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Das Akustikusneurinom 1
1.1.1Klinik und Pathophysiologie 1
1.1.2Diagnostik und Therapie 2
1.1.3Ursachen für die Entstehung 3
Neurotrophe Faktoren und ihre Bedeutung im
Akustikusneurinom 4
1.2.1 Die TGF β Superfamilie 4
1.2.2 Der Co Rezeptor Ret 10
1.2.3 Die Familie der Neurotrophine 11
Material 15
3.1.1 Untersuchungsmaterial 15
3.1.2 Auswahlkriterien und demographische Daten 15
Methoden 16
3.2.1 Molekularbiologische Methoden 16
3.2.1.1 RNA Isolierung aus Gewebe 16
3.2.1.2 Fotometrische Dichtebestimmung von Nukleinsäuren 17
3.2.1.3 DNA Verdau 17
3.2.1.4 Kontrolle der RNA Qualität 18
3.2.1.5 cDNA Synthese 18
3.2.1.6 Reverse Transkriptase Polymerase Kettenreaktion 19 3.2.1.7 Analytische Agarose Gelelektrophorese 21
3.2.1.8 Primerauswahl/Primerdesign 22
3.2.1.9 Sequenzierung der PCR Produkte 24
3.2.1.10 Fotodokumentation und densitometrische Auswertung
der Agarose Gele 24
3.2.2 Immunhistochemische Methoden 24
3.2.2.1 Die Avidin Biotin Komplex Methode 24
3.2.2.2 Der Ki 67 Proliferationsindex 26
3.2.2.3 Herstellung der Gewebeschnitte und
immunhistochemischer Nachweis der Expression
von MIB 1 im Akustikusneurinom 26
3.2.2.4 Kontrollen 27
3.2.3 Datenanalyse 28
3.2.3.1 Datenanalyse der PCR Ergebnisse 28
3.2.3.2 Ermittlung des Ki 67 Proliferationsindex 28
3.2.3.3 Statistik 28
Differentielle Genexpressionsanalyse neurotropher Faktoren im
Akustikusneurinom 29
4.1.1 Überprüfung der Qualität der extrahierten RNA 29 4.1.2 Expressionsnachweis der zu untersuchenden neurotrophen
Faktoren und Housekeeping Gene im Akustikusneurinom
und peripheren Nerv 31
4.1.3 Ermittlung der linearen Reaktionsphase während der Amplifikation für die zu untersuchenden neurotrophen
Faktoren 34
4.1.4 Bestimmung der linearen Reaktionsphase während der
Amplifikation für die zu untersuchenden Housekeeping Gene und Ermittlung eines geeigneten internen Standards 36 4.1.5 Bestimmung der Genexpressionslevel der neuotrophen
Faktoren und des Housekeeping Gens SDHA im
Akustikusneurinom und peripheren Nerv 40
4.1.6 Semiquantitative Bestimmung der Genexpressionslevel der neurotrophen Faktoren und des Housekeeping Gens
SDHA in den zu untersuchenden Geweben 41
4.1.7 Vergleich der mRNA Genexpressionslevel der neurotrophen Faktoren in den zu untersuchenden
Gewebefraktionen 55
Immunhistochemische Befunde 57
4.2.1 Kontrollen 57
4.2.2 Detektion des nukleären Ki 67 Antigens und Bestimmung des Ki 67 Proliferationsindex zur Ermittlung der
Wachstumsfraktion im Akustikusneurinom 59 4.2.3 Korrelation des mittleren Ki 67 Proliferationsindex
zum maximalen Proliferationsindex der Antoni Typ A
sowie der Antoni Typ B Region im Akustikusneurinom 63 4.2.4 Korrelation der NTF Genexpressionen zum mittleren
Ki 67 Proliferationsindex für das Akustikusneurinom 65
Vorbemerkungen 74
Bewertung der verwendeten Methode der semiquantitativen
PCR zur Expressionanalyse der neurotrophen Faktoren 75 Methodische Betrachtung der Verwendung von
Housekeeping Genen als internen Standard bei der RT PCR 77 Untersuchungen zum Nachweis und zur differentiellen Gen
expression neurotropher Faktoren im Akustikusneurinom 80
5.4.1 Expressionsnachweis neurotropher Faktoren in den zu
untersuchenden Geweben 81
5.4.2 Differentielle Expressionsanalyse neurotropher Faktoren im
Akustikusneurinom 83
5.4.2.1 Differentielle Expressionsanalyse: Mitglieder der
TGF β Superfamilie 84
5.4.2.2 Differentielle Expressionsanalyse: Das Neurotrophin
BDNF 87
Bewertung der verwendeten Methode des Ki 67 Nachweises zur Bestimmung des Proliferationsindex im
Akustikusneurinom 90
! Untersuchungen zur Ermittlung des Ki 67 Proliferationsindex im
Akustikusneurinom 93
Korrelation des mittleren Ki 67 Proliferationsindex zum maximalen Proliferationsindex der Antoni Typ A und Antoni Typ B Region sowie zur NTF Genexpression im
Akustikusneurinom 94
" Ausblick 97
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" '
" Reagenzien und Lösungen 114
" Laborbedarf und Verbrauchsmaterialien 115
" Geräte 116
" WHO Klassifikation der Tumoren der Hirnnerven und
peripheren Nerven 117
"
%$ &
(
A Adenosin (Purinbase)
Abb. Abbildung
ABC AvidinBiotinComplex
Aqua dest. Aqua destillata (destilliertes Wasser)
ART Artemin
ARTN Artemin
ATP Adenosintriphosphat
BERA BrainstemEvokedResponseAudiometry (Ableitung akustisch evozierter Hirnstammpotentiale)
bp Basenpaare
BDNF BrainDerivedNeurotrophicFactor bzw. beziehungsweise
C Cytidin (Pyrimidinbase)
°C GradCelsius
ca. circa
CD Cluster ofDifferentiation, Oberflächenantigene auf Zellmembranen cDNA complementaryDNA (komplementäre DNA)
c ret Cellular Rearranged duringTransfection C terminal Kohlenstoffende eines Proteins
CTP Cytidintriphosphat CV Coefficient ofVariance CycA CyclophilinA
D bzw. Da Dalton (1,66018 x 1024g) DEPC Diethylpyrocarbonat
DNA DesoxyribonucleicAcid (Desoxyribonukleinsäure) DNase I Deoxyribonuklease I
dNTP Desoxynukleotidtriphosphat (Nukleotidgemisch aus dATP, dCTP, dTTP, dGTP) EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
et al. et alii (und andere)
Fa. Firma
FGF FibroblasticGrowthFactor
for forward
g gravity (Erdbeschleunigung, 9,81m/s2) G Guanosin (Purinbase)
G0Phase Ruhephase
GTPhase Transition der Zellen von G0 zur G1Phase G1Phase präsynthetischer oder postmitotischerGap
G1aPhase Anfangsphase 1 von G1mit weniger RNA Gehalt, keine Ki 67 Expression G1bPhase Anfangsphase 2 von G1mit weniger RNA Gehalt, keine Ki 67 Expression G1APhase Endphase 1 von G1mit höherem RNA Gehalt, Ki 67 Expression
G1BPhase Endphase 2 von G1mit höherem RNA Gehalt, Ki 67 Expression G2Phase postsynthetischer oder prämitotischerGap
GAPDH Glycerinaldehyd 3 phosphat Dehydrogenase GDNF Glial Cell LineDerivedNeurotrophicFactor GFL GDNFFamilyLigand
GFR α GDNFFamilyReceptorα
GGF Glial DerivedGrowthFactor
GPI GlykosylPhospatidylInositol (Rezeptor Verankerung auf Zellmembranen) GTP Guanosintriphosphat
HL 60 Zellen im Rahmen einer akuten, myeloischen Leukämie gewonne Zelllinie, bestehend aus Promyelozyten
HPRT1 Hypoxanthin Phosphoribosyltransferase 1 HRP HorseradishPeroxidase
Ig Immunglobulin
IgG ImmunglobulinG
k Kilo (103)
K1 RNA Anfangskonzentration der Probe [ g/ l]
K Endkonzentration RNA [ g/ l]
Ki Kiel
l Liter
λ Lambda (Wellenlänge)
M mol/Liter
m milli (103)
mA Milliampère
max. maximal
max. PI A/PI B maximalerProliferationsindex für Gewebe vom Antoni TypAbzw. TypB
mg Milligramm
mikro(106)
MEN2A multiple endokrine Neoplasien Typ 2A, Sipple Syndrom MEN2B multiple endokrine Neoplasien Typ 2B, Gorlin Syndrom MHH MedizinischeHochschuleHannover
MIB 1 MolecularImmunologyBorstel1 min minute (Minute)
mittl. PI mittlerer Ki 67 Proliferationsindex
M Phase MitosePhase
mRNA messengerRNA(Boten RNA)
MRT Magnetresonanztomographie (Kernspintomographie) MW arithmetischerMittelwert
n Stichprobenumfang
NCAM NeuralCellAdhesionMolecule
NCBI NationalCenter forBiotechnologyInformation NF2 Neurofibromatose Typ2
ng Nanogramm (109) NGF Nerve Growth Factor
nm Nanometer
Nr. Nummer
NRTN Neurturin
NT Neurotrophin
N terminal Stickstoffende eines Proteins
NTF neurotropheFaktoren bzw. Nervenwachstumsfaktoren
NTN Neurturin
OD optischeDichte
OD260 optische Dichte bei einer Wellenlänge von 260 nm OD280 optische Dichte bei einer Wellenlänge von 280 nm Oligo (dT) Oligodeoxythymidin
P phosphoryliert
p piko (1012)
p75NTR p75 NeurotrophinReceptor PCNA ProliferatingCellNuclearAntigen
PCR PolymeraseChainReaction (Polymerasekettenreaktion)
pH negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration PHA PhytohämagglutininA
PI Proliferationsindex Pool Gemisch mehrerer Proben
PSP Persephin
PSPN Persephin
R lineares Bestimmtheitsmaß, R2= r2
r Korrelationskoeffizient bei der Regressionsanalyse Ret Rearranged duringTransfection
rev reverse
RNA RibonucleicAcid (Ribonukleinsäure)
RNase Ribonuclease
rpm revolutionsperminute (Umdrehungen pro Minute) rRNA ribosomaleRNA
RT Negativkontrolle, Probe ohne Zusatz von RTase bei der cDNA Trankription RTase reverseTranskriptase
RT PCR reverseTranskriptase Polymerase Kettenreaktion
sec second (Sekunde)
S Svedberg (Sedimentationskoeffizient)
s. siehe
5,8 S rRNA am Aufbau der großen (60S ) eukaryonten ribosomalen Untereinheit beteiligt 18 S rRNA am Aufbau der kleinen (40S ) eukaryonten ribosomalen Untereinheit beteiligt;
Verwendung als Housekeeping Gen
28 S rRNA am Aufbau der großen (60S ), eukaryonten ribosomalen Untereinheit beteiligt;
Verwendung als Housekeeping Gen
SDHA SuccinatDehydrogenase Komplex, subunitA, Flavoprotein
Smad der Begriff stammt vom Drosophila Protein MAD und den Caenorhabditis elegans Proteinen SMA 2, 3 und 4
T Thymidin (Pyrimidinbase)
T1 Spin Gitter Relaxation (Längsrelaxation T1), zur besseren Ortsauflösung (MRT) Taq Polymerase Thermusaquaticus DNAPolymerase
TBE TrisBoratEDTA TβR TGFβ receptor
Template Ausgangs DNA
TGF β TransformingGrowthFactorβ
TIF TaggedImageFile (PC Speicherformat) Trk TyrosinKinaseRezeptor
tRNA transferRNA TTP Tyrosintriphosphat
U Units (Einheit der Enzymaktivität) UV Ultraviolett
V Volt
V1 Ausgangsvolumen der Probe [ l]
V2 Endvolumen der Probe nach DNA Verdau [ l]
WHO WorldHealthOrganisation ZNS zentralesNervensystem
1. Einleitung
1.1 Das Akustikusneurinom
1.1.1 Klinik und Pathophysiologie
Das so genannte Akustikusneurinom (auch Vestibularisschwannom, Neurilemmom) ist ein benigner, in der Regel langsam wachsender Tumor der hinteren Schädelgrube mit nur geringer Tendenz zur malignen Entartung (WHO Grad I, siehe Anhang). Er geht aus den Schwann Zellen des VIII. Hirnnervs (Nervus vestibulocochlearis) hervor. Am häufigsten ist der Nervus vestibularis betroffen, seltener sind eine Entstehung aus dem Nervus cochlearis oder eine intralabyrinthäre Lokalisation.
Akustikusneurinome treten mit einer Inzidenz von 1/ 100 000 pro Jahr auf und stellen mit einer Häufigkeit von 8% die häufigste primär intrakranielle Tumorentität dar (CASADEI et al., 1995).
Akustikusneurinome entstehen bevorzugt in der vierten bis fünften Lebensdekade und treten in 95% der Fälle sporadisch und unilateral auf. Im Rahmen der autosomal dominant vererbten Neurofibromatose Typ 2 (NF2) tritt die Neoplasie bilateral auf (weniger als 5% aller Akustikusneurinome). Hierbei handelt es sich um eine neurokutane Erkrankung mit einer Geburtsinzidenz von 1/ 25 000 (EVANS et al., 2005), bei der eine Mutation des NF2 Tumorsuppressorgens auf dem Chromosom 22 zum Auftreten zahlreicher Tumoren des Nervensystems (beispielsweise im Schädelinneren und Spinalkanal) führt. Für die Entstehung der unilateralen, sporadischen Variante werden ähnliche molekulare Mechanismen diskutiert.
Klinische Symptome treten beim Akustikusneurinom in der Regel erst bei zunehmender Verdrängung von Nachbarstrukturen auf. Kardinalsymptome sind die langsam progrediente, ipsilaterale Hörminderung, Tinnitus und vestibuläre Ausfalls erscheinungen wie Schwindel oder Gleichgewichtsstörungen (BOENNINGHAUS &
LENARZ, 2004; MACKLE et al., 2007). Bei ausgedehntem Tumorwachstum können die Hirnnerven Nervus trigeminus, Nervus facialis und Nervus vagus beeinträchtigt werden und bei weiterer Größenzunahme können Hirnstammkompression und/ oder Liquorabflussstörungen mit Hirndruckanstieg auftreten.
Das sporadische, aus dem Neuroektoderm entstehende Akustikusneurinom ist makroskopisch von einer bindegewbsartigen Kapsel von gelb bräunlicher Farbe umgeben und weist unterschiedliche Konsistenzen auf (CASADEI et al., 1995). Der Tumor entsteht meist intrameatal im lateralen Übergangsbereich von Ganglienneurilemm zu Hirnstammneuroglia, der so genannten Obersteiner Redlich Zone (XENELLIS et al., 2003). Mikroskopisch können zwei Areale unterschieden werden: In der Antoni Typ A Region herrscht eine höhere Zelldichte mit fischzugartig, in Spiralen oder Palisaden („Verocay Bodies“) angeordneten spindelförmigen Zellen mit ovalären Nuclei vor. Davon unterschieden werden können Areale mit lockerer Textur, sternförmigen Zellen und hyaliner Degeneration (Antoni Typ B) (CHARABI et al., 1994).
Die Zellen des Akustikusneurinoms exprimieren die für Schwann Zellen phänotypischen Marker S 100, Vimentin und das integrale Membranprotein CD 57 (BONETTI et al., 1997).
1.1.2 Diagnostik und Therapie
Der Goldstandard in der Diagnostik des Akustikusneurinoms ist die kontrastmittelangereicherte, T1 gewichtete Magnetresonanztomographie (MRT) nach Gadoliniumgabe (SAUVAGET et al., 2005): Sie ermöglicht selbst bei sehr kleinen Tumoren eine genaue Lokalisation. Mit der Computertomographie können hingegen knöcherne Strukturen sowie Arrosionen des Felsenbeinknochens beurteilt werden; beide Verfahren erlauben vor allem in der koronaren Schnittführung eine gute Visualisation des Neurinoms.
Als weitere diagnostische Maßnahme kommt die Messung der Hirnstammpotentiale (BERA) in Betracht, die häufig asymmetrische Laufzeiten oder einen kompletten Leitungsblock bei einer typischen retrocochleären Störung aufweist.
Als radiologische Differentialdiagnose kommen mit abnehmender Häufigkeit Meningeome (10–15%) (LAIRD et al, 1985), Facialis und Trigeminusneurinome, Arachnoidalzysten, Cholesteatome, Hämangiome, Aneurysmata und maligne Schwannome in Betracht. Eine ähnliche klinische Symptomatik können auch pontine Raumforderungen oder demyelinisierende Erkrankungen und Infarkte aufweisen.
Die einzige Therapie mit einem kurativen Ansatz besteht in der primären operativen Totalentfernung des Tumors (SAMII & MATTHIES, 2000). In Abhängigkeit von Lage und Größe des Schwannoms und bereits geschädigten Hirnstrukturen erfolgt der Zugang transtemporal, translabyrinthär oder subokzipital. Als weitere Behandlungsmethoden kommen je nach Tumorgröße und lokalisation, klinischer Symptomatik, Alter und Gesundheitszustand des Patienten eine alleinige Wachstumskontrolle mit regelmäßigen MRT Verlaufskontrollen oder alternativ die stereotaktische Bestrahlung („Radiochirurgie“ bzw. „Gamma Knife Stereotactic Surgery“) in Betracht (ROWE et al., 2005). Hierbei wird nach vorheriger MRT Aufnahme eine stereotaktische Bestrahlung des Tumors durchgeführt. Um eine sichere Therapieentscheidung für oder gegen ein operatives Vorgehen treffen zu können, bedarf es häufig der zuverlässigen Einschätzung des Tumorwachstums.
Bislang ist jedoch kein prognostischer Marker bekannt, der eine Aussage zur Progression des Tumors erlaubt.
1.1.3 Ursachen für die Entstehung
Der Pathomechanismus für die Entstehung von Akustikusneurinomen ist bisher nicht bekannt. Sowohl für die Entwicklung von unilateralen, sporadischen Schwannomen als auch im Rahmen der familiären Neurofibromatose Typ 2 wird als molekulare Pathogenese eine Mutation im Tumorsuppressorgen NF2 auf Chromosom 22 mit konsekutivem Verlust der Heterozygotie („Loss of Heterozygosity“) und verminderter Merlin/ Schwannomin Expression diskutiert (IRVING et al., 1994;
BIAN et al., 2005). Auf Grund der Homologie des NF2 Produkts Merlin mit den Proteinen Ezrin, Radixin und Moesin, scheinen bei einer verminderten Proteinsynthese Zell Zell Kontakt, Membran und Zellskelett Organisation und somit das Zellwachstum gestört zu sein. Untersuchungen von weiteren Chromosomen Mutationen mit Veränderungen der Genexpression verschiedener Zytokine, angiogenetischer und neurotropher Faktoren (NTF, auch als Nervenwachstumsfaktoren bekannt) sind Gegenstand aktueller Studien (WELLING et al., 2002; THOMAS et al., 2004; WARREN et al., 2006).
Verschiedene neurotrophe Faktoren, die bei der embryonalen und postnatalen Entwicklung sowie an posttraumatischen Reparaturvorgängen im peripheren
Nervensystem beteiligt sind, kommen als weitere, nicht genetische Ursache für die Entstehung und das Wachstum von Akustikusneurinomen in Betracht.
1.2 Neurotrophe Faktoren und ihre Bedeutung im Akustikusneurinom Bei den neurotrophen Faktoren handelt es sich um Substanzen mit zytoprotektiver und differenzierungsfördernder Wirkung. Sie haben zahlreiche Einflüsse auf Neurone des zentralen und peripheren Nervensystems während der neuronalen Ontogenese, regulieren aber auch Prozesse in nicht neuronalen Systemen. Zu ihren Aufgaben gehören vor allem die Beeinflussung von Mitose und Apoptose, Neuritenaussprossung und Synapsenbildung und die Regulierung der neuronalen Plastizität im erwachsenen Organismus. Sie sind nicht nur entscheidend für Entwicklung und Erhalt des Nervensystems, sondern verhindern auch die Degeneration bei assoziierten neuronalen Erkrankungen, posttraumatisch und bei Neurotoxizität (SARIOLA & SAARMA, 2003). Die Terminologie der neurotrophen Faktoren ist komplex und uneinheitlich (EBADI et al., 1997). Sie sind in Gruppierungen unterteilt, von denen die folgenden Gegenstand der vorliegenden Studie waren.
1.2.1 Die TGF β Superfamilie
Große Bedeutung erlangten die Mitglieder der Transforming Growth Factor β (TGF β) Superfamilie, die mit weit über 50 Mitgliedern die größte und bedeutendste Gruppe unter den neurotrophen Faktoren darstellt (BÖTTNER et al., 2000). Als gemeinsames Strukturmerkmal weisen sie sechs Cystein Reste auf, die durch drei Disulfid Brücken miteinander verbunden sind (so genanntes Cystein Knoten Motiv).
Abhängig davon, welche anderen trophischen Faktoren gleichzeitig co exprimiert werden, werden viele komplexe Zellfunktionen wie Zellzyklus Kontrolle, Regulation der frühen Entwicklung und Differenzierung, Formation der extrazellulären Matrix, Angiogenese, Chemotaxis, Regeneration nach peripheren Nervenverletzungen (beispielsweise Wallersche Degeneration), Hämatopoese und Modulation des Immunsystems von den verschiedenen TGF β Isoformen beeinflusst (ASSOIAN et al., 1983; WEERDA et al., 1998; DIENSTHUBER et al., 2004).
Fünf TGF β Isoformen wurden bisher isoliert, wovon TGF β1, β2 und –β3 in Säugetieren exprimiert werden. Gegenstand aktueller Studien sind vor allem die zwei Homodimere TGF β1 und TGF– β2, die ein Molekulargewicht von 25 bzw. 24 kD, eine Sequenz Homologie von 70% aufweisen und proteolytisch von der Vorläuferstufe in die aktive Form umgewandelt werden (ASSOIAN et al., 1983;
BÖTTNER et al., 2000). Beide Isoformen werden als latent dimere Komplexe synthetisiert und sezerniert. Ein Amino terminales Ende und ein C terminales Fragment von 110–140 Aminosäuren pro Segment kennzeichnen das Präproprotein.
Durch Abspalten der Prodomäne und des C terminalen Endes wird das biologisch aktive Molekül generiert. TGF β1 und TGF β2 sind in der Lage, ihre Signale über drei transmembranäre Glykoprotein Rezeptoren (TβR 1, TβR 2, TβR 3), die zur Klasse der Serin/ Threonin Rezeptoren (Typ I und II) gehören, in das Zellinnere weiterzuleiten (MCLENNAN & KOISHI, 2002). Die Bildung eines heterodimeren Rezeptorkomplexes aus den Komponenten TβR 1 (53 kD) und TβR–2 (75 kD) ist notwendig, um eine Signaltransduktion von TGF β in das Zellinnere zu gewährleisten (PINZANI & MARRA, 2001): Dabei führt die Bindung von TGF β an Tβ R2 zu einer Rekrutierung und Phosphorylierung von Tβ R1. Dies führt zur Phosphorylierung und dadurch Aktivierung von zwei Smad Proteinen (Smad2 und Smad 3), welche zusammen mit Smad4 Heterodimere bilden. Dieser Heterokomplex transloziert in den Nukleus und reguliert zusammen mit Co Faktoren die Genexpression (Abb. 1).
TGF β1 und TGF β2 weisen ähnlich starke Potenzen bei der Zelladhäsionsprotein Expression auf (BOYD & MASSAGUE, 1989). DE LARCO &
TODARO (1978) beschrieben alle TGF β Isoformen als wichtige Induktoren für den Verlust der Kontaktinhibition, wodurch nicht neoplastische Zellen zu einem durch Nachbarstrukturen ungehemmten Wachstum angeregt werden. TGF β1 und β2 sind Wachstumsinhibitoren, die auf viele Zellarten in vitro anti mitogene (anti proliferative) Effekte ausüben. Ihre mitogene Wirkung hingegen wurde sowohl für Osteoblasten als auch für Gliazellen des peripheren Nervensystems, die so genannten Schwann Zellen, nach neuronalem Kontaktverlust beobachtet (RIDLEY et al., 1989).
Die Expression beider Faktoren in Schwann Zellen ist schon seit längerem bekannt.
Nach externer Applikation konnten mitogene Effekte auf Schwann Zellen der Ratte
beobachtet werden (SCHUBERT, 1992). Die posttraumatische Injektion von TGF β2 als potentestem Motoneuronen Survivalfaktor verhindert deren Degeneration (MCLENNAN & KOISHI, 2002). Hingegen wurde bei der Wallerschen Degeneration peripherer Nerven ein Expressionsanstieg und somit eine wichtigere Rolle von TGF β1 beobachtet. Den Arbeitsgruppen von CARDILLO et al. (1999) und DIENSTHUBER et al. (2004) gelang mit immunhistochemischen Methoden der Expressionsnachweis von TGF β1 im Akustikusneurinom. Diskutiert wird eine autokrine Aktivierung von latent exprimierten TGF β1 und die dadurch hervorgerufene Stimulation der eigenen Proliferation bei der Entstehung von Schwann Zell Tumoren (WEERDA et al., 1998).
Darstellung des TGF β Signalwegs via Bildung eines Rezeptor Komplexes in der Plasmamembran und Smad Aktivierung: TGF β bindet an den homodimeren Rezeptor II (Tβ RII), der dadurch den homodimeren Rezeptor I (Tβ RI) rekrutiert und phosphoryliert. Die Anwesenheit von Tβ RIII könnte dabei die Bindung von TGF β positiv beeinflussen (gestrichelte Pfeile). Der aktivierte Typ I Rezeptor phosporyliert (P) und aktiviert Smad2 und Smad3, welche daraufhin Heterodimere mit Smad4 bilden. Die Translokation dieses Heterokomplexes in den Nukleus führt zusammen mit Co Aktivatoren, Co Repressoren und anderen Transkriptionsfaktoren zur Regulierung der Genexpression. Die Aktivierung von Smad2 und Smad3 wird durch Smad7 inhibiert (nach PINZANI & MARRA, 2001).
Tβ R = Transforming Growth Factor β Rezeptor; TGF β = Transforming Growth Factor β
Die Glial Cell Line Derived Neurotrophic Factor Family Liganden (GFL) gehören ebenfalls zur TGF β Superfamilie, weisen aber nur eine 20%ige Homologie zu ihr auf (SAARMA & SARIOLA, 1999). Die Mitglieder dieser Gruppe, Glial Cell Line Derived Neurotrophic Factor (GDNF), Neurturin (NTN), Artemin (ART) und Persephin (PSP), erregten in den letzten Jahren großes Interesse, da sie das Überleben verschiedener Neurone des peripheren und zentralen Nervensystems (ZNS) (hauptsächlich dopaminerge und Motoneurone) fördern und die Entwicklung einiger Organe (zum Beispiel von Nieren, Hoden, zentralem und peripherem Nervensystem) entscheidend beeinflussen (SAARMA, 2000; ANDRES et al., 2001;
SARIOLA & SAARMA, 2003; YAN et al., 2003). Diese vier Moleküle übertragen ihre Signale durch ein Multikomponenten Rezeptor System, bestehend aus einer hochaffinen, per Glykosyl Phosphatidyl Inositol (GPI) an der Zellmembran verankerten Bindungskomponente (GDNF Family Receptor α, GFR α) und einer gemeinsamen Signalkomponente Ret („Rearranged During Transfection“), an das Zellinnere weiter (BALOH et al., 1998a) (Abb. 2). Studien über Liganden Bindung, Ret Phosporylierung und Zellantworten haben gezeigt, dass GFR α1 für GDNF (JING et al., 1996; TREANOR et al., 1996), GFR α2 für NTN (BUJ BELLO et al., 1997; WIDENFALK et al., 1997), GFR α3 für ART (BALOH et al., 1998b) und GFR α4 für PSP (ENOKIDO et al., 1998) den jeweils bevorzugten Rezeptor darstellen. Weitere Signalwege und –kaskaden für GFL, beispielsweise via NCAM („Neural Cell Adhesion Molecule“), sind derzeit Gegenstand der Forschung, da für GDNF in neuronalen Zellen eine Ret unabhängige Signal Übermittlung aufgezeigt wurde (TRUPP et al., 1998). NCAM ist in Schwann Zellen von im Rahmen der NF2 entstandenen Akustikusneurinomen hochreguliert (HUNG et al., 2002).
Darstellung derverschiedenen Signalwege der homodimeren GDNF Family Liganden via RET: GDNF (grün), NRTN (rot), ARTN (blau) und PSPN (gelb) binden mit hoher Affinität an ihre GPI verankerten GFR α Rezeptoren, führen durch die darauf folgende Anheftung an die transmembranäre Ret Tyrosin Kinase zu deren Homodimerisierung, Autophosporylierung und aktivieren dadurch weitere intrazelluläre Signalkaskaden. Durchgezogene Linien zeigen die bevorzugten funktionellen Bindungen an: GDNF bindet an GFR α1, NRTN an GFR α2, ARTN an GFR α3 und PSPN an GFR α4, während gestrichelte Linien mögliche Interaktionen in vivo aufzeigen. Dem nicht humanen GFR α4 fehlt die N terminale kugelförmige Domäne.
Für GDNF existieren noch weitere Signalwege über einen schon bestehenden GFR α1 Ret Komplex und Ret unabhängig via transmembranärem Neural Cell Adhesion Molecule (nach SAARMA, 2000).
ARTN = Artemin; GFR α = GDNF Family Receptor α; GPI = Glykosyl Phosphatidyl Inositol;
NRTN = Neurturin; PSPN = Persephim
Bei GDNF handelt es sich um ein Signalmolekül, das zuerst als trophischer Faktor für dopaminerge Neurone des Mittelhirns identifiziert wurde (LIN et al., 1993); die weitere Erforschung seines therapeutischen Potentials für die Behandlung des Morbus Parkinson wurde daraufhin stark vorangetrieben (GASH et al., 1996). GDNF
wirkt pharmakologisch auf die Neurotransmission (beispielsweise Steigerung von Dopaminumsatz und Tyrosin Hydroxylase Expression) und induziert Regeneration und Neuritenaussprossung in verletzten dopaminergen Neuronen. Es stellte sich allerdings heraus, dass die unspezifische GDNF Expression und Beeinflussung zahlreicher peripherer Organe den therapeutischen Gebrauch auf Grund eines zu breiten Wirk und Nebenwirkungsspektrums auf lokale Injektionen begrenzen (ESLAMBOLI et al., 2005). GDNF kommt in hohen Konzentrationen in Hoden, Niere, Magen und Haut vor, hat eine Schlüsselrolle bei der Entwicklung einiger Organsysteme (Niere, Harnwege, enterisches und parasympathisches Nervensystem) und beeinflusst als Survival , Differenzierungs und Regenerationsfaktor Neurone des peripheren und zentralen Nervensystems (HENDERSON et al., 1994;
SAARMA & SARIOLA, 1999). Für neurotrophe Effekte auf Nervenzellen, Motoneurone ausgenommen, benötigt GDNF die Co Expression von TGF β1, um den bevorzugten Rezeptor GFR α1 zu rekrutieren und auf der Zellmembran zu stabilisieren (KRIEGLSTEIN et al., 1998). Des Weiteren ist das Vorhandensein des Glykosaminoglykans Heparansulfat essentiell, um den Co Rezeptor Ret zu phosphorylieren und somit eine Bindung an GFR α1 zu ermöglichen (BARNETT et al., 2002). GDNF stellt den potentesten neurotrophen Faktor für spinale Motoneurone in vivo dar, der nach Axotomie eine Atrophie verhindert und ein Überleben der Neurone sichert (HENDERSON et al., 1994). Posttraumatisch zeigte sich in Schwann Zellen peripherer Nerven eine vermehrte Expression des Polypeptids GDNF; eine verletzungsbedingte neuronale Degeneration ließ sich durch die externe Applikation von GDNF verhindern (BÄR et al., 1997).
Neurturin besitzt eine 42% ige Strukturhomologie zu GDNF und wurde ursprünglich wegen seiner Fähigkeit, das Überleben ganglionärer Neurone zu unterstützen, identifiziert (KOTZBAUER et al., 1996). Die Funktionen von NTN und GDNF sind eng miteinander verknüpft, da über deren korrespondierende Rezeptoren (GFR α1 bzw. GFR α2) ein so genannter „funktioneller Crosstalk"
möglich ist: Beide Faktoren können ebenfalls den bevorzugten Rezeptor des anderen Liganden besetzen und ihre Signale so ins Zellinnere weiterleiten (CREEDON et al., 1997). Bei der Entwicklung von Axonen des peripheren Nervensystems scheint eine Änderung der Liganden Suszeptibilität stattzufinden, da NTN eine Antwort im
adulten Gewebe hervorruft während GDNF in der Lage ist, unreife Neurone zu stimulieren (PAVELIEV et al., 2004); ein Beispiel dafür ist die Differenzierung und Entwicklung des parasympathischen Nervensystems.
Artemin, auch als Neublastin oder Enovin bekannt, ist der zuletzt entdeckte Nervenwachstumsfaktor. Zu den übrigen Mitgliedern seiner Familie hat ART einen zu 45% (NTN und PSP) bzw. 36% (GDNF) identischen Molekülaufbau, wobei das Gen auf dem Chromosom 1p32 33 lokalisiert ist (CARMILLO et al., 2005). Auf die Entwicklung des sympathischen Nervensystems hat es entscheidenden Einfluss, indem es die Proliferation von Vorläuferzellen fördert, die mitotische Zellteilung neuer Neuronen in Kultur anregt und das Neuritenwachstum in vitro verbessert; ART übt außerdem chemotaktische Reize auf sympathische Neurone aus und triggert so deren Wachstum entlang von Gefäßstrukturen (HONMA et al., 2002). In weiteren Studien wurde die Expression dieses Faktors in fetalem Gewebe (Niere, Lunge), in Schwann Zellen und eine konsekutive Hochregulation nach peripherer Nervenverletzung beobachtet. Bei neuropathischen Schmerzen scheint die systemische Gabe von ART im Tiermodell zu einer signifikanten Schmerzreduktion und einem Rückgang der morphologischen und biochemischen Veränderungen des verletzten Nervengewebes zu führen (GARDELL et al., 2003).
Von dem in dieser Studie nicht näher untersuchten PSN ist bisher bekannt, dass es Einfluss auf dopaminerge und Motoneurone des ZNS ausübt und bei der Entwicklung der Niere eine Rolle spielt (BALOH et al., 1998b). Zusätzlich zeigte sich bei in vitro Versuchen, dass PSN als Survivalfaktor für periphere Neurone agiert (SAARMA & SARIOLA, 1999) und wie viele andere neurotrophe Faktoren beispielsweise in der Cochlea sowie in Spiralganglienzellen des Nervus cochlearis der Ratte exprimiert wird (STÖVER, 2003; WISSEL et al., 2006a, b).
1.2.2 Der Co Rezeptor Ret
Das Produkt des Proto Onkogens c ret, Ret, gehört zur Rezeptor Tyrosin Kinase (Trk) Superfamilie und kodiert für einen transmembranären Rezeptor. Ret ist von großer Bedeutung für die Signalübermittlung der Liganden der GDNF Familie: Nach Bindung eines GFL Homodimers an den korrespondierenden Rezeptor (GFR α Dimer) und Anheftung dieses Komplexes an Ret findet dessen Homodimerisierung
und dadurch eine Autophosporylierung und Aktivierung der Tyrosin Kinase statt (JING et al., 1996) (Abb. 2). Mehrere intrazelluläre Signalkaskaden werden durch Ret aktiviert und regulieren die Zellvitalität, Differenzierung, Proliferation, Migration, Chemotaxis, Neuriten Aussprossung und Verzweigung und synaptische Plastizität im zentralen und peripheren Nervensystem sowie in nicht neuronalen Organen (SCHUCHARDT et al., 1994; ENOMOTO et al., 2001; SARIOLA &
SAARMA, 2003).
Während der Durchführung von Transfektionsversuchen wurde per Zufall die onkogene Form von Ret detektiert, die durch ein Re Arrangement von Genen entsteht (LANZI et al., 1992). Keimbahn Mutationen, die mit einer Aktivitätszunahme des Ret Gens einhergehen („Gain of Function“), sind assoziiert mit einer familiären Prädisposition für medulläre und papilläre Schilddrüsen Karzinome, multiplen endokrinen Neoplasien Typ 2A und Typ 2B sowie Neurinomen (MEN2A und MEN2B), während Mutationen mit einem Funktionsverlust des Ret Gens („Loss of Function“) mit der Entstehung des Morbus Hirschsprung in Verbindung gebracht werden (LANZI et al., 1992; SCHUCHARDT et al., 1994). Ret ist als Co Rezeptor für alle GFL von großer Bedeutung (Abb. 2) und wird in Akustikusneurinomen exprimiert (DIENSTHUBER et al., 2004).
1.2.3 Die Familie der Neurotrophine
Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF), Nerve Growth Factor (NGF), Neurotrophin (NT) 3, 4 und 5 stellen eine Gruppe von miteinander verwandten Zytokinen dar, die zur Familie der Neurotrophine gehören. Sie interagieren mit hoher Affinität über die Familie der Tyrosin Kinase Rezeptoren (Trk), wobei auch Kreuzreaktivitäten bekannt sind, bzw. niedrig affin über den p75 Neurotrophin Rezeptor (p75NTR), der zur Familie der Tumor Nekrose Faktor Rezeptoren gehört (NOTTERPEK, 2003) (Abb. 3).
BDNF ist in der Lage, spezifisch über TrkB oder unspezifisch, bei kompetitiver Verdrängung von TrkB, über p75NTR zu signalisieren (HEMPSTEAD & SALZER, 2002). Die Signaltransduktion mittels p75NTRsteigert die Myelin Protein Expression im peripheren Nervensystem, wohingegen sie bei der Bindung von BDNF an Trk B deutlich reduziert ist (COSGAYA et al., 2002). Letztgenanntes ist dadurch zu
erklären, dass bei der Anlagerung von BDNF an TrkB vermutlich keine Aktivierung der Tyrosin Kinase stattfindet sowie TrkB mit p75NTR um die Bindung von BDNF konkurriert und so dessen Verfügbarkeit vermindert. Weiterhin wird nach Verletzung peripherer Nerven ein direkter Effekt auf Regeneration und –myelinisierung durch exogene BDNF Applikation erzielt (NOTTERPEK et al., 2003). Im sich entwickelnden und adulten Organismus scheint eine Langzeitexpression von BDNF zur Formationsbeschleunigung bzw. Zunahme der Myelin Schichtdicke zu führen (TOLWANI et al., 2004). Hingegen beeinflusst BDNF im ZNS die morphologische Komplexität von Axonen und Dendriten, steigert während der Entwicklung die Synapsen Anzahl und moduliert deren Reifung (HU et al., 2005). Die stimulierenden Effekte von BDNF auf das Wachstums und Regenerationsverhalten von Schwann Zellen in vitro lassen eine Beteiligung bei Proliferationsprozessen in Schwannomen vermuten.
Die Neurotrophine NGF, BDNF, NT 3, NT 4 und NT 5 binden an zwei unterschiedliche Arten von Zelloberflächen Rezeptoren: Über den jeweils bevorzugten hochaffinen Rezeptor (Rottöne), der ein Rezeptor Tyrosin Kinase Protein (TrkA, TrkB, TrkC) beinhaltet, bzw. über den niedrigaffinen Signalweg, der allen Neurotrophin Mitgliedern gemein ist, via p75NTR (lila). p75NTR gehört zur Familie der Tumor Nekrose Faktoren Rezeptoren.
Verglichen mit den hoch affinen Rezeptoren besitzt p75NTR eine strukturell und funktionell ähnlich aufgebaute Anlagerungsstelle für die Neurotrophin Liganden (nach WAARTIOVARRA, 1998).
BDNF = Brain Derived Neurotrophic Factor; NGF = Nerve Growth Factor; NT = Neurotrophin;
NTR
Im Rahmen der Erforschung von unilateralen, sporadischen Akustikusneurinomen existieren bisher nur wenige Erkenntnisse hinsichtlich wachstumsauslösender bzw.
modulierender Faktoren. Neben einer möglichen genetischen Ursache werden mitogene Stimuli verdächtigt, auf molekularer Ebene, Einflüsse auf das Wachstumsverhalten dieser Tumorentität auszuüben. Die so genannten neurotrophen Faktoren scheinen bei der Verschiebung des Gleichgewichts von Apoptose und Proliferation eine wichtige Position einzunehmen.
Neurotrophe Faktoren spielen im Zusammenhang mit der Entwicklung und dem Erhalt des peripheren und zentralen Nervensystems eine wichtige Rolle. Sie werden sowohl in zahlreichen Neuronen als auch in Schwann Zellen exprimiert und üben auf letztgenannte mitogene Effekte aus. Im peripheren Nervensystem beeinflussen sie nach externer Applikation die posttraumatische Regeneration und Myelinisierung positiv. Die Expression von GDNF, Ret und TGF β1 im Akustikusneurinom wurde bereits mit immunhistochemischen Methoden nachgewiesen. Die bereits nachgewiesenen Expressionen von BDNF, TGF β2, ART und NTN in vielen anderen Geweben des zentralen und peripheren Nervensystem sowie deren trophische Effekte auf neuronale Zellen sind ein weiterer indirekter Hinweis auf die potentielle Bedeutung dieser Faktoren hinsichtlich des Proliferationsverhaltens von Akustikusneurinomen.
Es ergeben sich somit folgende zu bearbeitende Zielsetzungen:
Mittels semiquantitativer Reverser Transkriptase Polymerase Kettenreaktion (RT PCR) sollte die Expression der neurotrophen Faktoren ART, GDNF.
NTN, TGF β1, TGF β2, BDNF sowie des Co Rezeptors Ret im Akustikusneurinom bestimmt und der Expression im Referenzgewebe peripherer Nerv gegenüber gestellt werden.
Für diese Untersuchungen sollte im Vorfeld die RT PCR etabliert und optimiert werden.
Weiterhin musste zur Normalisierung der PCR Ergebnisse vorerst ein geeignetes Housekeeping Gen als interner Standard ermittelt werden.
Um einen möglichen Zusammenhang zwischen der Expressionsstärke der neurotrophen Faktoren und der proliferativen Aktivität der Akustikusneurinome aufzuzeigen, sollte mittels Immunhistochemie der Ki 67 Proliferationsindex ermittelt und zur Expression der neurotrophen Faktoren in Relation gesetzt werden.
Alle Versuche der hier vorliegenden Studie wurden mit Genehmigung der Ethik Kommission der Medizinischen Hochschule Hannover (MHH) (Bestätigungsschreiben vom 30.11.2004) durchgeführt. Für die Untersuchungen wurden n = 18 unilaterale, sporadisch entstandene Akustikusneurinome verwendet, die an der MHH, Abteilung für Hals , Nasen und Ohrenheilkunde, operativ reseziert wurden. Die formalinfixierten und in Paraffin eingebetteten Gewebeblöcke für die immunhistochemischen Versuche sowie das Gewebe für die Positiv und Negativkontrollen (archiviertes Gewebe) wurden freundlicherweise vom Institut für Pathologie der MHH, Prof. Dr. med. H. H. Kreipe, zur Verfügung gestellt. Das periphere Nervengewebe (Nervus transversus colli) der Vergleichsgruppe (n = 11), fiel bei lateralen Halsausräumungen, so genannten Neck Dissektionen an, die ebenfalls an der MHH durchgeführt wurden.
Das operativ resezierte Material für die molekularbiologischen Untersuchungen wurde sofort nach Entnahme in RNAlater (Ambion, Austin, TX, USA) überführt und darin bis zur endgültigen Verarbeitung bei 80°C gelagert.
Die Auswahl beider Gewebearten, sowohl der Akustikusneurinome als auch der peripheren Nerven, erfolgte zufällig.
Die vorliegende Studie umfasste einseitige, sporadisch entstandene Akustikusneurinome von 18 Patienten. Von dieser Gruppe waren 11 Patienten weiblichen (61%) und sieben (39%) männlichen Geschlechts. Zum Zeitpunkt der Operation betrug das Alter der Patienten zwischen 20 und 77 Jahren (arithmetischer Mittelwert ± Standardabweichung = 54,3 ± 16,1 Jahre). Das mittlere Alter der Frauen betrug 49,3 ± 18,3 Jahre, das der Männer 62,1 ± 7,6 Jahre.
Aus der Gruppe der Patienten, bei denen eine Neck Dissektion durchgeführt werden musste, waren 3 Personen weiblich (27%) und 8 männlich (73%). Am
Operationstermin waren die Patienten zwischen 42 und 76 Jahre alt (arithmetischer Mittelwert = 58,5 ± 11,0 Jahre), wobei die Frauen ein Durchschnittsalter von 50,7 ± 13,3 und die Männer von 61,4 ± 9,2 Jahren aufwiesen.
!
Die Methode der Ribonukleinsäure (RNA) Präparation beruht auf dem Prinzip der Anionenaustauschchromatographie. Negativ geladene und in flüssiger Form vorliegende Moleküle, zum Beispiel Nukleinsäuren, interagieren mit einer entgegengesetzt geladenen, festen Trägermatrix im Innern einer Säule und werden so der Lösung entzogen. Durch mehrere Waschvorgänge werden Verunreinigungen entfernt, da sie nur sehr schwach gebunden sind. Ein abschließender Waschschritt mit einem Elutionspuffer führt durch eine Änderung des pH Werts zur Nukleinsäure Elution.
Nach dem Auftauen der Proben wurde jeweils ein ca. 20 mg großes Gewebestück in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß gegeben, das Keramikkügelchen (Lysing Matrix D, Q Biogene), 700 l Lysepuffer (Invitrogen) und 1% β Mercaptoethanol (Merck) enthielt. Mit Hilfe des Mikrodismembranators (Ionomix®, Ionos) wurde die Probe mehrere Male für jeweils 10 Sekunden (sec) homogenisiert. Das Lysat wurde in ein neues Gefäß überführt und bei 12.000 x g für 4 Minuten (min) zentrifugiert. Der Überstand wurde anschließend in ein neues 1,5 ml Gefäß transferiert. Nach Zugabe von 120 l Chloroform (J.T. Baker), kräftigem Schütteln und Zentrifugation bei 12.000 x g für 7 min wurde die RNA extrahiert. Die obere, wässrige Phase wurde dabei in ein neues 2 ml Reaktionsgefäß überführt; das Ausschütteln mit Chloroform diente der Abtrennung des lipidhaltigen Anteils von der wässrigen Phase, welche die RNA enthielt. Die RNA haltige Phase wurde mit 1 Volumen 70%igem Ethanol (in DEPC behandeltem Aqua dest.) gemischt. Jeweils 700 l wurden auf die Silicagel Säule ("Micro to Midi Total RNA Purification System", Invitrogen) gegeben und
anschließend für 15 sec bei 12.000 x g zentrifugiert. Das Lysat wurde verworfen und die Säule mit 700 l Waschpuffer I (Invitrogen) befüllt. Nach der Zentrifugation für 15 sec bei 12.000 x g wurde die Silicagel Säule in ein neues 2 ml Reaktionsgefäß und zweimal mit Waschpuffer II (Invitrogen) entsprechend dem Protokoll des Herstellers gewaschen und für 2 min mit 12.000 x g zentrifugiert, um Ethanol und verbliebene Waschpufferreste zu entfernen. Die RNA wurde zweimal mit je 30 l RNase freiem Aqua dest. (Invitrogen) bei 12.000 x g für 1 bzw. 2 min zentrifugiert.
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Die optische Dichte (OD) der RNA wurde bei λ = 260 nm (OD260) und λ = 280 nm (OD280) bestimmt, wobei als Referenz RNase freies Aqua dest. verwendet wurde (MANIATIS et al., 1982).
Die RNA Konzentration wurde folgendermaßen ermittelt: OD260 = 1 entspricht einer RNA Konzentration von 40 mg/ ml. OD280 stellt den Anteil an Protein in der Lösung dar, dessen Verhältnis zu OD260 (OD260/ OD280) Aufschluss über den Reinheitsgehalt der Nukleinsäurelösung gibt. Proben, die ein OD260/ OD280 Verhältnis von ≥ 1,8 aufwiesen, wurden für die cDNA Synthese verwendet.
%
Mögliche DNA Kontaminationen der extrahierten RNA wurden vor der Durchführung der cDNA Synthese durch enzymatischen Verdau beseitigt. Die hierfür verwendete Desoxyribonuclease I (DNase I) stellt eine Endonuklease dar, die bevorzugt einzel und doppelsträngige DNA unspezifisch in freie Di , Tri und Oligonukleotidprodukte mit 5’ phosphorylierten und 3’ hydroxylierten Enden spaltet.
Mit dem Kit „Deoxyribonuclease I, Amplification Grade“ der Firma (Fa.) Invitrogen wurde der DNA Verdau nach vorgegebenem Protokoll durchgeführt. Das Gesamtvolumen von 10 l setzte sich aus 1 l DNase Puffer, 1 l DNase I (1 U/ l) und 8 l Probe, die maximal 1,5 g RNA enthielt, zusammen und wurde bei 21°C für 15 min im Wasserbad inkubiert. Der Reaktionsstopp erfolgte durch Zugabe von 1 l 25 mM EDTA. Anschließend wurde die Denaturierung des Enzyms bei 65°C durchgeführt.
Die RNA Konzentration wurde nach Abschluss des DNA Verdaus wie folgt berechnet:
K2= V1x K1/ V2
K2: Endkonzentration RNA [ g/ l]
V1: Ausgangsvolumen der Probe [ l]
K1: RNA Anfangskonzentration der Probe [ g/ l]
V2: Endvolumen der Probe nach DNA Verdau [ l]
& '( $
Die Qualitätsüberprüfung der RNA erfolgte mittels Agarose Gelelektrophorese (siehe Kapitel, s. Kap. 3.2.1.7). Je Probe wurden 300–500 ng RNA eingesetzt. Bei einer anliegenden Spannung von 100 V, einer Stromstärke von 40 mA und einer Vorlaufzeit von 10 min, ohne Beladung der Geltaschen, erfolgte nach 30–45 min die Auftrennung der Untereinheiten der rRNA, entsprechend ihrer Größe, in eine 28 S und eine 18 S Bande bei 5,0 bzw. 1,9 kbp. Die 28S und 18S Banden werden dabei zur Beurteilung der RNA Qualität herangezogen.
Ein Verhältnis der 28 S zur 18 S Bande von 2:1 weist auf einwandfreie, nicht durch RNasen degradierte RNA hin.
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Als Voraussetzung für die anschließende Durchführung der Polymerase Kettenreaktion wurde die RNA mit Hilfe der Reversen Transkriptase (RTase) in einzelsträngige cDNA (so genannte complementary DNA) umgeschrieben (KAWASAKI, 1989). Diese wurde anschließend als Ausgangs DNA (Template) zur Herstellung antizyklischer DNA Sequenzen verwendet.
Bei der cDNA Synthese dienen Oligo (dT)18 Primer, die sich an die poly A Enden der mRNA anlagern, als Startpunkt für die Reverse Transkriptase. Zum Ausschluss der Amplifizierung genomischer DNA bei der nachfolgenden PCR wurde
in jeweils einem Probenansatz die RTase durch RNase freies Aqua dest. ersetzt (Negativkontrolle, RT ).
Für die Herstellung der cDNA wurde das „RevertAidTM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit“ der Fa. Fermentas verwendet, wobei das Protokoll leicht modifiziert wurde: Zur Denaturierung der RNA Sekundärstrukturen wurden 1 l
(0,5 g/ l) Oligo (dT)18 Primer, 500 ng RNA und RNase freies Wasser in einem
Gesamtvolumen von 12 l im Thermocycler (Hybaid) für 5 min bei 70°C erhitzt und anschließend für weitere 5 min auf Eis gestellt. Anschließend wurde ein Mastermix aus 4 l 5 x Reaktionspuffer, 1 mM dNTP, 20 U RNase Inhibitor und 200 UReverse Transkriptase hergestellt. Für die Negativkontrolle wurde der gleiche Mastermix verwendet, wobei jedoch wie oben beschrieben die RTase gegen die gleiche Menge Aqua dest. ausgetauscht wurde. Bei 42°C erfolgte die reverse Transkription im Thermocycler für 1 Stunde. Der abschließende Verdau vorhandener RNA wurde mit 5 U Ribonuclease H (Fermentas) im Wasserbad bei 37°C für 20 min durchgeführt.
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Bei der Reversen Transkriptase Polymerase Kettenreaktion werden zu untersuchende Gensequenzen enzymatisch amplifiziert, die zuvor durch ein spezifisches, zum jeweiligen Strang komplementäres Primerpaar „eingerahmt“ und somit definiert wurden. Diese Methode erlaubt eine exponentielle Vermehrung des zu analysierenden Genabschnitts und damit dessen Nachweis. Kleine, synthetisch hergestellte, einzelsträngige Oligonukleotide (so genannte Primer), die komplementär zu einem bestimmten DNA Abschnitt sind, werden bei der PCR eingesetzt. Das verwendete Enzym Thermus aquaticus DNA Polymerase (Taq Polymerase) benötigt für eine optimale DNA Amplifikation ein gepuffertes Milieu, das sich aus MgCl2,Desoxynukleotiden, einer DNA Matrize und einem spezifischen Primerpaar zusammensetzt (SAIKI et al., 1985; MULLIS & FALOONA, 1987). Das Prinzip der PCR besteht aus drei Schritten, die in einem Thermocyler nacheinander ablaufen (NEWTON & GRAHAM, 1994): Bei ca. 95°C erfolgt die Denaturierung der doppel in einzelsträngige DNA, indem die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den komplementären Basen gespalten werden. Für die Anlagerung der forward und reverse Primer an die komplementären Sequenzabschnitte (Annealing)
wird die Temperatur auf einen Wert unterhalb der Schmelztemperatur der Primersequenzen (50–60°C) abgesenkt. Ein zur DNA antizyklischer Strang wird bei der Elongation, im Bereich des Temperaturoptimums der hitzestabilen Taq Polymerase (72°C), unter Verwendung von Desoxyribonukleosid 5’ triphosphaten (dNTP) gebildet. Dabei dienen die 3’OH Enden der Primer als Startpunkt der Taq Polymerase, wobei aus den Einzelsträngen der Matrize doppelsträngige DNA Abschnitte synthetisiert werden.
Durch vielfaches Wiederholen dieser Zyklusabfolge wird die zu untersuchende DNA Sequenz bis zum Erreichen einer Plateauphase exponentiell vermehrt. Ab einer bestimmten Zyklenzahl kann die Menge an PCR Amplifikaten nicht mehr gesteigert werden (Plateau), da es zum Beispiel zu Interferenzen zwischen Amplifikaten und Primern, Substratverbrauch und Enzymsättigung kommt.
Für die verwendeten genspezifischen Primer ART, GDNF, NTN, Ret, TGF β1, TGF β2, BDNF sowie für die Housekeeping Gene CycA, GAPDH, HPRT1, SDHA und 18S rRNA wurde bei der Durchführung der PCR nach folgendem Protokoll vorgegangen:
Für jeden PCR Ansatz wurde entsprechend der Anzahl der zu amplifizierenden Proben ein Mastermix mit einem Gesamtvolumen von 50 l aus den unten aufgeführten Lösungen und Reagenzien hergestellt und jeweils 1 l der cDNA und 10–20 pmol Primerlösung hinzu gegeben.
5 l 5 x Taq Puffer 4 l 25 mM MgCl2 2 l 10 mM dNTP 1,25 U Taq Polymerase
bis zu einem Volumen von 50 l mit Aqua dest. auffüllen
Die Zugabe von 1 M Betaine für ART und NTN steigert die Amplifikationseffizienz ihrer GC reichen Regionen. Unterschiede in der Stabilität der AT und GC reichen DNA Bereiche werden so verringert, deren Schmelztemperaturen einander angeglichen und die Entstehung von unerwünschten Sekundärstrukturen minimiert (REES et al., 1993; HENKE et al., 1997).
Das Thermoprogramm wurde, in Abhängigkeit von den Eigenschaften der verwendeten Oligonukleotidprimer, dahingehend optimiert, dass bei einer bestimmten Zyklenzahl und Annealingtemperatur eine maximale Menge an Genprodukt von der Taq Polymerase synthetisiert wurde. Die übrigen Schritte während der PCR blieben unverändert:
5 min bei 95°C: initiale Denaturierung des Templates 1 min bei 94°C: Denaturierung
Annealing der Primer bei 54ºC (NTN bei 60ºC) 1 min bei 72°C: Elongation
5 min bei 72°C: finale Elongation
Nach Ablauf der PCR wurden die PCR Produkte, auf Grund ihrer definierten Fragmentlängen, mittels Agarose Gelelektrophorese detektiert und densitometrisch ausgewertet (s. Kap. 3.2.1.7).
/ + !
Mit Hilfe der Agarose Gelelektrophorese wird festgestellt, ob in der zuvor durchgeführten PCR der durch das Primerpaar definierte Genabschnitt amplifiziert wurde.
Alle Nukleinsäuren tragen eine negative Nettoladung und lassen sich somit durch Wanderung in einem elektrischen Feld der Größe nach auftrennen; entsprechend wandern kleinere PCR Produkte am schnellsten. Anhand eines DNA Längenstandards wird kontrolliert, ob es sich bei dem PCR Produkt um das gewünschte handelt. Das dem Gel zugesetzte fluoreszenzaktive Ethidiumbromid interkaliert in die doppelsträngige DNA bzw. in die Sekundärstrukturen der RNA und ermöglicht so das Sichtbarmachen der DNA bzw. ribosomalen RNA Banden auf einem UV Transilluminator.
Zur Herstellung eines 1,5%igen Agarose Gels wurden in 75 ml TBE Puffer (1x) (Roth) 1,13 g Agarose (Roth) gegeben, im Mikrowellengerät aufgekocht und auf Handtemperatur abgekühlt. Nach der Zugabe von 4 l 1%igem Ethidiumbromid wurde das Gel in einen mit Kämmen versehenen Gelträger gegossen. Nach der
Polymerisation des Gels wurde es mitsamt dem Gelträger in eine mit 1 x TBE Puffer gefüllte Elektrophorese Kammer gelegt und die Kämme anschließend entfernt. In die durch den Kamm ausgesparten Taschen wurde ein Gemisch aus 10 l des PCR Ansatzes, 4 l TBE Puffer und 1 l Gel Ladepuffer (10 x) (AppliChem) gegeben.
Zusätzlich wurde in eine Tasche 2 l eines DNA Längenstandards (beispielsweise FastRulerTM, Low Range) pipettiert. Bei einer anliegenden Spannung von 100 V und einer Stromstärke von 40 mA erfolgte die Auftrennung der PCR Produkte für 20–
30 min. Anschließend wurden die Analyse der DNA Banden und die fotografische Dokumentation unter UV Licht (λ = 366 nm) durchgeführt.
0 . 1.
Die für die semiquantitative PCR verwendeten Oligonukleotid Primer, ihre Gendatenbank Nummern, die dazugehörigen Primersequenzen sowie die Basenpaarlängen der PCR Amplifikate sind in Tabelle 1 und 2 aufgeführt. Die Sequenzen der genspezifischen Primer TGF β1 (KISZEWSKI et al., 2003), TGF β2 (WIMMEL et al., 2003) und Glycerinaldehyd 3 phosphat Dehydrogenase (GAPDH) (NAHLIK et al., 2003) wurden der Fachliteratur entnommen. Alle verwendeten Primer, ausgenommen Ret, CyclophilinA (CycA), Hypoxanthin Phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) und Succinat Dehydrogenase Komplex, Subunit A (SDHA) (Fa. Operon), wurden von der Fa. MWG Biotech synthetisiert.
Um eine optimale cDNA Amplifikation der zu untersuchenden neurotrophen Faktoren und der Housekeeping Gene zu erreichen, wurden folgende Kriterien für das Primerdesign festgelegt: Die genspezifischen forward bzw. reverse Primer für die Amplifikation von ART, GDNF, NTN, Ret, BDNF, CycA, HPRT1 und SDHA wurden innerhalb des kodierenden Sequenzbereichs ausgewählt und mittels Primer Premier 4 (PREMIER Biosoft Int., USA) konzipiert. Um für alle Primer ähnliche Schmelztemperaturen und somit einheitliche PCR Bedingungen zu schaffen, wurden ein GC Gehalt der Primer von 40–60% und Primerlängen von 18–24 bp gewählt. Die Fragmentgrößen der PCR Produkte wurden auf 160–500 bp begrenzt.
(Hersteller: MWG Biotech, Ebersberg)
ART NM_057090 for: 5' GACAACTGACTAGCAGCCCCAGAG '3
rev: 5' CCAGCTCCCATGAGTGAGTACAGG '3 278 bp BDNF NM_170735 for: 5' AGGTGGCTTGGCCTACCCAGGTGT '3
rev: 5' GTCTGCCGCCGTTACCCACTCACTA '3 371 bp GDNF L19063 for: 5' CACTGACTTGGGTCTGGGCTATGAA 3'
rev: 5' GTCTGCAACATGCCTGCCCTACTTT 3' 162 bp NTN NM_004558 for: 5' CCTGCCTGTGATGCCATTCTCCTC '3
rev: 5' ACGCCCCGTCTGTCCCTCCA '3 285 bp TGF
β1
KISZEWSKI et al., 2003
for: 5' TCACCCGCGTGCTAATGGTG 3'
rev: 5' CCACTGCCGGACAACTCCAGTGA 3' 322 bp TGF
β2
WIMMEL et al., 2003
for: 5' CCCCAGAAGACTATCCTGA 3'
rev: 5' GCGGCATGTCTATTTTGT 3' 246 bp (Hersteller: Operon Biotechnologies, Inc., USA) Ret X12949 for: 5' AAGTTTGCCCACAAGCCACCCAT '3
rev: 5' GCCGTATTTGGCGTACTCCACGAT '3 448 bp Darstellung genspezifischer Primersequenzen der untersuchten neurotrophen Faktoren, ihrer Genbank Zugangsnummern und der berechneten Größe der jeweiligen PCR Produkte.
Darstellung genspezifischer Primersequenzen der untersuchten Housekeeping Gene, ihrer Genbank Zugangsnummern und der jeweiligen berechneten Größe der PCR Produkte.
(Hersteller: MWG Biotech, Ebersberg)
GAPDH NAHLIK et
al., 2003
for: 5' GAAGGTGAAGCTCGGAGTCA 3'
rev: 5' TTCACACCCATGACGAACAT 3' 402 bp 18S
rRNA M10098 for: 5' GTTGGTGGAGCGATTTGTCTG 3'
rev: 5' AGGGCAGGGACTTAATCAACGC 3' 345 bp (Hersteller: Operon Biotechnologies Inc., USA) CycA NM_203431 for: 5' TTATCTTAACCACCAGATCATTCC '3
rev: 5' CTCTTAACTAACACGAGGACAATT '3 215 bp HPRT1 NM_000194 for: 5' CGTCGTGATTAGTGATGATGAACC '3
rev: 5' TTATACTGCCTGACCAAGGAAAGC '3 442 bp SDHA NM_004168 for: 5' TTTGATGCAGTGGTGGTAGGCG '3
rev: 5' AGCCCTTCACGGTGTCGTAGAAAT '3 206 bp
2 *34 .5.
Die erhaltenen PCR Produkte wurden sequenziert (Fa. Agowa, Berlin), um im Anschluss daran einen Abgleich der Sequenzabfolge der Amplifikate mit der Nukleotiddatenbank NCBI Blast vornehmen zu können.
6"
!
Jede Versuchsserie wurde auf ein Ethidiumbromid gefärbtes Agarose Gel aufgetragen, unter UV Durchleuchtung fotografiert, mittels des Programms ArgusX1 (Biostep Labor und Systemtechnik GmbH, Jahnsdorf, Germany) detektiert, digitalisiert und im TIF Format abgespeichert. Anschließend wurde mit der Software TotalLab v.2.01 (Nonlinear Dynamics Ltd., UK) die Signalintensität als logarithmische Funktion der Transmission des in die DNA Doppelhelix interkalierenden Ethidiumbromids bestimmt und die Daten in das Tabellenkalkulationsprogramm Excel übertragen. Das Programm TotalLab v.2.01 erlaubt, beim Einsatz quantitativ gleicher RNA Mengen, einen Vergleich unterschiedlicher Signalintensitäten. Die Bildinformation der Gelbanden und des Hintergrunds werden dabei abgeglichen (Hintergrundsubtraktion), um störende Artefakte, wie eine unspezifische Hintergrundfluoreszenz, auszugleichen.
# 7 '8
Bei der nach HSU et al. (1981) modifizierten Avidin Biotin Komplex (ABC) Methode bindet ein primärer Antikörper spezifisch an das Gewebsantigen und wird anschließend durch einen biotinylierten Sekundärantikörper detektiert. Die Zugabe des enzymgekoppelten Avidin Biotin Peroxidase Komplexes (Abb. 4) ermöglicht eine farbige Markierung der gesuchten Strukturen durch Interaktion mit dem Peroxidase spezifischen Substrat 3,3 Diaminobenzidin und Wasserstoffperoxid.
Anstatt der Peroxidase findet auch die alkalische Phosphatase als Markerenzym Verwendung.
Avidin ist ein in Hühnerprotein enthaltenes Glykoprotein mit einer Molekülmasse von 68 kD. Es kann vier Moleküle des wasserlöslichen Biotins mit hoher Affinität physikalisch binden (Dissoziationskonstante 1015 M) und bildet so eine Brücke zwischen einem biotinyliertem Antikörper und einem Peroxidase assoziiertem Biotin Molekül. Bei pH 7,0 liegt Avidin als Kation vor und bindet unspezifisch an negativ geladene Strukturen wie die Nukleinsäuren im Zellkern. Avidin wird mittlerweile durch das gentechnisch hergestellte reinere Protein Streptavidin (60 kD, neutraler pH Wert am isoelektrischen Punkt) ersetzt, wodurch unspezifische Reaktionen minimiert werden.
Schema der ABC Methode mit Darstellung des ABC Komplexes bestehend aus Primärantikörper, biotinyliertem Sekundärantikörper und Detektion durch das Markermolekül Meerrettich Peroxidase (HRP) (nach ALBERTS et al., 1998).
ABC = Avidin Biotin Complex; HRP = Horseradish Peroxidase; Ig = Immunglobulin
' ,/. 9 8
Beim nukleären Ki 67 Protein handelt es sich um ein Protease sensibles, alkalisches Zellkern Protein, das in zwei verschieden großen Isoformen vorkommt (345 kD sowie 395 kD) und für die Aufrechterhaltung des Zellzyklus absolut notwendig ist (DUCHROW, 2003). Der monoklonale Antikörper Ki 67 reagiert mit einem nukleären Antigen (formalinresistententes Epitop) (GERDES et al., 1983), das nur in proliferierenden Zellen (G1 , S , G2 und M Phase) exprimiert wird; in ruhenden Geweben (G0 Phase) ist es nicht nachweisbar (GERDES et al., 1984; SCHRAPE et al., 1987).
In dieser Studie wurde der monoklonale Antikörper MIB 1 (Molecular Immunology Borstel 1) verwendet, da er an das Ki 67 Epitop bindet und den Ki 67 Nachweis an Paraffinschnitten nach hitzeinduzierter Antigendemaskierung ermöglicht (CATTORETTI et al., 1992); formalinbedingte Eiweißvernetzungen werden so aufgebrochen und einer immunhistochemischen Untersuchung zugänglich gemacht.
Ziel der vorliegenden Studie war die Ermittlung des Ki 67 Proliferationsindex (Anteil positiver Zellen bezüglich des Ki 67 Antigens, s. Kap. 3.2.3.2), um die so genannte Wachstumsfraktion in 17 von 18 untersuchten Akustikusneurinomen zu bestimmen. Bei einem der Akustikusneurinome war nach erfolgter histologischer Untersuchung durch die Pathologie nur noch ein sehr kleiner Restbestandteil vorhanden, weshalb diese Probe nicht auf die Expression des Ki 67 Antigens untersucht werden konnte.
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Die in Paraffin eingebetteten Gewebeblöcke wurden freundlicherweise vom Institut für Pathologie der MHH, Prof. Dr. med. H. H. Kreipe, zur Verfügung gestellt. Alle immunhistochemischen Versuche zur Bestimmung des Ki 67 Markierungsindex wurden in Zusammenarbeit mit dem Institut für Pathologie der MHH durchgeführt.
Für die immunhistochemischen Färbungen mit dem Antikörper MIB 1 wurden das automatisierte System „BenchMark IHC/ ISH“ und ein Färbekit der Fa. Ventana Medical Systems Inc., Arizona, USA verwendet. Bei diesem Detektionssystem wird
der gebundene primäre Maus Antikörper von einem zweiten biotinylierten Anti Maus IgG erkannt und gebunden. An das Biotin des zweiten Antikörpers bindet wiederum ein Streptavidin Meerrettich Peroxidase/ Alkalische Phosphatase Komplex, der enzymatisch mittels Detektions Kit farblich markiert wird.
Von den Paraffinblöcken wurden ca. 5 m dicke Gewebeschnitte manuell angefertigt. Anschließend erfolgte die Einspannung aller Proben in das Färbemodul.
Zur Antigen Demaskierung wurde im Automaten zuerst eine Hitzevorbehandlung durchgeführt. Alle übrigen Schritte bestanden aus Entparaffinierung, Zellaufbereitung, Färben, Eindecken und Überziehen der Proben mit Deckgläsern sowie einer Etikettierung der Objektträger. Nach Abschluss der Entparaffinierung wurden die Proben aus dem Automaten genommen, gewaschen und jeweils 100 l 1:100 verdünnter Ki 67 Antikörper (MIB 1, Neo Marker) aufgebracht. Die Antigen Antikörper Reaktivität wurde anschließend im Färbeautomaten mit dem Kit
„Enhanced Alkaline Phosphatase Red Detection Kit“ der Fa. Ventana detektiert.
Nach dem Gegenfärben der Schnitte mit Hämatoxylin (Ventana) wurden die so gefärbten Areale zur besseren Kontrastierung mittels „Bluing Reagent“ (Ventana) zusätzlich gebläut.
Die fotografische Dokumentation wurde mit Hilfe einer Digitalkamera (Nikon Digital Sight DS SM) sowie eines TFT Monitors (Nikon Digital Sight DS L1) durchgeführt und die Bildbearbeitung erfolgte mit der Software Adobe Photoshop 7.0 (Adobe ® Systems Incorporated, USA).
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Bei den durchgeführten immunhistochemischen Färbungen wurden zusätzlich Positiv und Negativkontrollen angefertigt. Sowohl für die Positiv als auch für die Negativkontrolle wurden Gewebeschnitte archivierter humaner Tonsillen der Pathologie der MHH verwendet. Diese Präparate wurden in identischer Weise im Färbemodul gefärbt, dienten zum Ausschluss einer Immunreaktion von endogenem Biotin und Peroxidase und ermöglichten die Kontrolle eines korrekten Versuchsablaufs. Bei der Negativkontrolle wurde anstatt des primären Antikörpers Citratpuffer auf die Objektträger aufgetragen.
