et al., 1999). Ursache hierfür ist die ausbleibende Entwicklung eines funktionstüchtigen Gubernakulums während der Embryogenese, wodurch der Hodendeszensus verhindert wird und die Testes im Bauchraum verbleiben (Zimmermann et al., 1999). Über weitere autokrine/parakrine und systemische Funktionen des RLF ist derzeit nichts bekannt.
3. Material und Methoden
3.1. Allgemeiner Teil3.1.1. Gewebe
Gewebe wurde in flüssigem Stickstoff gefroren und bei -80oC gelagert. Paraffin-eingebettetes Gewebe wurde zuvor in Bouin-Lösung (30% Pikrinsäure, 10% Formalin, 5% Essigsäure) für 16 Stunden fixiert und bis zur Paraffinierung in 70% Alkohol bei 4oC aufbewahrt. Kein Tier wurde speziell für diese Studien getötet. Die Einfuhr der dem Artenschutz unterliegenden Lemurengewebe erfolgte entsprechend der gesetzlichen Bestimmungen (CITES Nummern: E-1874/96 und
E1506/97).
3.1.2. Molekularbiologische Methoden 3.1.2.1. RNA-Isolierung
Kryokonserviertes Gewebe diente als Ausgangsmaterial für die Gewinnung von Gesamt-RNA mit dem Trizol Reagents (Life Technologies, Eggenstein, Deutschland; Chomczynski und Sacchi, 1987). Aus der Gesamt-RNA wurde mRNA mit Hilfe von oligo-d(T)-beschichteten Magnetpartikeln isoliert (Dynal, Hamburg, Deutschland).
3.1.2.2. Northern Analyse
Gesamt-RNA (20 µg) wurde in einem 1% Formaldehyd-Agarosegel mit 0,001% Ethidiumbromid aufgetrennt. Gleiche RNA-Ladungsmengen wurden durch Vergleich der ribosomalen 18S- und 28S-RNA-Banden unter UV-Kontrolle verifiziert. Die RNA-Leiter (0.44 - 1.77 kb; Life Technologies) diente als RNA-Marker. Nach Transfer der RNA auf eine Nylonmembran (Hybond N+; Amersham, Braunschweig, Deutschland) für 1,5 Stunden (Chomszynski, 1992) wurde die Membran für 1 min UV-bestrahlt und 30 min bei 80oC inkubiert. Nach Prähybridisierung für 30 min bei 62oC mit der Easy-Hyb-Hybridisierungs-lösung (Böhringer Mannheim, Mannheim, Deutschland) wurde die Membran über Nacht bei 62oC in Hybridisierungslösung plus 200 ng/ml Digoxigenin-markierter cRNA inkubiert. Nach dem Waschen für 2x 20 min in 2x SSC/ 0.1% SDS bei Raumtemperatur und 2x 20 min in 0.5x SSC/ 0.1% SDS bei 60oC erfolgte der Nachweis spezifischer Hybridisierungssignale mit dem DIG-Lumineszenz Detektionskit (Böhringer Mannheim) nach Exposition eines Röntgenfilmes (NEN Life Science Products, Boston, MA).
3.1.2.3. RT-, RACE- und Capfinder-PCR Methoden zur cDNA Klonierung
Die Klonierung der Relaxin- und Relaxin-like Faktor (RLF)-cDNA erfolgte mit der Reverse-Transcriptase-PCR (RT-PCR) nach cDNA-Erststrangsynthese mit einem oligo-d(T)18-25-Primer und dem Superscript II-Kit nach Angaben des Herstellers (Life Technologies, Eggenstein, Deutschland). Die fehlenden 5´- und 3´-kodierenden cDNA-Sequenzen wurden mit Kits für die RACE-PCR (Rapid-Amplification-of-cDNA-Ends-PCR; Life Technologies) und spezifischen Oligonukleotidprimern (siehe 3.2 Spezieller Teil) bei 64oC amplifiziert. Die vollständige cDNA Kodierungssequenzen für die Relaxine der beiden Halbaffen Galago crassicaudatus und Varecia
variegata sowie des Relaxin-like Faktors (RLF) von G. crassicaudatus erfolgten mit der
Capfinder-PCR nach den Angaben des Herstellers (Clontech, Heidelberg, Deutschland). Die PCR-Amplifikate wurden nach der Agarosegel-Elektrophorese aufgereinigt und in den pGEM-T-Vektor (Promega) ligiert. Nach Transformation in den E. coli-Stamm XL-Blue (Statagene, Heidelberg, Deutschland) und Selektion auf Luria-Broth (LB)-Ampicillin-Agarplatten (100µg/ml Ampicillin) erfolgte die Plasmidisolierung aus Einzelkolonien mit dem GFX-Micro Plasmid Prep Kit (Pharmacia, Freiburg, Deutschland). Die Größen der cDNA-Inserts wurden durch Doppelverdau mit den Restriktionsenzymen NcoI und NotI oder NcoI und PstI im Agarosegel ermittelt. Die Sequenzanalyse erfolgte mit dem PRISM-Dye-Deoxy Terminator Sequenz-Kit (Perkin Elmer, Foster City, USA). Beide DNA-Stränge von mindestens drei unterschiedlichen cDNA-Inserts wurden mit dem T7- und SP6-Primer sequenziert (Sanger et al., 1977).
3.1.2.4. Vergleichende Sequenzanalyse
Die vergleichende Sequenzanalyse erfolgten mit dem BLAST-Programm (Altschul et al., 1990). Die Erstellung der phylogenetischen Dendogramme für die Relaxin- und RLF-Sequenzen erfolgte mit den Computerprogrammen Puzzle 4.0.2 (Strimmer und von Haeseler, 1996; Strimmer et al., 1997) und Treeview (Page, 1996).
3.1.2.5. Herstellung Digoxigenin-markierter cRNA Sonden
Für die cRNA-Synthese wurden 5 µg eines pGEM-T Vektors mit dem klonierten Relaxin- bzw. RLF-cDNA-Fragment durch Einzelverdau mit geeigneten Restriktionsenzymen linearisiert und
sense und antisense cRNA (Jackson, 1991) erfolgte mit 1µg des präzipitierten Plasmids als Template, dem 10x konzentrierten DIG-RNA labelling Mix (Böhringer Mannheim) und einem cRNA-Synthese-Kit (AMS Biotechnology, Wiesbaden, Deutschland; Klonisch et al., 1995).
3.1.2.6. Nichtradioaktive in-situ Hybridisierung
Kryoschnitte (6 µm) oder Paraffinschnitte (5 µm) wurden auf Objektträgern fixiert, die zuvor mit einer 2% Lösung aus 3-Aminopropyl-Triethoxysilane (APTEX, Sigma, Deisenhofen, Deutschland) beschichtet waren. Die deparaffinierten Gewebeschnitte wurden in 0,2 M HCl für 20 min bei Raumtemperatur und in 2x SSC bei 70oC für 10 min inkubiert. Hodengewebe wurde mit 20 µg/ml, Plazentagewebe sowie ovarielles Gewebe mit 30-45 µg/ml Proteinase K (Sigma) in PBS für 30 min bei 37oC verdaut. Überschüssige Enzymaktivität wurde durch Zugabe von 2 mg/ml Glycin in PBS für 1 min blockiert. Nach Postfixation in 4% Paraformaldehyd in 0,2 M PBS (Sigma) plus 5mM MgCl2 (PBSM) für 5 min bei Raumtemperatur erfolgte eine Inkubation mit 20% Essigsäure bei 4oC zur Inaktivierung endogener alkalischer Phospahatase-Aktivität. Nach Inkubation für 30 min bei Raum-temperatur mit 20% Glycerol in DEPC-Wasser wurden die entsprechende sense und antisense cRNA (ca. 300 ng/ml) in getrennten Ansätzen mit je 500 µg/ml Lachs-Sperma-DNA und Hefe-tRNA in DEPC-Wasser gemischt, 10 min bei 70oC denaturiert und zur Hybridsierungslösung pipettiert. Die Hybridsierungslösung bestand aus 50% Formamide, 10% Dextransulfat, 2x SSC, 1x BFP (je 0.02% bovines Serumalbumin, Ficoll 4000 und Polyvinylpyrrolidon; alle Sigma). Die Gewebeschnitte wurden mit der Hybridsierungslösungen über Nacht bei 42oC in einer gesättigten Atmosphäre aus 50% Formamid in 4x SSC inkubiert. Die weitere Prozessierung der Gewebeschnitte sowie der colorimetrische Nachweis spezifischer Hybridisierungssignale erfolgte nach der Methode von Lewis und Wells (1991). Die Kryoschnitte wurden mit einem Kryostat (Reichert-Jung Cryocut E, Bensheim, Deutschland) auf APTEX-beschichtete Objektträger appliziert, in einer Lösung aus 4% Paraformaldehyd in PBSM für 15 min fixiert, 5 min in PBSM gewaschen und bis zum Gebrauch in 70% Äthanol bei 4oC gelagert. In PBSM rehydrierte Kryoschnitte wurden für 10 min in 0.25% NP-40/ 0.25% Triton-X100 (beides Sigma) in DEPC-Wasser permeabilisiert. Die weiteren Schritte waren identisch zur Behandlung der Paraffinschnitte.
3.1.2.7. Isolierung genomischer DNA und Southern Analyse
Nach der Isolierung genomischer DNA mit einem Genomic Tip 100-Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) aus kroykonserviertem Lebergewebe von Ziege und Damwild sowie Muskelgewebe von G. crassicaudatus wurden 10 µg dieser genomischen DNA mit den Restriktionsenzymen
EcoRI oder HindIII (New England Biolabs, Schwalbach/Taunus, Deutschland) verdaut. Die
DNA-Fragmente wurden in einem 0,8% Agarosegel aufgetrennt, für 1,5 Stunden auf eine Hybond N+ Nylonmembran (Amersham) geblottet (Chomszynski, 1992) und für 1 min UV-fixiert. Die Membran wurde für eine Stunde mit Easy-Hyb-Hybridisierungslösung (Böhringer Mannheim) bei 68°C prähybridisiert und über Nacht bei 68°C in der gleichen Lösung plus 32P-markierter cDNA-Sonde inkubiert. Die Markierung der cDNA-Sonde mit 32P-dCTP (3000 Ci/mmol; Amersham) erfolgte durch Nick-Translation (Sambrook et al., 1989). Nach dem Waschen für 2x 30 min in 2x SSPE/ 0,1% SDS (2x SSPE: 0,34 M NaCl, 20 mM NaPO4, 2 mM EDTA, pH 7,7) bei 68°C wurden spezifische Hybridisierungssignale nach Exposition eines Röntgenfilms für 5 Tage bei -80oC detektiert.
3.1.3. Proteinnachweis
3.1.3.1. Fixierung und Schnittechnik
Der immunhistochemische Nachweis erfolgte an 7 µm Kryoschnitten (Plazenten verschiedener Graviditätsformen bei den Equiden; G. crassicaudatus Plazenta), an Formalin-fixiertem Gewebe (10 µm Schnitten equiner Follikel und Corpora lutea; 5µm Schnitte für die humanen ovariellen Sertoli-Leydigzelltumoren und humanen Plazenten) sowie an Bouin-fixiertem Gewebe (5µm Schnitten von Plazenten des Hundes, der Katze, Plazenta und Ovar des Dromedars, Hoden des Lemuren
3.1.3.2. Immunhistochemie
Für die immunhistochemischen Untersuchungen in den verschiedenen Spezies wurden die in Tab. 2 gelisteten primären Antikörper eingesetzt.
Tabelle 2. Eingesetzte Primärantikörper
Antigen Spezies Bezeichnung Hersteller
Cytokeratin, pan monoklonal, Maus MNF-116 Dako, Hamburg
Cytokeratin 18 monoklonal, Maus DC10 Dako, Hamburg
equiner Trophoblast monoklonal, Maus F102.1 Oriol et al., 1990 3β
-Hydroxysteroid-Dehydrogenase
polyklonal, Kaninchen 3β-HSD Dr. T Sweeney
17α-Hydroxylase polyklonal, Kaninchen 17α-H Dr. T Sweeney
Ki-67 monoklonal, Maus MIB-1 Dianova, Hamburg
MHC Klasse I monoklonal; Ratte JK 56 Kydd et al., 1991
HLA-G, schwere Kette 87G Dr. D.G. Geraghty
HLA-A/-G, schwere Kette monoklonal, Maus HLA-A1 Dr. J.J. Nesjens Relaxin, Pferd polyklonal, Kaninchen Nr. 3150 Stewart, 1986 Relaxin, Hund polyklonal, Kaninchen Nr. 78513 Steinetz et al., 1996 Relaxin, Schwein polyklonal, Kaninchen R6 O´Byrne et al., 1978
RLF polyklonal, Ratte RA15 Ivell et al., 1997b
PSP-60 polyklonal, Kaninchen PSP-60 Camous et al., 1991
ovine Placental Lactogen polyklonal, Kaninchen oPL Chan et al., 1976
Vimentin monoklonal, Maus V9 Dako, Hamburg
von-Willebrand Faktor polyklonal, Kaninchen P-0226 Dako, Hamburg
Der Nachweis immunoreaktiven Relaxins im Ovar und der Plazenta des Pferdes erfolgte mit einem Peroxidase-konjugierten Schwein anti-Kaninchen IgG Sekundärantikörper (1:50, Dako; Klonisch et al., 1995). In der Plazenten von G. crassicaudatus, Dromedar, Katze und Hund sowie im Ovar des Dromedars (Klonisch et al., 1999a+b) gelang der Nachweis immunoreaktiven Relaxins mit der alkalische Phosphatase-anti alkalische Phospatase-Technik (APAAP; Klonisch et al., 1999a).Für die immunhistochemische Identifizierung equiner Trophoblasten mit dem monoklonalen
Mausantikörper F102.1 (Oriol et al., 1990) mit der APAAP-Methode wurde ein Peroxidase-konjugierter Schaf anti-Maus Sekundärantikörper (1:400, Amersham; Klonisch et al., 1995) oder ein Kaninchen anti-Maus Sekundärantikörper (1:20, Dako) eingesetzt. Die Immunodetektion von Cytokeratin, Vimentin und von Willebrand-Faktor erfolgten wie beschrieben (Klonisch et al., 1999 a+b). Der Nachweis von Major Histocompatibility Complex (MHC) Klasse I-Molekülen auf equinen Trophoblasten mit einem monoklonalen Rattenantikörper JK56 erfolgte wie bei Kydd et al. (1991). Der Nachweis der Bindung der monoklonalen Mausantikörper 87G und HLA-A2 gegen HLA-G in der Plazenta des Damwildes und des Menschen erfolgte mit der APAAP-Methode unter Verwendung eines Kaninchen anti-Maus Sekundärantikörpers (1:25; Dako; Klonisch et al., 1999a). Der Nachweis immunoreaktiven Relaxin-like Faktors (RLF) im humanen Hoden und den ovariellen Sertoli-Leydigzelltumoren erfolgte nach der Methode von Ivell et al. (1997b).
3.1.4. High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
Relaxin wurde nach der Methode von Walsh und Niall (1980) aus der follikulären Flüssigkeit von 2 bis > 5 cm großen Follikeln über Octadecylsilica-Säulen (Sep-Pak, Waters Assoc., Missisauga, Ontario, Canada) gereinigt. An die Säulen gebundenes equines Relaxin wurde mit ansteigenden Konzentrationen (23%, 40% und 80%) von Acetonitril in 0,1% (v/v) Trifluoressigsäure (TFA) eluiert, das TFA evaporiert und die Proben in dest. Wasser aufgenommen. Nach Dialyse (3 kDA cut-off) gegen dest. Wasser wurden die Proben lyophilisiert und in 250µl 0,1 % TFA rehydriert. Die HPLC erfolgte nach Stewart et al. (1991) bei 280 nm mit einem Waters Model 441 UV-Detektor und anschließender Datenanalyse mit dem Waters Maxima/Baseline 810 Chromatograpie Programm. Je zwei HPLC-Analysen wurden pro untersuchter Follikelflüssigkeit durchgeführt.
3.1.5. Radioimmunoassay (RIA)
Der Relaxinnachweis in den Follikelflüssigkeiten und den HPLC-Eluaten erfolgte mit einem homologen equinen RIA (Stewart, 1986). Serum einer trächtigen Stute sowie Serum eines Wallachs dienten als Positiv- bzw. Negativkontrolle. Gereinigtes equines Relaxin wurde mit der Chloramin-T-Methode mit 125I-markiertem NaI (Amersham, Oakville, Ontario, Canada) iodiert. Der Nachweis des equinen Relaxins erfolgte mit dem polyklonalen Kaninchenserum gegen equines Relaxin Nr.
3.2. Spezieller Teil 3.2.1. Relaxin 3.2.1.1. Equiden
3.2.1.1.1. Klonierung des Prorelaxins des Pferdes (Equus caballus)
Das equine Prorelaxin-cDNA-Fragment wurde aus RNA von plazentarem Gewebe am Tag 300 der Gravidität mit RT-PCR und degenerierten Oligonukleotidprimern kloniert: forward:
5´
attaarscwtgcggccgaga3 und reverse: 5´gtrcaaccccartarcarcattt3 (k = G or T, r = G oder A; s = G oder C; w = A oder T; y = C oder T). Die Sequenz beider Primer wurde nach Homologievergleich mit den Relaxin cDNA-Sequenzen von Schwein, Ratte und Mensch ausgewählt. Digoxigenin-markierte sense und antisense cRNA des klonierten equinen Prorelaxins diente als Sonde bei den Northern- und Southern-Analysen und den in-situ Hybridisierungen (Klonisch et al., 1995).
3.2.1.1.2. Ovar
Ovarien zyklischer Stuten wurden von April bis September gesammelt. Follikel wurden entsprechend ihres Durchmessers unterteilt in sehr klein (≤ 2 cm), klein (> 2 - ≤ 3 cm), mittel (> 3 - ≤ 4 cm) und groß (> 4 cm). Atretische Follikel oder solche mit Blut-tingierter oder trüber Follikelflüssigkeit wurden nicht verwendet (Moore et al., 1978). Nach makroskopischer und histologischer Begutachtung (Levine et al., 1979) wurden das Corpus haemorragicum, frühe (Tage 1-2 post ovulationem [p.o.]), reifende (Tage 3-7 p.o.), reife (Tage 9-11 p.o.) und alternde (15-17 p.o.) Corpora lutea sowie das Corpus albicans unterschieden. Mit Ausnahme des C. haemorragicum (n=2) wurden n=3-6 Ovarien verschiedener Stuten untersucht. Aus allen Follikeln, einem C. haemorragicum sowie den verschiedenen C. lutea wurde Gesamt- und mRNA isoliert. Zur Bestimmung des Relaxingehaltes mit RIA und HPLC wurde die Follikelflüssigkeit aus Follikeln verschiedener Größen und eines C. haemorragicum aspiriert. Der immunhistochemische Nachweis equinen Relaxins erfolgte mit dem polyklonalen Kaninchenantiserum gegen equines Relaxin ( Nr. 3150, 1:500; Stewart, 1986) an Formalin-fixierten Gewebeschnitten (Ryan et al., 1997).
3.2.1.1.3. Präimplantationsembryonen und uteroplazentares Gewebe
In zwei equinen Präimplantationsembryonen am Tag 30 der Trächtigkeit erfolgte der RT-PCR-Nachweis von Prorelaxin aus Gesamt-RNA. Die Choriongürtelzellen wurden zuvor vom übrigen Embryo abpräpariert und beide embryonalen Anteile getrennt voneinander in der RT-PCR
untersucht. Die Northern Analyse erfolgte mit Gesamt-RNA vom Plazentagewebe am Tag 120 und 300 sowie Cerebellumgewebe einer adulten Stute als Kontrolle. An Chorion-gürtelzellen zweier Pferdeembryonen am Tag 33 der Gravidität sowie an endometrialen Cupzellen und Allantochoriongewebe von Equiden der in Tab. 3 gelisteten Graviditätstypen erfolgte die zelluläre Lokalisation von Relaxin mRNA sowie der Nachweis von immunoreaktivem equinem Relaxin ( Nr. 3150, 1:500; Stewart, 1986) und von MHC Klasse I Molekülen (JK56, 1:200; Kydd et al., 1991). Trophoblasten wurden mit dem equinen Trophoblastmarker F102.1 (1:50; Oriol et al., 1990) identifiziert (Klonisch et al., 1997). Die drei Graviditätstypen wurden gewählt, um a.) mögliche Effekte des Genotypes auf die Relaxin-Expression nachzuweisen und b.) zu untersuchen, ob die starken zellulären immunologischen Abwehrreaktionen im Uterus der Stute gegen den Eselembryo während der extraspezifischen Gravidität Einfluß auf die Relaxin-Expression nehmen.
Tabelle 3. Untersuchte Gewebe intra-, inter- und extraspezifischer equider Graviditätstypen.
Gewebe Graviditätstyp Graviditätstag
Präimplantationsembryo Pferd x Pferd
(intraspezifisch)
30
Choriongürtel Pferd x Pferd 33
Endometriale Cupzellen Pferd x Pferd 41, 45, 56, 70
Pferd x Pferd 46, 60, 120, 153, 300
Allantochorion Pferd x Esel
(interspezifisch)
45, 47, 52, 58
Eselembryo→Pferd (extraspezifisch)
59, 67, 75
3.2.1.2. Dromedar (Camelus dromedarius) 3.2.1.2.1. Klonierung des Präprorelaxins
Die Klonierung von Präprorelaxin des Dromedars erfolgte aus kryokonserviertem Gewebe einer Plazenta am Tag 300 der Trächtigkeit. Die in Tab. 4 gelisteten Oligonukleotidprimer wurden für die Klonierung der Präprorelaxin-cDNA des Dromedars eingesetzt.
Tabelle 4. Liste der in der RT-PCR sowie 5´- und 3´-RACE-PCR verwendeten Primer (GSP = Gen-spezifische Primer; k = G or T, r = G oder A; s = G oder C; w = A oder T; y = C oder T). Die Numerierung ist identisch zu den Primern-Nummern in Abb. 10.
PCR Methode Primer Primer Nr. Primersequenz Primer-Bindungsstelle (bp)* RT-PCR forward 1 5´attaarscwtgcggccgaga3´ 94-113 reverse 2 5´tytgrtacaacckayktkrcaaca3´ 553-576 RT-PCR für forward 3 5´atgccgcgcctgctcttgtcc3´ 1-21 komplette cDNA reverse 4 5´tcagcatgtgtagccatttcttttc3´ 575-600
3´-RACE- GSP-I 5 5´gccacactgtctgagaggcag3´ 349-369
PCR GSP-II 6 5´caaaatgaggaagaagacgagag3´ 452-473
GSP-III 7 5´agacgagagtctttcagaattaa3´ 465-487
GSP-III 8 5´cagagcgggttttggagcc3 189-207
5´-RACE- GSP-II 9 5´gggtctcagagcgggttttgga3´ 192-213
PCR GSP-I 10 5´atggcatgatttctgctggcggg3´ 252-274 5´ and 3´-RACE-PCR Universal-primer 11 5´ggccacgcgtcgactagtac3´
*Die Angaben zu den Primer-Bindungsstellen beziehen sich auf die kodierende cDNA-Sequenz des Präprorelaxins des Dromedars.
3.2.1.2.2. Ovar und uteroplazentares Gewebe
Die zelluläre Lokalisation von Relaxin-Transkripten sowie der immunhistochemische Nachweis von Relaxin (R6, 1:40.000) und Cytokeratin (MNF-116, 1:250) erfolgte an Bouin-fixiertem, Paraffin-eingebettetem ovariellem und uteroplazentarem Gewebe (n=1) während der Trächtig-keitstage 93, 102 (nur Ovar), 170, 196, 213, 240, 340 und 372 (je n=1).
3.2.1.3. Katze (Felis catus)
3.2.1.3.1. Klonierung des Präprorelaxins
Die Klonierung der cDNA für das Präprorelaxin der Katze erfolgte aus mRNA von Plazentagewebe am Tag 35 der Gravidität. Für die Klonierung der cDNA für das Präprorelaxin der Katze wurden die in Tab. 5 genannten Oligonukleotidprimer verwendet.
Tabelle 5. Liste der eingesetzten Oligonukleotidprimer (GSP = Gen-spezifische Primer; k = G or T, r = G oder A; s = G oder C; w = A oder T; y = C oder T). Die Numerierung ist identisch zu den Primern-Nummern in Abb. 17.
PCR Methode Primer Primer Nr. Primersequenz Primer-Bindungsstelle (bp)* RT-PCR forward 1 5´attaarscwtgcggccgaga3´ 89-107 reverse 2 5´tytgrtacaacckayktkrcaaca3´ 496-519 RT-PCR für forward 3 5´atgctgcgcctgttcttatccca3´ 1-23 komplette cDNA reverse 4 5´tcagcataaatcagcaagctctttc3´ 519-543
3´-RACE- GSP-I 5 5´atctgcggctcattgtcctggg3´ 130-151
PCR GSP-II 6 5´ggaaaaagcagtcaacaacacc3´ 151-172
5´-RACE- GSP-II 7 5´ctttggtcttcagcttcattttgtc3´ 392-416
PCR GSP-I 8 5´agaatgtgcatctaaccttgatcttc3´ 431-456 5´- und 3´-RACE-PCR Universal-primer 9 5´ggccacgcgtcgactagtac3´
*Die Angaben zu den Primer-Bindungsstellen beziehen sich auf die kodierende cDNA-Sequenz des Präprorelaxins der Katze.
3.2.1.3.2. Uteroplazentares Gewebe
Die Northern Analysen wurden mit Gesamt-RNA aus der Plazenta und Lebergewebe eines weiblichen Tieres als Negativkontrolle durchgeführt. Die plazentare Lokalisation der Relaxin-mRNA sowie der immunhistochemische Nachweis von Relaxin (R6, 1:4000) und Cytokeratin (MNF-116, 1:1000) erfolgten an Kryoschnitten zweier Plazenten am Tag 35 der Gravidität.
3.2.1.4. Hund (Canis domesticus)
3.2.1.4.1. Klonierung des Präprorelaxins
Die Klonierung der cDNA für das Präprorelaxin des Hundes erfolgte aus mRNA von kryokonserviertem Plazentagewebe am Tag 35 der Gravidität. Für die Klonierung der cDNA für das Präprorelaxin des Hundes wurden die in Tab. 6 gelisteten Oligonukleotidprimer verwendet.
Tabelle 6. Liste der in der RT-PCR sowie 5´- und 3´-RACE-PCR verwendeten Primer (GSP = Gen-spezifische Primer; m = A oder C; r = G oder A; y = C oder T). Die Numerierung ist identisch zu den Primern-Nummern in Abb. 20.
PCR Methode Primer Primer Nr.
Primersequenz Primer
Bindungsstelle( bp)*
RT-PCR mit forward 1 5´gayaaraarctgaargcmtgtggtcg3´ 82-107
degenerierten Primern reverse 2 5´gtacaaccyacrttrcagcatttrtc3´ 481-506
RT-PCR für forward 8 5´atgctgcgctggttcttgtccc3´ 1-22
komplette cDNA reverse 9 5´tcagcatcggctagcaagctctc3´ 512-534
3´-RACE- GSP-I 3 5´cccagccacggatgacaagaaac3´ 69-91
PCR GSP-II 4 5´atgtggtcgtgattatgtccgcc3´ 99-121
GSP-III 5 5´gattgaggtctgcggctccatc3´ 126-147
5´-RACE- GSP-I 6 5´cccagaccgtgttgctatcctc3´ 291-311
PCR GSP-II 7 5´tcctcagttcctgtggcatacc3´ 274-295 5´- und 3´-RACE-PCR Universal-primer 10 5´ggccacgcgtcgactagtac3´
*Die Angaben zu den Primer-Bindungsstellen beziehen sich auf die kodierende cDNA-Sequenz des Präprorelaxins des Hundes.
3.2.1.4.2. Uteroplazentares Gewebe
Die Northern Analysen wurden mit Gesamt-RNA einer Plazenta am Tag 35 der Gravidität und Nierengewebe eines männlichen Tieres als Kontrollgewebe durchgeführt. In-situ Hybridi-sierungen erfolgten an zwei Buoin-fixierten, paraffinierten Plazenten am Tag 30 und an Gefrierschnitten zweier Plazenten am Tag 35 der Gravidität. Es erfolgte der Nachweis von immunreaktivem Cytokeratin (MNF-116, 1:250),Vimentin (V9, 1:2000), von-Willebrand Faktor (P-0226, 1:100) und von immunreaktivem Relaxin mit einem für Hunderelaxin spezifischen polyklonalen Antiserum ( Nr. 78513, 1:250; Steinetz et al., 1996).
3.2.1.5. Galago crassicaudatus und Varecia variegata 3.2.1.5.1. Klonierung der Präprorelaxine
Die Klonierung der Präprorelaxine des Galago crassicaudatus und der Lemuren-Spezies Varecia
aufgelisteten Oligonukleotidprimer wurden bei der Klonierung der cDNA für die beiden Präprorelaxine verwendet.
Tabelle 7. Liste der in der RT-PCR sowie 5´- und 3´-RACE-PCR verwendeten Primer (GSP = Gen-spezifische Primer; k = G or T, r = G oder A, y = C oder T). Die Numerierung ist identisch zu den Primern-Nummern in Abb. 13.
PCR Methode Primer Primer Nr. Primersequenz Primer-Bindungsstelle (bp)* RT-PCR forward 1 5´atgcctcgcctgttttttttccac3´ 1-24 reverse 2 5´tytgrtacaacckayktkrcaaca3´ 553-576 RT-PCR für forward 3 5´atgcctcgcctgttttttttccac3´ 1-24 komplette cDNA reverse 4 5´tcagcaaaatctagcaagagatcttt3´ 542-567
3´-RACE- GSP-I 5 5´gctactgacccaaatttccagagc3´ 42-65
PCR GSP-II 6 5´catgtggccgccgactaatacgc3´ 107-129
GSP-III 7 5´gaacaaggtgaagcagaagacaacag3´ 415-440
GSP-III 8 5´ttgttgatgaaggatgatggcacaat3 220-245
5´-RACE- GSP-II 9 5´taaggtgggtggatattgctgtag3´ 343-366
PCR GSP-I 10 5´aatgactgttgtcttctgcttcacc3´ 421-441 5´ and 3´-RACE-PCR Universal-primer 11 5´ggccacgcgtcgactagtac3´
*Die Angaben zu den Primer-Bindungsstellen beziehen sich auf die in ihrer Länge identischen kodierenden cDNA-Sequenzen der Präprorelaxine von Galago crassicaudatus und Varecia
variegata.
3.2.1.5.2. Plazenta
In Kryoschnitten einer Plazenta von Galago crassicaudatus erfolgte der Nachweis von Relaxin-Transkripten sowie immunreaktivem Relaxin (R6, 1:1000), Cytokeratin (MNF-116, 1:1000) und Vimentin (V9, 1:500).
3.2.2. Relaxin-like Faktor (RLF) in unterschiedlichen Spezies 3.2.2.1. Ziege (Capra hircus)
3.2.2.1.1. Klonierung des RLF
Die Klonierung der RLF-cDNA erfolgte aus mRNA von gefrorenem Hodengewebe dreier 27 Monate alter Ziegenböcke. Die verwendeten Oligonukleotidprimer für die PCR-Klonierung des Ziegen-RLF sind in Tab. 8 gelistet.
Tabelle 8. Liste der in der RT-PCR sowie 5´- und 3´-RACE-PCR verwendeten Primer (GSP = Gen-spezifische Primer; k = G oder T; r = G oder A) für Ziegen- und Damwild-RLF. Die Numerierung ist identisch zu den Primern-Nummern in Abb. 23 (Ziegen-RLF) und Abb. 28 (Damwild-RLF).
PCR Methode Primer Primer Nr. Primersequenz Primer Bindungsstelle (bp)* RT-PCR forward 1 5´tgggckctrgtgctgctgggc3´ 22-42 reverse 2 5´tcagtrgggacagagggtcagca3´ 374-396 RT-PCR für forward 3 5´atggaccgtcgtccgctcacct3´ 1-22
komplette cDNA reverse 4 5´tcagtggggacagagggtcag3´ 376-396
3´-RACE- GSP-I** 5 5´tcggtcctgcagccgcgcag3´ 62-81
PCR GSP-II 6 5´gctcgtgcggctgtgcggcg3´ 123-142
5´-RACE- GSP-III*** 7 5´gtggggccagtaccagcacgg3´ 254-274
PCR GSP-II 8 5´cggtggtggtgatggcgagaag3´ 290-311 GSP-I 9 5´gaggcagcagtggcgggcag3´ 332-351 5´ and 3´-RACE-PCR Universal-primer 10 5´ggccacgcgtcgactagtac3´
*Die Angaben zu den Primer-Bindungsstellen beziehen sich auf die kodierende cDNA-Sequenz des RLF der Ziege und des Damwildes.
**abweichende Primersequenz für Damwild-RLF (5´tcagtcctgcagccgcgcag3) *** abweichende Primersequenz für Damwild-RLF (5´gtggggccagaaccagcacag3)
3.2.2.1.2. Testikuläre Expression
Die Northern Analyse erfolgte an Gesamt-RNA des Hodens und Nebenhodens eines Ziegenbockes sowie Gesamt-RNA von Leber und Muskel einer weiblichen Ziege. Bouin-fixiertes, paraffiniertes
Hodengewebe wurde für die Lokalisation der RLF-Transkripte sowie den immunhistochemischen Nachweis der beiden enzymatischen Marker der Steroidsynthese, 3β -Hydroxysteroid-Dehydrogenase (3β-HSD, 1:1000) und 17α-Hydroxylase (1:1000) eingesetzt.
3.2.2.2. Damwild (Dama dama) 3.2.2.2.1. Klonierung des RLF
Die RLF cDNA des Damwildes wurde aus kryokonserviertem Hodengewebe eines ca. drei Jahre alten geschlechtsreifen männlichen Tieres kloniert. Die verwendeten Oligonukleotid-Primer sind in Tab. 8 gelistet.
3.2.2.2.2. Testikuläre, ovarielle, uterine und uteroplazentare Expression
Gesamt-RNA von adultem Hoden, Nebenhoden, Leber und Muskel zweier Damwildböcke wurde in der Northern Analyse auf die Anwesenheit von RLF-Transkripten untersucht. Bouin-fixiertes, paraffiniertes Hodengewebe zweier geschlechtsreifer Böcke sowie je drei Plazenten und Ovarien um den 80. und 110. Trächtigkeitstag dienten dem zellulären Nachweis von RLF-Transkripten. In Hodenschnitten erfolgte der immunhistochemische Nachweis von 3β-HSD (1:1000) und 17α -Hydroxylase (1:1000). In den Plazenten wurden immunreaktives Cytokeratin (MNF-116, 1:100), ovines Plazentares Laktogen (oPL, 1:500), Pregnancy-specific protein-60 (PSP-60; 1:500) und MHC Klasse Ib Moleküle (87-G; 1:50) detektiert.
3.2.2.3. Galago crassicaudatus
3.2.2.3.1. Klonierung des RLF und genomische Organisation
Für die Southern Analyse des RLF-Genes wurde genomische DNA aus gefrorenem Muskelgewebe von G. crassicaudatus isoliert. Die Klonierung der cDNA für RLF von Galago crassicaudatus erfolgte aus testikulärem Gewebe eines geschlechtsreifen Tieres mit den in Tab. 9 gelisteten Oligonukleotidprimern.
Tabelle 9. Liste der in der RT-PCR sowie 5´- und 3´-RACE-PCR verwendeten Primer (GSP = Gen-spezifische Primer; k = G or T, y = C oder T). Die Numerierung ist identisch zu den Primern-Nummern in Abb. 32.
PCR Methode Primer Primer Nr. Primersequenz Primer-Bindungsstelle (bp)* RT-PCR forward 1 5´caccaccatggaccccc3´ (-)7-10 reverse 2 5´tcagtggggacagagggtcagc3´ 375-396 RT-PCR für forward 3 5´atggacccccgtctgtccgtc3´ 1-21 komplette cDNA reverse 4 5´tcagtggggacagagggtcagc3´ 375-396
3´-RACE- GSP-I 5 5´atggacccccgtctgtccgtc3´ 1-21
PCR GSP-II 6 5´cctgccctagttttcgcgctgc3´ 43-63
GSP-III 7 5´cctggagacgcgggagaagttg3´ 78-99
5´-RACE- forward 8 5´cttgaccttktycctgggcggtc3´ (-)119-(-)97**
PCR reverse 9 5´tcagtggggacagagggtcagc3´ 375-396 5´ and 3´-RACE-PCR Universal-primer 11 5´ggccacgcgtcgactagtac3´
*Die Angaben zu den Primer-Bindungsstellen beziehen sich auf die kodierende cDNA-Sequenz des Relaxin-like Faktors von Galago crassicaudatus.
**Primerbindungsstellen liegen in einem beim humanen und porcinen RLF konservierten Bereich im untranslatierten 5´-Ende.
3.2.5.4.2. Testikuläre Expression
Bouin-fixiertes, paraffiniertes Hodengewebe zweier Lemuren der Spezies Varecia variegata diente zum Nachweis von RLF-Transkripten mit einer Digoxigenin-markierten antisense cRNA-Sonde für RLF von G. crassicaudatus. Testikuläre Leydigzellen wurden immun-histochemisch durch den Nachweis der 17α-Hydroxylase (1:1000) identifiziert.
3.2.2.4. Mensch (Homo sapiens) 3.2.2.4.1. Klonierung des RLF
Humanes testikuläres Gewebe mit histologisch normaler Spermatogenese (Score 9-10; Holstein und Schirren, 1983) wurde nach Orchiektomie bei zwei Patienten (Alter 52 und 76 Jahre) mit Prostatakarzinom gewonnen, in flüssigem Stickstoff gefroren und bis zur Isolierung der Gesamt-RNA
bei -80oC gelagert. Die Klonierung der 396 bp cDNA für humanes RLF erfolgte mit dem forward-Primer 5´atggacccccgtctgcccgcc3 und dem reverse-Primer 5´tcagtagggacagagggtcagca3.
3.2.2.4.2. Testikuläre Leydigzell-Neoplasien
Bouin-fixiertes und paraffiniertes Hodenbiopsiematerial von zehn Patienten (Alter 44-76 Jahre; Mittelwert 62,7) mit obstruktiver Azoospermie und normalen endokrinen Parametern sowie normaler Spermatogenese (Score 9-10) dienten als Kontrollgewebe in der Immunhistochemie für RLF (RA15, 1: 2000; Ivell et al., 1997b) und in-situ Lokalisation für RLF-mRNA. Basierend auf der histologischen Diagnose wurden Hodenbiopsien von weiteren zehn Patienten mit Hyperplasie (Alter 29-46 Jahre; Mittelwert: 36,1) und von zwei Patienten mit bilateralen Leydigzell-Adenomen (Alter 24 und 38 Jahre) für diese Studie ausgewählt.
3.2.2.4.3. Ovarieller Sertoli-Leydigzell-Tumor
Bouin-fixiertes, paraffiniertes ovarielles Gewebe mit multiplen Nestern eines ovariellen Sertoli-Leydigzell-Tumors (SLCT) wurde nach Salpingo-Oophorektomie von einer Patientin (53 Jahre) mit zehnfach erhöhten Testosteronserumwerten und ausgeprägtem Hirsutismus Grad III (Ferriman-Gallwey-Klassifizierung) gewonnen. In-situ Hybridisierung mit einer RLF-Sonde wurde kombiniert mit dem immunhistochemischen Nachweis von Cytokertain 18 (1:50). Es erfolgte zusätzlich der Nachweis von immunreaktivem 3β-HSD (1:1000), 17α-Hydroxylase (1:1000) und Ki-67 (1:50).
3.2.2.4.4. Uteroplazentares Gewebe
In Paraffinschnitten dreier nicht pathologisch veränderten, humanen Plazenten des ersten Trimenons erfolgte der Nachweis von Transkripten mit einer cRNA-Sonde für humanes RLF. Die RLF-mRNA exprimierenden plazentaren Zellen wurden immunhistochemisch durch den Nachweis von Cytokeratin (1:500), Vimentin (1:1000) und HLA-A2 (1:200) näher charakterisiert.
3.2.3. Tabellarische Zusammenfassung der eingesetzten Methodiken
Tabelle 10. Zusammenfassende Darstellung der untersuchten Gewebe des Reproduktions-traktes, eingesetzten Methodiken und zugrundeliegende Fragestellungen für die hier ermittelten Relaxin cDNA-Sequenzen (ISH: in-situ Hybridisierung; IH: Immunhistochemie).
Spezies Gewebe Stadium (Tage) Methodik Fragestellung
Präimplantations -embryonen 30, 33 RT-PCR, ISH, IH Relaxin-Expression in Präimplantationsembryonen endometr. Cupzellen
41, 45, 56, 70 ISH, IH und invasiven Trophoblasten
300 RT-PCR Klonierung des Prorelaxins
120, 300 Northern-Analyse Struktur des Prorelaxins und Pferd Uteroplazentares intraspez.: 46, 60,
120, 153, 300 ISH, IH Expressionsmuster in der Gewebe interspez.: 45, 47, 52, 58 ISH, IH epitheliochorialen Plazenta extraspez.: 59, 67, 75 ISH, IH von Equiden Follikel ≤ 2 - ≥ 5 cm ISH, IH, RT-PCR,
RIA, HPLC
Mögliche Funktionen des C.
hämorragi-cum
1-2 RT-PCR, HPLC Relaxins im Ovar der
C. luteum 1-17 post ovulationem
ISH, IH, RT-PCR nichtträchtigen Stute nichtträchtiger
Uterus
nicht bestimmt ISH, IH Struktur des Präprorelaxins
Uteroplazentares 300 RACE- und
RT-PCR
und Expressions in der
Dromedar Gewebe 93, 170, 196, 213,
240, 340, 372
ISH, IH epitheliochorialen Plazenta Ovar 93, 102, 170, 196,
213, 240, 340, 372
ISH, IH Funktionen des Relaxins im Ovar des Dromedars Katze
Uteroplazentares Gewebe
35 RACE- und
RT-PCR,
Northern-Klonierung, Struktur und Expression der Präpro-Hund
Uteroplazentares Gewebe
30, 35 Analyse, ISH, IH relaxine in
endothelio-chorialen Plazenten G.
crassi-caudatus;
V. variegata Plazenta postpartal
Capfinder-, RACE-und RT-PCR, Klonierung, Struktur, phylogenetische Analyse G. crassi-caudatus
ISH, IH Expression des Präpro-relaxins in der epithelio-chorialen Plazenta
Tabelle 11. Zusammenfassende Darstellung der untersuchten Gewebe des Reproduktions-traktes, eingesetzten Methodiken und zugrundeliegende Fragestellungen für die hier ermittelten RLF cDNA-Sequenzen (ISH: in-situ Hybridisierung; IH: Immunhistochemie).
Spezies Gewebe Stadium Methodik Fragestellung
Ziege Hoden, Nebenhoden 27 Monate alte Böcke RACE- und RT-PCR, Northern-Analyse, ISH, IH Struktur des RLF; testikuläre RLF-Expression Uteroplazentares Gewebe postpartal RT-PCR Plazentare RLF-Expression Hoden, Nebenhoden 36 Monate alte Spiesser RACE- und RT-PCR, Northern-Analyse, ISH, IH Struktur des RLF; testikuläre RLF-Expression Damwild Uteroplazentares
Gewebe Tag 80 und 110 der ISH, IH
Plazentare RLF-Expression
Ovar Gravidität Ovarielle
RLF-Expression
Varecia variegata Hoden,
Nebenhoden geschlechtsreife Tiere RACE- und RT-PCR, ISH, IH Struktur des RLF; testikuläre RLF-Expression Alter: 52 und 76 Jahre (score 9-10) RT-PCR Klonierung von RLF Alter 44-76 Jahre; Verschlußazoo-spermie Mensch
Hoden Alter: 29-46 Jahre;
Leydigzell-Hyperplasie Testikuläre RLF-Expression Alter: 24 und 38 Jahre; Leydigzell-Adenom ISH, IH
Ovar 53 Jahre;
Sertoli-Leydigzelltumor
ektope RLF-Expression im SLCT
Plazenta 9. und 13. SSW Plazentare
4. Ergebnisse
4.1. Relaxin 4.1.1. Equiden4.1.1.1. Molekulare Charakterisierung 4.1.1.1.1. Prorelaxin cDNA-Sequenz
Mit zwei degenerierten Oligonukleotidprimern, die entsprechend der bekannten Peptid-sequenzen der A- und B-Domäne für equines Prorelaxin hergestellt wurden (siehe 3.2.1.1.1; Stewart et al., 1991), erfolgte der RT-PCR-Nachweis eines 428 bp Amplifikates aus Gesamt-RNA von Pferdeplazenten am Tag 120 und 300 der Trächtigkeit sowie von zwei Präimplan-tationsembryonen am Tag 30 der Gravidität, bei denen die Choriongürtelzellen zuvor abpräpariert worden waren. In den Zellen des Allantochorions, nicht jedoch in den Choriongürtelzellen, wurde Relaxin-mRNA detektiert (Abb. 2). Die partielle cDNA-Sequenz für equines Prorelaxin kodierte für die C-terminalen 22 Aminosäuren (66 bp) der B-Domäne, eine C-Domäne von 109 Aminosäuren (327 bp) und die N-terminalen 12 Aminosäuren (36 bp) der A-Domäne (Abb. 3).
Tabelle 12. Aminosäure-Homologien des equinen Präprorelaxins und der einzelnen Relaxin-Domänen mit Relaxinen anderer Spezies.
Spezies
Signalpeptid
B-Domäne
C-Domäne A-Domäne
Total
aSchwein
66,7 64,3 67,6 54,5 65,6Dromedar
76,0 69,2 61,9 50,0 65,4H1
b 52,0 57,1 53,8 45,5 52,2H2
b 50,0 53,6 50,5 50,0 50,0Katze
60,0 65,4 61,2 59,1 59,9Hund
72,0 44,5 23,7 59,1 48,0Ratte
57,1 42,9 40,4 45,5 41,2Maus
54,5 42,9 48,5 27,3 40,1 aProzentsatz identischer Aminosäuren b
H1 und H2: die zwei humanen Präprorelaxine
Die potentielle Rezeptorbindungssequenz in der B-Domäne wich in einer Aminosäure (V→A) vom klassischen Rezeptorbindungsmotif (-G-R-E-L-V-R-) ab (Abb. 3) und war identisch mit der kürzlich publizierten equinen Präprorelaxinsequenz (Min et al., 1996). Equines Prorelaxin zeigte die
